Obliczeniowe przewidywanie preferencji aminokwasów potencjalnie wielospecyficznych domen wiążących peptydy zaangażowanych w interakcje białko-białko

Podsumowanie

Opisujemy metodologię opartą na dywersyfikacji sekwencji w celu oszacowania preferencji aminokwasowych wielospecyficznych miejsc wiązania w interakcjach białko-białko (PPI). W ramach tej strategii tysiące potencjalnych ligandów peptydowych są generowane i badane in silico, pokonując w ten sposób niektóre ograniczenia dostępnych metod eksperymentalnych.

Streszczenie

Wiele interakcji białko-białko wiąże krótkie segmenty białka z domenami wiążącymi peptydy. Zazwyczaj takie oddziaływania wymagają rozpoznania motywów linearnych o zmiennej konserwacji. Połączenie wysoce konserwatywnych i bardziej zmiennych regionów w tych samych ligandach często przyczynia się do wielospecyficzności wiązania, co jest powszechną właściwością enzymów i białek sygnalizacji komórkowej. Charakterystyka preferencji aminokwasowych domen wiążących peptydy jest ważna dla projektowania mediatorów interakcji białko-białko (PPI). Metody obliczeniowe stanowią skuteczną alternatywę dla często kosztownych i kłopotliwych technik eksperymentalnych, umożliwiając projektowanie potencjalnych mediatorów, które można później zweryfikować w dalszych eksperymentach. W tym miejscu opisaliśmy metodologię wykorzystującą zastosowanie Pepspec w pakiecie do modelowania molekularnego Rosetta do przewidywania preferencji aminokwasowych domen wiążących peptydy. Metodologia ta jest przydatna, gdy struktura białka receptorowego i charakter liganda peptydowego są znane lub można je wywnioskować. Metodologia rozpoczyna się od dobrze scharakteryzowanej kotwicy z liganda, która jest przedłużana przez losowe dodawanie reszt aminokwasowych. Powinowactwo wiązania wytworzonych w ten sposób peptydów jest następnie oceniane za pomocą dokowania peptydów z elastycznym szkieletem w celu wybrania peptydów o najlepszych przewidywanych wynikach wiązania. Peptydy te są następnie wykorzystywane do obliczania preferencji aminokwasowych i opcjonalnie do obliczania macierzy pozycja-masa (PWM), którą można wykorzystać w dalszych badaniach. Aby zilustrować zastosowanie tej metodologii, wykorzystaliśmy interakcję między podjednostkami ludzkiego czynnika regulacyjnego interferonu 5 (IRF5), wcześniej znanego jako wielospecyficzny, ale globalnie kierowany przez krótki konserwatywny motyw zwany pLxIS. Oszacowane preferencje aminokwasowe były zgodne z wcześniejszą wiedzą na temat powierzchni wiązania IRF5. Pozycje zajmowane przez fosforylujące reszty seryny wykazywały wysoką częstotliwość asparaginianu i glutaminianu, prawdopodobnie dlatego, że ich ujemnie naładowane łańcuchy boczne są podobne do fosfoseryny.

Wprowadzenie

Interakcja między dwoma białkami często polega na wiązaniu krótkich segmentów aminokwasów z domenami wiążącymi peptydy, przypominając interfejsy białko-peptyd. Białka receptorowe biorące udział w takich interakcjach białko-białko (PPI) często mają zdolność rozpoznawania pewnego zestawu nakładających się na siebie, ale rozbieżnych sekwencji ligandów, co jest właściwością znaną jako wielospecyficzność^1,2. Rozpoznawanie wielogatunkowe jest cechą wielu białek komórkowych, ale jest szczególnie godne uwagi w enzymach i białkach sygnalizacji komórkowej³. Białka oddziałujące z wielospecyficznymi miejscami wiązania często mają kombinację mniej i bardziej konserwatywnych regionów w swojej sekwencji^4,5,6. W tym scenariuszu bardziej konserwatywne motywy sekwencji są zaangażowane w rygorystyczne interakcje molekularne. I odwrotnie, bardziej zmienne sekwencje oddziałują z w jakiś sposób permisywnymi powierzchniami w miejscu wiązania receptora. Zazwyczaj te mniej konserwatywne, ale wciąż funkcjonalnie istotne segmenty są pętlami pozbawionymi zdefiniowanych wzorców struktury drugorzędowej lub mają jeszcze bardziej dynamiczne konformacje, takie jak te typowe dla wewnętrznie nieuporządkowanych białek⁷.

Identyfikacja potencjalnych ligandów peptydowych miejsc wiązania jest zazwyczaj pierwszym krokiem w projektowaniu mediatorów zdolnych do zakłócania odpowiednich IPP⁸. Jednak często jest mało prawdopodobne, aby znaleźć pojedynczą najczęstszą resztę aminokwasową w co najwyżej położeniach sekwencji w ligandach wielospecyficznych miejsc wiązania. Zamiast tego strony te mogą mieć szczególne preferencje dotyczące określonej klasy aminokwasów zgodnie z ich właściwościami chemicznymi, np. kwaśne i ujemnie naładowane aminokwasy, takie jak asparaginian lub glutaminian, duże aminokwasy aromatyczne, takie jak fenyloalanina lub więcej reszt hydrofobowych, takich jak aminokwasy alifatyczne alanina, walina, leucyna lub izoleucyna³. Kilka metod eksperymentalnych może dostarczyć informacji na temat preferencji aminokwasów w miejscach wiązania białek, w tym ukierunkowana ewolucja⁹, mutageneza skanowania wielu kodonów¹⁰ i głębokie skanowanie mutacyjne¹¹. Wszystkie te metody są zgodne z podejściem dywersyfikacji sekwencji, które opiera się na wprowadzaniu mutacji do oryginalnych ligandów i dalszej analizie ich wpływu na funkcję białka receptorowego (zobacz Bratulic i Badran¹² dla kompleksowego przeglądu). Jednak metody te często wymagają przeglądu dużych bibliotek sekwencji, co czyni je bardziej kłopotliwymi, kosztownymi i czasochłonnymi.

Metody obliczeniowe pozwalające na określenie preferencji aminokwasowych wielospecyficznych miejsc wiązania mają potencjał do obejścia ograniczeń metod mokrego laboratorium. Wśród nich podejście różnicujące sekwencje in silico ocenia energetyczny wpływ szerokiego zakresu zamienników aminokwasów w sekwencji liganda jako sposób na scharakteryzowanie plastyczności strukturalnej klasy PPI¹³. Metoda ta rozpoczyna się od struktury lub modelu ligandu peptydowego związanego z miejscem wiązania receptora, a następnie wprowadza mutacje do sekwencji liganda. Funkcje statystyczne i oceny energetycznej są następnie wykorzystywane do oceny wpływu tych mutacji na stabilność i powinowactwo wiązania. Zestaw najlepiej punktowanych sekwencji ligandów wynikający z fazy oceny można następnie wykorzystać do obliczenia preferencji aminokwasów. Strategia ta ma potencjał do wydajnego przetwarzania bardzo dużej liczby sekwencji ligandów. W związku z tym może zapewnić bardziej kompletne i spójne wnioskowanie o preferencjach aminokwasowych w porównaniu z tymi obliczonymi na podstawie bardziej ograniczonej liczby sekwencji, które zwykle można przetworzyć w podejściach mokrych laboratoriów.

Aplikacja Pepspec zestawu do modelowania molekularnego Rosetta¹⁴ to narzędzie, które przeprowadza dywersyfikację sekwencji jako kluczowy krok w trybie projektowania peptydów. To zastosowanie wymaga struktury lub modelu białka receptorowego ze związanym peptydem o długości pojedynczej reszty aminokwasowej, który jest używany jako kotwica dla kolejnych kroków. Sekwencja związanego peptydu jest następnie wydłużana (jeśli to konieczne) i różnicowana w celu wygenerowania dużej liczby przypuszczalnych ligandów peptydowych. Powinowactwo wiązania tych peptydów jest następnie oceniane przez dokowanie peptydów z elastycznym szkieletem w celu wybrania tych z najlepszymi przewidywanymi wynikami wiązania. Chociaż głównym wynikiem tej aplikacji są najlepsi kandydaci na peptydy wybrani pod koniec fazy projektowania, znacznie większy zestaw peptydów zaakceptowanych podczas tej fazy można również wykorzystać do obliczenia preferencji aminokwasowych docelowego miejsca wiązania. Preferencje aminokwasowe są obliczane jako częstość każdej reszty aminokwasowej na pozycję sekwencji liganda reprezentowanej jako macierz pozycji (PWM) lub jako bardziej wizualne logo sekwencji.

W tym artykule opisujemy protokół do oszacowania preferencji aminokwasów powierzchni wiążącej białko receptorowe zaangażowane w PPI. Protokół koncentruje się na IPP, w których wiadomo, że liniowy segment liganda białka wiąże się z białkiem receptorowym, więc scenariusz można modelować jako interfejs białko-peptyd. W tym scenariuszu konserwatywne motywy z liganda zazwyczaj oddziałują ze zdefiniowanymi kieszeniami w miejscu wiązania receptora, chociaż cały segment liganda zaangażowany w PPI może zawierać mniej konserwatywnych regionów. Schemat blokowy podsumowujący główne kroki protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Protokół rozpoczyna się od struktury 3D kompleksu białko-białko i dalej redukuje białko liganda do potencjalnie najlepiej oddziałującego segmentu, pozostawiając białko receptorowe nienaruszone. Najlepiej oddziałujący segment jest określany za pomocą BUDE Alanine Scan server¹⁵, który przeprowadza obliczeniową mutagenezę skanowania alaniny w celu zidentyfikowania reszt gorących punktów między dwoma oddziałującymi białkami. W tym podejściu reszty z liganda są indywidualnie zastępowane alaniną, a szacowana zmiana energii swobodnej lub stabilności kompleksu (ΔΔG) jest następnie wykorzystywana do wnioskowania o znaczeniu odpowiedniej reszty dla docelowego PPI. Po wywnioskowaniu najlepiej oddziałującego segmentu, jego kompleks z białkiem receptorowym jest wykorzystywany jako struktura podstawowa przekazywana do Pepspec w celu przeprowadzenia dywersyfikacji sekwencji.

Rysunek 1: Przegląd głównych kroków protokołu proponowanego w tej pracy. Liczby zgadzają się z numerami kroków w sekcji protokołu. Rysunki wykonano za pomocą kompleksu białko-białko użytego jako przykład opisany w tekście. W tym kompleksie łańcuch białkowy uważany za receptor jest pokazany na różowo, podczas gdy łańcuch uważany za ligand jest pokazany na jasnoniebiesko, z przewidywanym najlepiej oddziałującym segmentem zaznaczonym na czerwono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jednym z ograniczeń proponowanego protokołu jest wymóg rozwiązanej struktury interfejsu białko-peptyd. Protokół może alternatywnie rozpocząć się od modelu granicy faz docelowe białko-peptyd, chociaż konkretne etapy modelowania nie są w nim opisane. Co więcej, chociaż protokół może być uruchamiany na komputerze osobistym z dowolnym systemem operacyjnym, do kroków związanych z aplikacjami Rosetta wymagane jest środowisko Linux. Klaster komputerowy jest również wysoce zalecany na etapie dywersyfikacji sekwencji ze względu na dużą liczbę iteracji zwykle wykonywanych przez Pepspec.

Zastosowanie proponowanego protokołu ilustruje oszacowanie preferencji aminokwasowych powierzchni licytacyjnej IRF5, członka rodziny ludzkich czynników regulacyjnych interferonu (IRF). Wybraliśmy to białko jako przykład, ponieważ podczas jego aktywacji dwie podjednostki wiążą się, tworząc dimer, którego struktura jest dobrze scharakteryzowana¹⁶. W dimerach IRF wiązanie można modelować jako interfejs białko-peptyd, w którym jedna podjednostka zapewnia powierzchnię wiązania, a druga oddziałuje przez region zawierający krótki konserwatywny motyw zwany pLxIS^17,18. Ponadto wiązanie z podjednostkami IRF jest wielospecyficzne; W związku z tym mogą tworzyć homodimery, heterodimery i kompleksy z innymi białkami komórkowymi znanymi jako koaktywatory18.

Protokół

1. Wstępne przygotowanie granicy faz białko-peptyd

1. Pobieranie struktury kompleksu białko-białko
   1. Przejdź do strony głównej Banku Danych o Białkach (PDB) (https://www.rcsb.org/) i wpisz identyfikator PDB dla struktury kompleksu białko-białko w głównym polu wyszukiwania (Rysunek 2A). Identyfikator PDB dla struktury dimera IRF5, użyty jako przykład w tej pracy, to 3DSH¹⁹.
   2. Na stronie głównej dla żądanej struktury kliknij na Download Files (Rysunek 2B), a następnie na Biological Assembly 1 (PDB - gz) (Rysunek 2C).
      UWAGA: W bazie danych PDB struktury wielu kompleksów białkowych utworzonych przez identyczne monomery są reprezentowane jako zespoły biologiczne, w których w pliku PDB przechowywana jest tylko struktura jednego monomeru (jednostki asymetrycznej). Struktura multimeru, w tym przypadku dimera IRF5, musi zostać pobrana jako zestaw biologiczny zawierający dwie instancje jednostki asymetrycznej. Aby ułatwić kolejne kroki tego protokołu, dwa monomery są najpierw rozdzielane i przypisywane są im różne identyfikatory łańcuchów.
   3. Otwórz pobraną strukturę w UCSF Chimera²⁰ i kliknij Narzędzia > Edycji struktury > Zmień identyfikatory łańcucha. W tym przykładzie oba łańcuchy w zespole biologicznym mają nazwę A. Zmień nazwę drugiego łańcucha (oznaczonego #0.2) na B i kliknij przycisk OK.
   4. Kliknij Ulubione > panelu modelu, a następnie wybierz model zawierający te dwa łańcuchy. Kliknij przycisk Grupuj/Rozgrupuj, aby rozdzielić każdy łańcuch na inny model. Następnie wybierz dwa modele i kliknij przycisk Kopiuj/Połącz. Wprowadź nową nazwę połączonego modelu, zaznacz opcję Zamknij modele źródłowe i kliknij przycisk OK.
   5. Kliknij Wybierz łańcuch > i potwierdź, że każdy łańcuch w dimerze jest teraz identyfikowany inną literą, a mianowicie A i B.
   6. Użyj opcji Plik > Zapisz plik PDB, aby zapisać edytowaną strukturę do innego pliku PDB, który będzie używany w kolejnych krokach protokołu (tutaj użyto nazwy IRF5_dimer.pdb).

Rysunek 2: Strona Banku Danych o Białkach (PDB) dla struktury użytej jako reprezentatywny przykład w tej pracy. (A) Pole wyszukiwania, aby wprowadzić kod przystąpienia do PDB docelowej struktury. (B) Menu do pobrania struktury w kilku formatach. (C) Opcje pobierania zespołów biologicznych, gdy struktura została zapisana jako jednostka asymetryczna (więcej szczegółów w kroku 1.1.2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Identyfikacja segmentu docelowego w białku ligandowym
   1. Przejdź do serwera BUDE Alanine Scan (https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/). Kliknij przycisk Wybierz plik w obszarze Przesyłanie struktury i wybierz plik PDB zapisany w kroku 1.1.6.
   2. Na następnej stronie sprawdź, czy struktura została poprawnie załadowana (Rysunek 3A) i wprowadź nazwę zadania na serwerze (Rysunek 3B).
   3. Ustaw łańcuchy z PDB, które będą traktowane jako receptor (A) i ligand (B) (Rysunek 3C). Następnie kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie, aby przesłać zadanie.
   4. Po zakończeniu zadania kliknij Pokaż wyniki, aby otworzyć stronę wyników (Rysunek 4).
      UWAGA: Na stronie wyników reszty ze struktury liganda są pokolorowane zgodnie z ich szacowaną zmianą energii swobodnej (ΔΔG), a te o wyższych wartościach są pokolorowane na czerwono.
   5. Z wykazu pozostałości wybrać odcinek pozostałości, co do którego przewiduje się, że będzie lepiej oddziaływał z docelową powierzchnią wiązania. Upewnij się, że te pozostałości grupują wyższe wartości różnicy w energii swobodnej (ΔΔG). W tym przykładzie wybrano segment między pozostałościami Leu424 i Ser436 (zaznaczony czerwoną ramką w prawym panelu Rysunek 4).
3. Przygotowanie granicy faz białko-peptyd do dywersyfikacji sekwencji
   1. Otwórz plik PDB zapisany w kroku 1.1.6 w Chimera i sprawdź, czy w strukturze docelowych podjednostek nie brakuje atomów lub wiązań.
   2. Usuń wszystkie małe cząsteczki, jony i rozpuszczalniki, które zostały skrystalizowane z oryginalną strukturą. Aby to zrobić, kliknij Wybierz > reszt, a następnie wybierz wszystkie cząsteczki inne niż standardowe aminokwasy. Następnie kliknij Akcje > Atomy/Wiązania i Usuń.
   3. Przytnij łańcuch liganda do najlepiej oddziałującego segmentu wybranego w kroku 1.2.5. Aby to zrobić, kliknij Ulubione i Sekwencja, a następnie kliknij łańcuch uważany za ligand (B). Na panelu Sekwencja przeciągnij myszą, aby zaznaczyć wszystkie pozostałości z wyjątkiem tych między pozycjami 424 i 436. Aby usunąć te pozostałości, kliknij Akcje > Atomy/Wiązania i Usuń.
   4. Użyj opcji Plik > Zapisz PDB, aby zapisać edytowaną strukturę do innego pliku PDB, który jest używany w kolejnych krokach protokołu (tutaj użyto nazwy IRF5_interface.pdb).

Rysunek 3: Wybór receptora i liganda w serwerze BUDE Alanine Scan. (A) Graficzne przedstawienie kompleksu białko-białko. (B) Pole tekstowe, aby wprowadzić nazwę zadania na serwerze. (C) Panel do interaktywnego wyboru łańcuchów, które będą uważane za receptor i ligand (więcej szczegółów w kroku 1.2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Strona z wynikami serwera BUDE Alanine Scan. Potencjalny najlepiej oddziałujący segment w sekwencji liganda jest oznaczony czerwoną ramką. W lewym panelu pozostałość o wyższym przewidywanym udziale energii (Leu433) jest podświetlona na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Zróżnicowanie sekwencji

UWAGA: W poniższych krokach rosetta_main odnosi się do głównego katalogu instalacyjnego Rosetty, który zazwyczaj znajduje się pod adresem /opt/rosetta_src__bundle/main/, gdzie oznacza zainstalowaną wersję Rosetty. Zakłada się również, że aplikacje Rosetta są dostępne w całym systemie; Jeśli tak nie jest, należy podać pełną ścieżkę do plików wykonywalnych. Po skompilowaniu ze źródła te pliki wykonywalne znajdują się w katalogu /rosetta_main/source/bin/.

1. Wstępna optymalizacja łańcuchów bocznych aminokwasów
   1. Skopiuj edytowaną strukturę zapisaną w kroku 1.3.4 do lokalizacji systemu Linux dostępnej dla aplikacji Rosetta.
   2. Użyj aplikacji FixBB firmy Rosetta, aby przeprowadzić przepakowanie wszystkich łańcuchów bocznych aminokwasów struktury podstawowej przed dywersyfikacją sekwencji. W tej operacji orientacja wszystkich łańcuchów bocznych aminokwasów jest zoptymalizowana w celu zminimalizowania energii i poprawy stabilności kompleksu. Aby to zrobić, uruchom następujące polecenie:
      
      UWAGA: To polecenie wyprowadza plik PDB o nazwie pochodzącej od oryginalnej struktury z dodatkowym sufiksem numerycznym (w tym przykładzie IRF5_interface_0001.pdb).
   3. Aby ułatwić wykonanie następnego kroku protokołu, zmień nazwę przepakowanego pliku PDB na sufiks _repack za pomocą następującego polecenia:
      mv IRF5_interface_0001.pdb IRF5_repack.pdb
2. Dywersyfikacja sekwencji
   1. Uruchom Pepspec w trybie projektowania, aby wykonać rzeczywisty krok dywersyfikacji sekwencji za pomocą następującego polecenia:
      
      Poniżej przedstawiono opcje ogólne:
      • -s wskazuje plik wejściowy (przepakowany plik PDB wygenerowany w kroku 2.1.3).
      • -o wskazuje prefiks do nazwania plików wyjściowych.
      • - baza danych wskazuje ścieżkę do głównej bazy danych Rosetta 3.
      • -ex1, -ex2 i extrachi_cutoff są opcjami biblioteki rotamer (więcej szczegółów w dokumentacji Pepspec).
      • -overwrite informuje aplikację, aby zastąpiła możliwe istniejące wcześniej dane wyjściowe wygenerowane przez poprzednie iteracje.
      Poniżej przedstawiono opcje odnoszące się do dywersyfikacji sekwencji jako takiej:
      • -pepspec:pep_chain wskazuje łańcuchy PDB uważane za ligand ("b" w tym przykładzie).
      • -pepspec:native_pep_anchor wskazuje resztę aminokwasową używaną jako kotwica (w tym przykładzie reszta Leu w pozycji 10 peptydu liganda).
      • -pepspec:n_peptides wskazuje liczbę struktur peptydowych do wyprowadzenia.
      • -pepspec:no_prepack_prot mówi aplikacji, aby pominęła przepakowywanie w wejściowej strukturze podstawowej (ponieważ zostało to wcześniej wykonane w kroku 2.1).
        UWAGA: Głównym wyjściem Pepspec jest katalog zawierający pliki PDB dla peptydów powstałych w fazie projektowania, nazwane za pomocą prefiksu wyjściowego z sufiksem .pdbs (w przykładzie IRF5.pdbs). Dodatkowo, Pepspec wyprowadza wszystkie zaakceptowane sekwencje peptydowe testowane w ramach etapu dywersyfikacji sekwencji i odpowiadające im wyniki energetyczne Rosetta w pliku tekstowym rozdzielanym tabulatorami, nazwanym na cześć prefiksu wyjściowego, z . sufiks spec (IRF5.spec w przykładzie). Ponieważ protokół opisany w tej pracy ma na celu oszacowanie preferencji aminokwasów, a nie rzeczywisty projekt peptydu, w następnych krokach używa się IRF5.spec zamiast struktur PDB w katalogu .pdbs.

3. Oszacowanie preferencji aminokwasowych

1. Obliczanie PWM
   1. Aby wygenerować PWM, użyj skryptu gen_pepspec_pwm.py zawartego w pakiecie Rosetta. Aby uruchomić ten skrypt, użyj następującego polecenia:
      
      gdzie:
      • IRF5.spec jest plikiem wyjściowym Pepspec wygenerowanym w kroku 2.2.
      • -1 wskazuje, że w sekwencji nie ma dodatkowych N-końcowych reszt, a zatem pozycje w PWM są oparte na 1.
      • 0,2 mówi skryptowi, aby brał pod uwagę tylko 20% najlepiej ocenianych peptydów z danych wyjściowych Pepspec (wartość domyślna to 0,1, co odpowiada 10%)
      • interface_score mówi skryptowi, aby uszeregował peptydy na podstawie wyniku interfejsu, który jest jednym z różnych wyników Rosetta zawartych w pliku wyjściowym Pepspec.
        UWAGA: Ten skrypt generuje dwa pliki wyjściowe, jeden dla obliczonego PWM (z sufiksem .pwm), a drugi dla sekwencji podzbioru peptydów używanych do obliczania PWM (z sufiksem .seq). Nazwy tych plików zawierają również wynik i frakcję peptydów użytych do uszeregowania. W tym przykładzie pliki te mają odpowiednio nazwy IRF5_interface_score_0.2.pwm i IRF5_interface_score_0.2.seq.
2. Generowanie logo sekwencji
   1. Przejdź do serwera WebLogo (https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)²¹ i kliknij przycisk Wybierz plik obok opcji Prześlij dane sekwencji. Prześlij plik z sekwencjami peptydowymi wygenerowanymi w kroku 3.1.1 (IRF5_interface_score_0.2.seq w tym przykładzie).
   2. Wybierz żądany format i rozmiar logo zgodnie z długością wejściową. W przykładzie użyto formatu PDF i rozmiaru 15 cm x 12 cm. Kliknij Utwórz logo.

Wyniki

W tym artykule opisaliśmy protokół do przewidywania preferencji aminokwasów na powierzchni wiążącej IRF5, członka rodziny czynników transkrypcyjnych znanych jako ludzkie czynniki regulacyjne interferonu. Białka te są regulatorami wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych oraz uczestniczą w różnicowaniu i aktywacji kilku komórek odpornościowych. Podjednostki IRF mają wysoce plastyczne i wielospecyficzne powierzchnie wiążące, zdolne do tworzenia homodimerów, heterodimerów i kompleksów z innymi białkami komórkowymi^17,18. Uważa się, że dimeryzacja jest pierwszym krokiem w aktywacji tych czynników, a u większości członków rodziny jest wywoływana przez fosforylację wielu reszt seryny/treoniny¹⁸. Podczas dimeryzacji każdy monomer oddziałuje z powierzchnią bidingową drugiego monomeru za pośrednictwem wysoce konserwatywnego motywu zwanego pLxIS, zlokalizowanego w kierunku C-końcowego obszaru ich sekwencji. Skrót pLxIS częściowo reprezentuje preferencje aminokwasowe powierzchni wiążącej, która kolejno rozpoznaje aminokwas polarny ("p"), po którym następują dwie pozycje z wysoką częstotliwością leucyny ("L") i izoleucyny ("I"), oddzielone pozycją zajmowaną przez dowolny aminokwas ("x"), a następnie fosforylowaną resztą seryny (Ser436 w tym przykładzie). Fosforylacja kilku reszt seryny, w tym motywu pLxIS, sprzyja zginaniu C-końcowego segmentu jednego monomeru i jego interakcji z powierzchnią wiążącą drugiego monomeru^19,22.

Opisany tutaj protokół rozpoczął się od struktury 3D dimeru IRF5 dimer¹⁹, w której jeden z monomerów był arbitralnie uważany za receptor w PPI, podczas gdy drugi był uważany za ligand zawierający motyw pLxIS. Aby lepiej zdefiniować segment liganda oddziałujący z miejscem wiązania receptora, przeprowadziliśmy obliczeniową mutagenezę skanowania alaniny (krok 1.2). Przewidywany segment składał się z 13 reszt aminokwasowych od pozycji 424 do 436, przy czym motyw pLxIS zaczynał się od Arg432. Struktura oryginalnego dimeru została następnie zredukowana do kompleksu peptydowo-białkowego, w którym sekwencja monomeru uważanego za ligand została przycięta do przewidywanego segmentu o najlepszej interakcji, podczas gdy drugi monomer pozostawiono nienaruszony (krok 1.3). Struktura ta została następnie wykorzystana jako dane wejściowe dla strategii dywersyfikacji sekwencji (sekcja 2), wyznaczając resztę leucyny motywu pLxIS (Leu433) jako kotwicę wymaganą przez Pepspec. W wyniku tego procesu powstało ponad 26 000 potencjalnych ligandów peptydowych. Ligandy o najwyższym potencjale 20% z najlepszymi wynikami energetycznymi (5 280) wykorzystano do oszacowania preferencji aminokwasowych powierzchni wiązania w postaci PWM (Rysunek 5A) i logo sekwencji (Rysunek 5B) (sekcja 3).

Rysunek 5: Preferencje aminokwasowe powierzchni wiążącej IRF3. (A) PWM wskazujące częstość występowania każdej reszty aminokwasowej (wierszy) na pozycję w sekwencji liganda peptydowego (kolumny). (B) Logo sekwencji wizualnie reprezentujące odpowiednie częstotliwości aminokwasów. Pozycje oryginalnej sekwencji IRF5 są pokazane w nawiasach pod każdą kolumną logo sekwencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W PWM każdy wiersz odpowiada określonej reszcie aminokwasowej, podczas gdy każda kolumna reprezentuje pozycję w sekwencji. Każda komórka macierzy zawiera względną częstotliwość każdego aminokwasu w tej pozycji, ważoną ogólnymi częstotliwościami tła. Logo sekwencji jest konstruowane poprzez ułożenie liter aminokwasów w taki sposób, aby całkowita wysokość stosu w każdej pozycji wskazywała na zachowanie całej sekwencji w tej pozycji. I odwrotnie, wysokość poszczególnych liter w stosie wskazuje na częstotliwość odpowiadającego im aminokwasu. W tym przykładzie zarówno PWM, jak i logo sekwencji są zgodne z wcześniejszą wiedzą dotyczącą powierzchni wiązania IRF5, z wyższą preferencją dla aminokwasu polarnego (glutaminianu) w pozycji 432 ("p") i bardzo wysoką preferencją dla leucyny i izoleucyny odpowiednio w pozycjach 433 i 435. Co ciekawe, przewidywano, że pozycje 427, 429 i 436 będą miały wyższą konserwację asparaginianu, mimo że były zajęte przez serynę w oryginalnej sekwencji IRF5. Odkrycie to dowodzi znaczenia fosforylacji tych pozycji dla tworzenia dimeru IRF5, ponieważ ładunek ujemny w łańcuchach bocznych asparaginianu i glutaminianu przypomina ładunek fosfoseryny. W rzeczywistości poprzednie badanie wykazało, że peptyd wabik o nazwie IRF5D, w którym te reszty seryny zostały zastąpione asparaginianem, był w stanie hamować aktywność IRF5²³. I odwrotnie, przewidywano, że pozycja 425 będzie miała bardzo wysoką preferencję dla seryny, co sugeruje, że reszta seryny w tej pozycji może uczestniczyć w PPI w swojej nieufosforylowanej formie. Rzeczywiście, wcześniej donoszono w przypadku innych IRF, że fosforylacja równoważnej reszty seryny negatywnie wpływa na dimeryzację i wiązanie z innymi koaktywatorami^16,24.

Dyskusja

W niniejszym artykule opisano protokół służący do oszacowania preferencji aminokwasowych potencjalnie wielospecyficznych miejsc wiązania w oparciu o dywersyfikację sekwencji in silico. Opracowano niewiele narzędzi obliczeniowych do oszacowania preferencji aminokwasowych granic faz białko-peptyd 14,25,26. Narzędzia te mają charakter predykcyjny, ale różnią się algorytmami obliczeniowymi używanymi do wykonywania ich przewidywań i poprawkami, które wdrażają w celu poprawy dokładności. W tej pracy wykorzystaliśmy aplikację Pepspec z zestawu¹⁴ do modelowania molekularnego Rosetta. Chociaż aplikacja ta jest zorientowana głównie na projektowanie peptydów, implementuje algorytm dywersyfikacji sekwencji, który można wykorzystać do przewidywania preferencji aminokwasów. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, to narzędzie jest jedynym obecnie dostępnym, które zapewnia wbudowany skrypt do obliczania PWM bezpośrednio na podstawie wyników dywersyfikacji sekwencji. Należy zauważyć, że protokół koncentruje się na IPP, dlatego oczekuje się, że początkowa struktura będzie kompleksem dwóch podjednostek białkowych. Przed właściwym etapem dywersyfikacji sekwencji białko uważane za ligand jest przycinane do segmentu, który ma oddziaływać z białkiem receptorowym, a następnie jest traktowane jako peptyd. Jednak protokół może być również stosowany do kompleksów białkowo-peptydowych, w scenariuszu, w którym kroki 1.1-1.3 mogą nie być wymagane. Na etapie przygotowania (sekcja 1) konieczne jest również skorygowanie nieprawidłowo sformatowanych reszt i heteroatomów, a także modelowanie segmentów złożonej struktury istotnych dla docelowego miejsca wiązania, których nie można było prawidłowo rozwiązać. Poprawki te zależą od konkretnej badanej struktury i nie były wymagane dla struktury użytej jako przykład w niniejszym dokumencie.

Najbardziej krytycznymi krokami tego protokołu są te wykonywane za pomocą aplikacji Rosetta, które obejmują wstępne przepakowanie łańcuchów bocznych za pomocą FixBB (krok 2.1) i właściwą dywersyfikację sekwencji za pomocą Pepspec (krok 2.2). Ten początkowy etap przepakowywania, zwany wstępnym pakowaniem, jest wyraźnie wymieniony jako wymagany przez autorów Pepspec¹⁴. Chociaż może to być wykonane przez Pepspec, autorzy tej aplikacji zdecydowanie zalecają korzystanie z aplikacji FixBB, która została specjalnie zaprojektowana do optymalizacji rotamerów łańcucha bocznego w stałych szkieletach białkowych. Na etapie dywersyfikacji sekwencji ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że aplikacja Pepspec jest zorientowana na projektowanie peptydów. W związku z tym domyślnie zgłasza kilku najlepiej ocenianych kandydatów na peptydy. Ponieważ celem przedstawionego tutaj protokołu jest wygenerowanie dużej liczby przypuszczalnych ligandów peptydowych, a nie kilku najlepiej punktowanych kandydatów, zmieniliśmy opcję "-pepspec:n_peptides" z 8 (domyślnie) na 200 (krok 2.2.1). Korzystając z tego ustawienia, Pepspec przewidział ponad 20 000 peptydów jako potencjalne ligandy. Ten zestaw przypuszczalnych peptydów zapewnił bardzo szeroki wgląd w krajobraz wiązania receptora, który następnie został pobrany pod kątem 20% najlepiej ocenianych peptydów w celu rzeczywistego oszacowania preferencji aminokwasów. Jeśli mniejsza liczba peptydów zostanie przekazana do "-pepspec:n_peptides", znacznie mniej kandydatów zostanie zaakceptowanych przez Pepspec. W tym scenariuszu próbkowanie zaproponowane w protokole może wychwycić wiele przypuszczalnych ligandów peptydowych o nieoptymalnych wynikach energetycznych, co potencjalnie może skutkować mniej wiarygodnymi szacunkami.

Jednym z głównych ograniczeń protokołu przedstawionego w tej pracy jest to, że opiera się on na wcześniejszej wiedzy na temat struktury białka zawierającego powierzchnię wiążącą. Jednak struktura ta niekoniecznie musi być określana doświadczalnie, ale może być modelowana ab initio lub przez modelowanie homologiczne¹⁴. Ponadto konieczna jest również znajomość trybu wiązania co najmniej jednej reszty aminokwasowej (kotwicy) ligandu peptydowego. Kotwica ta zostanie rozszerzona na określoną liczbę pozostałości za pomocą specjalnych opcji przedłużenia kotwicy firmy Pepspec w celu przeprowadzenia dywersyfikacji sekwencji. Jeżeli orientacja całego liganda w miejscu wiązania jest znana, jak ma to miejsce w przypadku reprezentatywnego przykładu tego badania, opcje związane z przedłużeniem kotwicy należy pozostawić jako domyślne (brak przedłużenia), chociaż reszta z peptydu musi być nadal określona jako kotwica, aby kierować algorytmem dywersyfikacji sekwencji. Aplikacja Pepspec nie obsługuje dokowania de novo możliwej pozostałości kotwicy, ale może wykorzystywać jako dane wejściowe dane wyjściowe innych aplikacji dokujących lub model homologicznego kompleksu białkowo-peptydowego do przeprowadzenia dokowania kotwicznego¹⁴; Chociaż te scenariusze wykraczają poza zakres tego artykułu.

Istotną wadą proponowanego protokołu jest jego nieodłączny predykcyjny charakter, na który bezpośredni wpływ ma rozdzielczość i dokładność początkowej struktury lub modelu kompleksu białko-białko. Jednak autorzy Pepspec stwierdzili, że dokładność tej aplikacji została znacznie poprawiona dzięki traktowaniu wejściowych współrzędnych szkieletowych jako zespołu struktur, a nie przy użyciu pojedynczej struktury białkowej i zastosowaniu normalizacji tła podczas obliczania PWM¹⁴. Co więcej, protokół stanowi alternatywę dla kłopotliwych i kosztownych metod eksperymentalnych do szacowania preferencji aminokwasów. Wszystkie te metody eksperymentalne opierają się na ocenie dużych bibliotek sekwencji uzyskanych przez wprowadzenie mutacji do sekwencji ligandów białkowych, a następnie na eksperymentalnej ocenie wpływu takich mutacji (patrz Bratulic i Badran¹² w celu zapoznania się z przeglądem). Protokoły obliczeniowe, takie jak ten zaproponowany w tej pracy, pozwalają na badanie przesiewowe tysięcy przypuszczalnych ligandów peptydowych w bardzo efektywny sposób, potencjalnie zapewniając bardziej niezawodny zestaw do szacowania preferencji aminokwasowych 13,14,25. Proponowany przez nas protokół można zastosować do każdego IPP, który można zredukować do granicy faz białko-peptyd. Ponadto protokół ten może służyć jako wstępna strategia identyfikacji mediatorów IPP, takich jak potencjalne aktywatory lub inhibitory. Zidentyfikowane mediatory mogą być dalej wykorzystywane do badania tych IPP w laboratorium lub mogą być oceniane jako potencjalne środki terapeutyczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BUDE Alanine Scan Server	Uniwersytet w Edynburgu	https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/	doi: 10.1021/acschembio.9b00560
Rosetta Modeling Software	Rosetta Commons	https://www.rosettacommons.org/software	doi: 10.1002/prot.22851
UCSF Chimera	Uniwersytet Kalifornijski San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	doi: 10.1002/ JCC.20084