Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zobacz materiał MLH1 Ekspresja genów we krwi obwodowej u pacjentów z rakiem jelita grubego i ich związek z rakiem jelita grubego

984 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66387

⸱

27 września 2024

 ,  , 
1Oncology Department, Affiliated Hospital 2 of Nantong University, Nantong First People's Hospital, 2Department of Emergency, Affiliated Hospital 2 of Nantong University, Nantong First People's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie bada związek między ekspresją genu MLH1 we krwi obwodowej a rakiem jelita grubego, wykorzystując podejście case-control do porównania poziomów ekspresji u pacjentów i dopasowanych zdrowych osób kontrolnych.

Streszczenie

MutL homolog 1 (MLH1) jest składnikiem heterodimerycznego kompleksu MutLα, który wykrywa i naprawia niedopasowania zasada-zasada oraz pętle insercji/delecji spowodowane nieprawidłowym włączeniem nukleotydów. W przypadku braku białka MLH1 zwiększa się częstość nienaprawionych niedopasowań, co prowadzi do raka narządów. Obecne badanie miało na celu ilościowe określenie ekspresji genu MLH1 i jej związku z inwazją guza (T) i inwazją węzłów chłonnych (N) w próbkach krwi od pacjentów z rakiem jelita grubego (CRC). Próbki krwi pobrano od 36 pacjentów z rakiem jelita grubego. RNA wyekstrahowano, a cDNA zsyntetyzowano za pomocą zestawu. Startery zbudowano przy użyciu podejścia opartego na połączeniu ekson-ekson, a geny MLH1 i β-aktyny przetestowano 3x przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR). Do analizy danych wykorzystano oprogramowanie do analizy ekspresji genów, a test t użyto do zbadania ekspresji MLH1 i jej związku ze zmiennymi T i N. W badaniu wzięło udział 36 pacjentów z rakiem jelita grubego, w tym 15 (41,6%) kobiet i 21 (58,4%) mężczyzn, o średniej wieku 57,35 ± 4,22 lat i w przedziale wiekowym 26-87 lat. Wyniki wykazały, że stosunek ekspresji genu MLH1 u pacjentów zmniejszył się w porównaniu z osobami zdrowymi, a spadek ekspresji genów w różnych stadiach choroby był znaczący. Wyniki tego badania wykazały, że zmniejszenie ekspresji genu MLH1 odgrywa skuteczną rolę w rozwoju CRC.

Wprowadzenie

Rak jelita grubego (CRC) jest jednym z najczęstszych rodzajów raka. Jest to czwarta najczęstsza przyczyna zgonów związanych z rakiem na świecie1. CRC występuje częściej u mężczyzn niż u kobiet i jest trzy do czterech razy częstszy w krajach uprzemysłowionych niż w krajach rozwijających się. Standaryzowany pod względem wieku (globalny) współczynnik zapadalności na 1 x 105 przypadków CRC wynosi 19,7 u obu płci, 23,6 u mężczyzn i 16,3 u kobiet2. Badania epidemiologiczne wykazały silne powiązania środowiskowe i styl życia z CRC. Otyłość, czerwone/przetworzone mięso, tytoń, alkohol, terapia deprywacji androgenów i cholecystektomia są związane z nieznacznie zwiększonym ryzykiem CRC2,3.

Niestabilność chromosomalna, niestabilność mikrosatelitarna i fenotyp metylatora wyspy CpG (CIMP) odgrywają ważną rolę w nowotworzeniu CRC4. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, u pacjentów z CRC zidentyfikowano około 250 różnych mutacji, co odpowiada około 55% znanych mutacji związanych z genami naprawy niedopasowania DNA (MMR). Defekty w białkach naprawczych niedopasowania mogą być spowodowane mutacjami linii zarodkowej w genach MSH6, MLH1, PMS2 i MSH2, a większość tych mutacji znajduje się w genach MLH1 i MSH24,5. Najważniejszym białkiem w układzie MMR, które zwykle bierze udział w CRC, jest MLH1. Ostatnie badania wykazały, że każda zmiana w ekspresji MLH1 może zwiększać ryzyko CRC. Mutacje linii zarodkowej w MLH1 są odpowiedzialne za zespół Lyncha, dziedziczny typ CRC. Ponadto 13%-15% przypadków rozlanego raka jelita grubego jest spowodowanych niedoborem MLH1 w oparciu o hipermetylację promotora somatycznego6,7,8.

Gen MLH1 znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu 3 na pozycji 22.2 i zawiera 21 eksonów9. Białko kodowane przez gen MLH1 może współpracować z endonukleazą zaangażowaną w naprawę niedopasowania, PMS2, w celu wytworzenia MutLα, który jest częścią systemu MMR. MutLα bierze udział głównie w naprawie niedopasowań zasada-zasada oraz pętli delecji i addycji w wyniku niepełnej replikacji DNA. Ponadto kodowane białko bierze udział w sygnalizacji uszkodzeń DNA i może zostać przekształcone do formy ɣMutL z białkiem MLH3, które bierze udział w naprawie niedopasowania DNA obserwowanej w mejozie10,11,12. Badania wykazały, że MLH1 bierze udział w innych głównych aktywnościach komórkowych, w tym w regulacji punktów kontrolnych cyklu komórkowego, apoptozie, rekombinacji krzyżowej i niezgodności mitotycznej13.

Gen MLH1 odgrywa kluczową rolę w systemie naprawy niedopasowania DNA (MMR). Defekt funkcji tego genu może prowadzić do akumulacji mutacji genetycznych, a w efekcie do rozwoju raka jelita grubego14. Wcześniejsze badania wykazały, że około 55% mutacji związanych z genami MMR u pacjentów z CRC jest związanych z mutacjami genu MLH1. Ponadto zmniejszona ekspresja genu MLH1 może prowadzić do zespołu Lyncha, który jest dziedziczną postacią raka jelita grubego15,16. Również defekt genu MLH1 oparty na hipermetylacji promotora somatycznego zaobserwowano w 13%-15% sporadycznych przypadków raka jelita grubego17. Te dowody naukowe pokazują, że gen MLH1 działa jako ważny biomarker w raku jelita grubego, a analiza jego ekspresji może dostarczyć cennych informacji na temat funkcji szlaku MMR i genetycznego ryzyka CRC18. Pomiar poziomu ekspresji MLH1 we krwi obwodowej pacjentów z rakiem jelita grubego może dostarczyć cennych informacji na temat funkcjonalności szlaku MMR, który często jest zaburzony w raku jelita grubego. Metoda ta może być wykorzystana do celów prognostycznych, a także do zrozumienia genetycznej podatności na raka jelita grubego19,20. Badanie dotyczące związku między mutacją MLH1 415 locus G do C a sporadycznym rakiem jelita grubego u chińskich pacjentów wykazało, że częstość występowania genotypu MLH1 C/C była znacznie wyższa u sporadycznych pacjentów z CRC niż w grupie kontrolnej, co sugeruje genetyczną podatność na sporadyczne CRC u chińskich pacjentów21. W innym badaniu porównano ekspresję genów biomarkerów genetycznych CRC w próbkach krwi obwodowej i biopsji pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit (IBD), podkreślając potencjał analizy ekspresji genów krwi obwodowej dla zrozumienia biomarkerów związanych z rakiem jelita grubego22.

Biorąc pod uwagę ważną rolę genu MLH1 i badania przeprowadzone w ostatnich dziesięcioleciach z analizą molekularną poprzez profilowanie ekspresji mRNA, nowotwory zostały sklasyfikowane z większą dokładnością. Celem tego badania było ilościowe zbadanie ekspresji MLH1 w próbkach krwi obwodowej pacjentów z CRC za pomocą PCR w czasie rzeczywistym oraz zbadanie jego związku z czynnikami patologicznymi, etapami progresji guza do warstw ściany jelita (T) oraz etapami inwazji węzłów chłonnych (N). Badanie to przeprowadzono u 36 pacjentów z CRC w celu potencjalnego ustalenia ilościowych zmian w ekspresji genów jako biomarkerów do badań przesiewowych CRC, rokowania i diagnozy przy użyciu próbek krwi obwodowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Między kwietniem 2021 a majem 2023 przeprowadzono badanie kliniczno-kontrolne w Szpitalu Stowarzyszonym 2 Uniwersytetu Nantong. Nawiąż kontakt z działem administracyjnym szpitala w celu ustalenia ram badania. Zgodę etyczną uzyskano poprzez przedłożenie propozycji badania Komitetowi Etyki Uniwersytetu Nantong. Przestrzegano wytycznych etycznych w celu zapewnienia poufności i świadomej zgody.

1. Rekrutacja pacjentów i projektowanie badań

  1. Pobieranie próbek w celu włączenia uczestników do badania
    1. Zbadaj ekspresję genu MLH1 we krwi obwodowej 36 osób z rakiem jelita grubego i grupy kontrolnej. Opracuj jasne kryteria włączania i wykluczania przy wyborze uczestników.
    2. Rekrutuj osoby, u których zdiagnozowano określone rodzaje raka jelita grubego (rak odbytnicy, jelita ślepego, rak wstępujący, poprzeczny i zstępujący, które zostały uznane za mające guzy jelita grubego) i uzyskały świadomą zgodę.
    3. Wyklucz osoby z innymi diagnozami raka lub schorzeniami, które mogą zakłócić analizę ekspresji genów. Ponadto należy wykluczyć uczestników, którzy w ciągu ostatnich 3 miesięcy przetaczali krew, w ciągu ostatnich 6 miesięcy przechodzili chemioterapię lub radioterapię, w których spożywano alkohol lub zażywano narkotyki, a także występowali w nich choroby autoimmunologiczne lub choroby zapalne jelit.
  2. Kategoryzuj kliniczne czynniki ryzyka zgodnie z systemem oceny stopnia zaawansowania TNM (guz, węzły i przerzuty), biorąc pod uwagę masę nowotworu, wielkość guza i inwazję na sąsiednie narządy23,24.
    1. Podziel różne stadia raka (0-4) na podstawie dostępnych danych z pliku patologicznego.
    2. Podziel tempo wzrostu i progresji guza w warstwach ściany jelita (indeks T) na cztery odrębne grupy (T1-4, T0-TX) i inwazję węzłów chłonnych (indeks N) na cztery grupy (N1-3, N0-NX).
  3. Przygotuj grupę kontrolną z osobami zdrowymi.
    1. Dopasuj grupę kontrolną do grupy pacjentów pod względem wieku i płci. Zbierz szczegółowe dane demograficzne dla każdego uczestnika, aby zapewnić porównywalność.
  4. Proces świadomej zgody
    1. Przygotuj dokumenty świadomej zgody, które wyjaśniają cel badania, procedury i potencjalne ryzyko.
    2. Nawiąż kontakt z uczestnikami, dając im wystarczająco dużo czasu na zadawanie pytań. Zbierz podpisane formularze świadomej zgody przed przystąpieniem do pobierania próbek.

2. Ekstrakcja i oczyszczanie RNA

  1. Pobieranie próbek krwi obwodowej
    1. Uzyskaj dostępne na rynku probówki z powłoką EDTA, które są certyfikowane do użytku klinicznego lub laboratoryjnego. Sprawdź datę ważności probówek. Sprawdź integralność opakowania tuby.
    2. Poinstruuj uczestnika, aby usiadł wygodnie. Za pomocą sterylnej strzykawki pobrać 5 ml krwi z żyły łokciowej. Upewnij się, że uczestnik jest zrelaksowany, z wyciągniętym ramieniem, aby odsłonić żyłę. Natychmiast przenieś próbki krwi do przygotowanych probówek, zapewniając minimalną ekspozycję na powietrze.
    3. Próbki należy utrzymywać w temperaturze 4 °C podczas transportu do laboratorium w celu zachowania integralności RNA.
  2. Użyj mini zestawu RNA krwi do izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Krótko mówiąc, poddać lizie czerwone krwinki, inkubując próbkę krwi pełnej z Buffer EL na lodzie. Odwirować w celu osadzenia leukocytów i odrzucenia supernatantu. Lizować leukocyty za pomocą buforu RLT i homogenizować lizat za pomocą kolumny rozdrabniacza.
    2. Dodać etanol do homogenizowanego lizatu i przenieść do kolumny wirowej. Umyć kolumnę buforem RW1 i buforem RPE. Eluuj oczyszczony RNA, dodając do kolumny wodę wolną od RNaz i odwirowując.
  3. Ocena ilości i jakości RNA
    1. Kwantyfikacja RNA: Zastosuj spektrofotometr do pomiaru stężenia i czystości RNA. Otwórz oprogramowanie na podłączonym komputerze. Wybierz opcję Kwas nukleinowy z menu głównego. Nanieść 1 μl próbki RNA na obszar próbki.
    2. Badanie czystości i integralności RNA
      UWAGA: Integralność i rozkład wielkości całkowitego RNA oczyszczonego za pomocą mini zestawu RNA do krwi można sprawdzić za pomocą spektrofotometrii i elektroforezy żelowej. Rybosomalne RNA powinny pojawiać się jako ostre pasma lub piki. Pozorny stosunek 28S rRNA do 18S rRNA powinien wynosić około 2:1. Jeśli prążki rybosomalne lub piki określonej próbki nie są ostre, ale pojawiają się jako rozmazanie w kierunku RNA o mniejszych rozmiarach; jest prawdopodobne, że próbka uległa znacznej degradacji przed lub w trakcie oczyszczania RNA.
      1. W przypadku pomiaru spektrofotometrii opuść ramię urządzenia i kliknij przycisk Zmierz, aby uzyskać stosunek A260/A280. Oceń czystość próbki RNA, dążąc do uzyskania stosunku A260/A280 między 1,8 a 2,0.
      2. Wykonaj 1% elektroforezę w żelu agarozowym, jak opisano poniżej.
        1. Przygotować 1% roztwór agarozy, ogrzewając proszek agarozy w buforze TAE aż do rozpuszczenia. Dodać bromek etydyny do roztworu agarozy, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 μg/ml. Wlać roztwór bromku agarozy i etydyny do tacki do odlewania żelu i pozostawić do zestalenia.
          UWAGA: Bromek etydyny jest barwnikiem fluorescencyjnym, który interkaluje z RNA, aby umożliwić wizualizację w świetle UV.
        2. Wymieszaj próbki RNA z barwnikiem ładującym i ostrożnie załaduj je do studzienek zestalonego żelu. Uruchom elektroforezę żelową przy napięciu 100 V przez około 30 minut, aby oddzielić fragmenty RNA według wielkości. Wizualizuj prążki RNA, umieszczając żel na transiluminatorze UV lub systemie obrazowania, co powoduje fluoryzację RNA barwionego bromkiem etydyny.
  4. Przechowywanie wyekstrahowanego RNA
    1. Pobrać wyekstrahowane próbki RNA. Porcjować RNA do sterylnych probówek do mikrowirówek, używając 10 μl objętości na podwielokrotność. Przechowywać podwielokrotności RNA w temperaturze -80 °C lub niższej.
  5. Odwrotna transkrypcja RNA do cDNA
    1. Postępuj zgodnie z protokołem zestawu do odwrotnej transkrypcji. Rozmrozić i przygotować niezbędne odczynniki na lodzie i w temperaturze pokojowej.
    2. Przeprowadź reakcję eliminacji genomowego DNA, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenie genomowego DNA.
    3. Przygotować główną mieszankę odwrotnej transkrypcji na lodzie, która zawiera wszystkie składniki z wyjątkiem matrycy RNA.
    4. Dodaj matrycę RNA z etapu eliminacji DNA do głównej mieszanki odwrotnej transkrypcji. Inkubować reakcję odwrotnej transkrypcji w temperaturze 42 °C przez 15 minut.
    5. Inaktywować enzym odwrotnej transkryptazy przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 3 minuty. Użyć podwielokrotności gotowego cDNA do natychmiastowego PCR w czasie rzeczywistym lub przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

3. Projekt startera do PCR w czasie rzeczywistym

  1. Selekcja genów docelowych i kontrole wewnętrzne
    1. Wybierz gen MLH1 jako cel do oceny ilościowej ze względu na jego związek z rakiem jelita grubego. Wybierz β-aktynę jako wewnętrzną kontrolę dla normalizacji danych dotyczących ekspresji genów.
  2. Proces projektowania podkładów
    1. Uruchom oprogramowanie do projektowania starterów i wprowadź sekwencję genu MLH1 uzyskaną z przeglądarki genomu Ensemble lub UCSC.
    2. Ustaw temperaturę topnienia (Tm) dla starterów w zakresie 58-60 °C, optymalną zawartość GC na poziomie 40%-60%, a długość startera w zakresie 18-24 nukleotydów.
    3. Wprowadź zaprojektowane sekwencje starterów do bazy danych NCBI BLAST, aby potwierdzić specyficzność.
      1. Wejdź na stronę BLAST, wybierz Nucleotide BLAST. Wklej sekwencje starterów w polu wyszukiwania i kliknij BLAST.
      2. Przeanalizuj wyniki, aby upewnić się, że nie przewiduje się wzmocnienia poza celem. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 1.

4. PCR w czasie rzeczywistym

  1. Konfiguracja reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 2.
    1. Odwirować odczynniki w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 10 000 x g, aby zebrać zawartość na dnie probówek.
    2. Przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z protokołem zestawu komercyjnego, który zawiera SYBR Green, bufor, dNTPs, MgCl2 i polimerazę Taq.
    3. Umieść mieszaninę wzorcową w znakowanych probówkach PCR, zapewniając stałą objętość we wszystkich próbkach.
    4. Dodaj odpowiednią objętość starterów do przodu i do tyłu dla MLH1 i β-aktyny do odpowiednich probówek.
    5. Rozcieńczyć próbki RNA do stałego stężenia 100 ng / μl przed odwrotną transkrypcją i odwrotną transkrypcją do cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji.
  2. Wzmocnienie i gromadzenie danych
    1. Umieść probówki PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym.
    2. Zaprogramuj termocykler ze zoptymalizowanymi warunkami cyklu: 95 °C przez 20 s w przypadku denaturacji, 54 °C przez 30 s w przypadku wyżarzania i 72 °C przez 30 s w przypadku przedłużenia. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 3.
    3. Ustaw maszynę tak, aby działała przez 45 cykli.
    4. Monitoruj reakcję w czasie rzeczywistym za pomocą interfejsu oprogramowania systemu, obserwując krzywe wzmocnienia dla każdej próbki.
    5. Uwzględnij kontrolę ujemną bez cDNA, aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczenia. Powtórz przebieg PCR 3 razy dla każdej próbki, aby zapewnić wiarygodność danych.
  3. analiza danych
    1. Po zakończeniu cykli należy użyć oprogramowania systemu do analizy wartości progowych cyklu (Ct). Wyeksportuj wartości Ct do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
    2. Oblicz względną ekspresję genów za pomocą metody 2-ΔΔCt25, normalizując dane do kontroli β-aktyny.

5. Immunohistochemia i analizy genetyczne

  1. Przeprowadzić immunohistochemię na skrawkach tkanki, aby skorelować ekspresję białka MLH1 z poziomami ekspresji genów.
    1. Przygotować preparaty tkankowe i nałożyć przeciwciało anty-MLH1.
    2. Użyj zestawu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP i substratu DAB (3,3'-diaminobenzydyna). Wywołaj szkiełka zgodnie z instrukcjami zestawu i przeanalizuj je za pomocą mikroskopu świetlnego.
  2. Wykonaj PCR specyficzne dla metylacji i testy niestabilności mikrosatelitarnej, aby odróżnić zespół Lyncha od sporadycznego CRC.
    1. Użyj komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA. Postępuj zgodnie z protokołem zestawu zarówno dla krwi, jak i tkanek nowotworowych.
    2. Potraktuj DNA za pomocą zestawu do konwersji wodorosiarczynu. Stosować startery specyficzne dla metylacji przeznaczone dla regionu promotora MLH1. Wykonaj PCR zgodnie z protokołem zestawu.
    3. Uruchom elektroforezę żelową na produktach PCR, aby zobrazować stan metylacji.
    4. Do badania niestabilności mikrosatelitarnej (MSI), elektroforeza kapilarna przy użyciu analizatora genetycznego. Porównaj długości mikrosatelitów, analizując produkty PCR znakowane fluorescencyjnie.

6. Analiza statystyczna

  1. Korzystaj z komercyjnego oprogramowania do analizy statystycznej do analizy danych.
    1. Otwórz oprogramowanie i utwórz nowy zestaw danych dla ekspresji genów i danych demograficznych.
    2. Wprowadź względne wartości ekspresji genów i odpowiadające im dane demograficzne do zestawu danych.
    3. Użyj testu Kołmogorowa-Smirnowa, aby ocenić normalność danych.
      1. Wybierz pozycję Analizuj z górnego menu, wybierz pozycję Testy nieparametryczne, a następnie pozycję Starsze okna dialogowe.
      2. Kliknij Test Kołmogorowa-Smirnowa i wprowadź zmienną do ekspresji genów. Wykonaj test i zinterpretuj dane wyjściowe pod kątem znaczenia normalności rozkładu.
    4. Przeprowadź testy T, aby porównać ekspresję genu MLH1 między pacjentami a grupą kontrolną.
      1. Wybierz pozycję Analizuj, a następnie pozycję Porównaj średnie i wybierz pozycję Test t dla prób niezależnych.
      2. Przypisz przynależność do grupy (pacjent lub grupa kontrolna) jako zmienną grupującą i ekspresję genu jako zmienną testową. Uruchom test i zinterpretuj dwustronny poziom istotności.
    5. Oblicz zmiany krotności w ekspresji genów za pomocą metody 2-ΔΔCt25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu u 36 pacjentów z rakiem jelita grubego zbadano ekspresję genu MLH1 we krwi obwodowej oraz jej związek z rakiem jelita grubego. Analiza zmiennych demograficznych wykazała, że 15 pacjentów (41,6%) było kobietami, a 21 pacjentów (58,4%) mężczyznami. Średni wiek pacjentów wynosił 57,35 ± 4,22 lat, a zakres wieku od 26 do 87 lat. Status wskaźnika masy ciała (BMI) pacjentów wykazał, że 14 pacjentów (38,8%) miało BMI w normie (18,5 i 24,9 kg/m2), a 22 pacjentów (61,2%) miało BMI poza zak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to zostało przeprowadzone w celu zbadania ekspresji genu MLH1 . W badaniu tym wykazano, że poziom ekspresji genu MLH1 był obniżony u osób chorych w porównaniu z osobami zdrowymi. Na podstawie badań zmian fałdowych wykazano, że ekspresja genu MLH1 w stadium II, III i IV u osób chorych w porównaniu z osobami zdrowymi uległa znacznemu zmniejszeniu.

Rak jelita grubego stanowi poważny problem w leczeniu nowotworów na świecie ze względu na jego rozpowszechnienie i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność i uznanie dla wszystkich, którzy pomogli nam ukończyć to przedsięwzięcie badawcze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowym SystemyBio-RadMini-Sub Cell GTSłuży do sprawdzania jakości RNA
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichE9884Stosowany jako antykoagulant do próbek krwi
NanoDropThermoFisher ScientificND-2000używany do określania czystości RNA
Zastosowano maszynę do PCR w czasie rzeczywistym BiosystemsA34322Używany do reakcji RT-PCR
Zestaw do ekstrakcji RNAIntron Biotechnology Co#Cat 17061Używany do ekstrakcji RNA z próbek krwi
Zestaw SYBR Green PCRThermo Fisher Scientific4309155Odczynniki używane do eksperymentów RT-PCR
Spektrofotometr

Bibliografia

  1. Favoriti, P., et al. Worldwide burden of colorectal cancer: a review. Updates Surg. 68 (1), 7-11 (2016).
  2. Lotfollahzadeh, S., Recio-Boiles, A., Cagir, B. Colon cancer. StatPearls. , (2024).
  3. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Prz Gastroenterol. 14 (2), 89-103 (2019).
  4. Woischke, C., Michl, M., Neumann, J. Molecular pathology of colorectal cancer. Pathologie. 44 (5), 279-286 (2023).
  5. Lachit, K., Vinita, P. Study of mismatch repair protein expression by using immunohistochemistry in various carcinomas with special reference to colorectal adenocarcinomas-at a tertiary referral laboratory in India. Asian Pacific J Cancer Biol. 7 (4), 341-347 (2022).
  6. Cerretelli, G., Ager, A., Arends, M. J., Frayling, I. M. Molecular pathology of Lynch syndrome. J Pathol. 250 (5), 518-531 (2020).
  7. Tiwari, A. K., Roy, H. K., Lynch, H. T. Lynch syndrome in the 21st century: clinical perspectives. QJM. 109 (3), 151-158 (2016).
  8. Hinrichsen, I., et al. Reduced migration of MLH1 deficient colon cancer cells depends on SPTAN1. Mol Cancer. 13 (1), 1-12 (2014).
  9. Nissar, B., Shah, I. A., ul Afshan, F., Ganai, B. A. A decade in unravelling the etiology of gastric carcinogenesis in Kashmir, India - A high risk region. Gene Rep. 21 (1), 100832(2020).
  10. Reyes, G. X., Schmidt, T. T., Kolodner, R. D., Hombauer, H. New insights into the mechanism of DNA mismatch repair. Chromosoma. 124 (4), 443-462 (2015).
  11. Rogacheva, M. V., et al. Mlh1-Mlh3, a meiotic crossover and DNA mismatch repair factor, is a Msh2-Msh3-stimulated endonuclease. J Biol Chem. 289 (9), 5664-5673 (2014).
  12. Martin, S. A. The DNA mismatch repair pathway. DNA Repair Cancer Ther. , 151-177 (2016).
  13. Fukuhara, S., et al. DNA mismatch repair gene MLH1 induces apoptosis in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (22), 11297-11307 (2014).
  14. Boland, C. R., Goel, A., Patel, S. G. The genetic and epigenetic landscape of early-onset colorectal cancer. Colorectal Cancer. 9 (3), CRC23 (2020).
  15. Özdemir, Z., et al. Uncommon variants detected via hereditary cancer panel and suggestions for genetic counseling. Mutat Res. 827, 111831(2023).
  16. Sinicrope, F. A. Lynch syndrome-associated colorectal cancer. New Engl J Med. 379 (8), 764-773 (2018).
  17. Westwood, A., et al. Additional loss of MSH2 and MSH6 expression in sporadic deficient mismatch repair colorectal cancer due to MLH1 promoter hypermethylation. J Clin Pathol. 72 (6), 443-447 (2019).
  18. Chung, C. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in colorectal cancer: A 2021 update on current development, evidence, and recommendation. J Oncol Pharm Pract. 28 (4), 850-869 (2022).
  19. Yu, H., et al. The mRNA level of MLH1 in peripheral blood is a biomarker for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Am J Cancer Res. 6 (5), 1135-1140 (2016).
  20. Kasprzak, A. Prognostic biomarkers of cell proliferation in colorectal cancer (CRC): From immunohistochemistry to molecular biology techniques. Cancers. 15 (18), 4570(2023).
  21. Tao, W., Xie, Y. Study on relationship between NILH1 gene 415 locus G→G mutation and sporadic colorectal cancer in Chinese patients. Chinese J Exp Surg. 26 (6), 752-754 (2009).
  22. Martinez, E. C., Zevallos-Delgado, C., Joseph, M. Analysis of the genetic expression of colon cancer genetic biomarkers on inflammatory bowel disease on blood and biopsy samples. Genomics Gene Func. 164, 4 Supplement S49(2023).
  23. Rahiminejad, S., Maurya, M. R., Mukund, K., Subramaniam, S. Modular and mechanistic changes across stages of colorectal cancer. BMC cancer. 22 (1), 436(2022).
  24. Alrushaid, N., Khan, F. A., Al-Suhaimi, E., Elaissari, A. Progress and perspectives in colon cancer pathology, diagnosis, and treatments. Diseases. 11 (4), 148(2023).
  25. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinfo Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  26. Jurescu, A., et al. Colorectal carcinomas: Searching for new histological parameters associated with lymph node metastases. Medicina. 59 (10), 1761(2023).
  27. Sawicki, T., et al. A review of colorectal cancer in terms of epidemiology, risk factors, development, symptoms and diagnosis. Cancers. 13 (9), 2025(2021).
  28. Cardoso, R., et al. Overall and stage-specific survival of patients with screen-detected colorectal cancer in European countries: A population-based study in 9 countries. Lancet Reg Health Eur. 21 (1), 100458(2022).
  29. Dekker, E., Tanis, P. J., Vleugels, J. L. A., Kasi, P. M., Wallace, M. B. Colorectal cancer. Lancet. 394 (10207), 1467-1480 (2019).
  30. Hull, M. A., Rees, C. J., Sharp, L., Koo, S. A risk-stratified approach to colorectal cancer prevention and diagnosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (12), 773-780 (2020).
  31. Hossain, M. S., et al. Colorectal cancer: A review of carcinogenesis, global epidemiology, current challenges, risk factors, preventive and treatment strategies. Cancers. 14 (7), 1732(2022).
  32. Guyot D'Asnières De Salins, A., et al. Discordance between immunochemistry of mismatch repair proteins and molecular testing of microsatellite instability in colorectal cancer. ESMO open. 6 (3), 100120(2021).
  33. Chen, W., Swanson, B. J., Frankel, W. L. Molecular genetics of microsatellite-unstable colorectal cancer for pathologists. Diagn Pathol. 12 (1), 24(2017).
  34. Li, J., et al. Role of MLH1 methylation in esophageal cancer carcinogenesis and its clinical significance. Onco Targets Ther. 11 (1), 651-663 (2018).
  35. Iyer, R. R., Pluciennik, A. DNA mismatch repair and its role in Huntington's disease. J Huntingtons Dis. 10 (1), 75-94 (2021).
  36. Rebuzzi, F., Ulivi, P., Tedaldi, G. Genetic predisposition to colorectal cancer: How many and which genes to test. Int J Mol Sci. 24 (3), 2137(2023).
  37. Guo, L., Yu, Z., Li, Q., Liang, X., Yang, L. Correlation of MLH1 and MSH2 levels with clinicopathologic characteristics in colorectal cancer. Am J Transl Res. 15 (2), 1107-1116 (2023).
  38. Liu, Y., Yang, C., Li, W., Zhang, S., Li, L. Analysis of association of MLH1 and PMS2 gene expression with clinicopathological features in elderly patients with colorectal cancer. Chinese J Geriatrics. 1 (12), 927-930 (2020).
  39. Salem, M. E., et al. Molecular analyses of left- and right-sided tumors in adolescents and young adults with colorectal cancer. Oncologist. 25 (5), 404-413 (2020).
  40. Goshayeshi, L., et al. Prevalence and clinicopathological characteristics of mismatch repair-deficient colorectal carcinoma in early onset cases as compared with late-onset cases: a retrospective cross-sectional study in Northeastern Iran. BMJ open. 8 (8), e023102(2018).
  41. Zaborowski, A. M., et al. Clinicopathological features and oncological outcomes of patients with young-onset rectal cancer. Br J Surg. 107 (5), 606-612 (2020).
  42. Paredes, S. R., Chan, C., Rickard, M. Immunohistochemistry in screening for heritable colorectal cancer: what to do with an abnormal result. ANZ J Surg. 90 (5), 702-707 (2020).
  43. Anvari, A. H., Ganji, S. M., Movahhed, T. K. Cellular MLH1 gene expression and pathologic factors in Iranian patients with colorectal cancer. Qom Univ Med Sci J. 14 (8), 62-70 (2020).
  44. Sahin, I. H., et al. Analysis of age, tumor-sidedness, and mismatch repair (MMR) genes with response to immune checkpoint inhibitors (ICIs) in MMR-deficient (dMMR) colorectal cancer (CRC) patients (pts): A multi-institutional study. J Clinl Oncol. 37 (15), e15029(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Rak jelita grubegoPCR w czasie rzeczywistymanaliza ekspresji genównaciekanie nowotworowenaciekanie węzłów chłonnychekstrakcja RNAsynteza cDNA

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.