Artykuł metodologiczny

Zobacz materiał MLH1 Ekspresja genów we krwi obwodowej u pacjentów z rakiem jelita grubego i ich związek z rakiem jelita grubego

977 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66387

⸱

27 września 2024

 ,  , 
1Oncology Department, Affiliated Hospital 2 of Nantong University, Nantong First People's Hospital, 2Department of Emergency, Affiliated Hospital 2 of Nantong University, Nantong First People's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie bada związek między ekspresją genu MLH1 we krwi obwodowej a rakiem jelita grubego, wykorzystując podejście case-control do porównania poziomów ekspresji u pacjentów i dopasowanych zdrowych osób kontrolnych.

Streszczenie

MutL homolog 1 (MLH1) jest składnikiem heterodimerycznego kompleksu MutLα, który wykrywa i naprawia niedopasowania zasada-zasada oraz pętle insercji/delecji spowodowane nieprawidłowym włączeniem nukleotydów. W przypadku braku białka MLH1 zwiększa się częstość nienaprawionych niedopasowań, co prowadzi do raka narządów. Obecne badanie miało na celu ilościowe określenie ekspresji genu MLH1 i jej związku z inwazją guza (T) i inwazją węzłów chłonnych (N) w próbkach krwi od pacjentów z rakiem jelita grubego (CRC). Próbki krwi pobrano od 36 pacjentów z rakiem jelita grubego. RNA wyekstrahowano, a cDNA zsyntetyzowano za pomocą zestawu. Startery zbudowano przy użyciu podejścia opartego na połączeniu ekson-ekson, a geny MLH1 i β-aktyny przetestowano 3x przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR). Do analizy danych wykorzystano oprogramowanie do analizy ekspresji genów, a test t użyto do zbadania ekspresji MLH1 i jej związku ze zmiennymi T i N. W badaniu wzięło udział 36 pacjentów z rakiem jelita grubego, w tym 15 (41,6%) kobiet i 21 (58,4%) mężczyzn, o średniej wieku 57,35 ± 4,22 lat i w przedziale wiekowym 26-87 lat. Wyniki wykazały, że stosunek ekspresji genu MLH1 u pacjentów zmniejszył się w porównaniu z osobami zdrowymi, a spadek ekspresji genów w różnych stadiach choroby był znaczący. Wyniki tego badania wykazały, że zmniejszenie ekspresji genu MLH1 odgrywa skuteczną rolę w rozwoju CRC.

Wprowadzenie

Rak jelita grubego (CRC) jest jednym z najczęstszych rodzajów raka. Jest to czwarta najczęstsza przyczyna zgonów związanych z rakiem na świecie1. CRC występuje częściej u mężczyzn niż u kobiet i jest trzy do czterech razy częstszy w krajach uprzemysłowionych niż w krajach rozwijających się. Standaryzowany pod względem wieku (globalny) współczynnik zapadalności na 1 x 105 przypadków CRC wynosi 19,7 u obu płci, 23,6 u mężczyzn i 16,3 u kobiet2. Badania epidemiologiczne wykazały silne powiązania środowiskowe i styl życia z CRC. Otyłość, czerwone/przetworzone mięso, tytoń, alkohol, terapia deprywacji androgenów i cholecystektomia są związane z nieznacznie zwiększonym ryzykiem CRC2,3.

Niestabilność chromosomalna, niestabilność mikrosatelitarna i fenotyp metylatora wyspy CpG (CIMP) odgrywają ważną rolę w nowotworzeniu CRC4. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, u pacjentów z CRC zidentyfikowano około 250 różnych mutacji, co odpowiada około 55% znanych mutacji związanych z genami naprawy niedopasowania DNA (MMR). Defekty w białkach naprawczych niedopasowania mogą być spowodowane mutacjami linii zarodkowej w genach MSH6, MLH1, PMS2 i MSH2, a większość tych mutacji znajduje się w genach MLH1 i MSH24,5. Najważniejszym białkiem w układzie MMR, które zwykle bierze udział w CRC, jest MLH1. Ostatnie badania wykazały, że każda zmiana w ekspresji MLH1 może zwiększać ryzyko CRC. Mutacje linii zarodkowej w MLH1 są odpowiedzialne za zespół Lyncha, dziedziczny typ CRC. Ponadto 13%-15% przypadków rozlanego raka jelita grubego jest spowodowanych niedoborem MLH1 w oparciu o hipermetylację promotora somatycznego6,7,8.

Gen MLH1 znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu 3 na pozycji 22.2 i zawiera 21 eksonów9. Białko kodowane przez gen MLH1 może współpracować z endonukleazą zaangażowaną w naprawę niedopasowania, PMS2, w celu wytworzenia MutLα, który jest częścią systemu MMR. MutLα bierze udział głównie w naprawie niedopasowań zasada-zasada oraz pętli delecji i addycji w wyniku niepełnej replikacji DNA. Ponadto kodowane białko bierze udział w sygnalizacji uszkodzeń DNA i może zostać przekształcone do formy ɣMutL z białkiem MLH3, które bierze udział w naprawie niedopasowania DNA obserwowanej w mejozie10,11,12. Badania wykazały, że MLH1 bierze udział w innych głównych aktywnościach komórkowych, w tym w regulacji punktów kontrolnych cyklu komórkowego, apoptozie, rekombinacji krzyżowej i niezgodności mitotycznej13.

Gen MLH1 odgrywa kluczową rolę w systemie naprawy niedopasowania DNA (MMR). Defekt funkcji tego genu może prowadzić do akumulacji mutacji genetycznych, a w efekcie do rozwoju raka jelita grubego14. Wcześniejsze badania wykazały, że około 55% mutacji związanych z genami MMR u pacjentów z CRC jest związanych z mutacjami genu MLH1. Ponadto zmniejszona ekspresja genu MLH1 może prowadzić do zespołu Lyncha, który jest dziedziczną postacią raka jelita grubego15,16. Również defekt genu MLH1 oparty na hipermetylacji promotora somatycznego zaobserwowano w 13%-15% sporadycznych przypadków raka jelita grubego17. Te dowody naukowe pokazują, że gen MLH1 działa jako ważny biomarker w raku jelita grubego, a analiza jego ekspresji może dostarczyć cennych informacji na temat funkcji szlaku MMR i genetycznego ryzyka CRC18. Pomiar poziomu ekspresji MLH1 we krwi obwodowej pacjentów z rakiem jelita grubego może dostarczyć cennych informacji na temat funkcjonalności szlaku MMR, który często jest zaburzony w raku jelita grubego. Metoda ta może być wykorzystana do celów prognostycznych, a także do zrozumienia genetycznej podatności na raka jelita grubego19,20. Badanie dotyczące związku między mutacją MLH1 415 locus G do C a sporadycznym rakiem jelita grubego u chińskich pacjentów wykazało, że częstość występowania genotypu MLH1 C/C była znacznie wyższa u sporadycznych pacjentów z CRC niż w grupie kontrolnej, co sugeruje genetyczną podatność na sporadyczne CRC u chińskich pacjentów21. W innym badaniu porównano ekspresję genów biomarkerów genetycznych CRC w próbkach krwi obwodowej i biopsji pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit (IBD), podkreślając potencjał analizy ekspresji genów krwi obwodowej dla zrozumienia biomarkerów związanych z rakiem jelita grubego22.

Biorąc pod uwagę ważną rolę genu MLH1 i badania przeprowadzone w ostatnich dziesięcioleciach z analizą molekularną poprzez profilowanie ekspresji mRNA, nowotwory zostały sklasyfikowane z większą dokładnością. Celem tego badania było ilościowe zbadanie ekspresji MLH1 w próbkach krwi obwodowej pacjentów z CRC za pomocą PCR w czasie rzeczywistym oraz zbadanie jego związku z czynnikami patologicznymi, etapami progresji guza do warstw ściany jelita (T) oraz etapami inwazji węzłów chłonnych (N). Badanie to przeprowadzono u 36 pacjentów z CRC w celu potencjalnego ustalenia ilościowych zmian w ekspresji genów jako biomarkerów do badań przesiewowych CRC, rokowania i diagnozy przy użyciu próbek krwi obwodowej.

Protokół

Między kwietniem 2021 a majem 2023 przeprowadzono badanie kliniczno-kontrolne w Szpitalu Stowarzyszonym 2 Uniwersytetu Nantong. Nawiąż kontakt z działem administracyjnym szpitala w celu ustalenia ram badania. Zgodę etyczną uzyskano poprzez przedłożenie propozycji badania Komitetowi Etyki Uniwersytetu Nantong. Przestrzegano wytycznych etycznych w celu zapewnienia poufności i świadomej zgody.

1. Rekrutacja pacjentów i projektowanie badań

  1. Pobieranie próbek w celu włączenia uczestników do badania
    1. Zbadaj ekspresję genu MLH1 we krwi obwodowej 36 osób z rakiem jelita grubego i grupy kontrolnej. Opracuj jasne kryteria włączania i wykluczania przy wyborze uczestników.
    2. Rekrutuj osoby, u których zdiagnozowano określone rodzaje raka jelita grubego (rak odbytnicy, jelita ślepego, rak wstępujący, poprzeczny i zstępujący, które zostały uznane za mające guzy jelita grubego) i uzyskały świadomą zgodę.
    3. Wyklucz osoby z innymi diagnozami raka lub schorzeniami, które mogą zakłócić analizę ekspresji genów. Ponadto należy wykluczyć uczestników, którzy w ciągu ostatnich 3 miesięcy przetaczali krew, w ciągu ostatnich 6 miesięcy przechodzili chemioterapię lub radioterapię, w których spożywano alkohol lub zażywano narkotyki, a także występowali w nich choroby autoimmunologiczne lub choroby zapalne jelit.
  2. Kategoryzuj kliniczne czynniki ryzyka zgodnie z systemem oceny stopnia zaawansowania TNM (guz, węzły i przerzuty), biorąc pod uwagę masę nowotworu, wielkość guza i inwazję na sąsiednie narządy23,24.
    1. Podziel różne stadia raka (0-4) na podstawie dostępnych danych z pliku patologicznego.
    2. Podziel tempo wzrostu i progresji guza w warstwach ściany jelita (indeks T) na cztery odrębne grupy (T1-4, T0-TX) i inwazję węzłów chłonnych (indeks N) na cztery grupy (N1-3, N0-NX).
  3. Przygotuj grupę kontrolną z osobami zdrowymi.
    1. Dopasuj grupę kontrolną do grupy pacjentów pod względem wieku i płci. Zbierz szczegółowe dane demograficzne dla każdego uczestnika, aby zapewnić porównywalność.
  4. Proces świadomej zgody
    1. Przygotuj dokumenty świadomej zgody, które wyjaśniają cel badania, procedury i potencjalne ryzyko.
    2. Nawiąż kontakt z uczestnikami, dając im wystarczająco dużo czasu na zadawanie pytań. Zbierz podpisane formularze świadomej zgody przed przystąpieniem do pobierania próbek.

2. Ekstrakcja i oczyszczanie RNA

  1. Pobieranie próbek krwi obwodowej
    1. Uzyskaj dostępne na rynku probówki z powłoką EDTA, które są certyfikowane do użytku klinicznego lub laboratoryjnego. Sprawdź datę ważności probówek. Sprawdź integralność opakowania tuby.
    2. Poinstruuj uczestnika, aby usiadł wygodnie. Za pomocą sterylnej strzykawki pobrać 5 ml krwi z żyły łokciowej. Upewnij się, że uczestnik jest zrelaksowany, z wyciągniętym ramieniem, aby odsłonić żyłę. Natychmiast przenieś próbki krwi do przygotowanych probówek, zapewniając minimalną ekspozycję na powietrze.
    3. Próbki należy utrzymywać w temperaturze 4 °C podczas transportu do laboratorium w celu zachowania integralności RNA.
  2. Użyj mini zestawu RNA krwi do izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Krótko mówiąc, poddać lizie czerwone krwinki, inkubując próbkę krwi pełnej z Buffer EL na lodzie. Odwirować w celu osadzenia leukocytów i odrzucenia supernatantu. Lizować leukocyty za pomocą buforu RLT i homogenizować lizat za pomocą kolumny rozdrabniacza.
    2. Dodać etanol do homogenizowanego lizatu i przenieść do kolumny wirowej. Umyć kolumnę buforem RW1 i buforem RPE. Eluuj oczyszczony RNA, dodając do kolumny wodę wolną od RNaz i odwirowując.
  3. Ocena ilości i jakości RNA
    1. Kwantyfikacja RNA: Zastosuj spektrofotometr do pomiaru stężenia i czystości RNA. Otwórz oprogramowanie na podłączonym komputerze. Wybierz opcję Kwas nukleinowy z menu głównego. Nanieść 1 μl próbki RNA na obszar próbki.
    2. Badanie czystości i integralności RNA
      UWAGA: Integralność i rozkład wielkości całkowitego RNA oczyszczonego za pomocą mini zestawu RNA do krwi można sprawdzić za pomocą spektrofotometrii i elektroforezy żelowej. Rybosomalne RNA powinny pojawiać się jako ostre pasma lub piki. Pozorny stosunek 28S rRNA do 18S rRNA powinien wynosić około 2:1. Jeśli prążki rybosomalne lub piki określonej próbki nie są ostre, ale pojawiają się jako rozmazanie w kierunku RNA o mniejszych rozmiarach; jest prawdopodobne, że próbka uległa znacznej degradacji przed lub w trakcie oczyszczania RNA.
      1. W przypadku pomiaru spektrofotometrii opuść ramię urządzenia i kliknij przycisk Zmierz, aby uzyskać stosunek A260/A280. Oceń czystość próbki RNA, dążąc do uzyskania stosunku A260/A280 między 1,8 a 2,0.
      2. Wykonaj 1% elektroforezę w żelu agarozowym, jak opisano poniżej.
        1. Przygotować 1% roztwór agarozy, ogrzewając proszek agarozy w buforze TAE aż do rozpuszczenia. Dodać bromek etydyny do roztworu agarozy, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 μg/ml. Wlać roztwór bromku agarozy i etydyny do tacki do odlewania żelu i pozostawić do zestalenia.
          UWAGA: Bromek etydyny jest barwnikiem fluorescencyjnym, który interkaluje z RNA, aby umożliwić wizualizację w świetle UV.
        2. Wymieszaj próbki RNA z barwnikiem ładującym i ostrożnie załaduj je do studzienek zestalonego żelu. Uruchom elektroforezę żelową przy napięciu 100 V przez około 30 minut, aby oddzielić fragmenty RNA według wielkości. Wizualizuj prążki RNA, umieszczając żel na transiluminatorze UV lub systemie obrazowania, co powoduje fluoryzację RNA barwionego bromkiem etydyny.
  4. Przechowywanie wyekstrahowanego RNA
    1. Pobrać wyekstrahowane próbki RNA. Porcjować RNA do sterylnych probówek do mikrowirówek, używając 10 μl objętości na podwielokrotność. Przechowywać podwielokrotności RNA w temperaturze -80 °C lub niższej.
  5. Odwrotna transkrypcja RNA do cDNA
    1. Postępuj zgodnie z protokołem zestawu do odwrotnej transkrypcji. Rozmrozić i przygotować niezbędne odczynniki na lodzie i w temperaturze pokojowej.
    2. Przeprowadź reakcję eliminacji genomowego DNA, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenie genomowego DNA.
    3. Przygotować główną mieszankę odwrotnej transkrypcji na lodzie, która zawiera wszystkie składniki z wyjątkiem matrycy RNA.
    4. Dodaj matrycę RNA z etapu eliminacji DNA do głównej mieszanki odwrotnej transkrypcji. Inkubować reakcję odwrotnej transkrypcji w temperaturze 42 °C przez 15 minut.
    5. Inaktywować enzym odwrotnej transkryptazy przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 3 minuty. Użyć podwielokrotności gotowego cDNA do natychmiastowego PCR w czasie rzeczywistym lub przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

3. Projekt startera do PCR w czasie rzeczywistym

  1. Selekcja genów docelowych i kontrole wewnętrzne
    1. Wybierz gen MLH1 jako cel do oceny ilościowej ze względu na jego związek z rakiem jelita grubego. Wybierz β-aktynę jako wewnętrzną kontrolę dla normalizacji danych dotyczących ekspresji genów.
  2. Proces projektowania podkładów
    1. Uruchom oprogramowanie do projektowania starterów i wprowadź sekwencję genu MLH1 uzyskaną z przeglądarki genomu Ensemble lub UCSC.
    2. Ustaw temperaturę topnienia (Tm) dla starterów w zakresie 58-60 °C, optymalną zawartość GC na poziomie 40%-60%, a długość startera w zakresie 18-24 nukleotydów.
    3. Wprowadź zaprojektowane sekwencje starterów do bazy danych NCBI BLAST, aby potwierdzić specyficzność.
      1. Wejdź na stronę BLAST, wybierz Nucleotide BLAST. Wklej sekwencje starterów w polu wyszukiwania i kliknij BLAST.
      2. Przeanalizuj wyniki, aby upewnić się, że nie przewiduje się wzmocnienia poza celem. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 1.

4. PCR w czasie rzeczywistym

  1. Konfiguracja reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 2.
    1. Odwirować odczynniki w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 10 000 x g, aby zebrać zawartość na dnie probówek.
    2. Przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z protokołem zestawu komercyjnego, który zawiera SYBR Green, bufor, dNTPs, MgCl2 i polimerazę Taq.
    3. Umieść mieszaninę wzorcową w znakowanych probówkach PCR, zapewniając stałą objętość we wszystkich próbkach.
    4. Dodaj odpowiednią objętość starterów do przodu i do tyłu dla MLH1 i β-aktyny do odpowiednich probówek.
    5. Rozcieńczyć próbki RNA do stałego stężenia 100 ng / μl przed odwrotną transkrypcją i odwrotną transkrypcją do cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji.
  2. Wzmocnienie i gromadzenie danych
    1. Umieść probówki PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym.
    2. Zaprogramuj termocykler ze zoptymalizowanymi warunkami cyklu: 95 °C przez 20 s w przypadku denaturacji, 54 °C przez 30 s w przypadku wyżarzania i 72 °C przez 30 s w przypadku przedłużenia. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 3.
    3. Ustaw maszynę tak, aby działała przez 45 cykli.
    4. Monitoruj reakcję w czasie rzeczywistym za pomocą interfejsu oprogramowania systemu, obserwując krzywe wzmocnienia dla każdej próbki.
    5. Uwzględnij kontrolę ujemną bez cDNA, aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczenia. Powtórz przebieg PCR 3 razy dla każdej próbki, aby zapewnić wiarygodność danych.
  3. analiza danych
    1. Po zakończeniu cykli należy użyć oprogramowania systemu do analizy wartości progowych cyklu (Ct). Wyeksportuj wartości Ct do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
    2. Oblicz względną ekspresję genów za pomocą metody 2-ΔΔCt25, normalizując dane do kontroli β-aktyny.

5. Immunohistochemia i analizy genetyczne

  1. Przeprowadzić immunohistochemię na skrawkach tkanki, aby skorelować ekspresję białka MLH1 z poziomami ekspresji genów.
    1. Przygotować preparaty tkankowe i nałożyć przeciwciało anty-MLH1.
    2. Użyj zestawu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP i substratu DAB (3,3'-diaminobenzydyna). Wywołaj szkiełka zgodnie z instrukcjami zestawu i przeanalizuj je za pomocą mikroskopu świetlnego.
  2. Wykonaj PCR specyficzne dla metylacji i testy niestabilności mikrosatelitarnej, aby odróżnić zespół Lyncha od sporadycznego CRC.
    1. Użyj komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA. Postępuj zgodnie z protokołem zestawu zarówno dla krwi, jak i tkanek nowotworowych.
    2. Potraktuj DNA za pomocą zestawu do konwersji wodorosiarczynu. Stosować startery specyficzne dla metylacji przeznaczone dla regionu promotora MLH1. Wykonaj PCR zgodnie z protokołem zestawu.
    3. Uruchom elektroforezę żelową na produktach PCR, aby zobrazować stan metylacji.
    4. Do badania niestabilności mikrosatelitarnej (MSI), elektroforeza kapilarna przy użyciu analizatora genetycznego. Porównaj długości mikrosatelitów, analizując produkty PCR znakowane fluorescencyjnie.

6. Analiza statystyczna

  1. Korzystaj z komercyjnego oprogramowania do analizy statystycznej do analizy danych.
    1. Otwórz oprogramowanie i utwórz nowy zestaw danych dla ekspresji genów i danych demograficznych.
    2. Wprowadź względne wartości ekspresji genów i odpowiadające im dane demograficzne do zestawu danych.
    3. Użyj testu Kołmogorowa-Smirnowa, aby ocenić normalność danych.
      1. Wybierz pozycję Analizuj z górnego menu, wybierz pozycję Testy nieparametryczne, a następnie pozycję Starsze okna dialogowe.
      2. Kliknij Test Kołmogorowa-Smirnowa i wprowadź zmienną do ekspresji genów. Wykonaj test i zinterpretuj dane wyjściowe pod kątem znaczenia normalności rozkładu.
    4. Przeprowadź testy T, aby porównać ekspresję genu MLH1 między pacjentami a grupą kontrolną.
      1. Wybierz pozycję Analizuj, a następnie pozycję Porównaj średnie i wybierz pozycję Test t dla prób niezależnych.
      2. Przypisz przynależność do grupy (pacjent lub grupa kontrolna) jako zmienną grupującą i ekspresję genu jako zmienną testową. Uruchom test i zinterpretuj dwustronny poziom istotności.
    5. Oblicz zmiany krotności w ekspresji genów za pomocą metody 2-ΔΔCt25.

Wyniki

W niniejszym badaniu u 36 pacjentów z rakiem jelita grubego zbadano ekspresję genu MLH1 we krwi obwodowej oraz jej związek z rakiem jelita grubego. Analiza zmiennych demograficznych wykazała, że 15 pacjentów (41,6%) było kobietami, a 21 pacjentów (58,4%) mężczyznami. Średni wiek pacjentów wynosił 57,35 ± 4,22 lat, a zakres wieku od 26 do 87 lat. Status wskaźnika masy ciała (BMI) pacjentów wykazał, że 14 pacjentów (38,8%) miało BMI w normie (18,5 i 24,9 kg/m2), a 22 pacjentów (61,2%) miało BMI poza zakresem normy (poniżej 18,5 lub powyżej 24,9 kg/m2). Charakterystyka histopatologiczna przypadków raka jelita grubego przedstawiała się następująco: stopień złośliwości guza sklasyfikowano zgodnie z systemem stopniowania WHO26, przy czym 12 przypadków (33,3%) było dobrze zróżnicowanych, 18 przypadków (50%) umiarkowanie zróżnicowanych, a 6 przypadków (16,7%) słabo zróżnicowanych. Inwazja naczyniowo-limfatyczna wystąpiła w 14 przypadkach (38,9%), a inwazja okołonerwowa zaobserwowano w 9 przypadkach (25%). U wszystkich pacjentów marginesy resekcyjne były wolne od nowotworu. Wyniki badania zmiennej lokalizacji guza wykazały, że 20 guzów (55,5%) znajdowało się w okrężnicy, a 16 (45,5%) w odbytnicy. Spośród wszystkich guzów 4 guzy (11,1%) były mniejsze niż 10 mm, a 32 guzy (88,9%) były większe niż 10 mm (Tabela 4).

Przeprowadziliśmy analizę warstwową hipermetylacji promotora MLH1 oraz zespołu Lyncha. Spośród 36 pacjentów z rakiem jelita grubego u 10 (27,8%) stwierdzono hipermetylację promotora MLH1, natomiast sekwencjonowanie genetyczne zidentyfikowało 5 pacjentów (13,9%) z mutacjami w linii zarodkowej zgodnymi z zespołem Lyncha. Pozostali 21 pacjentów (58,3%) nie wykazywał hipermetylacji MLH1 ani zespołu Lyncha, co sugeruje sporadyczny przebieg CRC (Tabela 5).

W niniejszym badaniu do odróżnienia przypadków dziedzicznego niedoboru MLH1 od somatycznego niedoboru MLH1 wykorzystano badania genetyczne oraz wywiad rodzinny. Spośród 36 pacjentów u 12 stwierdzono wywiad rodzinny w kierunku zespołu Lyncha, a sekwencjonowanie genetyczne potwierdziło mutacje germinalne MLH1 u 5 z tych pacjentów (13,9%). Pozostałych 7 pacjentów z wywiadem rodzinnym nie wykazywało mutacji germinalnych, lecz posiadało somatyczne niedobory MLH1, prawdopodobnie w wyniku nabytych mutacji lub zmian epigenetycznych, takich jak hipermetylacja. Spośród 24 pacjentów bez wywiadu rodzinnego w kierunku zespołu Lyncha, 15 (41,7%) miało somatyczny niedobór MLH1 spowodowany hipermetylacją lub mutacjami somatycznymi. Pozostałych 9 pacjentów bez wywiadu rodzinnego wykazywało prawidłowe poziomy ekspresji MLH1, co sugeruje istnienie innych mechanizmów napędzających rozwój CRC.

W grupie z dziedzicznym niedoborem MLH1 odnotowano najistotniejszy spadek ekspresji MLH1, ze średnią krotnością zmiany wynoszącą 0,4, co było statystycznie istotne (p <0,01). Grupa z somatycznym niedoborem MLH1 również wykazała istotny spadek ekspresji, przy średniej krotności zmiany wynoszącej 0,6 (p <0,001). W grupie z normalnym poziomem ekspresji MLH1 nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych (Tabela 6).

Rysunek 1 przedstawia porównanie poziomów ekspresji genu MLH1 w dwóch grupach. W szczególności u pacjentów z CRC odnotowano znacznie niższe poziomy ekspresji genu MLH1 w porównaniu z osobami zdrowymi (p ≤ 0,001; Rysunek 1).

Poziom ekspresji genu na każdym etapie choroby w porównaniu z poziomem u osób zdrowych przedstawiono w Tabeli 7. Poziom ekspresji genu MLH1 był istotny w stopniu II (p ≤ 0,02), stopniu III (p ≤ 0,01) oraz stopniu IV (p ≤ 0,03). Wskazuje to na spadek ekspresji genu w tych stadiach choroby u osób chorych w porównaniu z osobami zdrowymi.

Porównanie ekspresji genów, wykres słupkowy przedstawia poziomy ekspresji u pacjentów w porównaniu z osobami zdrowymi; n=30 próbek.
Rycina 1: Ekspresja genu MLH1. Porównanie ekspresji genu MLH1 w próbkach krwi dwóch grup: pacjentów z rakiem jelita grubego oraz osób zdrowych. Różnica jest istotna (p ≤ 0.001). Zastosowano test t dla prób niezależnych. Słupki błędów oznaczają błąd standardowy średniej (SEM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

StarterSekwencja primeraDługośćTa (°C)
MLH1 Starter forwardTCAGGTCATCGGAGCAAGCAC2360
MLH1 Starter odwrotnyCGATCTTCCTCTGTCAAGCCAC2058

Tabela 1: Startery użyte w badaniu. Sekwencje zaprojektowanych starterów oraz długość produktu PCR dla genu docelowego MLH1. Podano również temperaturę przyłączania (Ta).

OdczynnikObjętość (µL)Stężenie końcowe
2x PCR Master Mix101x (zgodnie z instrukcją zestawu)
Startery Forward (10 µM)10.5 µM
Startery Reverse (10 µM)10.5 µM
Matryca cDNA2przyjęte 100 ng/µL
Woda wolna od nukleaz6do wyrównania objętości

Tabela 2: Parametry reakcji.

45 cykli
FazaTemperaturaCzas trwania
Denaturacja95 °C20 min
Przyłączanie54 °C30 s
Elongacja72 °C30 s

Tabela 3: Cykl temperaturowy i czas trwania poszczególnych etapów w technice real-time PCR.

PacjentStatus 
Wiek4,22 ± 57,35 (26-86) lat
PłećMężczyzna(58.4%) 21
Kobieta(41.6%) 15
BMI (wskaźnik masy ciała)normalny(38.8%) 14
Nieprawidłowy(61.2%) 22
Rodzinna historia raka jelita grubego(33.3%) 12
Diagnostyka histopatologicznaDobrze zróżnicowany(33.3%) 12
Średniozróżnicowany(50%) 18
Słabo zróżnicowany(16.7%) 6
InwazjaLimfovaskularny(38.9%) 14
Oknołowe(25%) 9
Inne(36.1%) 13
Marginesy resekcyjnePrzejrzyste(100) 36
LokalizacjaJelito grube(55.5%) 20
Odbytnica(45.5%) 16
Rozmiar< 10 mm(11.1%) 4
> 10 mm(88.9%) 32

Tabela 4: Charakterystyka demograficzna i kliniczna pacjentów.

GrupaLiczba pacjentówProcent
Hipermetylacja MLH11027.80%
Zespół Lyncha513.90%
Żaden z nich2158.30%

Tabela 5: Dane dotyczące hipermetylacji promotora MLH1 i statusu zespołu Lyncha.

GrupaLiczba pacjentówProcentŚrednia krotność zmianywartość p
Dziedziczny niedobór MLH1513.90%0.4<0.01
Somaticzny niedobór MLH12261.10%0.6<0.001
Normalna ekspresja MLH1925%0.9>0.05

Tabela 6: Poziomy ekspresji genu MLH1 u pacjentów z CRC. Średni poziom zmiany krotności (fold-change) wskazuje poziom ekspresji genu MLH1 w stosunku do grupy kontrolnej. Zmiana krotności mniejsza niż 1 wskazuje na obniżenie ekspresji.

EtapKrotność zmianyWartość p
Zmniejszenie Zwiększyć 
Etap 01.8-0.33
Etap I1.7-0.12
Etap II2.2-0.02
Stopień III5.2-0.01
Stopień IV7.3-0.03

Tabela 7: Ekspresja genów na różnych etapach. Względny poziom ekspresji genów w poszczególnych stadiach choroby w porównaniu z osobami zdrowymi.

Dyskusja

Badanie to zostało przeprowadzone w celu zbadania ekspresji genu MLH1 . W badaniu tym wykazano, że poziom ekspresji genu MLH1 był obniżony u osób chorych w porównaniu z osobami zdrowymi. Na podstawie badań zmian fałdowych wykazano, że ekspresja genu MLH1 w stadium II, III i IV u osób chorych w porównaniu z osobami zdrowymi uległa znacznemu zmniejszeniu.

Rak jelita grubego stanowi poważny problem w leczeniu nowotworów na świecie ze względu na jego rozpowszechnienie i przeżywalność 3,27. Biorąc pod uwagę, że oczekiwana długość życia niektórych pacjentów z rakiem jelita grubego nie sięga nawet 5 lat, a także dlatego, że potrzeby pacjentów z rakiem są różne w różnych latach po diagnozie, pełne badanie raka jelita grubego jest niezbędną potrzebą28,29.

Tymczasem uruchomienie całkowicie specyficznych molekularnych testów diagnostycznych wraz z objawami klinicznymi może być skuteczną pomocą w diagnozowaniu osób zagrożonych, a nawet osób bez objawów klinicznych raka jelita grubego30,31. Defekty w białkach naprawiających niedopasowanie mogą wynikać z mutacji w genach, takich jak MLH1. Najważniejszym białkiem naprawy niedopasowania DNA zaangażowanym w raka jelita grubego jest MLH1 32,33.

Według badań gen MLH1 jest związany z wieloma nowotworami, w tym jelita grubego, żołądka, przełyku i szyjki macicy34. Gen MLH1 odgrywa istotną rolę w naprawie DNA, a białko to pomaga korygować błędy występujące podczas replikacji DNA w ramach przygotowań do podziału komórki35. Dlatego lepsza identyfikacja mechanizmu i ekspresji genu MLH1 może określić, w jaki sposób występuje rak jelita grubego, a identyfikując ten mechanizm, można podjąć odpowiednie środki w celu zapobiegania i leczenia raka jelita grubego36.

Guo i wsp. przeprowadzili badanie w Chinach w celu zbadania ekspresji genów MLH1 i MSH2 z cechami kliniczno-patologicznymi w raku jelita grubego. W badaniu tym zebrano dane kliniczne i patologiczne 88 pacjentów poddawanych leczeniu onkologicznemu. Zmianę krotności MLH1 i MSH2 w tkankach mierzono za pomocą qRT-PCR, a związek między MLH1 i MSH2 analizowano przy użyciu danych patologicznych pacjentów. Wyniki tego badania potwierdziły wyniki naszego badania i wykazały, że ekspresja genów MLH1 i MSH2 jest niższa w tkankach nowotworowych niż w innych tkankach37.

W innym badaniu przeprowadzonym przez Liu i wsp. zbadano analizę ekspresji genów MLH1 i PMS2 u starszych pacjentów z rakiem jelita grubego i jej związek z klinicznymi cechami patologicznymi. W tym retrospektywnym badaniu kohortowym pacjenci w podeszłym wieku z rakiem jelita grubego od stycznia 2014 r. do grudnia 2018 r., którzy zostali przyjęci do szpitala w Pekinie, zostali podzieleni na dwie grupy, MLH1 i PMS. Charakterystyki patologiczne i ekspresję genów porównano w dwóch grupach. Wyniki wykazały, że ekspresja genu MLH1 jest zmniejszona u pacjentów, a ten spadek ekspresji genu jest również widoczny w różnych stadiach raka, a spadek ekspresji genów u pacjentów jest związany z wiekiem zachorowania, szybką progresją guza, słabym różnicowaniem i patologicznym stopniowaniemzaawansowania 38.

Ten spadek ekspresji genów wykazano w innych badaniach przeprowadzonych w innych krajach. W badaniach przeprowadzonych w Stanach Zjednoczonych39, Iranie40 i Irlandii41 wykazano zmniejszenie ekspresji genu MLH1 u pacjentów z rakiem jelita grubego.

Obecny standard obejmuje uniwersalną analizę guzów wyciętych próbek CRC przy użyciu IHC i technik molekularnych. Pacjenci z nieprawidłowymi wynikami IHC są następnie kierowani na ostateczne badania mutacyjne. Jednak ostatnie osiągnięcia w naszym rozumieniu genetyki molekularnej zmieniły praktyki badań przesiewowych i diagnostycznych w kierunku zespołu Lyncha42. W badaniu Alipoora i wsp. przeanalizowano ilościowo ekspresję genu MLH1 i jej związek z głębokością inwazji guza (T) i czynnikami inwazji węzłów chłonnych (N) w próbkach krwi irańskich pacjentów z CRC. Badanie wykazało, że ekspresja genu MLH1 była istotnie związana ze stadiami T i N, co sugeruje, że analiza ekspresji genu MLH1 może dostarczyć dodatkowych informacji poza technikami IHC43. Co więcej, w badaniu przeprowadzonym przez Halil i wsp. przeanalizowano wpływ każdej specyficznej utraty genu MMR i charakterystyki klinicznej pacjentów z dMMR CRC, którzy otrzymywali inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI). Badanie wykazało, że ogólne wskaźniki odpowiedzi (ORR) w grupach MLH1 ± PMS2 i MSH2 ±MSH6 wynosiły odpowiednio 68% i 57,1%, bez różnicy statystycznej. Sugeruje to, że analiza ekspresji genu MLH1 może być cennym narzędziem do przewidywania odpowiedzi na terapię ICI u pacjentów z dMMR CRC44. Potrzebne są dalsze badania, aby potwierdzić rolę analizy ekspresji genu MLH1 w leczeniu raka jelita grubego i włączyć ją do praktyki klinicznej.

Biorąc pod uwagę ważną i kluczową rolę genu MLH1 w naprawie niespójności DNA oraz zgodnie z wynikami wcześniejszych badań, można stwierdzić, że rak jelita grubego jest związany ze spadkiem ekspresji genu MLH1 . Dlatego przy zmniejszeniu ekspresji genów nie ma możliwości skorygowania wadliwego cyklu replikacji, a ryzyko powstania mutacji wzrośnie; Dlatego ten spadek ekspresji genów będzie odgrywał ważną rolę w procesie rozwoju choroby, leczenia i końcowego wyniku choroby dla ludzi.

Wyniki wykazały, że zmniejszenie ekspresji genu MLH1 odgrywa skuteczną rolę w rozwoju raka jelita grubego. Ale znaczenie tego genu polega na jego roli w stadiach raka, co zmniejsza ekspresję genów na każdym etapie choroby. Dlatego gen ten może być bardziej rozważany w przyszłych badaniach; Ponieważ istnieje możliwość, że w przyszłości może odegrać skuteczną rolę w poprawie stanu leczenia raka jelita grubego. Konieczne wydaje się również przeprowadzenie większej liczby badań, aby dowiedzieć się o innych aspektach.

Krytyczne kroki w ramach protokołu obejmują ścisłe przestrzeganie procedur ekstrakcji i oczyszczania RNA, ponieważ jakość RNA ma kluczowe znaczenie dla dokładnej analizy ekspresji genów. Ponadto konfiguracja PCR w czasie rzeczywistym i specyficzne warunki cykliczne mają kluczowe znaczenie dla wiarygodnej amplifikacji i kwantyfikacji genu MLH1 . W trakcie badania omówiono modyfikacje i rozwiązywanie problemów związanych z techniką. Na przykład, gdy początkowo stwierdzono nieoptymalną czystość RNA, na co wskazują pomiary spektrofotometrem, protokół ekstrakcji został dopracowany, aby uwzględnić dodatkowe etapy płukania w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń. Do ograniczeń tej techniki należy poleganie na krwi obwodowej, która może nie odzwierciedlać w pełni poziomów ekspresji MLH1 w mikrośrodowisku guza.

W tym badaniu przeanalizowaliśmy ekspresję genu MLH1 w próbkach krwi obwodowej od 36 pacjentów z rakiem jelita grubego. Zdajemy sobie sprawę, że ta wielkość próby jest ograniczona, co może wpłynąć na moc statystyczną naszych ustaleń. Przyszłe badania z większymi kohortami są uzasadnione, aby potwierdzić nasze wyniki i lepiej zrozumieć rolę ekspresji MLH1 w raku jelita grubego. Ponadto metoda doboru próby dla wygody może wprowadzać błąd systematyczny selekcji, potencjalnie wpływając na możliwość uogólnienia wyników.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność i uznanie dla wszystkich, którzy pomogli nam ukończyć to przedsięwzięcie badawcze.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowym SystemyBio-RadMini-Sub Cell GTSłuży do sprawdzania jakości RNA
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichE9884Stosowany jako antykoagulant do próbek krwi
NanoDropThermoFisher ScientificND-2000używany do określania czystości RNA
Zastosowano maszynę do PCR w czasie rzeczywistym BiosystemsA34322Używany do reakcji RT-PCR
Zestaw do ekstrakcji RNAIntron Biotechnology Co#Cat 17061Używany do ekstrakcji RNA z próbek krwi
Zestaw SYBR Green PCRThermo Fisher Scientific4309155Odczynniki używane do eksperymentów RT-PCR
Spektrofotometr

Bibliografia

  1. Favoriti, P., et al. Worldwide burden of colorectal cancer: a review. Updates Surg. 68 (1), 7-11 (2016).
  2. Lotfollahzadeh, S., Recio-Boiles, A., Cagir, B. Colon cancer. StatPearls. , (2024).
  3. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Prz Gastroenterol. 14 (2), 89-103 (2019).
  4. Woischke, C., Michl, M., Neumann, J. Molecular pathology of colorectal cancer. Pathologie. 44 (5), 279-286 (2023).
  5. Lachit, K., Vinita, P. Study of mismatch repair protein expression by using immunohistochemistry in various carcinomas with special reference to colorectal adenocarcinomas-at a tertiary referral laboratory in India. Asian Pacific J Cancer Biol. 7 (4), 341-347 (2022).
  6. Cerretelli, G., Ager, A., Arends, M. J., Frayling, I. M. Molecular pathology of Lynch syndrome. J Pathol. 250 (5), 518-531 (2020).
  7. Tiwari, A. K., Roy, H. K., Lynch, H. T. Lynch syndrome in the 21st century: clinical perspectives. QJM. 109 (3), 151-158 (2016).
  8. Hinrichsen, I., et al. Reduced migration of MLH1 deficient colon cancer cells depends on SPTAN1. Mol Cancer. 13 (1), 1-12 (2014).
  9. Nissar, B., Shah, I. A., ul Afshan, F., Ganai, B. A. A decade in unravelling the etiology of gastric carcinogenesis in Kashmir, India - A high risk region. Gene Rep. 21 (1), 100832(2020).
  10. Reyes, G. X., Schmidt, T. T., Kolodner, R. D., Hombauer, H. New insights into the mechanism of DNA mismatch repair. Chromosoma. 124 (4), 443-462 (2015).
  11. Rogacheva, M. V., et al. Mlh1-Mlh3, a meiotic crossover and DNA mismatch repair factor, is a Msh2-Msh3-stimulated endonuclease. J Biol Chem. 289 (9), 5664-5673 (2014).
  12. Martin, S. A. The DNA mismatch repair pathway. DNA Repair Cancer Ther. , 151-177 (2016).
  13. Fukuhara, S., et al. DNA mismatch repair gene MLH1 induces apoptosis in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (22), 11297-11307 (2014).
  14. Boland, C. R., Goel, A., Patel, S. G. The genetic and epigenetic landscape of early-onset colorectal cancer. Colorectal Cancer. 9 (3), CRC23 (2020).
  15. Özdemir, Z., et al. Uncommon variants detected via hereditary cancer panel and suggestions for genetic counseling. Mutat Res. 827, 111831(2023).
  16. Sinicrope, F. A. Lynch syndrome-associated colorectal cancer. New Engl J Med. 379 (8), 764-773 (2018).
  17. Westwood, A., et al. Additional loss of MSH2 and MSH6 expression in sporadic deficient mismatch repair colorectal cancer due to MLH1 promoter hypermethylation. J Clin Pathol. 72 (6), 443-447 (2019).
  18. Chung, C. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in colorectal cancer: A 2021 update on current development, evidence, and recommendation. J Oncol Pharm Pract. 28 (4), 850-869 (2022).
  19. Yu, H., et al. The mRNA level of MLH1 in peripheral blood is a biomarker for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Am J Cancer Res. 6 (5), 1135-1140 (2016).
  20. Kasprzak, A. Prognostic biomarkers of cell proliferation in colorectal cancer (CRC): From immunohistochemistry to molecular biology techniques. Cancers. 15 (18), 4570(2023).
  21. Tao, W., Xie, Y. Study on relationship between NILH1 gene 415 locus G→G mutation and sporadic colorectal cancer in Chinese patients. Chinese J Exp Surg. 26 (6), 752-754 (2009).
  22. Martinez, E. C., Zevallos-Delgado, C., Joseph, M. Analysis of the genetic expression of colon cancer genetic biomarkers on inflammatory bowel disease on blood and biopsy samples. Genomics Gene Func. 164, 4 Supplement S49(2023).
  23. Rahiminejad, S., Maurya, M. R., Mukund, K., Subramaniam, S. Modular and mechanistic changes across stages of colorectal cancer. BMC cancer. 22 (1), 436(2022).
  24. Alrushaid, N., Khan, F. A., Al-Suhaimi, E., Elaissari, A. Progress and perspectives in colon cancer pathology, diagnosis, and treatments. Diseases. 11 (4), 148(2023).
  25. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinfo Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  26. Jurescu, A., et al. Colorectal carcinomas: Searching for new histological parameters associated with lymph node metastases. Medicina. 59 (10), 1761(2023).
  27. Sawicki, T., et al. A review of colorectal cancer in terms of epidemiology, risk factors, development, symptoms and diagnosis. Cancers. 13 (9), 2025(2021).
  28. Cardoso, R., et al. Overall and stage-specific survival of patients with screen-detected colorectal cancer in European countries: A population-based study in 9 countries. Lancet Reg Health Eur. 21 (1), 100458(2022).
  29. Dekker, E., Tanis, P. J., Vleugels, J. L. A., Kasi, P. M., Wallace, M. B. Colorectal cancer. Lancet. 394 (10207), 1467-1480 (2019).
  30. Hull, M. A., Rees, C. J., Sharp, L., Koo, S. A risk-stratified approach to colorectal cancer prevention and diagnosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (12), 773-780 (2020).
  31. Hossain, M. S., et al. Colorectal cancer: A review of carcinogenesis, global epidemiology, current challenges, risk factors, preventive and treatment strategies. Cancers. 14 (7), 1732(2022).
  32. Guyot D'Asnières De Salins, A., et al. Discordance between immunochemistry of mismatch repair proteins and molecular testing of microsatellite instability in colorectal cancer. ESMO open. 6 (3), 100120(2021).
  33. Chen, W., Swanson, B. J., Frankel, W. L. Molecular genetics of microsatellite-unstable colorectal cancer for pathologists. Diagn Pathol. 12 (1), 24(2017).
  34. Li, J., et al. Role of MLH1 methylation in esophageal cancer carcinogenesis and its clinical significance. Onco Targets Ther. 11 (1), 651-663 (2018).
  35. Iyer, R. R., Pluciennik, A. DNA mismatch repair and its role in Huntington's disease. J Huntingtons Dis. 10 (1), 75-94 (2021).
  36. Rebuzzi, F., Ulivi, P., Tedaldi, G. Genetic predisposition to colorectal cancer: How many and which genes to test. Int J Mol Sci. 24 (3), 2137(2023).
  37. Guo, L., Yu, Z., Li, Q., Liang, X., Yang, L. Correlation of MLH1 and MSH2 levels with clinicopathologic characteristics in colorectal cancer. Am J Transl Res. 15 (2), 1107-1116 (2023).
  38. Liu, Y., Yang, C., Li, W., Zhang, S., Li, L. Analysis of association of MLH1 and PMS2 gene expression with clinicopathological features in elderly patients with colorectal cancer. Chinese J Geriatrics. 1 (12), 927-930 (2020).
  39. Salem, M. E., et al. Molecular analyses of left- and right-sided tumors in adolescents and young adults with colorectal cancer. Oncologist. 25 (5), 404-413 (2020).
  40. Goshayeshi, L., et al. Prevalence and clinicopathological characteristics of mismatch repair-deficient colorectal carcinoma in early onset cases as compared with late-onset cases: a retrospective cross-sectional study in Northeastern Iran. BMJ open. 8 (8), e023102(2018).
  41. Zaborowski, A. M., et al. Clinicopathological features and oncological outcomes of patients with young-onset rectal cancer. Br J Surg. 107 (5), 606-612 (2020).
  42. Paredes, S. R., Chan, C., Rickard, M. Immunohistochemistry in screening for heritable colorectal cancer: what to do with an abnormal result. ANZ J Surg. 90 (5), 702-707 (2020).
  43. Anvari, A. H., Ganji, S. M., Movahhed, T. K. Cellular MLH1 gene expression and pathologic factors in Iranian patients with colorectal cancer. Qom Univ Med Sci J. 14 (8), 62-70 (2020).
  44. Sahin, I. H., et al. Analysis of age, tumor-sidedness, and mismatch repair (MMR) genes with response to immune checkpoint inhibitors (ICIs) in MMR-deficient (dMMR) colorectal cancer (CRC) patients (pts): A multi-institutional study. J Clinl Oncol. 37 (15), e15029(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rak jelita grubegoPCR w czasie rzeczywistymanaliza ekspresji genównaciekanie nowotworowenaciekanie węzłów chłonnychekstrakcja RNAsynteza cDNA

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.