Zdalnie wyzwalana okluzja LAD za pomocą cewnika balonowego u spontanicznie oddychających myszy

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia unikalną technikę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego (IRI) u myszy. Przedstawiona metoda pozwala myszom na spontaniczne oddychanie, jednocześnie zdalnie wywołując niedokrwienie mięśnia sercowego. Zapewnia to dostęp do zwierzęcia w celu badania dynamicznych procesów niedokrwienia i reperfuzji in situ oraz w czasie rzeczywistym za pomocą nieinwazyjnego obrazowania.

Streszczenie

Ostra choroba mięśnia sercowego (AMI) jest powszechną i wysoce śmiertelną chorobą sercowo-naczyniową. Pomimo postępów w strategiach rewaskularyzacji zawału mięśnia sercowego, często prowadzi on do uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego (IRI), wzmacniając uszkodzenie serca. Modele mysie służą jako niezbędne narzędzia do badania zarówno ostrych urazów, jak i przewlekłej przebudowy mięśnia sercowego in vivo. Badanie to przedstawia unikalną technikę zamkniętej klatki piersiowej do zdalnej indukcji IRI mięśnia sercowego u myszy, umożliwiając badanie bardzo wczesnej fazy okluzji i reperfuzji za pomocą obrazowania in vivo, takiego jak MRI lub PET. Protokół wykorzystuje metodę zdalnej okluzji, umożliwiając precyzyjną kontrolę nad inicjacją niedokrwienia po zamknięciu klatki piersiowej. Zmniejsza uraz chirurgiczny, umożliwia spontaniczne oddychanie i poprawia spójność eksperymentu. To, co wyróżnia tę technikę, to jej potencjał do jednoczesnego nieinwazyjnego obrazowania, w tym obrazowania ultrasonograficznego i rezonansu magnetycznego (MRI), podczas zdarzeń okluzji i reperfuzji. Oferuje wyjątkową możliwość analizowania reakcji tkanek w czasie niemal rzeczywistym, dostarczając krytycznych informacji na temat procesów zachodzących podczas niedokrwienia i reperfuzji. Przeprowadzono szeroko zakrojone, systematyczne testy tego innowacyjnego podejścia, mierząc markery martwicy serca dla zawału, oceniając obszar ryzyka za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym oraz barwiąc zawały na etapie dojrzewania blizny. W ramach tych badań położono nacisk na wartość proponowanego narzędzia w rozwijaniu podejść badawczych do uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego i przyspieszeniu rozwoju ukierunkowanych interwencji. W artykule przedstawiono wstępne wyniki badań wskazujące na możliwość połączenia proponowanego innowacyjnego protokołu eksperymentalnego z nieinwazyjnymi technikami obrazowania. Te wstępne wyniki podkreślają korzyści płynące z wykorzystania specjalnie zaprojektowanej kołyski dla zwierząt do zdalnego wywoływania niedokrwienia mięśnia sercowego przy jednoczesnym przeprowadzaniu skanów MRI.

Wprowadzenie

Ostry zawał mięśnia sercowego (AMI), powszechna globalna choroba sercowo-naczyniowa, wiąże się z wysoką śmiertelnością i zachorowalnością¹. Pomimo postępu technologicznego, który umożliwił wczesne i skuteczne strategie rewaskularyzacji u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego, pacjenci nadal doświadczają uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego (IRI) po tych interwencjach². Dlatego kluczowe znaczenie ma zrozumienie podstawowych mechanizmów i sformułowanie podejść w celu złagodzenia IRI. IRI reprezentuje złożony stan patofizjologiczny obejmujący wiele skomplikowanych procesów biologicznych. Obejmują one regulowaną śmierć komórki, reakcje na stres oksydacyjny, stany zapalne, gojenie się ran, zwłóknienie i przebudowę komór. Modele zwierzęce, takie jak myszy, mają ogromne znaczenie dla badań IRI i są szeroko stosowane ze względu na ich opłacalność, szybką hodowlę i bogactwo mechanistycznych informacji z modeli transgenicznych³.

Ten protokół przedstawia innowacyjną technikę zdalnego wywoływania IRI u spontanicznie oddychających myszy z zamkniętą klatką piersiową, bardziej naśladując ludzką patologię. Zdalna okluzja została osiągnięta poprzez wykorzystanie cewnika balonowego umieszczonego w pewnej odległości od mięśnia sercowego w celu zamknięcia lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD). Takie podejście zapewnia ciągły dostęp do bijącego serca dokładnie w momentach okluzji i reperfuzji, ułatwiając jednoczesne metody obrazowania, w tym obrazowanie ultrasonograficzne lub rezonans magnetyczny (MRI). Te nieinwazyjne metody mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat reakcji tkanek przed, w trakcie i po zdarzeniach okluzji i reperfuzji.

Istnieją różne techniki chirurgiczne do wywoływania IRI w modelach mysich. Uraz chirurgiczny wynikający z torakotomii w modelach podwiązania naczyń wieńcowych z otwartą klatką piersiową wyzwala odpowiedź immunologiczną wpływającą na różne mechanizmy związane z niedokrwieniem i reperfuzją. Aktywacja wrodzonego układu odpornościowego może potencjalnie wpływać na zakres zawału mięśnia sercowego⁴. Zaproponowana zaadaptowana technika zapewnia potencjalne podejście do badania kondycjonowania wstępnego i końcowego mięśnia sercowego oraz możliwego zmniejszenia wpływu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na uraz chirurgiczny w badaniach IRI u myszy poprzez zminimalizowanie ram czasowych otwartej klatki piersiowej do maksymalnie 5 minut. Co więcej, nowo opracowana technika może również przyczynić się do zmniejszenia następstw prozapalnych spowodowanych uszkodzeniem płuc wywołanym przez respirator⁵. Jednak połączone efekty tej nowej metody zamkniętej klatki piersiowej wymagałyby dalszych dogłębnych badań.

Dokładna walidacja proponowanej techniki została przeprowadzona poprzez porównanie jej z tradycyjną metodą, która polega na eksponowaniu LAD poprzez chirurgiczne rozwarstwienie klatki piersiowej i okluzję wywołaną podwiązaniem przez 30 minut. Wyniki obu technik zostały porównane, które obejmowały pomiary troponiny odzwierciedlające rozmiar zawału serca, oceny obszaru ryzyka za pomocą MRI z dodatkiem kontrastu gadolinu, barwienie histologiczne chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC) oraz określenie ostatecznych rozmiarów blizn za pomocą barwienia Sirius Red (SR). Wyniki wskazują na solidność i skuteczność proponowanego podejścia do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w modelach mysich.

Protokół

Ten protokół dla zwierząt został zatwierdzony i jest zgodny z wytycznymi i przepisami określonymi przez Komitet Etyczny ds. Eksperymentów na Zwierzętach (ECD) na Katolickim Uniwersytecie w Leuven. Wszystkie zasady opracowane przez lokalne ECD są zgodne z przepisami Unii Europejskiej dotyczącymi dobrostanu zwierząt laboratoryjnych, zgodnie z deklaracją zawartą w dyrektywie 2010/63/UE. Wszystkie opisane poniżej testy zostały przeprowadzone na 8-12 tygodniowych (masa ciała = 20-23 g) samcach myszy C57BL/6. Ostre eksperymenty reprezentują zwierzęta, które zostały uśmiercone natychmiast po operacji. Eksperymenty dotyczące przeżycia obejmowały czterotygodniową obserwację, w tym pomiar troponiny, rezonans magnetyczny i barwienie SR.

1. Znieczulenie i intubacja dotchawicza

1. Podawać leki przed znieczuleniem przy użyciu mieszanki ketaminy (7,5 mg/kg; Nimatek 100 mg/ml), ksylazyna (1 mg/kg; Rompun, 20 mg/ml) i acepromazyna (0,1 mg/kg; Placivet, 10 mg/ml) (KXA) (patrz tabela materiałów) z 0,9 % rozcieńczalnikiem soli fizjologicznej dootrzewnowo. Pozwala to na płynniejszą i mniej inwazyjną intubację.
2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej (patrz tabela materiałów) i wywołaj znieczulenie za pomocą 2,5% izofluranu w czystym tlenie o natężeniu przepływu 1 l/min, aż do utraty prostowania i odruchu szczypania palców.
3. Przenieść zwierzę na rozgrzaną podkładkę (±38 °C) i ułożyć je na wznak z głową skierowaną w stronę chirurga. Przymocuj ogon i przednie łapy taśmą na podkładce. Upewnij się, że przednie kończyny nie są nadmiernie rozciągnięte, ponieważ może to zagrozić oddychaniu.
4. Umieść jedwabny szew 2-0 (patrz Tabela materiałów) wokół górnych siekaczy i przyklej szew na granicy podkładki, aby naciągnąć mysz. W razie potrzeby przymocuj uchwyt na igłę, aby utrzymać napięcie szwu. Utrzymuj zwierzę w stanie znieczulenia za pomocą 2% izofluranu w 100% tlenu o przepływie 1 l/min za pomocą stożka.
5. Umieść źródło światła tuż przy mostku, usuń stożek nosowy i umieść dopływ izofluranu na respiratorze. Zaintubuj mysz za pomocą kleszczy, unosząc język do góry i trzymając samodzielnie wykonany laryngoskop, aby jeszcze bardziej unieść podstawową część języka i uwidocznić struny głosowe.
6. Umieść samodzielnie wykonaną rurkę dotchawiczą za pomocą cewnika 18 G na igle między strunami głosowymi. Przesuń cewnik w górę, wyjmij igłę i połącz rurkę z respiratorem myszy (patrz Tabela materiałów).
7. Użyj zmodyfikowanego łącznika w kształcie litery Y (patrz Tabela materiałów), aby podłączyć rurkę intubacyjną do respiratora. Prawidłowe ułożenie rurki dotchawiczej można potwierdzić, oceniając symetryczne rozszerzenie klatki piersiowej.
8. Ustaw objętość oddechową (ml) na masę ciała (m.c.) (g) x 7, a szybkość wentylacji na 53,5 x (m.c. (g)^-0,26) uderzeń na minutę i w razie potrzeby dostosuj ją do masy ciała konkretnej myszy⁶ (np. dla myszy o wadze 25 g objętość oddechowa wynosi 175 ml przy 140 uderzeniach na minutę).
9. Zmniejsz poziom izofluranu do 1% w 100% tlenu, ponieważ zwierzę pozostanie znieczulone z powodu premedykacji. Jednak regularnie oceniaj głębokość znieczulenia, wykonując szczypanie palca u nogi. Dostosuj stężenie izofluranu w zależności od głębokości znieczulenia.
10. Nałóż kroplę maści okulistycznej, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.

2. Instalacja narzędzia IRI

UWAGA: Usuń wszystkie taśmy i umieść zwierzę na płycie podstawy specjalnie zbudowanego narzędzia IRI. Szczegółowe informacje na temat właściwości narzędzia IRI znajdują się w pliku uzupełniającym 1.

1. Zamocuj płytę podstawy specjalnie zaprojektowanego zdalnego narzędzia IRI w pozycji bocznej przed chirurgiem. Przymocuj ogon i łapy za pomocą taśmy. Zamocuj głowę za pomocą jedwabnego szwu 2-0 wokół górnych siekaczy, aby zapobiec przypadkowemu ruchowi (Rysunek 1).
2. Włóż doodbytniczą sondę termiczną (patrz Tabela materiałów), aby monitorować temperaturę ciała i użyj lampy grzewczej na podczerwień nad zwierzęciem, aby utrzymać temperaturę około 37 °C. Zwróć uwagę na wystarczającą odległość między zwierzęciem a lampą, aby uniknąć przegrzania.
3. Umieść elektrody igłowe EKG we wszystkich czterech łapach, aby obserwować i rejestrować tętno oraz przebieg EKG. Przymocuj sondę doodbytniczą i elektrody EKG do platformy za pomocą taśmy.
4. Nałóż krem do depilacji po lewej stronie klatki piersiowej, aby usunąć włosy i stworzyć czyste pole chirurgiczne.
   UWAGA: Ogranicz czas aplikacji i zwróć uwagę na całkowite usunięcie kremu, aby zapobiec poparzeniom chemicznym.

3. Torakotomia

1. Wykonaj aseptyczne przygotowanie skóry za pomocą roztworu Betadine, a następnie umieść serwetę chirurgiczną na lewej klatce piersiowej, aby zapewnić sterylne środowisko. Do wykonania zabiegu użyj wysterylizowanego sprzętu. Wykonaj pionowe nacięcie skóry w środkowej części mięśnia piersiowego o długości około 1 cm i odległości 2 mm od lewej granicy mostka.
2. Wypluj mięsień piersiowy, aby odsłonić żebra pod spodem. Unikaj przypadkowych obrażeń naczynia. Jeśli wystąpi krwawienie, użyj bawełnianych aplikatorów, aby zatamować krwawienie.
3. Wizualizuj żebra i zidentyfikuj przestrzenie międzyżebrowe, obserwując napełniające się płuco przez cienką, półprzezroczystą ścianę klatki piersiowej. Otwórz jamę klatki piersiowej za pomocą nożyczek chirurgicznych, wykonując nacięcie 6-8 mm w trzeciej przestrzeni międzyżebrowej. Upewnij się, że nacięcie znajduje się co najmniej 2 mm od granicy mostka, gdzie znajduje się wewnętrzna tętnica piersiowa.
4. Włóż mały wziernik w oko szczura (patrz Tabela materiałów) w przestrzeń międzyżebrową. Będzie on działał jako zwijacz żeber (Rysunek 1A).
5. Delikatnie podnieś osierdzie zakrzywionymi kleszczami i rozsuń je.
6. Połóż mały kawałek bawełny na płucach i delikatnie popchnij w dół.

4. Przygotowanie do LAD

1. LAD wydaje się jaskrawoczerwony i biegnie od aorty pod lewą małżowiną uszną w kierunku wierzchołka. Idealne ułożenie ligatury znajduje się około 2 mm niżej niż końcówka lewej małżowiny usznej. Użyj tułowia płucnego jako markera, aby pomóc zidentyfikować lewą małżowinę uszną i zoptymalizować wizualizację LAD za pomocą dopływu światła (Rysunek 2).
2. Użyj stożkowej igły, aby przełożyć szew polipropylenowy 7-0 wokół LAD. Nie należy umieszczać igły zbyt głęboko, ponieważ może wejść do lewej komory, ani zbyt płytko, ponieważ może to uszkodzić LAD.
3. Usuń mały kawałek bawełny i sprawdź, czy lewe płuco jest nadal wentylowane.
4. Wyjmij zwijacz żeber.
5. Upewnij się, że szew ma minimalną długość 15 cm na obu końcach. Odetnij igłę.
6. Umieść kawałek rurki PE-50 o średnicy 1 mm na kawałku rurki PE-10 o średnicy 15 mm (patrz Tabela materiałów). Przeprowadź oba końce szwu przez rurkę PE-10 i przesuń rurkę PE grubszym końcem do serca.

5. Zamykanie klatki piersiowej i ekstubacja

1. Nałóż trochę żelu z kwasem fusydowym na otwartą przestrzeń międzyżebrową i delikatnie pozwól pozostałemu powietrzu z klatki piersiowej uciec, na krótko blokując odpływ wentylatora. Dodatkowy żel z kwasem fusydowym można dodać do zewnętrznej części rurki PE, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do klatki piersiowej.
2. Zamknij mięsień piersiowy za pomocą polipropylenowego ściegu X 5-0 powyżej i poniżej poziomu rurki PE i upewnij się, że pogrubiona część rurki PE znajduje się poniżej poziomu mięśnia.
3. Zamknij skórę dwoma szwami polipropylenowymi 5-0 X powyżej i dwoma poniżej rurki PE (Rysunek 1B i Rysunek 3).
4. Przy zamkniętej klatce piersiowej zwierzę może ponownie spontanicznie oddychać. Odzwyczaj zwierzęcia od respiratora, powoli zmniejszając objętość oddechową i częstość oddechów. Kiedy zwierzę zacznie oddychać, spontanicznie ostrożnie odłącz rurkę respiratora, ale trzymaj ją na miejscu, dopóki nie zostanie zaobserwowany stabilny wzorzec oddychania.
5. Połączyć dopływ izofluranu z stożkiem umieszczonym nad nosem zwierzęcia i przymocowanym do płytki podstawy.

6. Montaż zdalnego narzędzia IR

1. Umieść pionową część boczną w płycie podstawy, wkładając ją w szczeliny.
2. Użyj cienkiego haczyka, aby wyciągnąć dwa końce szwu i przeciągnij je przez środkowy otwór w bocznej części za balonem (patrz Tabela materiałów).
3. Poprowadź jeden z końców szwów nad i wokół balonu. Postępuj zgodnie z drugim końcem szwu pod balonem i wokół niego. Zastosuj żel z kwasem fusydowym, aby uzyskać płynniejsze prowadzenie szwu.
4. Przeprowadź końce szwów przez szczeliny na górze części bocznej. Na dystalną część szwu nałóż ciężarek 2,1 g, aby utrzymać każdy koniec szwu na miejscu (Rysunek 1C i Rysunek 4).
   UWAGA: Konfiguracja odpowiednich odważników może ulec zmianie i musi zostać wcześniej przetestowana. Szczegółowe informacje można znaleźć na rysunku uzupełniającym 1 i pliku uzupełniającym 1. Konstrukcja zdalnego narzędzia IRI jest przedstawiona na rysunku uzupełniającym 2.

7. Indukcja niedokrwienia i reperfuzji

1. Wywołaj niedokrwienie poprzez natychmiastowe napompowanie balonu za pomocą naczyniowej pompy balonowej do 2 barów. Zablokuj pompę. Sprawdź wzrokowo, czy balon jest napompowany, a ciężarki są podniesione (Rysunek 4).
2. Potwierdź niedokrwienie, obserwując zmianę w zapisie EKG.
3. Pozostaw balon napompowany na ustalony czas zgodnie z określonym protokołem badania (30 minut w prezentowanych eksperymentach).
4. Zatrzymaj okluzję, po prostu odblokowując pompę. Ostrożnie opróżnij balon. Sprawdź wzrokowo, czy balon jest opróżniony, a ciężary obniżone.

8. Demontaż zdalnego narzędzia IR

1. Przetnij szew i rurkę między zwierzęciem a częścią boczną i ostrożnie usuń część boczną.
2. Nałóż żel z kwasem fusydowym w miejscu wprowadzenia rurki do klatki piersiowej. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie docisnąć skórę do rurki i użyj innych kleszczy, aby wyjąć rurkę. Przetnij pozostały szew blisko skóry.
3. Umieść dodatkowy szew z polipropylenu 5-0, aby zamknąć miejsce wyjścia rurki i zminimalizować ryzyko przedostania się powietrza do klatki piersiowej.

9. Koniec narkozy i powrót do

zdrowia

1. Zatrzymaj dopływ izofluranu i pozwól zwierzęciu obudzić się w cichym, ciepłym i bogatym w tlen środowisku.
2. Upewnij się, że mysz nie ma żadnej niewydolności oddechowej, obserwując ją aż do pełnego wyzdrowienia. Podać 0,3 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (o temperaturze ciała) we wstrzyknięciu dootrzewnowym, aby zapobiec odwodnieniu.
3. W przypadku analgezji pooperacyjnej należy podać opioidowy lek przeciwbólowy (buprenorfina, 0,1 mg/kg) podskórnie, zanim zwierzę zacznie chodzić. Sprawdzaj myszy co 4-6 godzin przez następne 24-48 godzin, gdy podawana jest buprenorfina, aby upewnić się, że myszy reagują na leki przeciwbólowe i określić, czy potrzebne są dodatkowe leki przeciwbólowe. Dodatkowe wsparcie powinno obejmować standardowy, zalecany żel lub zacier do leczenia wspomagającego, umieszczany na podłodze klatki po operacji.

Wyniki

Walidację zdolności do indukowania niedokrwienia przeprowadzono za pomocą czterech testów: barwienia chlorkiem trifenylotetrazoliu (TTC) i Sirius Red (SR), pomiaru troponiny I w mięśniu sercowym oraz obrazowania MR z późnym wzmocnieniem gadolinowym (LGE). Ze względu na ograniczoną wielkość próby, istotność statystyczną oceniano za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya. Istotność statystyczną przyjęto dla p < 0,05.

W eksperymentach ostrych (barwienie TTC, n = 15) nie wystąpiły żadne błędy techniczne i wszystkie zwierzęta zostały włączone do badania. Eksperymenty te obejmowały bezpośrednie badania kontrolne (troponina I serca, LGE MRI, barwienie czerwienią siriusową, n = 12) i charakteryzowały się przeżywalnością na poziomie odpowiednio 85% dla techniki zamykania odległego oraz 80% dla techniki zamykania standardowego w okresie 4 tygodni.

Barwienie chlorkiem trifenylotetrazoliu
Barwienie TTC (chlorkiem trifenylotetrazoliu) w mysim modelu urazu reperfuzyjnego w sercu pozwala na makroskopowy pomiar żywotności mięśnia sercowego poprzez wykazanie utraty funkcji dehydrogenazy. Ta metoda barwienia pomaga odróżnić obszary serca, które są nadal żywotne, od tych, które stały się nieżywotne w wyniku niedokrwienia. Żywy mięsień sercowy barwi się na czerwono za pomocą TTC, podczas gdy obszar niedokrwienny pozostaje blady lub niebarwiący się, ponieważ dehydrogenaza nie jest już funkcjonalna. Dostarcza to kluczowych informacji o stopniu uszkodzenia tkanki wkrótce po wystąpieniu niedokrwienia. Barwienie przeprowadzono w standardowych grupach IRI (n = 7) oraz grupach zdalnego IRI (n = 8) natychmiast po 30 min niedokrwienia. Rycina 5 przedstawia reprezentatywne pocięcia barwione dla jednego zwierzęcia, z przekrojami tkanek biegnącymi od podstawy w stronę wierzchołka. Wyniki barwienia TTC przedstawiono na Rycini 6, a nie wykazują one istotnych różnic między obiema technikami IRI. Barwienie TTC przeprowadzono zgodnie z opisem Fishbeina i wsp.⁷.

MRI z późnym wzmocnieniem gadolinowym
W celu nieinwazyjnego pomiaru zakresu obszaru niedokrwiennego, w grupach standardowego IRI (n = 5) oraz zdalnego IRI (n = 5) zastosowano LGE MRI 24 h po zamknięciu naczynia. Szczegółowe parametry akwizycji znajdują się w Pliku uzupełniającym 1. Obszar zagrożony mierzony jest jako % tkanki lewej komory w trzech najbardziej apikalnych przekrojach, w których przekroczono kryteria progu opisane w Pliku uzupełniającym 1. Przedstawienie graficzne na Rysunku 7 wykazuje, że nie zaobserwowano istotnych różnic między nową proponowaną techniką zdalnego zamknięcia naczynia a konwencjonalną metodą „otwartej klatki piersiowej” podczas pomiaru obszaru zagrożonego.

Barwienie szkarłatem syryjskim (Sirius Red)
Zawał mięśnia sercowego, będący następstwem niedokrwienia mięśnia sercowego, stanowi poważny problem dla osób doświadczających niedokrwienia, ponieważ prowadzi do zmniejszenia kurczliwej masy serca, upośledzając jego zdolność do wydajnego pompowania krwi. Rysunek 8 wyjaśnia wyniki, wykorzystując barwienie szkarłatem syryjskim 4 tygodnie po zamknięciu naczynia, aby potwierdzić lokalizację blizny na podstawie obszaru zagrożonego wskazanego w MRI LGE oraz zmierzyć rozległość tkanki bliznowatej. Barwienie przeprowadzono dla standardowej grupy IRI (n = 5) oraz grupy IRI zdalnej (n = 5). Jasnoczerwone obszary wyznaczają nekrotyczny rdzeń zawału, natomiast części pomarańczowe wskazują tkankę żywotną. Wreszcie, Rysunek 9 przedstawia końcowe rozmiary blizn zmierzone za pomocą barwienia szkarłatem syryjskim dla obu technik. Rozmiar blizny obliczono jako stosunek powierzchni zabarwionego zawału do całkowitej powierzchni wolnej ściany lewej komory w plastrze przekroju tkanki wierzchołkowej o grubości 2,4 mm. Barwienie szkarłatem syryjskim wykonano zgodnie z metodą Rittié⁸.

Troponina I serca
Oprócz technik obrazowania i barwienia, w badaniu oceniano również uszkodzenie serca, wykorzystując troponinę I serca jako marker. Próbki krwi pobrano 24 h po operacji w grupach standardowego IRI (n = 8) oraz zdalnego IRI (n = 8). Rysunek 10 przedstawia wartości troponiny I serca, wykazując brak istotnych różnic przy porównaniu nowej techniki zdalnej okluzji z techniką standardowego IRI.

W celu wykazania wykonalności proponowanej koncepcji przedstawiono również wstępne wyniki indukcji niedokrwienia z miejsca zdalnego przy jednoczesnym nieinwazyjnym obrazowaniu. Osiągnięto to poprzez zastosowanie specjalnie zbudowanego narzędzia do zdalnej okluzji, które umieszczono w koszyku dla zwierząt do MRI i wypozycjonowano w centrum skanera MR. Wyniki przedstawione na Rysunku 11 wykazują różnice w kontraście obrazu (poziomach jasności) pomiędzy obszarami zawałowymi a niezawałowymi. Na Rysunku 12B przedstawiono zapis EKG wykazujący typowe uniesienie odcinka ST jako marker potwierdzający skuteczną okluzję LAD podczas przebywania zwierzęcia w skanerze MR, natomiast Rysunek 12A przedstawia zapis EKG przed okluzją.

To kompleksowe podejście zapewnia szczegółowe zrozumienie wpływu nowo zaproponowanej techniki zdalnej okluzji na niedokrwienie, martwicę i uszkodzenia serca w modelu eksperymentalnym w porównaniu do konwencjonalnej metody „otwartej klatki piersiowej”.

Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy przedstawiające przygotowanie zwierzęcia zgodnie z opisanym protokołem. (A) Torakotomia z wprowadzeniem rozwieracza żeber. (B) Zamknięcie klatki piersiowej z rurką PE-10 wychodzącą z klatki piersiowej i prowadzącą szew wokół LAD. (C) Pozycjonowanie zwierzęcia w zmontowanym zdalnym narzędziu IRI. Zwróć uwagę na dwa obciążniki o masie 2,1 g zaciskające każdy koniec szwu i spoczywające przy bocznej części podstawki zdalnego narzędzia IRI. Część boczna jest ustawiona i utrzymana na miejscu przez wycięcia w płycie podstawy narzędzia. Cewnik balonowy naczyniowy jest odwietrzony. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2: Wizualizacja ex vivo LAD (biała strzałka) i lewego przedsionka (czarna strzałka). Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rysunek 3: Schematyczny widok z góry układu eksperymentalnego, ilustrujący położenie narzędzia używanego do zdalnej okluzji.Utworzono za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Schemat ilustrujący zastosowanie narzędzia do zdalnej okluzji widziane z boku. (A) Od początku zabiegu zwierzę znajduje się w części dolnej. Po zamknięciu klatki piersiowej montowana jest część boczna. Na tym etapie balon jest wciąż odwspółśrodkowany (deflated), a obciążniki spoczywają na części dolnej. (B) Napompowanie cewnika balonowego uniesie obciążniki (oznaczone strzałkami) i spowoduje okluzję LAD z następującym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Pomyślną okluzję stwierdza się na podstawie zmian w zapisie ECG. Wypuszczenie powietrza z balonu przywróci przepływ krwi przez LAD. Utworzono za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy przekrojów serca myszy barwionych chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC). Przekroje przebiegają od podstawy do wierzchołka od lewej do prawej, zaczynając od górnego rzędu. (A) Standardowa IRI. (B) Zdalna IRI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 6: Wyniki barwienia TTC. Barwienie TTC wykonano 24 h po zamknięciu naczynia w celu pomiaru wielkości zawału. Punkty danych przedstawiono jako średnie z SEM dla grup standardowego IRI (n = 7) i zdalnego IRI (n = 8). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 7: MRI z późnym wzmocnieniem gadolinowym (LGE). Obszar zagrożony 24 h po zamknięciu naczynia, wyznaczony na trzech najbardziej apikalnych przekrojach (z wyłączeniem samego wierzchołka), uzyskanych za pomocą LGE MRI. Punkty danych przedstawiono jako średnie z błędem standardowym średniej (SEM) dla grup standard IRI (n = 5) i remote IRI (n = 5). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 8: Walidacja urządzenia do zdalnego zamykania naczynia za pomocą MRI po procedurze niedokrwienia/reperfuzji. Reprezentatywne porównanie obszaru zagrożonego, wyznaczonego na obrazach LGE MR 1 dzień po zamknięciu naczynia, z ostateczną tkanką bliznowatą barwioną Sirius Red 4 tygodnie po zamknięciu naczynia. (A-B) Przekroje osi krótkiej zwierzęcia z zamknięciem zdalnym i warsztatowym, odpowiednio. Strzałka wskazuje wyznaczony obszar zagrożony. (C-D) Przekroje histologiczne barwione Sirius Red tych samych zwierząt potwierdzają, że tworzenie się ostatecznej blizny odpowiada wyznaczeniu obszaru zagrożonego w MRI 24 h po zamknięciu naczynia. LV = lewa komora. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 9: Wyniki barwienia Sirius Red. Barwienie Sirius Red wykonano 4 tygodnie po okluzji w celu pomiaru zakresu formowania się blizny. Punkty danych przedstawiono jako średnie z SEM dla grup standardowego IRI (n = 5) i zdalnego IRI (n = 5). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Oznaczenie stężenia troponiny I w sercu w surowicy mysiej pobranej 24 godziny po zamknięciu naczynia. Punkty danych dla cTnI przedstawiono jako średnie z SEM dla grup standardowego IRI (n = 8) oraz zdalnego IRI (n = 8). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Przedstawiono wstępne wyniki uzyskane przy użyciu proponowanego narzędzia do zdalnej okluzji w połączeniu z jednoczesnym obrazowaniem MRI. Prezentowany jest ten sam przekrój środkowy komory w orientacji krótkiej osi jednego zwierzęcia przed, w trakcie i krótko po okluzji. Po lewej stronie reprezentacyjny przekrój obrazu pokazuje granice mięśnia sercowego na początku eksperymentu (przed wywołaniem IRI). W środku pokazano ten sam przekrój w krótkiej osi po 30 min zdalnie wywołanego niedokrwienia. Jako środek kontrastowy wykorzystano chlorek manganu (MnCl), aby wyróżnić obszar zawału (zaznaczony na żółto). Jasność została dostosowana ręcznie i nasycona, aby uwydatnić różne obszary tkanki. Należy zwrócić uwagę na różnicę w jasności między ścianą przegrody a boczną ścianą wolną (zaznaczoną na żółto). Po prawej stronie, przy zastosowaniu tych samych ustawień jasności co wcześniej, pokazano ten sam przekrój w krótkiej osi 20 min po okluzji (etap reperfuzji). Strzałka wskazuje obszar o zwiększonej jasności w porównaniu z momentem okluzji, co świadczy o pobieraniu środka kontrastowego w fazie reperfuzji oraz zmniejszeniu początkowego obszaru hipointensywnego, wyznaczonego w czasie okluzji. LV = lewa komora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 12: Zapis EKG zarejestrowany za pomocą systemu monitorowania MRI w celu potwierdzenia wystąpienia niedokrwienia. (A) Normalny zapis EKG zarejestrowany przed zdalną okluzją. (B) Zapis EKG zarejestrowany tuż po nadmuchaniu balonu u tego samego zwierzęcia. Strzałka wskazuje uniesienie odcinka ST, co zazwyczaj uznaje się za marker skutecznego wystąpienia niedokrwienia. Obserwuje się również wzrost częstotliwości akcji serca i oddychania oraz spadek amplitudy sygnału. Zwierzę znajduje się w centrum skanera MR podczas etapów okluzji i reperfuzji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Konfiguracja ciężarów. Wykres wszystkich ciężarów w funkcji przemieszczenia dynamometru z użyciem systemu zdalnego Balloon (kolor niebieski) vs. oryginalnego systemu bloczków (kolor pomarańczowy). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Projekt zdalnego narzędzia IRI. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Szczegółowe informacje na temat właściwości narzędzia IRI oraz technik akwizycji i analizy obrazów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Nowatorska technika zdalnej okluzji przedstawiona w tym badaniu stanowi unikalną platformę do postępu badań w dziedzinie modelowania uszkodzeń niedokrwienno-reperfuzyjnych poprzez uniknięcie konieczności bezpośredniej manipulacji naczyniami podczas początkowej operacji i umożliwienie jednoczesnego obrazowania multimodalnego mięśnia sercowego z wczesnym reperfuzją. Kompleksowa charakterystyka, w tym pomiary troponiny-I, rezonans magnetyczny z kontrastem LGE, TTC i barwienie SR, pokazuje, że proponowana technika jest równoważna obecnemu złotemu standardowi (tj. podwiązaniu LAD w otwartej klatce piersiowej)⁹.

Proponowana technika ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnym "otwartym" podejściem do podwiązywania LAD. Przede wszystkim skraca czas otwarcia klatki piersiowej podczas operacji do zaledwie 15 minut, w przeciwieństwie do czasu okluzji (30-60 min) plus czasu chirurgicznego (15 min) wymaganego w tradycyjnym podejściu. Ta zminimalizowana operacja na otwartym sercu może złagodzić uszkodzenia tkanek i stan zapalny, ale wymagałaby dalszych badań. Co więcej, wczesne zamknięcie torakotomii pozwala na odzwyczajenie od respiratora, umożliwiając w ten sposób spontaniczne oddychanie pod wpływem izofluranu podczas eksperymentów niedokrwienno-reperfuzyjnych. Ma to potencjał do zmniejszenia uszkodzenia płuc wywołanego przez respirator i związanego z nim stanu zapalnego, jednocześnie umożliwiając bardziej fizjologicznie dokładną odpowiedź na niedokrwienie mięśnia sercowego i reperfuzję¹⁰.

Co więcej, technika zdalnej okluzji zapewnia lepszą kontrolę nad dokładnym czasem indukcji niedokrwienia. Jako dowód słuszności koncepcji zademonstrowano wykonalność i wstępne wyniki zdalnego wywoływania i kontrolowania niedokrwienia mięśnia sercowego, podczas gdy zwierzę umieszczono w środku skanera MR. Zdolność do precyzyjnego zainicjowania niedokrwienia po zamknięciu klatki piersiowej pozwala badaczom na określenie czasu interwencji terapeutycznych lub dodatkowych badań i synchronizację uszkodzenia niedokrwiennego między osobami eksperymentalnymi. Ta zwiększona kontrola może prowadzić do dokładniejszej i bardziej spójnej indukcji IRI, co ma kluczowe znaczenie dla badań mechanistycznych i terapeutycznych. Niemniej jednak marginalne wydłużenie inhalacji izofluranu podczas wykonywania rezonansu magnetycznego serca może stanowić ograniczenie dla tego badania. Mianowicie, przedłużona ekspozycja na izofluran może mieć dodatkowe działanie kardioprotekcyjne, jak wykazano w badaniach na myszach, i wymagałoby dalszych badań dla proponowanego modelu¹¹.

Zmienność zakresu indukowanego urazu jest częstym wyzwaniem w modelach IRI, często wynikającym z różnic w wykonaniu operacji lub zmiennej anatomii¹². Co ważne, odpowiednie przeszkolenie chirurga będzie miało wpływ na wskaźniki śmiertelności w tym modelu poza innymi uznanymi zmiennymi, takimi jak umiejscowienie LAD, czas trwania eksperymentu, szczepy myszy i tło genetyczne¹³. Wybór środków znieczulających i przeciwbólowych może również wpływać na wyniki. Z doświadczenia wynika, że model ten wykazuje ogólny wskaźnik śmiertelności bliski 15%. Wdrożenie rygorystycznego leczenia bólu i czujne monitorowanie zwierząt może jeszcze bardziej zmniejszyć śmiertelność.

Jednym z istotnych kierunków wskazywanych przez tę pracę jest potencjalne zastosowanie techniki zdalnej okluzji w ocenie interwencji terapeutycznych we wczesnych fazach okluzji lub reperfuzji.

Podsumowując, technika zdalnej okluzji stanowi obiecujący postęp w modelowaniu IRI, potencjalnie udoskonalając badania mechanistyczne i przyspieszając terapie celowane. Jego zdolność do zmniejszania urazów chirurgicznych, poprawy kontroli czasu niedokrwienia i poprawy spójności eksperymentalnej podkreśla jego znaczenie. Poprzez dalsze badania zdolności adaptacyjnych tej techniki, naukowcy mogą uwolnić jej pełny potencjał i przyczynić się do dokładniejszego zrozumienia wczesnych faz indukcji niedokrwienia, reperfuzji i towarzyszącego jej uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Również na tych początkowych etapach można zaobserwować efekt różnych strategii leczenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szew jedwabny 2-0	Sharpoint Products	DC-2515N
5-0 szew polipropylenowy	Ethicon	8710H
7-0 szew polipropylenowy	Ethicon	8206H
ACCLARENT Urządzenie do napełniania balonów	Johnson& Johnson MedTech	BID30
Acepromazyna	Kela
BD Vialon 18 G	BD	381347
BD Vialon 20 G	BD	381334
Roztwór betadyny	Purdue Pharma	25655-41-8
Buprenorfina (Buprenex do wstrzykiwań)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
Carp Zoom Styl Knijplood 2,1 g (ołowiane ciężarki wędkarskie)	Visdeal.nl
Dumont #3 Kleszcze	Narzędzia do nauki	11231-30
Dumont #5 Kleszcze	Narzędzia do nauki	11251-30
Cienkie nożyczki	Fine Science Tools	14040-10
Fucydyna	Leo Pharma
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
KD Mouse/Rat Eye Speculum	World Precision Instruments	501897
KD wziernik myszy/szczura	Światowe instrumenty precyzyjne	501897
Ketamina	Dechra
Źródło światła		Zeiss	KL 1500
	Bruker BioSpin, Ettlingen, Niemcy	BioSpec 70/30
Chlorek sodu 0,9%	Baxter
Nocna lampa grzewcza na podczerwień	Zoo Med Laboratories, Inc.	RS-75
ParaVision	Bruker BioSpin	wersja 6.0.1
rurki polietylenowe PE-10	SAI Technologie infuzyjne	PE-10
Rurki polietylenowe PE-50	SAI Technologie infuzyjne	PE-50
PMMA)	domowej roboty
Monitor chirurgiczny dla gryzoni	Instrumenty
Segment v4.0	Medviso, segment.heiberg.se	R12067
Samobramkowana sekwencja echa gradientowego	Bruker BioSpin, Ettlingen, Niemcy	IntraGate, ParaVision 6.0.1
Cienki wydłużony uchwyt na igłę	Fine Science Tools	12005-15
Sure-Seal Komora indukcyjna dla myszy / szczura	Świat Precyzyjne instrumenty	EZ-178
Złącza rurowe, Poly, kształt Y	Westlab	072025-0001
Cewnik dylatacyjny Ultraverse 035 PTA: 5mm x 40mm, balon RBP 17 ATM na cewniku o długości 130 cm	Bard Peripheral Vascular, Inc.
Veet (krem do depilacji)	Reckitt Benkiser
, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Vidisic	BAUSCH & LOMB PHARMA	685313
Xylazine	Bayer

żel System MRI LCD Oprogramowanie zdalne narzędzie IRI PE-50 (Indus00801741092671Respirator medyczny