Artykuł metodologiczny

Przebieg pracy do ilościowej oceny endofitycznych i epifitycznych mikrobiomów bakteryjnych kory Populus trichocarpa

DOI:

10.3791/66318

⸱

27 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia niezawodny i wydajny przepływ pracy od pobrania próbki do analizy danych w celu profilowania endofitycznych i epifitycznych mikrobiomów bakteryjnych obecnych w korze Populus trichocarpa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroorganizmy kolonizujące powierzchnie roślin i tkanki wewnętrzne mogą pełnić korzystne funkcje w promowaniu wzrostu i zdrowia roślin. Jednak informacje na temat mikrobiomu tkanek kory roślin drzewiastych pozostają ograniczone, zwłaszcza w odniesieniu do endofitycznej i epifitycznej mikrobioty bakteryjnej kory Populus. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy proces ilościowego określania składu i różnorodności endofitycznej i epifitycznej mikroflory bakteryjnej kolonizującej korę Populus trichocarpa. Krótko mówiąc, naskórek łodygi P. trichocarpa był wielokrotnie przecierany wacikiem zanurzonym w 0,1% Tween 20 w celu uzyskania próbek bakterii epifitycznych. Pozbawiony naskórka został wysterylizowany, a następnie wielokrotnie zamrożony i rozdrobniony odpowiednio za pomocą ciekłego azotu i ubijaka do kulek w celu pobrania próbek bakterii endofitycznych. Genomowe DNA wyekstrahowano ze zbiorowisk bakterii epifitycznych przylegających do bawełny i pokruszonej kory P. trichocarpa, a następnie poddano amplifikacji w reakcji łańcuchowej pejmerazy (PCR) za pomocą starterów ukierunkowanych na hiperzmienne regiony V5-V7 i V4 bakteryjnego genu 16S rRNA. Trzy powtórzenia otrzymanych produktów PCR z każdej próbki endofitycznej lub epifitycznej zmieszano w równych stężeniach w celu zbudowania biblioteki amplikonów, którą następnie zsekwencjonowano. Uzyskane sekwencje analizowano za pomocą splicingu sekwencji, filtrowania jakościowego, usuwania chimer i adnotacji taksonomicznych. Podsumowując, stworzyliśmy niezawodny i wydajny przepływ pracy od pobrania próbki do analizy danych w celu określenia endofitycznych i epifitycznych mikrobiomów bakteryjnych kory P. trichocarpa poprzez profilowanie genu 16S rRNA. Wraz z metodami badania mikrobioty kolonizującej korę ustalonymi w poprzednim badaniu, nasza metodologia może służyć jako wzór do projektowania protokołów badania mikrobiomu kory innych gatunków roślin drzewiastych, szczególnie ważnych gospodarczo drzew leśnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kora to najbardziej zewnętrzna warstwa łodyg roślin drzewiastych, odnosząca się do wszystkich tkanek poza kambium naczyniowym, w tym łyka i perydermy1,2. Szeroko zakrojone badania wykazały, że kora odgrywa kluczową rolę w translokacji wody i węglowodanów, ochronie drzew przed pożarem i uszkodzeniami mechanicznymi3 oraz adaptacji do abiotic4i stresów biotycznych5. Co ważniejsze, jako interfejs między drzewem a otaczającym powietrzem, kora służy również jako unikalne siedlisko dla mikroorganizmów6. Warto zauważyć, że potwierdzono, że mikroorganizmy związane z korą pełnią funkcje wspomagające wzrost gospodarza7, pomagając drzewom w pozyskiwaniu składników odżywczych8, zwiększając syntezę hormonów roślinnych9, oraz chroniąc gospodarzy przed infekcją fitopatogenami5. Jednak znacznie mniej uwagi poświęcono społecznościom mikrobiologicznym kolonizującym korę w porównaniu z mikrobiotą fyllosfery i ryzopshere10,11. Istnieje ograniczona wiedza na temat biologicznych cech mikrobiomu kory drzew. Celem niniejszej pracy metodologicznej jest dostarczenie badaczom zestawu protokołów do opisu różnorodności i składu endofitycznego i epifitycznego mikrobiomu bakteryjnego kory roślin drzewiastych.

Na podstawie opublikowanych metod badania mikrobioty kory12,13w tej pracy zaprojektowaliśmy i przetestowaliśmy skomplikowany przepływ pracy oparty na analizie sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA, aby zbadać mikrobiom bakteryjny osadzający wewnętrzne tkanki lub powierzchnie kory łodygi Populus trichocarpa, ważnego organizmu modelowego używanego w biologii roślin drzewiastych14. P. trichocarpa charakteryzuje się szybkim wzrostem15, względną łatwością manipulacji eksperymentalnej16 i łatwą transformacją genetyczną, a także, znany z szerokiego zastosowania w produkcji drewna17. W szczególności metoda zaproponowana w niniejszej pracy rozpoczyna się od szczegółowego opisu pobierania próbek endofitycznej i epifitycznej mikrobioty kory łodygi P. trichocarpa. Wraz z włączeniem etapu sterylizacji powierzchniowej kory alkoholem i podchlorynem sodu po zebraniu mikrobiomu kolonizującego powierzchnię, badanie to ustaliło procedurę jednoczesnego i oddzielnego zbierania mikroorganizmów znajdujących się w wewnętrznej strukturze kory (endofity) i tych żyjących na zewnętrznej powierzchni kory (epifity). Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, wśród opublikowanych badań nad mikrobiomem kory roślin drzewiastych nie przeprowadzono testów na zbiorowiskach drobnoustrojów endofitycznych i epifitycznych zebranych z tej samej próbki kory w oparciu o wyraźne rozróżnienie między wewnętrznymi i zewnętrznymi niszami kory18,19,20. Tym samym opracowana w ramach tych badań metoda umożliwi naukowcom precyzyjne i kompleksowe zbadanie różnorodności i składu zbiorowisk bakteryjnych zasiedlających korę. Ponadto badanie to zawiera szczegółowe opisy procedur ekstrakcji genomowego DNA, amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), przygotowania biblioteki sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA21 oraz analizy danych sekwencjonowania. W szczególności w badaniu tym wykorzystano parę starterów ukierunkowanych na hiperzmienne regiony V5-V7 bakteryjnego genu 16S rRNA w celu zmniejszenia niespecyficznej amplifikacji sekwencji mitochondrialnych i chloroplastowych roślin żywicielskich22, co dało bezstronne profile mikrobiomu związanego z korą. Różnorodność α oceniono za pomocą indeksu Shannona23, popularnego wskaźnika różnorodności szeroko stosowanego w badaniach ekologii, a skład taksonomiczny na poziomie gromady został obliczony i zwizualizowany w Quantitative Insights in Microbial Ecology (QIIME) 24i R software25. Wraz z metodami badania mikrobioty kolonizującej korę ustalonymi w poprzednim badaniu 1,6, nasza metodologia może służyć jako wzór do projektowania protokołów badania mikrobiomu kory innych gatunków roślin drzewiastych, w szczególności ważnych gospodarczo drzew leśnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.Pobieranie próbek

  1. Wyrośnij 3-miesięcznego P. Sadzonki trichocarpa w komorze wzrostowej (21–25°C; 16-godzinny cykl świetlny/8-godzinny cykl ciemny z dodatkowym światłem około 300 μEm−2 s−1 z trzypasmowej liniowej lampy fluorescencyjnej [T5 28 W 6400 K]; i wilgotności 60–80%)26.
  2. Odetnij 10-centymetrowe segmenty łodygi P. trichocarpa od 2–12 cm nad wysterylizowaną powierzchnią gleby (Rysunek 1A) za pomocą wysterylizowanego sekatora. Umieść segmenty łodygi na wysterylizowanej kwadratowej szalce Petriego (13 cm x 13 cm).
    UWAGA: Do tego badania wybrano sześć drzew tej samej wielkości, z których trzy użyto do amplifikacji PCR z każdym zestawem starterów.

2. Przetwarzanie próbek

  1. Kilkakrotnie przetrzyj naskórek łodygi na wysterylizowanej kwadratowej szalce Petriego za pomocą sterylnego wacika nasączonego 0,1% Tween 20, aby skuteczniej zbierać mikroorganizmy kolonizujące powierzchnię kory (Rysunek 1B).
    UWAGA: Sterylne bawełny o niskiej wilgotności służą do zbierania mikroorganizmów przylegających do powierzchni łodygi. Nie używaj bawełny, która jest zbyt sucha lub zbyt mokra do wycierania powierzchni łodygi. Tween 20 to środek powierzchniowo czynny zdolny do zmniejszania napięcia powierzchniowego, co jest korzystne dla uzyskiwania większej liczby próbek drobnoustrojów z powierzchni roślin27,28.
  2. Odetnij bawełnianą końcówkę od wacika za pomocą sterylnego ostrza i umieść każdą bawełnianą końcówkę zawierającą epifityczne próbki drobnoustrojów w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Po wytarciu powierzchni łodygi rozetnij korę, z której pobrano próbki mikroorganizmów epifitycznych za pomocą sterylnego skalpela, oderwij korę i umieść ją na kwadratowej szalce Petriego.
  4. Korę oderwaną od łodygi w kroku 2.3 pokrój na około 1 cm segmenty (Rysunek 1C) za pomocą sterylnego skalpela.
  5. Wysterylizuj segmenty, mocząc je w 70% (v/v) alkoholu przez 2 minuty. Następnie namocz segmenty w podchlorynie sodu (2,5% efektywnej zawartości chloru) uzupełnionym 0,1% Tween 80 przez 5 minut.
  6. Sterylizuj segmenty otrzymane w kroku 2.5 przez 30 s w 70% (v/v) alkoholu29. Następnie umyj wszystkie próbki trzykrotnie sterylną wodą destylowaną i umieść je na czystej ławce do wysuszenia na powietrzu.
    UWAGA: Próbki kory są mieszane tam iz powrotem za pomocą sterylnej pęsety, aby zapewnić wystarczającą sterylizację powierzchni.
  7. Przechowywać każdy wysterylizowany powierzchniowo segment kory łodygi (próbki endofityczne) w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml w temperaturze -80 °C.

3. Ekstrakcja genomowego DNA

  1. Wykonaj następujące kroki, aby poddać próbki wstępnej obróbce do ekstrakcji DNA.
    1. Umieść wysterylizowane powierzchniowo segmenty kory łodygi uzyskane w kroku 2.7 w sterylnych twardych probówkach o pojemności 5 ml i dodaj trzy wysterylizowane stalowe koraliki (4 mm) do każdej probówki.
      UWAGA: Wykonaj ten krok na czystej stole, aby zapobiec skażeniu mikrobiologicznemu. Waciki przygotowane w kroku 2.2 (próbki epifityczne) nie muszą być wstępnie przetwarzane i są bezpośrednio wykorzystywane do ekstrakcji genomowego DNA.
    2. Twarde probówki zawierające próbki należy zamrozić w ciekłym azocie na 10 minut.
    3. Miażdż próbki kory przez 5 minut za pomocą ubijaka do koralików. Następnie ponownie zamroź twardą rurkę w ciekłym azocie na 1 minutę i powtórz etap ubijania koralików przez 5 minut.
  2. Ekstrakcja genomowego DNA.
    UWAGA: Użyj komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, aby wyizolować genomowe DNA z próbek endofitycznych i epifitycznych.
    1. Dodaj pokruszoną korę łodygi P. Trichocarpa i przylegające do bawełny epifityczne zbiorowiska bakterii (po 0,25 g każda) do każdej z rurek z kulkami. Następnie dodać 60 μl roztworu C1 dostarczonego w zestawie i delikatnie wymieszać przez odwrócenie.
    2. Następnie homogenizuj próbki endofityczne i epifityczne za pomocą ubijaka do kulek w czterech 1-minutowych przebiegach. Po każdym cyklu należy umieścić próbki na lodzie na 30 sekund.
    3. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 1 minutę.
    4. Ekstrahować próbki endofityczne i epifityczne za pomocą zestawu (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Dodać 30 μl roztworu C6 do środka białej membrany filtracyjnej i inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 minut.
    6. Wirować przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 min.

4. Amplifikacja PCR

  1. Standaryzuj stężenie wyekstrahowanego DNA.
    1. Zmierzyć stężenia genomowego DNA wyekstrahowanego z próbek epifitycznych i endofitycznych za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
    2. Rozcieńczyć każdą próbkę DNA sterylnym ddH2O do 2 ng/μl, aby uzyskać matrycę DNA do amplifikacji PCR.
  2. Amplifikuj te próbki DNA.
    1. Amplifikuj region V5–V7 bakteryjnego genu 16S rRNA za pomocą startera do przodu 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') i startera odwrotnego 1193R (5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3') 10. Amplifikuj region V4 bakteryjnego genu 16S rRNA za pomocą startera do przodu 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') i startera odwrotnego 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30.
      UWAGA: Genomowe DNA wyekstrahowane z każdej próbki jest wykorzystywane jako matryca dla każdej z potrójnych reakcji amplifikacji PCR, a dodatkowa reakcja niezawierająca DNA jest ustawiana jako kontrola ujemna. Dla każdej próbki objętość mieszaniny reakcyjnej PCR wynosi 25 μl. W przypadku pary starterów 799F/1193R każda reakcja zawiera 12 μl wody PCR, 1 μl każdego ze starterów F/R (10 μM), 1 μl matrycy DNA i 10 μl roztworu mieszającego. W przypadku pary starterów 515F/806R każda reakcja zawiera 12 μl wody PCR, 1 μl każdego ze starterów F/R (10 μM), 1 μl matrycy DNA i 10 μl roztworu mieszającego. Reakcje PCR z parą starterów 799F/1193R przeprowadza się w następujących warunkach cyklu: początkowa denaturacja w temperaturze 98 °C przez 5 minut, 25 cykli w temperaturze 98 °C przez 30 s, 53 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s oraz końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Reakcje PCR z parą starterów 515F/806R przeprowadza się w następujących warunkach cyklu: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 45 s, 50 °C przez 60 s i 72 °C przez 90 s i końcowe przedłużenie przez 10 minut w temperaturze 72 °C.
    2. Dokładnie wymieszaj każdą próbkę i odwiruj, aby wyeliminować pęcherzyki.
    3. Wykonaj amplifikację regionu V5–V7 lub V4 bakteryjnych genów 16S rRNA na termocyklerze.
  3. Wykryj wzmocnione produkty.
    1. Załaduj 5 μl każdego amplikonu na 1% żel agarozowy i wykonuj elektroforezę pod napięciem 120 V przez 30 minut.
    2. Zobacz żel w świetle UV, aby potwierdzić pomyślną amplifikację PCR. Rozmiary produktów PCR otrzymanych z parami starterów 799F/1193R i 515F/806R powinny wynosić odpowiednio około 430 pz i 400 pz.

5. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania amplikonów

  1. Wymieszać amplifikowane produkty i określić ich stężenia.
    1. Wymieszać produkty uzyskane z trzech powtórzeń amplifikacji PCR dla każdej próbki w probówce do PCR.
    2. Dodać 5 μl produktów PCR i 195 μl roztworu roboczego do dołka z 96-dołkową mikropłytką zgodnie z instrukcjami producenta zestawu (patrz tabela materiałów). Następnie dodać 10 μl wzorcowego DNA (odczynniki DNA o stężeniach 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 i 100 ng/μl z zestawu) i 190 μl roztworu roboczego do studzienki na tej samej mikropłytce. Po wykonaniu tego kroku określ intensywność fluorescencji produktów PCR i standardowego DNA.
    3. Pomiar fluorescencji za pomocą czytnika mikropłytek.
      UWAGA: Wzbudzenie/emisja standardowych długości fal fluoresceiny jest ustawiona na 480/530 nm w celu zmierzenia ilości dwuniciowego DNA w każdej próbce.
    4. Ustalić krzywą wzorcową stężeń DNA i intensywności fluorescencji, stosując wzorcowe stężenia DNA w wzorcowych roztworach DNA (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 i 100 ng/μl) oraz intensywność fluorescencji każdego z wzorcowych roztworów DNA. Zastąp wartość intensywności fluorescencji każdego z produktów PCR krzywą wzorcową, aby obliczyć stężenia DNA w produktach PCR.
  2. Zbuduj biblioteki sekwencjonowania amplikonów.
    1. Zgodnie ze stężeniami wykrytymi w kroku 5.1.4, wymieszaj pozostałe produkty PCR amplifikowane tą samą parą starterów w równych stężeniach, aby zbudować bibliotekę sekwencjonowania amplikonów.
      UWAGA: Frakcja produktów PCR w każdej próbce użytej do ilościowego określenia stężenia dwuniciowego DNA poprzez pomiar intensywności fluorescencji nie jest zawarta w bibliotece sekwencjonowania amplikonów, która jest zbudowana z pozostałych produktów PCR tej samej próbki.
  3. Wykonaj ekstrakcję żelu.
    1. Przeprowadź elektroforezę w żelu agarozowym za pomocą aparatury do elektroforezy. Krótko przygotuj 1,3% żel agarozowy (tj. 1,3 g proszku agarozy w 100 ml 1 x bufor TAE).
      UWAGA: Należy zadbać o to, aby ilość studzienek w żelu była wystarczająca do utrzymania każdego produktu PCR i drabinki DNA; w tym badaniu 1,3% żel agarozowy przygotowuje się przez rozpuszczenie 1,3 g proszku agarozy w 100 ml 1 x buforu TAE.
    2. Usuń grzebienie po zestaleniu żelu i umieść żel w zbiorniku do elektroforezy z 1 x buforem TAE. Następnie dodaj 1 jednostkę objętości 6 x pomarańczowy bufor ładujący do 5 jednostek objętości każdego produktu PCR, przy czym 100 μl tego ostatniego należy umieścić w każdym dołku. Dodać 30 μl drabinki DNA do jednego dołka. Po podłączeniu przewodu dodatniego i ujemnego należy wykonać elektroforezę pod napięciem 80 V przez 50 min.
      UWAGA: W tym badaniu ekstrakcja żelu jest stosowana do oczyszczania biblioteki sekwencjonowania amplikonów reprezentowanej przez pasmo 400 pz lub 430 pz amplifikowane odpowiednio parą starterów 515F/806R lub 799F/1193R.
    3. Wyciąć fragmenty DNA z żelu agarozowego za pomocą czystego, ostrego skalpela.
    4. Zważ plasterek żelu i przenieś go do bezbarwnej tubki. Dodaj bufor, aby zanurzyć plasterek żelu.
      UWAGA: Maksymalna ilość żelu na kolumnę wirową wynosi 400 mg. Trzy jednostki objętości buforu dodaje się do jednej jednostki objętości danego plastra żelu.
    5. Wykonaj ekstrakcję żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Bibliotekę amplikonów skonstruowaną z produktów PCR ukierunkowanych na bakteryjny gen 16S rRNA używany do sekwencjonowania społeczności bakterii endofitycznych i epifitycznych uzyskuje się tą metodą.
  4. Potwierdź jakość oczyszczonej biblioteki sekwencjonowania amplikonów.
    1. Określić stężenie dwuniciowego DNA w oczyszczonej bibliotece sekwencjonowania amplikonów uzyskanej w kroku 5.3.5 za pomocą fluorometru przy użyciu zestawu komercyjnego (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta (Rysunek 2).
    2. Określić docelowy rozmiar fragmentu DNA w bibliotece sekwencjonowania amplikonów uzyskanej w kroku 5.3.5 przy użyciu systemu analizy kontroli jakości kwasów nukleinowych z dostępnymi na rynku chipami i zestawami (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Upewnij się, że rozmiar fragmentu mieści się w oczekiwanym zakresie i że w bibliotece sekwencjonowania amplikonów nie ma dimerów starterów.
    3. Określić efektywne stężenie biblioteki sekwencjonowania uzyskanej w kroku 5.3.5, stosując ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) z zestawem komercyjnym (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
    4. Rozcieńczyć bibliotekę sekwencjonowania amplikonów, aby osiągnąć stężenie obciążenia zalecane dla platformy sekwencjonowania.

6. Przetwarzanie sekwencji i analiza statystyczna

  1. Po sekwencjonowaniu biblioteki amplikonów uzyskanej w kroku 5.4.4 przy użyciu platformy sekwencjonowania (patrz Tabela materiałów)31. Utwórz folder o nazwie emp-paired-end-sequences w katalogu roboczym, a następnie zapisz skompresowany plik sekwencjonowania w formacie fastq w tym folderze. Następnie otwórz Ubuntu i aktywuj środowisko conda oraz Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2)(v2021.2)32.
  2. Napisz plik mapowania i zapisz go jako plik tekstowy. Zawartość pliku przedstawiono w tabeli 2.
  3. Podziel dane sekwencjonowania uzyskane za pomocą biblioteki sekwencjonowania amplicon i usuń startery z danych sekwencjonowania za pomocą pliku mapowania.
    1. Użyj następującego polecenia, aby podzielić dane sekwencjonowania: time qiime demux emp-paired --m-plik-kodów-kreskowych Mapping_file.txt --m-kolumna-kodów-kreskowych Sekwencja kodów kreskowych --p-rev-comp-mapping-kody kreskowe --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. Użyj następującego polecenia, aby usunąć startery: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F lub 515F --p-front-r 1193R lub 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. Przesiewaj i usuwaj wszelkie chimery za pomocą DADA2 pipeline33. Grupuj przefiltrowane sekwencje w warianty sekwencji amplikonów (ASV) z 99% podobieństwem.
    1. Użyj następującego polecenia, aby przesiać i usunąć sekwencje chimer i klastrów do ASV: czas qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. Twórz adnotacje taksonomiczne przy użyciu bazy danych SILVA (v138) na podstawie sekwencji referencyjnych34.
    1. Użyj następującego polecenia, aby dodać adnotacje do ASV uzyskanych w kroku 6.4: time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. Utwórz tabelę ASV w QIIME2 (wersja 2021.2) przy użyciu następujących poleceń:
    qiime narzędzia export --input-path tabela.qza --output-path eksportowana-tabela-funkcji
    qiime narzędzia export --ścieżka-wejściowa taksonomia.qza --ścieżka-wyjściowa eksportowana-feature_table
    biom add-metadata -i tabela-funkcji.biom -o tabela.womd.biom --metadata-fp taksonomia.tsv --nagłówek-obserwacji OTUID, taksonomia --sc-oddzielona taksonomia
    biom convert -i tabela.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --klucz-nagłówka taksonomia
    UWAGA: Te polecenia generują tabelę zawierającą liczbę odczytów wszystkich ASV dla każdej próbki.
  7. Obliczyć liczbę ASV i odczytów zbiorowisk bakterii endofitycznych i epifitycznych wygenerowanych odpowiednio za pomocą par starterów 799F/1193R i 515F/806R.
    1. Obliczyć łączną liczbę ASV mających ≥ odczyt 1 na poziomach odpowiednio gromady, klasy, rzędu, rodziny i rodzaju w każdej próbce w tabeli ASV otrzymanej w kroku 6.6 przez zliczanie.
    2. Obliczyć łączną liczbę odczytów w każdej próbce na podstawie sumy liczby odczytów wszystkich ASV w tabeli ASV uzyskanej w kroku 6.6 przez zliczanie.
    3. Obliczyć liczbę odczytów roślin w każdej próbce, korzystając z liczby odczytów ASV oznaczonych jako chloroplasty lub mitochondria w tabeli ASV uzyskanej w kroku 6.6 przez zliczanie.
    4. Oblicz liczbę odczytów bakteryjnych w każdej próbce, korzystając z następującego wzoru:
      Liczba odczytów bakteryjnych = Liczba całkowitych odczytów − Liczba odczytów roślin.
    5. Oblicz i zwizualizuj średnią liczbę ASV (odpowiednio na poziomie typu, klasy, rzędu, rodziny i rodzaju) lub odczytów (łącznie lub odpowiednio roślin i bakterii) społeczności bakterii endofitycznych i epifitycznych wygenerowanych przez pary starterów 799F/1193R i 515F/806R przy użyciu oprogramowania Excel (2019) i Prism (v8.0).
    6. Oceń znaczenie różnic między liczbą ASV (odpowiednio na poziomie typu, klasy, rzędu, rodziny i rodzaju) lub odczytami (łącznie lub odpowiednio roślin i bakterii) wygenerowanych za pomocą par starterów 799F/1193R i 515F/806R przy użyciu testu t-Studenta w oprogramowaniu Prism (v8.0).
  8. Przefiltruj odczyty oznaczone adnotacjami jako chloroplasty i mitochondria za pomocą następującego polecenia: time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taksonomia taksonomia.qza --p-exclude mitochondria, chloroplast --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
  9. Utwórz drzewo filogenetyczne za pomocą następującego polecenia: czas qiime filogeneza align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. Oblicz i zwizualizuj rozmaitości alfa reprezentowane przez indeks Shannona społeczności bakterii endofitycznych i epifitycznych przy użyciu pakietu QIIME2 (v2021.2) i "ggplot2" w R (v4.0.5)35.
    1. Użyj następującego polecenia, aby obliczyć rozmaitości alfa: czas qiime różnorodność core-metrics-phylogenetic --i-filogeneza rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-samplingling-depth najniższa odczytana wartość spośród wszystkich próbek --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. Oblicz względną liczebność populacji na poziomie gromady zbiorowisk bakterii endofitycznych i epifitycznych. Wygeneruj plik w formacie qzv o nazwie "taxa-bar-plots" za pomocą następującego polecenia QIIME2 (v2021.2): time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. Otwórz plik taxa-bar-plots.qzv online pod adresem https://view.qiime2.org/. Pobierz i zapisz nowo wygenerowany plik z poziomu 2. Oblicz obfitość względną według następującego wzoru z R (v4.0.5):
      Względna liczebność każdej gromady bakterii (%) = (liczba odczytów każdej gromady bakterii w każdej próbce / liczba całkowitych odczytów każdej próbki) x 100 %.
      Wizualizuj dane przy użyciu pakietów ggplot2, RColorBrewer, reshape i ggalluvial w języku R (wersja 4.0.5).
  12. Przeanalizuj znaczenie różnicy między względną liczebnością każdej z dominujących typów (zdefiniowanych jako gromada o względnej liczebności > 0,5%) w endofitycznych i epifitycznych społecznościach bakteryjnych sekwencjonowanych parą starterów 799F/1193R, używając jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Tukeya na poziomie istotności 0,05 w oprogramowaniu STAMP36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokiej jakości genomowe DNA endofitycznych i epifitycznych mikrobiomów bakteryjnych kory P. Trichocarpa uzyskano przy użyciu zoptymalizowanego protokołu (Tabela 1). Amplifikacja PCR wszystkich 12 próbek dała pojedyncze silne prążki o odpowiednim rozmiarze (Ryc. 3). Obie pary starterów 799F/1193R i 515F/806R z powodzeniem amplifikowały produkty docelowe z próbek tkanek kory endofitycznych lub epifitycznych odpowiednio przy około 40...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowany na podstawie opublikowanej metodologii badania mikrobioty kory 7,18, proponowany przez nas przepływ pracy zapewnia ogólne wskazówki dotyczące identyfikacji i charakterystyki endofitycznych i epifitycznych mikrobiomów kory roślin drzewiastych. Metoda ta obejmuje protokoły pobierania i przetwarzania próbek, ekstrakcji genomowego DNA, amplifikacji PCR, przygotowania bibliotek sekwencjonowania amplikonów oraz analizy danych sekwencjonowania, służąc jako po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Panu Davidowi Anthony'emu Athertonowi za dostarczenie narracji wideo oraz członkom laboratorium B.N. za cenne rady. Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauki Chin (grant nr 32071741 [dla BN]), Kluczowe projekty planu badawczo-rozwojowego w regionie autonomicznym Sinciang-Ujgur (numer grantu 2022B02014), Plan Wprowadzenia "Talenty Tianchi" (dla BN), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (numer grantu 2021YFD2200203 [do GQ]) oraz Projekt Innowacyjny Państwowego Kluczowego Laboratorium Genetyki i Hodowli Drzew (Northeast Forestry University) (numer grantu 2019A01 [do BN]).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wyposażenie:
Ubijak do koralikówDHS Wirówkado 401265
do probówek 1,5 mlThermo Scientific75002440
Wirówka do probówek PCR Czytnik
mikropłytekBioTek8040528
NanodropDHS Life Science & Technologia Co., Sp. z o.o.2010/2020 Spektrofotometr mikroobjętościowy
Fluorometr kubitowy 3.0 Fluorometr invitrogenQ33216 
Lodówka(-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
T100 TermocyklerBio-Rad1861096termocykler
Tanon EPS-600 TanonA-179047-2313Do elektroforezy
LabChip GX Touch HTPerkinElmer CLS138625Biblioteka wykrywania dystrybucji fragmentów DNA, analiza kontroli jakości kwasów nukleinowych
Applied Biosystems QuantStudio 12KApplied Biosystems4485694Biblioteka kwantyfikacji
Illumina Novaseq6000Illumina Sekwencjonowanie biblioteki
Materiały:
RękawiceDowolna
10 i mu; LAxygenTF-300-R-S
końcówka bariery aerozolowej 20μ LAxygenTF-20-R-S
końcówka bariery aerozolowej 200μ LAxygenTF-200-R-S
wywrotka barierowa aerozolowa 1000μ LAxygenTF-1000-R-S
1,5 mlAxygenMCT-150-C
Corning 96-dołkowa/przezroczysta płaska płytka do mikropłytekCorning3631
bawełniany patyczekZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitQIAGEN 12888-100Do ekstrakcji DNA
bezenzymatyczna probówka wirówkowa 1,5 mlUSA SCIENTIFIC1415-2600
etanolTianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited64-17-5
twarde probówki (5 ml)DHS Life Science0401261-17
Hot Master Mix Quanta Bio2200400
probówka do mikrowirówek 2,0 mlAxygenMCT-200-C-S
PCR WodaQIAGEN 17000-10
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu QIAGEN28704Do ekstrakcji żelu
Zestawy testowe Quant-iT dsDNA, szeroki zakresInvitrogenQ33130Do oznaczania stężenia amplifikowanych produktów i oczyszczonych bibliotek amplikonów
kwadratowa szalka PetriegoChangde Bkman Biotechnology Co., Ltd110301014
koraliki staloweShangyu Yixin Ball Industry Co., Ltd.
roztwór podchlorynu soduTianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd 7681-52-9
Tween 20Studio Biotechnologiczne Nachuan9005-64-5
Zestaw odczynników High Sens z podwójnym protokołem DNAPerkinElmerCLS760672
Zestaw kwantyfikacyjny biblioteki VAHTS dla IlluminaVazyme Biotech Co., LtdBiblioteka kwantyfikacjiNQ104
nauk przyrodniczych końcówka bariery aerozolowej NA Probówka wirówkowa YXB36985

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aguirre-Von-Wobeser, E., Alonso-Sanchez, A., Mendez-Bravo, A., Villanueva Espino, L. A., Reverchon, F. Barks from avocado trees of different geographic locations have consistent microbial communities. Archs Microbiol. 203 (7), 4593-4607 (2021).
  2. Konopka, B., Pajtik, J., Seben, V., Merganicova, K. Modeling bark thickness and bark biomass on stems of four broadleaved tree species. Plants (Basel). 11 (9), 1148(2022).
  3. Rosell, J. A. Bark in woody plants: Understanding the diversity of a multifunctional structure. Integr Comp Biol. 59 (3), 535-547 (2019).
  4. Kobayashi, K., Aoyagi, H. Microbial community structure analysis inacer palmatumbark and isolation of novel bacteria IAD-21 of the candidate division FBP. PeerJ. 7, e7876(2019).
  5. Pellitier, P. T., Zak, D. R., Salley, S. O. Environmental filtering structures fungal endophyte communities in tree bark. Mol Ecol. 28 (23), 5188-5198 (2019).
  6. Dreyling, L., Schmitt, I., Dal Grande, F. Tree size drives diversity and community structure of microbial communities on the bark of beech (fagus sylvatica). Front For Glob Change. 5, 858382(2022).
  7. Jo, Y., et al. Changes in microbial community structure in response to gummosis in peach tree bark. Plants (Basel). 11 (21), 2834(2022).
  8. Dong, C., et al. core microbiota, and function of the rhizosphere soil and bark microbiota in Eucommia ulmoides. Front Microbiol. 13, 855317(2022).
  9. Bodenhausen, N., Bortfeld-Miller, M., Ackermann, M., Vorholt, J. A. A synthetic community approach reveals plant genotypes affecting the phyllosphere microbiota. PLoS Genet. 10 (4), e1004283(2014).
  10. Bodenhausen, N., Horton, M. W., Bergelson, J. Bacterial communities associated with the leaves and the roots of Arabidopsis thaliana. PLoS One. 8 (2), e52369(2013).
  11. Stone, B. W. G., Weingarten, E. A., Jackson, C. R. The Role of the phyllosphere microbiome in plant health and function. Annual plant reviews. 1, 1-24 (2018).
  12. Lambais, M. R., Lucheta, A. R., Crowley, D. E. Bacterial community assemblages associated with the phyllosphere, dermosphere, and rhizosphere of tree species of the atlantic forest are host taxon dependent. Microb. Ecol. 68 (3), 567-574 (2014).
  13. Arrigoni, E., Antonielli, L., Pindo, M., Pertot, I., Perazzolli, M. Tissue age and plant genotype affect the microbiota of apple and pear bark. Microbiol Res. 211, 57-68 (2018).
  14. Germain, H., Séguin, A. Innate immunity: Has poplar made its bed. New Phytol. 189 (3), 678-687 (2011).
  15. Varnagirytė-Kabašinskienė, I., et al. Evaluation of shoot collection timing and hormonal treatment on seedling rooting and growth in four poplar genomic groups. Forests. 15 (9), (2024).
  16. Lu, S., et al. Ptr-mir397a is a negative regulator of laccase genes affecting lignin content in Populus trichocarpa. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (26), 10848-10853 (2013).
  17. Krabel, D., et al. Early root and aboveground biomass development of hybrid poplars (populus spp.) under drought conditions. Can J For Res. 45 (10), 1289-1298 (2015).
  18. Vitulo, N., et al. Bark and grape microbiome of vitis vinifera: Influence of geographic patterns and agronomic management on bacterial diversity. Front Microbiol. 9, 3203(2018).
  19. Aschenbrenner, I. A., Cernava, T., Erlacher, A., Berg, G., Grube, M. Differential sharing and distinct co-occurrence networks among spatially close bacterial microbiota of bark, mosses and lichens. Mol Ecol. 26 (10), 2826-2838 (2017).
  20. Liang, X., Wan, D., Tan, L., Liu, H. Dynamic changes of endophytic bacteria in the bark and leaves of medicinal plant eucommia ulmoides in different seasons. Microbiol Res. 280, 127567(2024).
  21. De Muinck, E. J., Trosvik, P., Gilfillan, G. D., Hov, J. R., Sundaram, A. Y. M. A novel ultra high-throughput 16s rRNA gene amplicon sequencing library preparation method for the illumina Hiseq platform. Microbiome. 5 (1), 68(2017).
  22. Anguita-Maeso, M., Haro, C., Navas-Cortes, J. A., Landa, B. B. Primer choice and xylem-microbiome-extraction method are important determinants in assessing xylem bacterial community in olive trees. Plants (Basel). 11 (10), 1320(2022).
  23. Wang, C., Liu, D. W., Bai, E. Decreasing soil microbial diversity is associated with decreasing microbial biomass under nitrogen addition. Soil Biol Biochem. 120, 126-133 (2018).
  24. Almeida, A., Mitchell, A. L., Tarkowska, A., Finn, R. D. Benchmarking taxonomic assignments based on 16s rRNA gene profiling of the microbiota from commonly sampled environments. GigaScience. 7 (5), giy54(2018).
  25. Liland, K. H., Vinje, H., Snipen, L. Microclass: An R-package for 16s taxonomy classification. BMC Bioinform. 18 (1), 172(2017).
  26. Li, S., et al. The AREb1 transcription factor influences histone acetylation to regulate drought responses and tolerance in Populus trichocarpa. Plant Cell. 31 (3), 663-686 (2019).
  27. Cregger, M. A., et al. The Populus holobiont: Dissecting the effects of plant niches and genotype on the microbiome. Microbiome. 6 (1), 31(2018).
  28. Maria Rodríguez, J. O., Ziani, K., Maté, J. I. Combined effect of plasticizers and surfactants on the physical properties of starch based edible films. Food Res Int. 39 (8), 840-846 (2006).
  29. Beckers, B., De Beeck, M. O., Weyens, N., Boerjan, W., Vangronsveld, J. Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees. Microbiome. 5 (1), 25(2017).
  30. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16s rrna diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 4516-4522 (2011).
  31. Mcpherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments. J Vis Exp. 24 (137), e57932(2018).
  32. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  33. Callahan, B. J., et al. Dada2: High-resolution sample inference from illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  34. Pruesse, E., et al. A comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Res. 35 (21), 7188-7196 (2007).
  35. Ginestet, C. Ggplot2: Elegant graphics for data analysis. J R Stat Soc Ser A Stat Soc. 174, 245-245 (2011).
  36. Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. Stamp: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinform. 30 (21), 3123-3124 (2014).
  37. Holmes, S. P., McMurdie, P. J., Callahan, B. J. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. 11, 2639-2643 (2017).
  38. Chernov, T. I., Tkhakakhova, A. K., Kutovaya, O. V. Assessment of diversity indices for the characterization of the soil prokaryotic community by metagenomic analysis. Eurasian Soil Sci. 48 (4), 410-415 (2015).
  39. Li Yu, X., Hu, X. Y., Wang, X. X., Zhang, X. Y., Du, K. B. A protocol specialized for microbial DNA extraction from living poplar wood. Not Bot Horti Agrobot Cluj Napoca. 50 (4), (2022).
  40. Jeffrey, L. C., et al. Bark-dwelling methanotrophic bacteria decrease methane emissions from trees. Nat Commun. 12 (1), 2127(2021).
  41. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of zea mays l. Microb Ecol. 41 (3), 252-263 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrobiom korybakterie endofitycznebakterie epifitycznesekwencjonowanie 16S rRNAekstrakcja DNAamplifikacja PCRbiblioteka amplikon welektroforeza w elu agarozowymr norodno mikrobiologiczna

Powiązane artykuły