Artykuł metodologiczny

Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66381

⸱

16 lutego 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Rytmy okołodobowe, które istnieją w większości organizmów, regulują czasową organizację organoidów biologicznych processes. 3D ostatnio pojawiły się jako fizjologicznie istotny model in vitro. Protokół ten opisuje zastosowanie bioluminescencyjnych reporterów do obserwacji rytmów okołodobowych w organoidach, umożliwiając badania in vitro rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych.

Streszczenie

Większość organizmów żyjących posiada rytmy okołodobowe, które są procesami biologicznymi, które zachodzą w ciągu około 24 godzin i regulują różnorodny repertuar procesów komórkowych i fizjologicznych, począwszy od cykli snu i czuwania, a skończywszy na metabolizmie. Ten mechanizm zegarowy obciąża organizm w oparciu o zmiany środowiskowe i koordynuje czasową regulację zdarzeń molekularnych i fizjologicznych. Wcześniej wykazano, że autonomiczne rytmy okołodobowe są utrzymywane nawet na poziomie pojedynczej komórki za pomocą linii komórkowych, takich jak fibroblasty NIH3T3, które odegrały zasadniczą rolę w odkryciu mechanizmów rytmów okołodobowych. Jednak te linie komórkowe są jednorodnymi kulturami, którym brakuje wielokomórkowości i silnej komunikacji międzykomórkowej. W ciągu ostatniej dekady przeprowadzono szeroko zakrojone prace nad opracowaniem, charakteryzacją i zastosowaniem organoidów 3D, które są wielokomórkowymi układami in vitro, które przypominają struktury i funkcje morfologiczne in vivo. W pracy opisano protokół wykrywania rytmów okołodobowych za pomocą bioluminescencyjnego reportera w enteroidach jelitowych człowieka, który umożliwia badanie rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych in vitro.

Wprowadzenie

Zegar okołodobowy
Wszystkie organizmy, od bakterii po ssaki, mają złożoną i dynamiczną relację ze swoim środowiskiem. W ramach tej relacji adaptacja do zmian środowiskowych ma kluczowe znaczenie dla przetrwania organizmów. Większość organizmów posiada rytmy okołodobowe, które umożliwiają im dostosowanie i optymalizację ich funkcji do cykli dobowych trwających około 24 godzin. Zegar okołodobowy to hierarchiczna sieć zegarów centralnych i peryferyjnych, które współpracują ze sobą, aby utrzymać fizjologiczną homeostazę i synchronizować organizmy z codziennymi zmianami1,2. U ssaków centralny lub główny zegar znajdujący się w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) odbiera zewnętrzne sygnały, takie jak światło, i przekazuje informacje do zegarów peryferyjnych poprzez zaawansowaną interakcję neuronalnych i humoralnych ścieżek sygnałowych3. Oprócz zegara centralnego, tkanki obwodowe posiadają własny, autonomiczny mechanizm zegara okołodobowego, utrzymywany przez transkrypcyjno-translacyjną pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego (TTFL) regulującą specyficzne tkankowo geny kontrolowane zegarem (CCG)4,5. Ta molekularna maszyneria wytwarza około 24-godzinną rytmiczność w zdarzeniach komórkowych i fizjologicznych, takich jak ekspresja genów, szlaki sygnałowe, odpowiedzi immunologiczne i trawienie. Zegar okołodobowy jest obecny w prawie wszystkich komórkach ssaków i wykazano, że do 50% wzorców ekspresji genów wykazuje rytmiczność okołodobową6. Biorąc pod uwagę obfitość CCG, zakłócenie tego mechanizmu zegara może skutkować krytycznymi problemami fizjologicznymi. W związku z tym badania nad rytmami okołodobowymi są niezbędne do wyjaśnienia podstawowych mechanizmów biologicznych i opracowania nowych strategii terapeutycznych.

system reporterów lucyferazy
W badaniach okołodobowych monitorowanie w czasie rzeczywistym ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia zachowań i reakcji komórek, ponieważ umożliwia śledzenie czasowych zmian w ekspresji genów i/lub poziomach białek, zapewniając wgląd w mechanizmy molekularne regulowane przez zegar okołodobowy. Co więcej, monitorowanie w czasie rzeczywistym umożliwia naukowcom badanie wpływu zmian środowiskowych na mechanizmy molekularne7,8. Istnieje wiele technik monitorowania badań w czasie rzeczywistym, w tym test bioluminescencji, który jest szeroko stosowany do śledzenia ekspresji genów lub poziomów białek w czasie. Test bioluminescencji to metoda wykrywania procesów biologicznych wykorzystująca produkcję światła jako odczyt. W tym teście enzym oksydacyjny, który wytwarza bioluminescencję (np. lucyferaza), jest przejściowo lub stabilnie transfekowany do komórek będących przedmiotem zainteresowania, a odczyt bioluminescencji jest mierzony w obecności substratu (np. lucyferyny) w czasie. Na przykład enzym lucyferazy wytwarza bioluminescencję poprzez utlenianie substratu lucyferyny w obecności ATP9. Ze względu na krótki okres półtrwania, 3-4 h10, lucyferazy świetlików jest potężnym narzędziem do badań okołodobowych pod względem zapewnienia dynamicznego monitorowania w czasie rzeczywistym przy minimalnym szumie tła11,12,13. W przypadku insercji DNA za pomocą promotora znakowanego lucyferazą lub otwartej ramki odczytu (ORF), system dostarczania genów lentiwirusowych jest niezawodną metodą, która zapewnia wysoką skuteczność transdukcji, stabilną integrację i niską immunogenność. Stabilna transdukcja bioluminescencyjnego reportera zapewnia solidną ekspresję w dzielących się i niedzielących się komórkach, generując spójne dane dla badań okołodobowych14.

Organoid jako model<br /> Tradycyjne, unieśmiertelnione dwuwymiarowe linie komórkowe odegrały zasadniczą rolę w badaniach biologicznych, począwszy od odkrywania podstawowych mechanizmów molekularnych rytmów okołodobowych, a skończywszy na badaniach przesiewowych leków. Pomimo wygody wykorzystania homogenizowanych linii komórkowych, brakuje im struktur wielokomórkowych i interakcji międzykomórkowych. W przeciwieństwie do tego, organoidy są in vitro 3D wielokomórkowymi strukturami "podobnymi do narządów", które naśladują strukturę narządów w naczyniu, wykazując podobieństwo do architektury tkanek in vivo i wielokomórkowości, w tym komórek macierzystych, progenitorowych i zróżnicowanych15,16. Posiadanie cech samoorganizacji, wielokomórkowości i funkcjonalności sprawia, że organoidy są niezwykłym modelem in vitro reprezentującym procesy komórkowe i fizjologiczne zachodzące w prawdziwych tkankach17. Różne rodzaje organoidów mogą być pozyskiwane z pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez ukierunkowane różnicowanie lub dorosłe komórki macierzyste pobrane z różnych narządów, w tym z jelita cienkiego, mózgu, wątroby, płuc i nerek18,19. Ponieważ struktury organoidowe mają rzeczywistą strukturę i funkcję podobną do tkanki, z wielokomórkowością i dynamiczną interakcją między komórkami, są lepsze od homogenizowanych linii komórkowych w zrozumieniu zdarzeń komórkowych zachodzących w tkankach in vivo. Organoidy są również łatwe w manipulacji i mogą być hodowane w kontrolowanych warunkach, co czyni je przydatnymi do badań okołodobowych20.

Głównym celem tej pracy jest wprowadzenie metody monitorowania w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem testu bioluminescencyjnego specjalnie dostosowanego do badania rytmów okołodobowych w wielokomórkowych organoidach 3D. Monitorowanie zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym przy użyciu techniki testu bioluminescencyjnego jest szeroko stosowane w hodowlach komórkowych pozbawionych złożoności wielokomórkowej i komunikacji międzykomórkowej, które istnieją w prawdziwych tkankach. Organoidy 3D stwarzają unikalne możliwości badania funkcji rytmów okołodobowych w systemach wielokomórkowych in vitro. Na przykład, można badać rytmy okołodobowe w organoidach ze zmienionym składem komórkowym lub organoidami pochodzącymi z chorych tkanek pacjentów. Protokół ten umożliwia wykorzystanie testu bioluminescencji do zbadania różnych aspektów rytmów okołodobowych w bardziej fizjologicznie istotnym modelu in vitro, organoidach, co pomoże nam lepiej zrozumieć rolę rytmów okołodobowych w narządach obwodowych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z użyciem tkanek ludzkich do generowania HIE zostały zatwierdzone przez IRB w CCHMC (IRB#2014-0427). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów użytych w niniejszym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

UWAGA: Aby zilustrować procedurę opisaną w tym protokole, użyliśmy ludzkich enteroidów jelitowych Bmal1-luc (HIEs). Te enteroidy przeszły stabilną transdukcję lentiwirusową22 z plazmidem reporterowym pABpuro-BluF, który zawiera promotor Bmal1 połączony z lucyferazy, wykazując aktywność promotora Bmal121.

1. Transdukcja lentiwirusowa

  1. Przeprowadzić transdukcję lentiwirusową 22 w warunkach wzbogaconych komórkami macierzystymi dla HIEs. W szczególności należy zapewnić tworzenie się sferoid w HIE w ciągu 3-4 dni po przejściu w pożywce wzrostowej jelita, co stwarza warunki wzbogacone w komórki macierzyste.
  2. Po transdukcji lentiwirusowej 22, przeprowadź selekcję antybiotyków z 2 μg / ml puromycyny, odzyskaj HIE oporne na puromycynę i przeprowadź je ze stosunkowo dużą gęstością (tj. 1 studnia do 2 dołków) przez 2-3x. Jeśli tempo wzrostu HIE jest powolne, dodaj 10 μM inhibitorów ROCK (Y-27632) i 10 μM inhibitora GSK-3 (CHIR-99021) do pożywki wzrostowej organoidów jelitowych.

2. Przygotowanie organoidów do testu bioluminescencyjnego

  1. Dzień 1: Przejście HIE do okrągłych szalek o średnicy 35 mm.
    1. Krótko mówiąc, w celu ekspansji HIEs, wymieszaj HIE z matrycą hodowli 3D o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) i wysiewaj je na 24-dołkowe płytki z trzema kropelkami po 10 μl matrycy hodowlanej 3D na studzienkę. Dodać 350 μl pożywki HIE i zmieniać ją co drugi dzień.
      UWAGA: Gęstość HIE w matrycy hodowli 3D ma kluczowe znaczenie dla wzrostu enteroidów. W przybliżeniu liczba sferoid powinna przekraczać więcej niż 50 w każdej kropli. Jeśli liczba ta jest niska, ma to negatywny wpływ na tempo wzrostu HIE.
    2. Gdy HIE wystarczająco urosną (około 7 dni po pasażu), zbierz HIE z czterech dołków do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    3. Umyj HIE zimnym PBS za pomocą mini wirówki stołowej (2 000 × g) przez 40 s szybkiego wirowania, aby usunąć zanieczyszczenia i nadmiar matrycy hodowlanej 3D za pomocą pipety.
    4. Dodaj 0,5 ml zimnego PBS do granulki i zastosuj turbulencje fizyczne, strzykając do 10 razy strzykawką insulinową o pojemności 1 ml w celu dysocjacji HIEs.
    5. Odwirować zdysocjowane HIE za pomocą miniwirówki stołowej, jak w kroku 2.1.3, i delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Następnie umieść probówkę do mikrowirówki z granulkami HIE na lodzie, aby ostygła przez około 3 minuty.
    6. Dodaj matrycę hodowlaną GFR 3D do probówki mikrowirówki i wymieszaj ją z HIE pellet.
      UWAGA: Oblicz ilość matrycy hodowli 3D na podstawie liczby okrągłych naczyń o średnicy 35 mm, które zostaną użyte w eksperymencie. Zazwyczaj wysiewamy 30 μl kropelek matrycy hodowlanej 3D na okrągłe naczynie.
    7. Wysiewać mieszaninę HIE i matrycę kultur 3D na środku okrągłej płytki o średnicy 35 mm i inkubować szalkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu zestalenia matrycy kultur 3D.
      UWAGA: Gęstość wysiewu HIE należy określić doświadczalnie. Na podstawie intensywności bioluminescencji można określić liczbę HIE podczas tego procesu.
    8. Dodaj 2 ml podgrzanej pożywki wzrostowej organoidów jelitowych do każdego naczynia i inkubuj naczynia w inkubatorze CO2 do następnego kroku.
  2. Dzień 3: Inicjacja różnicowania
    1. Aby zainicjować różnicowanie HIEs, należy usunąć pożywkę wzrostową i dodać 2 ml podgrzanej pożywki różnicującej.
      UWAGA: W Tabeli 1 znajdują się przepisy dotyczące podłoża różnicującego HIE23.
  3. Dzień 4: Nie jest wymagany żaden dodatkowy proces.
  4. Dzień 5: Zastąp pożywkę enteroidów 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej.
  5. Dzień 6: Synchronizacja zegara i rejestracja bioluminescencji
    1. Aby zsynchronizować zegar molekularny enteroidów, dodaj 2 μl 100 μM deksametazonu (Dex), aby uzyskać końcowe stężenie 100 nM w każdym naczyniu, a następnie inkubuj szalki w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2) przez 1 h24.
    2. Podczas resetowania Dex przygotuj inkubacyjny luminometr. Sprawdź CO2 i temperaturę luminometru inkubującego i ustaw odpowiednio na 5% i 37 °C.
      UWAGA: Zaleca się przetarcie wnętrza inkubacyjnego luminometru 70% alkoholem przed i po każdym użyciu urządzenia, aby zachować jego sterylność.
    3. Po synchronizacji zegara uzupełnij enteroidy 3 ml podgrzanej pożywki różnicującej zawierającej 200 μM D-lucyferyny.
      UWAGA: Ponieważ lucyferyna jest wrażliwa na światło, pożywkę zawierającą lucyferynę należy owinąć folią i wstępnie podgrzać w łaźni grzewczej o temperaturze 37 °C przed nałożeniem jej na naczynie.
    4. Umieścić naczynia w 8-dołkowym stole do naczyń inkubującego luminometru i przykryć stół z naczyniami na próbki pokrywką. Umieść dwie komory nawilżacza z mokrą chusteczką lub gąbką na stole z naczyniami na próbki. Jest to proces jednorazowy.
      UWAGA: Po rozpoczęciu eksperymentu pokrywę inkubującego luminometru należy trzymać zamkniętą do momentu zakończenia eksperymentu. Upewnij się, że chusteczki / gąbki są wystarczająco mokre.
    5. Zamknij pokrywę urządzenia i zainicjuj program pomiaru bioluminescencji przez żądaną liczbę dni i rozdzielczość.
      1. W oprogramowaniu wybierz ustawienia warunku, klikając zakładkę Warunek i dostosuj ustawienia na tym panelu: liczbę naczyń, czas pomiaru, przetwarzanie w tle i typ filtra.
        UWAGA: Do tej demonstracji wybraliśmy wszystkie naczynia od A do H; domyślny czas pomiaru, który jest określany przez oprogramowanie na podstawie liczby naczyń; czas oczekiwania na przetwarzanie w tle i typ filtru F0. Ponieważ istnieją trzy opcje filtrów, jednocześnie można mierzyć trzy kolory luminescencyjne.
      2. Po wprowadzeniu wszystkich odpowiednich ustawień na podstawie eksperymentu zapisz ustawienia, klikając przycisk OK.
      3. Aby rozpocząć przeprowadzanie eksperymentu, kliknij kartę Uruchom | Przycisk Start (ikona zielonego trójkąta). Obserwuj dane jako niesurowe, przefiltrowane szumami lub zdetrendowane, dokonując odpowiednich wyborów w górnej części ekranu oprogramowania podczas przeprowadzania eksperymentów. Kliknij zakładki Raw, Filtrowane szumy lub Detrended, aby obserwować wybrane dane.
      4. Obserwuj sygnały przez maksymalnie 5 dni.
        UWAGA: Po 5 dniach monitorowania w inkubacyjnym luminometrze enteroidy mogą zacząć obumierać z powodu wyczerpania pożywki. Aby zapobiec ewentualnym zakłóceniom rytmu dobowego podczas eksperymentu, nie wykonujemy zmiany pożywki na czas trwania eksperymentu.
      5. Na końcu eksperymentu zatrzymaj przebieg, klikając przycisk Zatrzymaj (niebieska kwadratowa ikona), przejdź do karty Plik i kliknij pozycję Zapisz jako. Zapisz dane w formacie Kronos; wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w sekcji Plik, klikając opcję Plik, a następnie wybierając opcję Eksportuj jako format programu Excel w obszarze Plik w celu dalszej analizy.

Wyniki

Rejestrację bioluminescencji przeprowadzono w celu oceny rytmiki okołodobowej ludzkich enteroidów jelitowych (HIEs) w dwóch różnych warunkach: w warunkach wzbogaconych w komórki macierzyste przy użyciu pożywki do wzrostu organoidów jelitowych (Rysunek 3) oraz w warunkach indukujących różnicowanie, osiągniętych poprzez zastąpienie pożywki do wzrostu organoidów jelitowych pożywką różnicującą. W dniu eksperymentu zsynchronizowano zegary okołodobowe, stosując 1-godzinną inkubację z 100 nM deksametazony. Następnie zastąpiono pożywkę 3 mL pożywki do wzrostu organoidów jelitowych lub pożywki różnicującej, uzupełnionej o 200 µM D-lucyferyny, i rozpoczęto monitorowanie aktywności bioluminescencyjnej. Po okresie rejestracji trwającym 4-5 dni przeprowadzono analizę szybkiej transformaty Fouriera (FFT), aby określić okres obserwowanych rytmów okołodobowych. Rysunek 3 przedstawia dynamikę czasową aktywności promotora Bmal1 w wyżej wymienionych warunkach. W warunkach różnicowania bioluminescencja Bmal1-luc wykazywała silne oscylacje okołodobowe ze średnią okresowością 22,92 h. W przeciwieństwie do tego, HIEs w warunkach wzbogaconych w komórki macierzyste wykazywały zaburzone rytmy okołodobowe (Rysunek 3). Dane te wskazują, że HIEs w warunkach wzbogaconych w komórki macierzyste nie wykazują silnych oscylacji okołodobowych. Innymi słowy, przed badaniem funkcji organoidów zależnych od zegara okołodobowego należy ocenić wpływ warunków hodowli na rytmy okołodobowe.

Metoda różnicowania enteroidów; etapy z pomiarem luminescencji; schemat przedstawiający układ eksperymentalny.
Rysunek 1: Schematyczny rysunek protokołu. HIE są pasażowane do naczyń 35 mm w dniu 1. i hodowane w 2 mL pożywki wzrostowej do dnia 3. W trzecim dniu po pasażu pożywkę zastępuje się 2 mL podgrzanej pożywki różnicującej, aby zainicjować różnicowanie enteroidów. W dniu 5. powtarza się wymianę pożywki na 2 mL podgrzanej pożywki, aby zapobiec wyczerpaniu składników odżywczych. W dniu 6. enteroidy są traktowane 100 nM deksametazonem przez 1 h w celu synchronizacji zegara okołodobowego. Po godzinie pożywkę zastępuje się 3 mL pożywki zawierającej 200 µM D-lucyferyny, a naczynia umieszcza się w inkubującym lumnometrze. Po rejestrowaniu ekspresji bioluminescencji przez 4-5 dni eksperyment zostaje zakończony, a wygenerowane dane eksportowane są do arkuszy kalkulacyjnych w celu dalszej analizy. Skrót: HIE = ludzki enteroid jelitowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia, sferoidy hodowlane komórek, obraz mikroskopowy, wzrost komórek, analiza morfologii.
Rysunek 2: Reprezentatywny obraz HIE w pożywce wzrostowej. Obraz wykonano za pomocą mikroskopu szerokopolowego z obiektywem 25x. Pasek skali = 1 mm. Skrót: HIE = ludzki enteroid jelitowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza różnicowania komórek macierzystych, wykresy oscylacji Bmal1:luc, serie czasowe, wyniki statystyczne.
Rysunek 3: Rejestracje bioluminescencji z HIE w warunkach wzbogaconych w komórki macierzyste oraz w warunkach różnicowania. (A) Surowe i (B) odtrendowane dane z rejestracji bioluminescencji HIE Bmal1-luc w warunkach wzbogaconych w komórki macierzyste (czerwony) oraz w warunkach różnicowania (czarny). (C) Okres oscylacji Bmal1-luc w HIE w warunkach różnicowania. Okres obliczono za pomocą analizy FFT; n = 3 dla HIE Bmal1-luc w warunkach wzbogaconych w komórki macierzyste i n = 4 dla HIE Bmal1-luc w warunkach różnicowania. Słupki błędu oznaczają SD. Skróty: HIE = ludzki enteroid jelitowy; FFT = szybka transformata Fouriera. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Składy pożywek różnicujących
Nazwa odczynnikaFirmaNumer katalogowyStężenie końcoweKomentarze
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028Dodać jako ostatni składnik. W przypadku przygotowania 50 ml pożywki, po dodaniu wszystkich pozostałych składników, dopełnić objętość do 50 ml za pomocą Advanced DMEM/F12.
A 83-01Sigma AldrichSML0788500 nM
Suplement B-27 (50x)Gibco17504-0441x
Gastryna I ludzkaSigma AldrichG902010 nM
GlutaMAXGibco350500611x
HEPESGibco1563008010 mM
Suplement N-2 (100x)Gibco17502-0481x
N-acetyl-L-cysteinaSigma AldrichA91651 mM
pożywka warunkowana NOGGIN5%Wykonane w laboratorium
penicylina-streptomycynaGibco15140122100 J/ml
Rekombinowany mysi EGFPeproTech315-0950 ng/mL
Pożywka warunkowana R-SPONDIN10%Opracowane w laboratorium

Tabela 1: Skład pośrodków różnicowania HIE23.

Dyskusja

Test bioluminescencji oferuje kilka korzyści w badaniu rytmów okołodobowych, co wymaga zbierania danych z długoterminowych eksperymentów w czasie. Po pierwsze, umożliwia naukowcom monitorowanie ekspresji genów lub białka będącego przedmiotem zainteresowania w miarę ruchu i namnażania się komórek. Bez dokonywania niepotrzebnych korekt lub zakłócania funkcji komórek, zainteresowane zdarzenia komórkowe lub ekspresja genów mogą być rejestrowane za pomocą odczytu bioluminescencji, który dostarcza wiarygodnych danych w czasie rzeczywistym. Co ważne, test bioluminescencji generuje minimalny szum tła w porównaniu z testami fluorescencyjnymi, ponieważ jest wykonywany w ciągłej ciemności25. Ponadto test bioluminescencyjny jest preferowany do długoterminowego monitorowania, ponieważ ciągłe wzbudzenie do testu fluorescencji przez kilka dni może powodować wysoką fototoksyczność i fotowybielanie. Jednak ze względu na brak wzbudzenia świetlnego, test bioluminescencji zapewnia ciemniejszy sygnał niż białka fluorescencyjne26. Krótki okres półtrwania lucyferazy sprawia, że jest ona preferowana w badaniach okołodobowych i może być dodatkowo skrócona, dodając dodatkowe sekwencje destabilizujące12.

Pomimo kilku zalet w monitorowaniu żywych komórek, testy bioluminescencyjne mają pewne ograniczenia. Chociaż test bioluminescencji zapewnia solidny odczyt dla czasowej ekspresji genów lub monitorowania białek z populacji komórek, jego rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona, co czyni go mniej wykonalnym w eksperymentach zbierających dane o lokalizacji białek z pojedynczych komórek. Biorąc pod uwagę zalety i wady, test bioluminescencji jest lepszy od innych metod, zwłaszcza w badaniach okołodobowych; Oferuje mniejszą toksyczność i wysoką czułość, dzięki czemu idealnie nadaje się do długotrwałego monitorowania.

Podczas fazy przygotowania doświadczalnego należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych czynników. Przede wszystkim kluczowe znaczenie ma wdrożenie odpowiedniej strategii selekcji do transdukcji lentiwirusowej; w naszym przypadku przeprowadziliśmy selekcję puromycyny w dawce 2 μg/ml przez 2 tygodnie. Niewłaściwe przeprowadzenie selekcji może skutkować niewystarczającą liczbą enteroidów zawierających plazmid reporterowy, co skutkuje niespójnymi poziomami ekspresji lucyferazy. Równie ważna jest optymalna gęstość wysiewu; Nadmierna gęstość może powodować przedwczesne wyczerpanie składników odżywczych podczas eksperymentu, ponieważ po rozpoczęciu zapisu bioluminescencyjnego nie dochodzi do wymiany pożywki. I odwrotnie, niska gęstość HIE może skutkować zmniejszoną wydajnością bioluminescencji, wpływając w ten sposób na niezawodność odczytu. Zapewnienie odpowiedniego środowiska dla enteroidów podczas monitorowania ma zasadnicze znaczenie dla wiarygodności wyników eksperymentalnych. Utrzymanie optymalnych warunków, w tym poziomu CO2 , temperatury i wilgotności, ma kluczowe znaczenie dla utrzymania HIE, promując odporność procesów komórkowych w enteroidach. Odchylenia od optymalnej temperatury i poziomu CO2 mogą wpływać na metabolizm komórkowy i szlaki sygnałowe, potencjalnie wpływając na rytmy okołodobowe. Równie ważny jest odpowiedni poziom wilgotności, zapobiegający wysuszeniu i utrzymujący integralność strukturalną enteroidów. W związku z tym skrupulatne zwracanie uwagi na warunki środowiskowe ma kluczowe znaczenie dla dokładności modelu eksperymentalnego i badań okołodobowych z udziałem enteroidów.

Synchronizacja zegara jest niezbędna w badaniach okołodobowych, ponieważ wyrównuje wewnętrzny zegar okołodobowy poszczególnych komórek, zapewniając, że są one w stanie zjednoczonym i skoordynowanym. Synchronizacja ta jest niezbędna do precyzyjnej obserwacji i analizy rytmiki okołodobowej na poziomie całej kultury. W tym protokole przeprowadziliśmy synchronizację zegara z deksametazonem 100 nM (Dex). Mogą istnieć pewne obawy dotyczące wpływu Dex na strukturę lub funkcję komórki. Wcześniejsze badania sugerują, że kortykosteroidy wzmacniają funkcję bariery nabłonkowej w enteroidach27. Należy jednak podkreślić, że fenotyp ten obserwuje się po leczeniu enteroidów 10 μM prednizolonem przez 12 godzin. Spodziewamy się, że krótkotrwała, trwająca 1 godzinę kuracja deksametazonem nie wywoła istotnych zmian w odniesieniu do struktury i funkcji komórek w enteroidach.

Monitorowanie aktywności bioluminescencyjnej hodowli organoidów zamiast homologicznej hodowli jednokomórkowej ma wyjątkowe zalety. Po pierwsze, wiele typów komórek oddziałuje ze sobą w hodowli organoidów, tak jak w tkance in vivo , podczas gdy typowa hodowla komórkowa 2D monitoruje interesującą ekspresję genów w rodzaju izolowanego środowiska składającego się z jednego typu komórki. Hodowla organoidów zapewnia bardziej realistyczne wyniki w przypadku interakcji wielokomórkowych i szlaków sygnałowych. Interakcja międzykomórkowa ma kluczowe znaczenie, szczególnie w przypadku badań różnicowania i szlaków międzykomórkowych, które wymagają heterogenicznej hodowli komórek28. Nasze wyniki wskazują, że HIE w stanie zróżnicowanym wykazują silne oscylacje okołodobowe, ale zakłócone rytmy okołodobowe w stanie wzbogaconym w komórki macierzyste. Dane te sugerują potencjalną przebudowę mechanizmu zegara okołodobowego z dorosłych komórek macierzystych na komórki zróżnicowane. Podsumowując, organoidy z okołodobowym bioluminescencyjnym reporterem umożliwiają badanie rytmów okołodobowych w wielokomórkowym systemie in vitro , odkrywając funkcje rytmów okołodobowych w bardziej fizjologicznie istotny sposób.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ludzkie enteroidy jelitowe zostały uzyskane z laboratorium dr Michaela Helmratha w Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Prace te były wspierane przez R01 DK11005 (CIH) oraz University of Cincinnati Cancer Center Pilot Funding. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie w zakresie obrazowania ze strony University of Cincinnati Live Microscopy Core (NIH S10OD030402).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
35 x 10 Naczynia do hodowli tkankowych FalconFisher Scientific08-772A
A 83-01Sigma AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028
Suplement B-27 (50x)Gibco17504-044
Strzykawki do insuliny Micro-Fine IVFisher Scientific14-829-1BbProducent: BD 329424
CHIR99021Cayman Chemical13122Inhibitor GSK-3
DeksametazonSigma AldrichD4902-500MG
D-Lucyferyna (sól potasowa)Cayman Chemical14681
Gastrin I LudzkaSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibco35050061
Zredukowany czynnik wzrostu (GFR) MatrigelCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)Stemcell Technologies06010składa się z ludzkiego podłoża podstawowego IntestiCult OGM, 50 ml i suplementu organoidowego, 50 ml. Wymieszaj oba w stosunku 1:1 do użycia jako pożywka do wzrostu organoidów jelitowych
Luminometr Kronos DioATTO CorporationAB-2550
Suplement N-2 (100x)Gibco17502-048
N-acetylo-L-cysteinaSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF plazmid reporterowyAddgene46824
PBS bez wapnia i magnezuCorning21-040-CV
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
Rekombinowana mysia EGFPeproTech315-09
Y-27632R& Inhibitor D Systems1254/10ROCK

Bibliografia

  1. Cox, K. H., Takahashi, J. S. Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism. J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).
  2. Ayyar, V. S., Sukumaran, S. Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions. J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).
  3. Reppert, S., Weaver, D. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  4. Takahashi, J. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).
  5. Wolff, C. A., et al. Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice. Cell Rep. 42 (1), 111982(2023).
  6. Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Trans Med. 10 (458), 8806(2018).
  7. Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions. STAR Protoc. 2 (2), 100416(2021).
  8. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).
  9. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).
  10. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).
  11. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters. J Vis Exp. (67), e4234(2012).
  12. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  13. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  14. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  15. Lee, S., Hong, C. I. Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments. Front Genet. 13, 874288(2022).
  16. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  17. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  19. Rosselot, A. E., et al. Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids. EMBO J. 41 (2), 106973(2021).
  20. Corrò, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).
  21. Brown, S. A., et al. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLos Biol. 3 (10), e338(2005).
  22. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. J Vis Exp. (98), e52531(2015).
  23. Criss, Z. K., et al. Drivers of transcriptional variance in human intestinal epithelial organoids. Physiol Genomics. 53 (11), 486-508 (2021).
  24. Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput Biol. 2 (10), e136(2006).
  25. Hara-Miyauchi, C., et al. Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior. Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).
  26. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
  27. Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease. J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).
  28. AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment. Clin Transll Med. 11 (2), 308(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rytmy oko odoboweludzkie enteroidy jelitowemodel organoidalnyr nicowanie kom rek macierzystychsynchronizacja zegara molekularnegomacierz hodowli 3Dtest bioluminescencyjnyanaliza transformaty Fouriera
Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.