Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66381

⸱

16 lutego 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Rytmy okołodobowe, które istnieją w większości organizmów, regulują czasową organizację organoidów biologicznych processes. 3D ostatnio pojawiły się jako fizjologicznie istotny model in vitro. Protokół ten opisuje zastosowanie bioluminescencyjnych reporterów do obserwacji rytmów okołodobowych w organoidach, umożliwiając badania in vitro rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych.

Streszczenie

Większość organizmów żyjących posiada rytmy okołodobowe, które są procesami biologicznymi, które zachodzą w ciągu około 24 godzin i regulują różnorodny repertuar procesów komórkowych i fizjologicznych, począwszy od cykli snu i czuwania, a skończywszy na metabolizmie. Ten mechanizm zegarowy obciąża organizm w oparciu o zmiany środowiskowe i koordynuje czasową regulację zdarzeń molekularnych i fizjologicznych. Wcześniej wykazano, że autonomiczne rytmy okołodobowe są utrzymywane nawet na poziomie pojedynczej komórki za pomocą linii komórkowych, takich jak fibroblasty NIH3T3, które odegrały zasadniczą rolę w odkryciu mechanizmów rytmów okołodobowych. Jednak te linie komórkowe są jednorodnymi kulturami, którym brakuje wielokomórkowości i silnej komunikacji międzykomórkowej. W ciągu ostatniej dekady przeprowadzono szeroko zakrojone prace nad opracowaniem, charakteryzacją i zastosowaniem organoidów 3D, które są wielokomórkowymi układami in vitro, które przypominają struktury i funkcje morfologiczne in vivo. W pracy opisano protokół wykrywania rytmów okołodobowych za pomocą bioluminescencyjnego reportera w enteroidach jelitowych człowieka, który umożliwia badanie rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych in vitro.

Wprowadzenie

Zegar okołodobowy
Wszystkie organizmy, od bakterii po ssaki, mają złożoną i dynamiczną relację ze swoim środowiskiem. W ramach tej relacji adaptacja do zmian środowiskowych ma kluczowe znaczenie dla przetrwania organizmów. Większość organizmów posiada rytmy okołodobowe, które umożliwiają im dostosowanie i optymalizację ich funkcji do cykli dobowych trwających około 24 godzin. Zegar okołodobowy to hierarchiczna sieć zegarów centralnych i peryferyjnych, które współpracują ze sobą, aby utrzymać fizjologiczną homeostazę i synchronizować organizmy z codziennymi zmianami1,2. U ssaków centralny lub główny zegar znajdujący się w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) odbiera zewnętrzne sygnały, takie jak światło, i przekazuje informacje do zegarów peryferyjnych poprzez zaawansowaną interakcję neuronalnych i humoralnych ścieżek sygnałowych3. Oprócz zegara centralnego, tkanki obwodowe posiadają własny, autonomiczny mechanizm zegara okołodobowego, utrzymywany przez transkrypcyjno-translacyjną pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego (TTFL) regulującą specyficzne tkankowo geny kontrolowane zegarem (CCG)4,5. Ta molekularna maszyneria wytwarza około 24-godzinną rytmiczność w zdarzeniach komórkowych i fizjologicznych, takich jak ekspresja genów, szlaki sygnałowe, odpowiedzi immunologiczne i trawienie. Zegar okołodobowy jest obecny w prawie wszystkich komórkach ssaków i wykazano, że do 50% wzorców ekspresji genów wykazuje rytmiczność okołodobową6. Biorąc pod uwagę obfitość CCG, zakłócenie tego mechanizmu zegara może skutkować krytycznymi problemami fizjologicznymi. W związku z tym badania nad rytmami okołodobowymi są niezbędne do wyjaśnienia podstawowych mechanizmów biologicznych i opracowania nowych strategii terapeutycznych.

system reporterów lucyferazy
W badaniach okołodobowych monitorowanie w czasie rzeczywistym ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia zachowań i reakcji komórek, ponieważ umożliwia śledzenie czasowych zmian w ekspresji genów i/lub poziomach białek, zapewniając wgląd w mechanizmy molekularne regulowane przez zegar okołodobowy. Co więcej, monitorowanie w czasie rzeczywistym umożliwia naukowcom badanie wpływu zmian środowiskowych na mechanizmy molekularne7,8. Istnieje wiele technik monitorowania badań w czasie rzeczywistym, w tym test bioluminescencji, który jest szeroko stosowany do śledzenia ekspresji genów lub poziomów białek w czasie. Test bioluminescencji to metoda wykrywania procesów biologicznych wykorzystująca produkcję światła jako odczyt. W tym teście enzym oksydacyjny, który wytwarza bioluminescencję (np. lucyferaza), jest przejściowo lub stabilnie transfekowany do komórek będących przedmiotem zainteresowania, a odczyt bioluminescencji jest mierzony w obecności substratu (np. lucyferyny) w czasie. Na przykład enzym lucyferazy wytwarza bioluminescencję poprzez utlenianie substratu lucyferyny w obecności ATP9. Ze względu na krótki okres półtrwania, 3-4 h10, lucyferazy świetlików jest potężnym narzędziem do badań okołodobowych pod względem zapewnienia dynamicznego monitorowania w czasie rzeczywistym przy minimalnym szumie tła11,12,13. W przypadku insercji DNA za pomocą promotora znakowanego lucyferazą lub otwartej ramki odczytu (ORF), system dostarczania genów lentiwirusowych jest niezawodną metodą, która zapewnia wysoką skuteczność transdukcji, stabilną integrację i niską immunogenność. Stabilna transdukcja bioluminescencyjnego reportera zapewnia solidną ekspresję w dzielących się i niedzielących się komórkach, generując spójne dane dla badań okołodobowych14.

Organoid jako model<br /> Tradycyjne, unieśmiertelnione dwuwymiarowe linie komórkowe odegrały zasadniczą rolę w badaniach biologicznych, począwszy od odkrywania podstawowych mechanizmów molekularnych rytmów okołodobowych, a skończywszy na badaniach przesiewowych leków. Pomimo wygody wykorzystania homogenizowanych linii komórkowych, brakuje im struktur wielokomórkowych i interakcji międzykomórkowych. W przeciwieństwie do tego, organoidy są in vitro 3D wielokomórkowymi strukturami "podobnymi do narządów", które naśladują strukturę narządów w naczyniu, wykazując podobieństwo do architektury tkanek in vivo i wielokomórkowości, w tym komórek macierzystych, progenitorowych i zróżnicowanych15,16. Posiadanie cech samoorganizacji, wielokomórkowości i funkcjonalności sprawia, że organoidy są niezwykłym modelem in vitro reprezentującym procesy komórkowe i fizjologiczne zachodzące w prawdziwych tkankach17. Różne rodzaje organoidów mogą być pozyskiwane z pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez ukierunkowane różnicowanie lub dorosłe komórki macierzyste pobrane z różnych narządów, w tym z jelita cienkiego, mózgu, wątroby, płuc i nerek18,19. Ponieważ struktury organoidowe mają rzeczywistą strukturę i funkcję podobną do tkanki, z wielokomórkowością i dynamiczną interakcją między komórkami, są lepsze od homogenizowanych linii komórkowych w zrozumieniu zdarzeń komórkowych zachodzących w tkankach in vivo. Organoidy są również łatwe w manipulacji i mogą być hodowane w kontrolowanych warunkach, co czyni je przydatnymi do badań okołodobowych20.

Głównym celem tej pracy jest wprowadzenie metody monitorowania w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem testu bioluminescencyjnego specjalnie dostosowanego do badania rytmów okołodobowych w wielokomórkowych organoidach 3D. Monitorowanie zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym przy użyciu techniki testu bioluminescencyjnego jest szeroko stosowane w hodowlach komórkowych pozbawionych złożoności wielokomórkowej i komunikacji międzykomórkowej, które istnieją w prawdziwych tkankach. Organoidy 3D stwarzają unikalne możliwości badania funkcji rytmów okołodobowych w systemach wielokomórkowych in vitro. Na przykład, można badać rytmy okołodobowe w organoidach ze zmienionym składem komórkowym lub organoidami pochodzącymi z chorych tkanek pacjentów. Protokół ten umożliwia wykorzystanie testu bioluminescencji do zbadania różnych aspektów rytmów okołodobowych w bardziej fizjologicznie istotnym modelu in vitro, organoidach, co pomoże nam lepiej zrozumieć rolę rytmów okołodobowych w narządach obwodowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z użyciem tkanek ludzkich do generowania HIE zostały zatwierdzone przez IRB w CCHMC (IRB#2014-0427). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów użytych w niniejszym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

UWAGA: Aby zilustrować procedurę opisaną w tym protokole, użyliśmy ludzkich enteroidów jelitowych Bmal1-luc (HIEs). Te enteroidy przeszły stabilną transdukcję lentiwirusową22 z plazmidem reporterowym pABpuro-BluF, który zawiera promotor Bmal1 połączony z lucyferazy, wykazując aktywność promotora Bmal121.

1. Transdukcja lentiwirusowa

  1. Przeprowadzić transdukcję lentiwirusową 22 w warunkach wzbogaconych komórkami macierzystymi dla HIEs. W szczególności należy zapewnić tworzenie się sferoid w HIE w ciągu 3-4 dni po przejściu w pożywce wzrostowej jelita, co stwarza warunki wzbogacone w komórki macierzyste.
  2. Po transdukcji lentiwirusowej 22, przeprowadź selekcję antybiotyków z 2 μg / ml puromycyny, odzyskaj HIE oporne na puromycynę i przeprowadź je ze stosunkowo dużą gęstością (tj. 1 studnia do 2 dołków) przez 2-3x. Jeśli tempo wzrostu HIE jest powolne, dodaj 10 μM inhibitorów ROCK (Y-27632) i 10 μM inhibitora GSK-3 (CHIR-99021) do pożywki wzrostowej organoidów jelitowych.

2. Przygotowanie organoidów do testu bioluminescencyjnego

  1. Dzień 1: Przejście HIE do okrągłych szalek o średnicy 35 mm.
    1. Krótko mówiąc, w celu ekspansji HIEs, wymieszaj HIE z matrycą hodowli 3D o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) i wysiewaj je na 24-dołkowe płytki z trzema kropelkami po 10 μl matrycy hodowlanej 3D na studzienkę. Dodać 350 μl pożywki HIE i zmieniać ją co drugi dzień.
      UWAGA: Gęstość HIE w matrycy hodowli 3D ma kluczowe znaczenie dla wzrostu enteroidów. W przybliżeniu liczba sferoid powinna przekraczać więcej niż 50 w każdej kropli. Jeśli liczba ta jest niska, ma to negatywny wpływ na tempo wzrostu HIE.
    2. Gdy HIE wystarczająco urosną (około 7 dni po pasażu), zbierz HIE z czterech dołków do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    3. Umyj HIE zimnym PBS za pomocą mini wirówki stołowej (2 000 × g) przez 40 s szybkiego wirowania, aby usunąć zanieczyszczenia i nadmiar matrycy hodowlanej 3D za pomocą pipety.
    4. Dodaj 0,5 ml zimnego PBS do granulki i zastosuj turbulencje fizyczne, strzykając do 10 razy strzykawką insulinową o pojemności 1 ml w celu dysocjacji HIEs.
    5. Odwirować zdysocjowane HIE za pomocą miniwirówki stołowej, jak w kroku 2.1.3, i delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Następnie umieść probówkę do mikrowirówki z granulkami HIE na lodzie, aby ostygła przez około 3 minuty.
    6. Dodaj matrycę hodowlaną GFR 3D do probówki mikrowirówki i wymieszaj ją z HIE pellet.
      UWAGA: Oblicz ilość matrycy hodowli 3D na podstawie liczby okrągłych naczyń o średnicy 35 mm, które zostaną użyte w eksperymencie. Zazwyczaj wysiewamy 30 μl kropelek matrycy hodowlanej 3D na okrągłe naczynie.
    7. Wysiewać mieszaninę HIE i matrycę kultur 3D na środku okrągłej płytki o średnicy 35 mm i inkubować szalkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu zestalenia matrycy kultur 3D.
      UWAGA: Gęstość wysiewu HIE należy określić doświadczalnie. Na podstawie intensywności bioluminescencji można określić liczbę HIE podczas tego procesu.
    8. Dodaj 2 ml podgrzanej pożywki wzrostowej organoidów jelitowych do każdego naczynia i inkubuj naczynia w inkubatorze CO2 do następnego kroku.
  2. Dzień 3: Inicjacja różnicowania
    1. Aby zainicjować różnicowanie HIEs, należy usunąć pożywkę wzrostową i dodać 2 ml podgrzanej pożywki różnicującej.
      UWAGA: W Tabeli 1 znajdują się przepisy dotyczące podłoża różnicującego HIE23.
  3. Dzień 4: Nie jest wymagany żaden dodatkowy proces.
  4. Dzień 5: Zastąp pożywkę enteroidów 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej.
  5. Dzień 6: Synchronizacja zegara i rejestracja bioluminescencji
    1. Aby zsynchronizować zegar molekularny enteroidów, dodaj 2 μl 100 μM deksametazonu (Dex), aby uzyskać końcowe stężenie 100 nM w każdym naczyniu, a następnie inkubuj szalki w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2) przez 1 h24.
    2. Podczas resetowania Dex przygotuj inkubacyjny luminometr. Sprawdź CO2 i temperaturę luminometru inkubującego i ustaw odpowiednio na 5% i 37 °C.
      UWAGA: Zaleca się przetarcie wnętrza inkubacyjnego luminometru 70% alkoholem przed i po każdym użyciu urządzenia, aby zachować jego sterylność.
    3. Po synchronizacji zegara uzupełnij enteroidy 3 ml podgrzanej pożywki różnicującej zawierającej 200 μM D-lucyferyny.
      UWAGA: Ponieważ lucyferyna jest wrażliwa na światło, pożywkę zawierającą lucyferynę należy owinąć folią i wstępnie podgrzać w łaźni grzewczej o temperaturze 37 °C przed nałożeniem jej na naczynie.
    4. Umieścić naczynia w 8-dołkowym stole do naczyń inkubującego luminometru i przykryć stół z naczyniami na próbki pokrywką. Umieść dwie komory nawilżacza z mokrą chusteczką lub gąbką na stole z naczyniami na próbki. Jest to proces jednorazowy.
      UWAGA: Po rozpoczęciu eksperymentu pokrywę inkubującego luminometru należy trzymać zamkniętą do momentu zakończenia eksperymentu. Upewnij się, że chusteczki / gąbki są wystarczająco mokre.
    5. Zamknij pokrywę urządzenia i zainicjuj program pomiaru bioluminescencji przez żądaną liczbę dni i rozdzielczość.
      1. W oprogramowaniu wybierz ustawienia warunku, klikając zakładkę Warunek i dostosuj ustawienia na tym panelu: liczbę naczyń, czas pomiaru, przetwarzanie w tle i typ filtra.
        UWAGA: Do tej demonstracji wybraliśmy wszystkie naczynia od A do H; domyślny czas pomiaru, który jest określany przez oprogramowanie na podstawie liczby naczyń; czas oczekiwania na przetwarzanie w tle i typ filtru F0. Ponieważ istnieją trzy opcje filtrów, jednocześnie można mierzyć trzy kolory luminescencyjne.
      2. Po wprowadzeniu wszystkich odpowiednich ustawień na podstawie eksperymentu zapisz ustawienia, klikając przycisk OK.
      3. Aby rozpocząć przeprowadzanie eksperymentu, kliknij kartę Uruchom | Przycisk Start (ikona zielonego trójkąta). Obserwuj dane jako niesurowe, przefiltrowane szumami lub zdetrendowane, dokonując odpowiednich wyborów w górnej części ekranu oprogramowania podczas przeprowadzania eksperymentów. Kliknij zakładki Raw, Filtrowane szumy lub Detrended, aby obserwować wybrane dane.
      4. Obserwuj sygnały przez maksymalnie 5 dni.
        UWAGA: Po 5 dniach monitorowania w inkubacyjnym luminometrze enteroidy mogą zacząć obumierać z powodu wyczerpania pożywki. Aby zapobiec ewentualnym zakłóceniom rytmu dobowego podczas eksperymentu, nie wykonujemy zmiany pożywki na czas trwania eksperymentu.
      5. Na końcu eksperymentu zatrzymaj przebieg, klikając przycisk Zatrzymaj (niebieska kwadratowa ikona), przejdź do karty Plik i kliknij pozycję Zapisz jako. Zapisz dane w formacie Kronos; wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w sekcji Plik, klikając opcję Plik, a następnie wybierając opcję Eksportuj jako format programu Excel w obszarze Plik w celu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rejestrację bioluminescencji przeprowadzono w celu oceny rytmiki okołodobowej ludzkich enteroidów jelitowych (HIEs) w dwóch różnych warunkach: w warunkach wzbogaconych w komórki macierzyste przy użyciu pożywki do wzrostu organoidów jelitowych (Rysunek 3) oraz w warunkach indukujących różnicowanie, osiągniętych poprzez zastąpienie pożywki do wzrostu organoidów jelitowych pożywką różnicującą. W dniu eksperymentu zsynchronizowano zegary okołodobowe, stosując 1-godzinną inkubację z 100 nM deksam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test bioluminescencji oferuje kilka korzyści w badaniu rytmów okołodobowych, co wymaga zbierania danych z długoterminowych eksperymentów w czasie. Po pierwsze, umożliwia naukowcom monitorowanie ekspresji genów lub białka będącego przedmiotem zainteresowania w miarę ruchu i namnażania się komórek. Bez dokonywania niepotrzebnych korekt lub zakłócania funkcji komórek, zainteresowane zdarzenia komórkowe lub ekspresja genów mogą być rejestrowane za pomocą odczytu bioluminescencji, który dostarcza wiarygodnych danych w czasie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ludzkie enteroidy jelitowe zostały uzyskane z laboratorium dr Michaela Helmratha w Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Prace te były wspierane przez R01 DK11005 (CIH) oraz University of Cincinnati Cancer Center Pilot Funding. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie w zakresie obrazowania ze strony University of Cincinnati Live Microscopy Core (NIH S10OD030402).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
35 x 10 Naczynia do hodowli tkankowych FalconFisher Scientific08-772A
A 83-01Sigma AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028
Suplement B-27 (50x)Gibco17504-044
Strzykawki do insuliny Micro-Fine IVFisher Scientific14-829-1BbProducent: BD 329424
CHIR99021Cayman Chemical13122Inhibitor GSK-3
DeksametazonSigma AldrichD4902-500MG
D-Lucyferyna (sól potasowa)Cayman Chemical14681
Gastrin I LudzkaSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibco35050061
Zredukowany czynnik wzrostu (GFR) MatrigelCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)Stemcell Technologies06010składa się z ludzkiego podłoża podstawowego IntestiCult OGM, 50 ml i suplementu organoidowego, 50 ml. Wymieszaj oba w stosunku 1:1 do użycia jako pożywka do wzrostu organoidów jelitowych
Luminometr Kronos DioATTO CorporationAB-2550
Suplement N-2 (100x)Gibco17502-048
N-acetylo-L-cysteinaSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF plazmid reporterowyAddgene46824
PBS bez wapnia i magnezuCorning21-040-CV
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
Rekombinowana mysia EGFPeproTech315-09
Y-27632R& Inhibitor D Systems1254/10ROCK

Bibliografia

  1. Cox, K. H., Takahashi, J. S. Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism. J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).
  2. Ayyar, V. S., Sukumaran, S. Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions. J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).
  3. Reppert, S., Weaver, D. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  4. Takahashi, J. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).
  5. Wolff, C. A., et al. Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice. Cell Rep. 42 (1), 111982(2023).
  6. Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Trans Med. 10 (458), 8806(2018).
  7. Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions. STAR Protoc. 2 (2), 100416(2021).
  8. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).
  9. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).
  10. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).
  11. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters. J Vis Exp. (67), e4234(2012).
  12. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  13. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  14. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  15. Lee, S., Hong, C. I. Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments. Front Genet. 13, 874288(2022).
  16. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  17. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  19. Rosselot, A. E., et al. Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids. EMBO J. 41 (2), 106973(2021).
  20. Corrò, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).
  21. Brown, S. A., et al. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLos Biol. 3 (10), e338(2005).
  22. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. J Vis Exp. (98), e52531(2015).
  23. Criss, Z. K., et al. Drivers of transcriptional variance in human intestinal epithelial organoids. Physiol Genomics. 53 (11), 486-508 (2021).
  24. Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput Biol. 2 (10), e136(2006).
  25. Hara-Miyauchi, C., et al. Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior. Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).
  26. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
  27. Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease. J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).
  28. AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment. Clin Transll Med. 11 (2), 308(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Rytmy okołodoboweludzkie enteroidy jelitowemodel organoidalnyróżnicowanie komórek macierzystychsynchronizacja zegara molekularnegomacierz hodowli 3Dtest bioluminescencyjnyanaliza transformaty Fouriera
Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.