Artykuł metodologiczny

Zastosowanie badawcze fali uderzeniowej indukowanej laserem do badania uszkodzeń ślimaka wywołanych wybuchem

DOI:

10.3791/66396

⸱

1 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National Defense Medical College, 2Division of Bioinformation and Therapeutic Systems, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy eksperymentalne protokoły tworzenia zwierzęcego modelu uszkodzenia ślimaka wywołanego wybuchem za pomocą fali uderzeniowej indukowanej laserem (LISW). Narażenie kości skroniowej na LISW pozwala na odtworzenie patofizjologii ślimaka wywołanej przez blasty. Ten model zwierzęcy może stać się platformą do wyjaśnienia patologii ślimaka i zbadania potencjalnych metod leczenia urazów spowodowanych wybuchem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ucho jest organem najbardziej podatnym na nadciśnienie eksplozji, a urazy ślimaka często występują po ekspozycji na wybuch. Narażenie na wybuch może prowadzić do odbiorczego ubytku słuchu (SNHL), który jest nieodwracalnym ubytkiem słuchu, który negatywnie wpływa na jakość życia. Szczegółowe patologie ślimaka wywołane wybuchem, takie jak utrata komórek rzęsatych, neurony spiralnego zwoju, synapsy ślimaka i zakłócenie stereocilii, zostały już wcześniej udokumentowane. Jednak określenie pogorszenia stanu czuciowo-nerwowego ślimaka po urazie spowodowanym wybuchem jest trudne, ponieważ zwierzęta narażone na nadciśnienie zwykle doświadczają perforacji błony bębenkowej (TMP), która powoduje jednoczesny przewodzeniowy ubytek słuchu. Aby ocenić czystą odbiorczą dysfunkcję ślimaka, opracowaliśmy eksperymentalny model zwierzęcy uszkodzenia ślimaka wywołanego wybuchem za pomocą fali uderzeniowej indukowanej laserem. Metoda ta pozwala uniknąć TMP i współistniejących urazów ogólnoustrojowych oraz odtwarza funkcjonalny spadek składowej SNHL w sposób zależny od energii po ekspozycji na LISW. Ten model zwierzęcy może stać się platformą do wyjaśnienia mechanizmów patologicznych i zbadania potencjalnych metod leczenia dysfunkcji ślimaka wywołanej przez blasty.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubytek słuchu i szumy uszne należą do najczęstszych niepełnosprawności, zgłaszanych aż u 62% weteranów1. U osób narażonych na nadciśnieni> Co więcej, badania przeprowadzone na osobach narażonych na wybuchy sugerują, że narażenie na wybuch często powoduje zaburzenia w słuchowej rozdzielczości czasowej, nawet jeśli progi słyszenia mieszczą się w normalnym zakresie, co jest znane jako "ukryty ubytek słuchu (HHL)"3. Powszechnie wiadomo, że w pat> Zwyrodnienie synaptyczne powoduje upośledzenie przetwarzania słuchowego i jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju HHL5. Tak więc narządy słuchu są delikatnymi elementami zawierającymi złożone i wysoce zorganizowane struktury. Jednak dokładny mechanizm, za pomocą którego fale uderzeniowe wpływają na ucho wewnętrzne na poziomie komórkowym, pozostaje niejasny. Wynika to z wyzwań związanych z odtworzeniem precyzyjnych klinicznych i mechanicznych zawiłości urazów spowodowanych wybuchem w warunkach laboratoryjnych oraz złożoności patologii ślimaka wywołanych wybuchem.

Podstawowym składnikiem obrażeń spowodowanych wybuchem jest fala uderzeniowa (SW), charakteryzująca się szybkim i wysokim wzrostem ciśnienia szczytowego6. Złożoność obrażeń spowodowanych wybuchem została szeroko zbadana w licznych badaniach retrospektywnych7,8,9. Istnieją różne urządzenia do generowania wybuchów, takie jak sprężony gaz10, rury uderzeniowe11 i materiały wybuchowe o małej sile 12, przy różnych poziomach ciśnienia. Przebieg ciśnienia SW generowany przez niedawno opracowane urządzenia bardzo przypominał przebieg rzeczywistej eksplozji. Ważną koncepcją w tworzeniu zwierzęcego modelu odbiorczego ubytku słuchu wywołanego wybuchem jest zminimalizowanie współistniejących urazów, innych niż uszkodzenia słuchu, w celu zmniejszenia śmiertelności zwierząt. W związku z tym opracowano badania nad obrażeniami spowodowanymi wybuchem, w których rurki uderzeniowe zostały zminiaturyzowane, a moc wyjściowa może być precyzyjnie kontrolowana, dzięki czemu narażone zwierzęta rzadko umierają. Jednakże, mimo że w tych modelach zwierzęcych zwykle rozwijają się powikłania, takie jak TMP, ocena funkcji ślimaka jest trudna ze względu na współistniejący przewodzeniowy ubytek słuchu2. Wcześniej przeprowadziliśmy badanie na zwierzętach chronionych przed uszami na obrażeniach spowodowanych wybuchem przy użyciu zatyczek do uszu i nie znaleźliśmy częstości występowania TMP13. Zatyczki do uszu mogą częściowo łagodzić poważne uszkodzenia ślimaka, ale nie neurodegenerację centralnego słuchu ani rozwój szumów usznych. W ten sposób zatyczki do uszu chronią ślimak, a także błonę bębenkową. Jednak do zbadania patofizjologii ślimaka spowodowanej przez blast wymagany jest zwierzęcy model czystego uszkodzenia ślimaka wywołanego wybuchem bez TMP.

Wcześniej opracowaliśmy model miejscowego uszkodzenia ucha wewnętrznego u szczurów i myszy za pomocą laserowo indukowanej fali uderzeniowej (LISW)14,15. Metoda ta może być bezpiecznie i łatwo wykonana na standardowym poziomie laboratoryjnym i została wykorzystana do generowania modeli urazów płuc i uderzeń głowy16,17. Energię LISW można regulować, zmieniając typ i moc lasera, co pozwala na kontrolę nad stopniem uszkodzenia ślimaka. Model uszkodzenia ślimaka wywołany przez LISW jest cenny dla badania mechanizmów SNHL spowodowanych urazami spowodowanymi wybuchem i badania potencjalnych metod leczenia. W tym badaniu opisujemy szczegółowe protokoły eksperymentalne tworzenia mysiego modelu uszkodzenia ślimaka wywołanego blastem za pomocą LISW i pokazujemy zwyrodnienie ślimaka, w tym utratę komórek rzęsatych (HC), synaps ślimakowych i neuronów spiralnych (SGN), w sposób zależny od energii u myszy po ekspozycji na LISW.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Kolegium Medycznego Obrony (zatwierdzenie #18050) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia oraz Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować liczbę zwierząt i ich cierpienie.

1. Zwierzęta

  1. Użyj 8-tygodniowych samców myszy CBA/J, aby postępować zgodnie z tym protokołem. Przed eksperymentem poddaj myszy testowi funkcji słuchu i endoskopowej obserwacji błony bębenkowej, aby zapewnić normalność.
  2. Podziel 27 myszy CBA/J na trzy grupy: (1) grupa narażona na 2,0 J/cm2 (n = 9 myszy); (2) grupa narażona 2,25 J/cm2 (n = 9 myszy); i (3) grupa narażona na 2,5 J/cm2 (n = 9 myszy). Usuń wszystkie uszy do oceny 1 miesiąc po ekspozycji na LISW.

2. Eksperymentalne ustawienia ekspozycji LISW

  1. Tarcza laserowa to dysk z kauczuku naturalnego o średnicy 10 mm i grubości 0,5 mm. Aby zwiększyć impuls LISW, użyj kleju spawalniczego na bazie żywicy akrylowej, aby przykleić przezroczysty arkusz politereftalanu etylenu (PET) o grubości 1,0 mm do górnej części obszaru docelowego. Naświetlić laser Nd:YAG o długości fali 532 nm, aby wygenerować LISW za celem (Rysunek 1A).
  2. Skoncentruj impuls laserowy za pomocą soczewki płasko-wypukłej na plamkę o średnicy 3,0 mm na tarczy laserowej.
  3. Użyj promieniowania LISW, aby wytworzyć plazmę na powierzchni łączącej dwa materiały i odparować gumę (ablacja za pośrednictwem plazmy), pozostawiając odparowaną gumę we wnęce.
  4. Użyj hydrofonu, aby zmierzyć falę ciśnienia LISW na głębokości 1.0 mm pod wodą, a nie w żywej tkance. Umieść hydrofon światłowodowy o średnicy 0,25 mm pod czarną gumą 1,0 mm pod powierzchnią wody, aby zarejestrować przebiegi ciśnienia LISW i zmierzyć je za pomocą oscyloskopu cyfrowego.
    UWAGA: Przebiegi ciśnienia wykazywały stabilną charakterystykę przy podobnym maksymalnym ciśnieniu i impulsie, jak pokazano na Rysunek 1B.
  5. Wszystkie zabiegi na zwierzętach należy wykonywać w znieczuleniu ogólnym, stosując iniekcje dootrzewnowe chlorowodorku medetomidyny 1 mg/kg i 75 mg/kg ketaminy. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu i zapewnić wsparcie cieplne.
  6. Ostrożnie ogol okolice zauszne, aby uniknąć zatrzymywania powietrza uwięzionego w sierści. Zamocuj myszy na talerzu i umieść obszary zauszne w obszarze ogniskowym LISW w pionie w górę.
  7. Przymocuj czarną gumową tarczę przezskórnie do zausznej części ucha myszy. Aby zapewnić dopasowanie impedancji akustycznej, należy użyć żelu przewodzącego ultradźwięki między celem lasera a powierzchnią skóry.
  8. Zastosuj pojedynczy impuls LISW do ślimaka przez kość skroniową. Ustaw wyjścia impulsów laserowych na trzy gęstości energii: 2.0 J/cm2 , 2.25 J/cm2 i 2.5 J/cm2.

3. Test funkcjonalny ślimaka

UWAGA: Testy słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) zostały przeprowadzone zgodnie z wcześniejszymi raportami14,15.

  1. Wykonaj pomiar ABR 1 dzień przed i 1 dzień oraz 1 miesiąc po ekspozycji na LISW.
  2. ABR jest słuchowym potencjałem wywołanym w odpowiedzi na bodźce słuchowe i jest powszechnie stosowany do oceny progów słyszenia przy czterech częstotliwościach (12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz i 24,0 kHz).
  3. Zaprezentuj dźwięk stymulacji przez małą słuchawkę i zmierz poziom ciśnienia akustycznego w pobliżu błony bębenkowej myszy za pomocą małego mikrofonu umieszczonego w pobliżu słuchawki. Wysyłaj bodźce impulsowe z generatora dźwięku z prędkością 37 cykli/s i wzmacniaj ciśnienie akustyczne z poziomu ciśnienia akustycznego (SPL) 20 dB do 80 dB SPL w krokach co 5 dB SPL.
  4. Umieść elektrodę igłową ze stali nierdzewnej do zapisu elektroencefalogramu pod kanałem słuchowym i przednią częścią ucha, a następnie włóż elektrodę masową pod ogonową okolicę ogona.
  5. Oceń funkcje ślimaka, mierząc amplitudę piku ABR I (P1). Automatycznie analizuj przebiegi ABR w odniesieniu do progów słyszenia i amplitudy ABR P1 za pomocą oprogramowania do analizy pików ABR, jak wcześniej raportowano18.
  6. Oblicz przesunięcia progowe ABR, odejmując progi uzyskane przed ekspozycją. Porównaj przesunięcia progowe ABR w trzech narażonych grupach z tymi w nieeksponowanych uszach przeciwległych (kontrola). Zmierz amplitudy ABR za pomocą kształtu fali ABR podczas stymulacji 80 dB SPL.

4. Ocena histologiczna

UWAGA: Ocena histologiczna została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem14,15.

  1. HC i synapsa ślimakowa
    1. Wykonaj badanie patomorfologiczne ślimaka 1 miesiąc po ekspozycji na LISW.
    2. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez uszczypnięcie palca u nogi przed perfuzją. Po hemoperfuzji z mleczanowym roztworem Ringera należy przeprowadzić perfuzję przezsercową z 1 ml/g 4% paraformaldehydu (PFA). Po dekapitacji należy usunąć ślimak i wykonać perfuzję bezpośrednio z 4% PFA, a następnie utrwalić w temperaturze 4 °C przez noc.
    3. Po utrwaleniu odwapnić ślimak, wstrząsając roztworem kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o stężeniu 0,5 mol/l przez 2 dni.
    4. Podziel zdemineralizowany ślimak na cztery części. Po zamrożeniu każdego kawałka ślimaka na suchym lodzie przez 10 minut, wykonaj blokowanie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w 5% normalnej surowicy końskiej po prostu sprzężonej z 0,3% Triton X w celu przepuszczalności.
    5. Użyj przeciwciał anty-miozyny 7a (Myo7A), białka wiążącego anty-C-end (CtBP2) i przeciwciał anty-neurofilamentowych (NF) jako przeciwciał pierwszorzędowych i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc. Użyj przeciwciał Myo7A, CtBP2 i NF do oceny odpowiednio HC, wstążek presynaptycznych i włókien nerwowych ślimaka.
    6. Niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe zmyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przez 5 x 3 min. Próbki należy inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Po zabarwieniu myć próbki przez 3 x 5 minut PBS i zamknąć próbki na szkiełku szkiełkowym rozpuszczalnym w wodzie środkiem kapsułkującym za pomocą szkła nakrywkowego.
    7. W celu oceny należy uzyskać cały obraz ślimaka (podzielony na cztery części) w 10-krotnym powiększeniu i obliczyć mapę częstotliwości ślimaka za pomocą wspomnianej wtyczki oprogramowania ImageJ, aby precyzyjnie zlokalizować określone regiony ślimaka przy częstotliwości 12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz i 24,0 kHz.
    8. Oblicz wskaźniki przeżycia HC i liczbę synaps przy każdej częstotliwości.
      1. Aby obliczyć wskaźniki przeżycia HC, należy policzyć liczbę ocalałych i brakujących HC na 200 μm długości przy każdej częstotliwości i obliczyć wskaźnik przeżycia HC za pomocą równania (1) pokazanego poniżej:
        Wskaźnik przeżycia HC (%) = (liczba ocalałych HC / Liczba ocalałych i brakujących HC) × 100 (1)
      2. Aby obliczyć liczbę synaps, należy uzyskać obrazy stosu z o wysokiej rozdzielczości wewnętrznego obszaru HC za pomocą soczewki obiektywowej z olejkiem (63×) z 3,1-krotnym zoomem cyfrowym i krokiem 0,25 μm pod konfokalną mikroskopią fluorescencyjną. Zaimportuj stosy obrazów do ImageJ i automatycznie zlicz punkty CtBP2 na IHC w zakresie 50 μm w każdym stosie obrazów. Oblicz współczynnik przeżycia wstęg synaptycznych za pomocą równania (2):
        Wskaźnik przeżywalności wstążek synaptycznych (%) = (liczba wstążek synaptycznych w uszach odsłoniętych przez LISW / liczba wstążek synaptycznych w uszach kontrolnych) × 100 (2)
    9. W przypadku skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) należy usunąć ślimak, jak opisano wcześniej, a następnie połączyć go 2% PFA i 2,5% aldehydu glutarowego w temperaturze 4 °C przez noc. Po odwapnieniu ślimaka przez wytrząsanie w roztworze EDTA o stężeniu 0,5 mol/l w temperaturze 4 °C przez 7 dni, należy rozdzielić ślimak na cztery części w celu przygotowania go w całości.
    10. Utrwalić tkanki 1% tetratlenkiem osmu w temperaturze 4 °C przez 30 minut, odwodnić w 50% etanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut, powtórzyć z 70 %, 80 %, 95 %, a następnie 100 % etanolem, rozpylić osmem i zbadać pod mikroskopem elektronowym przy napięciu 5,0 kV, jak wcześniej podano14.
    11. Przeprowadź analizę ilościową rozerwania wiązki stereorzęskowej w zewnętrznych komórkach rzęsatych (OHC), obliczając stosunek zakłóconych stereocilii (liczba zakłóconych stereocilii OHC/całkowita liczba stereocilii OHC) w każdej grupie energetycznej przy użyciu obrazów SEM14. Policz liczbę stereocilii na 100 μm w środku obszarów 16,0 i 24,0 kHz. Oznacz jeden lub więcej rzędów wiązek OHC, które są wygięte w bok, splątane lub pozbawione podstawy, jako przerwane.
  2. Numery SGN
    1. Aby ilościowo ocenić liczbę SGN po 1 miesiącu od ekspozycji na LISW, należy przeprowadzić perfuzję przezsercową z 4% PBS, zdekapitować, usunąć ślimak i wykonać stabilizację tylną w tych samych warunkach, jak opisano powyżej. Odwapnić ślimak w 0,5 M EDTA przez 1 tydzień.
    2. Po odwapnieniu zanurz ślimaki w 30% sacharozie na noc, zanurz je w związku kriosekcji, zamroź w ciekłym azocie, aby przygotować skrawki w pobliżu kanału Rosenthala o grubości 15 μm, wybarwij hematoksyliną i eozyną i obejrzyj je pod mikroskopem świetlnym14.
    3. W celu pomiaru gęstości SGN należy policzyć liczbę SGN w środkowym zwrocie kanału Rosenthala i obliczyć przeżycie SGN na kontrolę.

5. Analiza statystyczna

  1. Wykonuj analizy statystyczne za pomocą wybranego oprogramowania.
  2. Analizuj różnice statystyczne w przesunięciu progu ABR, HC, SGN i liczbie synaps za pomocą dwukierunkowych pomiarów powtarzanych ANOVA ["częstotliwość lub części ślimaka (wierzchołkowe/środkowe/zasadowe)" × "grupy zwierząt"], dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnego porównania Tukeya post hoc.
  3. Przedstaw wszystkie dane jako średni ± błąd standardowy i ustaw poziom istotności statystycznej na p < 0,05.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

przebieg LISW
Odtwarzalność przebiegu ciśnienia LISW zmierzono 5x przy 2,0 J/cm2 w następujący sposób. Przebiegi były na ogół podobne i stabilne oraz wykazywały gwałtowny wzrost wraz z szerokością czasu, szczytowym ciśnieniem i impulsem 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa i 14,1 ± 1,9 Pa∙s (mediana ± SD), co odpowiada charakterystyce SW (Rysunek 1B). LISW charakteryzują się szybkim czasem narastania, wysokim ciśnieniem szczytowym, krótkim czasem trwania i dominacją nadciśnienia. Po nałożeniu na tkankę biologiczną cel jest umieszczany bezpośrednio na żywej tkance przez galaretkę i można uznać, że SW ma prawie takie same cechy, jak zmierzony SW zastosowany do tkanki. Po ekspozycji na LISW występowanie TMP oceniano za pomocą małego endoskopu cyfrowego. Żadna z myszy w grupie energetycznej LISW nie wykazywała TMP po ekspozycji (Rysunek 1C).

Ocena słuchowa
Wykonano badanie ABR w celu określenia funkcji słuchowych. ABR jest miarą potencjału wywołanego dźwiękiem w szlaku słuchowym, a ABR P1 reprezentuje skumulowaną aktywność neuronalną w nerwie ślimakowym. Jednego dnia po ekspozycji na LISW odsłonięte ucho wykazało istotną różnicę w przesunięciu progu ABR między różnymi grupami LISW (dwukierunkowa ANOVA, p < 0,0001; Rysunek 2A). Ten wzrost przesunięcia progu ABR utrzymywał się przez okres do 1 miesiąca po ekspozycji na LISW w grupach 2,25 i 2,5 J/cm2 (dwukierunkowa ANOVA, 2,25 J/cm2, p < 0,0001; 2,5 J/cm2, p < 0,0001). W szczególności w regionie wysokiej częstotliwości odnotowano znaczny wzrost przesunięcia progu ABR. Jednak progi ABR powróciły do poziomu, który nie różnił się istotnie od napromieniowania wstępnego w grupie 2,0 J (dwukierunkowa ANOVA, 2,0 J/cm2, p = 0,76), co wskazuje, że podniesienie progu było zależne od energii. Jeśli chodzi o amplitudy ABR P1, wszystkie grupy napromieniowane LISW wykazały znaczny spadek amplitudy ABR P1 przy wszystkich częstotliwościach 1 dzień i 1 miesiąc po ekspozycji na LISW (dwukierunkowa ANOVA, p < 0,0001; Rysunek 2B). Ucho nienarażone (kontrolne; lewe ucho) nie wykazywało zauważalnych zmian w progu słyszenia ABR po ekspozycji na LISW (dane nie pokazane).

Przeżywalność HCs i SGN
Obserwacja mikroskopowa uszu wystawionych na działanie LISW nie wykazała żadnych mechanicznych uszkodzeń ślimaka, takich jak złamanie i zwichnięcie kosteczek słuchowych, pęknięcie błony okiennej okrągłej lub krwotok wewnątrzślimakowy, po ekspozycji na LISW (dane nie pokazane), co jest zgodne z wcześniejszymi ustaleniami6,14.

Fluorescencyjne barwienie immunologiczne HCs za pomocą Myo7A, wstęg synaptycznych za pomocą CtBP2 i nerwu ślimakowego za pomocą NF jest pokazane w Rysunek 3A. W żadnej z grup nie zaobserwowano poważnych uszkodzeń ślimaka, takich jak utrata HC lub włókien nerwowych. Jednak ilościowa ocena przeżycia Myo7A dodatnich OHC różniła się istotnie między grupami (dwukierunkowa ANOVA, p = 0,002; Rysunek 3B). Grupa 2,5 J/cm2 wykazała istotnie niższe wskaźniki przeżycia OHC niż grupa kontrolna, szczególnie w obszarze wysokiej częstotliwości (dwukierunkowa ANOVA, 2,5 J/cm2, p = 0,0002). Jednak wskaźniki przeżycia IHC były porównywalne między grupami, co wskazuje, że OHC są podatne na wysokoenergetyczne LISW (dwukierunkowa ANOVA, p = 0,76). Ilościowa ocena przeżycia wstęgi synaptycznej jest pokazana w Rysunek 3C. Wstęgi synaptyczne były znacznie zmniejszone zarówno w grupach 2,25, jak i 2,5 J/cm2 w porównaniu z grupą kontrolną (dwukierunkowa ANOVA, 2,25 J/cm2, p < 0,0001; 2,5 J/cm2, p < 0,0001), a wyższe częstotliwości wykazywały silniejszą tendencję do zmniejszania się, podobną do przesunięcia progu ABR i przeżycia OHC.

Następnie oceniono gęstość SGN, jak pokazano w Rysunek 3D. Stwierdzono istotną różnicę w gęstości SGN między grupami (dwukierunkowa ANOVA, p = 0,76), a grupa 2,5 J/cm2 wykazała istotnie niższe wskaźniki przeżycia SGN w porównaniu z grupami kontrolnymi (dwukierunkowa ANOVA, 2,5 J/cm2, p = 0,007). Jednak grupy 2,0 i 2,25 J/cm2 wykazały porównywalne przeżycie SGN w porównaniu z grupą kontrolną. Wynik ten wskazuje, że nasilenie zwyrodnienia ślimaka i dysfunkcji słuchu zależy od ekspozycji na energię LISW, co jest zgodne z wynikami przeżycia ABR i HC.

Wiązka stereociliarna
Zaobserwowaliśmy znaczny wzrost progu ABR, około 30 dB, zarówno w grupach 2,25, jak i 2,5 J/cm2 przy częstotliwościach powyżej 20 kHz, który utrzymywał się do 1 miesiąca po ekspozycji na LISW (jak pokazano na Rysunek 2A). Jednak zaobserwowane przez nas przesunięcie progu o 30 dB nie może być przypisane wyłącznie utracie OHC, zwyrodnieniu synaps ślimakowych lub zmniejszonej liczbie SGC (Rysunek 3). Poprzednie badanie wykazało, że przesunięcia progu ABR były minimalne, gdy liczba wstęg synaptycznych zmniejszyła się o 50%19. W związku z tym przeprowadziliśmy SEM w celu zbadania przyczyny podniesienia progu ABR. Po ekspozycji na LISW o intensywności 2,5 J/cm2, niektóre stereorzęskowe wiązki OHC wydawały się być zakłócone, szczególnie w obszarach o wysokiej częstotliwości (Figura 4A), co może być jedną z przyczyn zwiększonego progu ABR po ekspozycji na LISW. Ilościowa ocena zakłóceń stereorzęskowych wykazała, że współczynnik zakłóceń był wyższy w obszarze wyższej częstotliwości w sposób zależny od energii (Rysunek 4B).

figure-results-1
Rysunek 1: Ustawienia eksperymentalne i profil ciśnienia LISW. (A) Eksperymentalny układ do generowania LISW u zwierząt. (B) Charakterystyka przebiegów ciśnienia LISW ustalonych na poziomie 2,0 J/cm2. (C) Reprezentatywne obrazy błony bębenkowej. TMP nie zaobserwowano w żadnym z uszu wystawionych na działanie LISW. Jako odniesienie, reprezentatywne TMP (żółte groty strzałek) wywołane wybuchem są pokazane za pomocą rurki strzałowej. Skróty: LISW = fala uderzeniowa indukowana laserem; PET = politereftalan etylenu; TMP = perforacja błony bębenkowej; YAG = granat itrowo-aluminiowy; SHG = generacja drugiej harmonicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wyniki ABR po ekspozycji na LISW. (A) Znaczące przesunięcia progu ABR zaobserwowano we wszystkich grupach 1 dzień po ekspozycji na LISW. Przesunięcia progu ABR w grupach 2,25 i 2,5 J/cm2 pozostawały znacznie podwyższone przez okres do 1 miesiąca po ekspozycji na LISW. (B) Amplituda ABR P1 1 dzień i 1 miesiąc po ekspozycji na LISW znacznie zmniejszyła się we wszystkich grupach. Gwiazdki wskazują na istotne różnice między grupami w porównaniu z wartościami sprzed ekspozycji (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Słupki błędu wskazują błąd standardowy średniej. Skróty: ABR = słuchowa odpowiedź pnia mózgu; LISW = fala uderzeniowa indukowana laserem; P1 = pik 1; SPL = poziom ciśnienia akustycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Patologia ślimaka po ekspozycji na LISW. (A) Konfokalne obrazy fluorescencyjne narządu Cortiego w obszarze 20 kHz barwione Myo7A (niebieski), CtBP2 (czerwony) i NF (zielony) po ekspozycji na LISW. (B) Średni odsetek HC, które przeżyły, przedstawiono w cytokachleogramach. Ocena ilościowa wykazała znaczną utratę OHC przy 2,5 J/cm2, chociaż nie było znaczącej różnicy w przeżywalności IHC między grupami. (C) Wskaźnik przeżycia wstęg presynaptycznych w porównaniu z wartościami sprzed ekspozycji był znacznie zmniejszony w grupach 2,25 i 2,5 J/cm2. (D) Reprezentatywne mikrofotografie SGN we wszystkich grupach 1 miesiąc po ekspozycji na LISW. Wskaźnik przeżycia SGN zmniejszył się istotnie i wynosił 2,5 J/cm2. Gwiazdki wskazują na istotne różnice w porównaniu z wartościami sprzed ekspozycji (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Słupki błędu wskazują błąd standardowy średniej. Podziałka = 5 μm (A), 100 μm (D). Skróty: LISW = fala uderzeniowa indukowana laserem; IHC = wewnętrzna komórka rzęsata; NF = neurofilament; OHC = zewnętrzna komórka rzęsata; SGN = neuron spiralnego zwoju. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Struktury powierzchniowe OHC. (A) Reprezentatywne obrazy stereocilii OHC z skaningowej mikroskopii elektronowej w obszarach 16 kHz i 24 kHz narządu Cortiego miesiąc po ekspozycji na LISW. Zakłócenie stereorzęskowe jest widoczne na powiększonych obrazach obszaru pudełkowego w grupie 2,5 J/cm2 (obszar 24 kHz). Pasek skali -= 2 μm. (B) Szybkość zakłóceń stereorzęskowych była wyższa wraz ze wzrostem nadciśnienia LISW. Skróty: LISW = fala uderzeniowa indukowana laserem; OHC = zewnętrzne komórki rzęsate. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to miało na celu walidację mysiego modelu uszkodzenia ślimaka wywołanego wybuchem za pomocą LISW. Nasze odkrycia wykazały, że po zastosowaniu LISW przez kość skroniową, odsłonięte ucho myszy wykazywało konsekwentny patologiczny i fizjologiczny spadek ślimaka, któremu towarzyszył wzrost nadciśnienia LISW. Wyniki te wskazują, że ten mysi model jest odpowiedni do replikacji różnych patologii ślimaka poprzez dostosowanie danych wyjściowych LISW. W szczególności ten mysi model dysfunkcji ślimaka wywołany przez LISW może służyć jako dobry model uszkodzenia ślimaka ze względu na jego kontrolowany, powtarzalny i wymierny charakter, a także zdolność do odtwarzania patofizjologicznego spadku wydajności ślimaka w kontrolowanych warunkach.

W naszym poprzednim badaniu wykorzystaliśmy model szczurzy i zaobserwowaliśmy zwyrodnienie ślimaka wywołane przez LISW, w tym podniesienie progów słyszenia, utratę wstążek synaptycznych i zaburzenie pęczka stereorzęskowego14. W innym badaniu badano patofizjologiczne zwyrodnienie ślimaka po urazie wybuchowym u myszy przy użyciu dwóch rodzajów blastów o różnej charakterystyce: dominujących o niskiej częstotliwości przy użyciu rurki blasturowej i dominujących o wysokiej częstotliwości przy użyciu LISW15. Ustalili, że dominująca częstotliwość widma mocy wybuchu była głównym czynnikiem określającym obszar uszkodzenia ślimaka, jak wcześniej informowano15. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwsze badanie, które demonstruje szczegółową metodologię ekspozycji ślimaka LISW oraz zależnego od energii i częstotliwości zwyrodnienia ślimaka wywołanego przez LISW.

Wykorzystaliśmy ekspozycję na LISW do uszkodzenia ślimaka przez kość skroniową zauszną, a nie przez zewnętrzny przewód słuchowy, aby stworzyć model, który obejmował wyłącznie uszkodzenie ślimaka bez żadnego TMP lub przerwania łańcucha kosteczek słuchowych. Nasze wyniki sugerują, że upośledzenie słuchu wykazane w tym badaniu było spowodowane pogorszeniem składników czuciowo-nerwowych w szlaku słuchowym. Ostatnie badania wykazały, że TMP może służyć jako bufor przeciwko uszkodzeniu ślimaka poprzez pochłanianie energii SW 2,20,21. Ten model LISW nie był w stanie indukować TMP, nawet przy LISW o dużej intensywności, ponieważ SW był bezpośrednio napromieniowany do ucha wewnętrznego, a nie przez błonę bębenkową. Dlatego, aby przeanalizować mieszany ubytek słuchu z TMP i SNHL, idealny jest podmuch o dużej intensywności generowany przy użyciu prawdziwej rurki wybuchowej lub szokowej. Wybór rodzaju wybuchu zależy od konkretnego zastosowania lub celu badania. Dlatego ten oparty na LISW model obrażeń zwierząt jest przydatny do wyjaśnienia patofizjologii ślimaka wywołanej czystym wybuchem bez TMP, co skutkuje przewodzeniowym ubytkiem słuchu. Z innej perspektywy, naświetlanie LISW wymagało 1 godziny na zwierzę, w tym ustawienia sprzętu i sprawdzenia błony bębenkowej po napromieniowaniu. W związku z tym, jeśli kilka zwierząt było narażonych na LISW z rzędu w ciągu 1 dnia, trudno jest zmierzyć napromienianie LISW i ABR tego samego dnia za pomocą pojedynczej dawki środka znieczulającego. Ze względu na ryzyko śmierci zwierzęcia przy zwiększaniu dawki środka znieczulającego, w tym badaniu zdecydowaliśmy się na wykonanie pomiarów ABR następnego dnia, a nie bezpośrednio po napromieniowaniu tego samego dnia.

W urazie spowodowanym wybuchem faza pierwotna jest spowodowana siłami fizycznymi eksplozji i szybką transmisją SW ze znacznymi zmianami gęstości tkanek, takimi jak połączenia tkanka-powietrze22. W związku z tym uważa się, że większość urazów ślimaka wywołanych wybuchem wynika z SW w pierwotnej fazie6, co sugeruje, że badania nad uszkodzeniami ślimaka narażonymi na SW mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów dysfunkcji ślimaka wywołanej przez blast. Tworzenie SW za pomocą wysokoenergetycznego impulsu laserowego na materiale stałym jest znane jako LISW. W poprzednich badaniach wykorzystano LISW do opracowania modeli zwierzęcych urazowych uszkodzeń mózgu i płuc wywołanych wybuchem16,17. Korzyści płynące z zastosowania LISW do badań związanych z wybuchami obejmują powtarzalny model uszkodzeń zależny od intensywności lasera oraz specyficzne ukierunkowanie na uszkodzony narząd, ponieważ LISW nie wpływa na obszary poza obszarem docelowym.

W tym badaniu odkryliśmy, że LISW wywołuje patologiczne zmiany w HC ślimaka, SGN, ich synapsach i pęczku stereorzęskowym, podobne do uszkodzeń spowodowanych prawdziwym uszkodzeniem po wybuchu12. Uszkodzenia spowodowane różnymi formami urazów ślimaka, takie jak utrata słuchu spowodowana hałasem, można przypisać dwóm podstawowym czynnikom: bezpośredniemu obciążeniu mechanicznemu i wtórnemu zaburzeniu metabolicznemu. Sugerujemy, że przerwanie pęczka stereorzęskowego jest pierwotną patologią wynikającą z bezpośredniego naprężenia mechanicznego LISW. Zaburzenia stereociliary są częstymi patologiami związanymi z dysfunkcją słuchu związaną z wiekiem i wywołaną hałasem23,24. Dokładny mechanizm leżący u podstaw tego zaburzenia stereorzęskowego nie został jeszcze wyjaśniony. Poprzednie badanie wykazało, że zaburzenie stereociliary obserwowano 1 tydzień po ekspozycji na blast12. Możliwą przyczyną tej unikalnej zmiany morfologicznej może być rozłączenie ogniw wierzchołkowych i bocznych między zaburzoną stereocilią w skrajnym rzędzie zewnętrznym a stereocilią w środkowym rzędzie14. Ponadto korzonki najbardziej zewnętrznego rzędu stereocilia, które składają się z aktyny i białek wiązanych, takich jak TRIOBP, są również mechanicznie uszkodzone15.

Uszkodzenia ślimaka zwykle prowadzą do dalszych zakłóceń procesów metabolicznych, które mogą utrzymywać się przez kilka dni, anawet miesięcy. W szczególności synapsy w ślimaku, które są odpowiedzialne za przetwarzanie dźwięków słuchowych, są bardzo wrażliwe na ekspozycję na wybuchy25. Nasze modele zwierzęce wykazały, że zwyrodnienie funkcji AN, o czym świadczy spadek amplitud ABR P1, było spowodowane uszkodzeniem ślimaka wywołanym przez LISW. Jednym z możliwych mechanizmów synaptopatii ślimakowej indukowanej przez LISW jest nadmierne uwalnianie glutaminianu przez IHC, takie jak ototoksyczność glutaminianu26. Ekspozycja na LISW powoduje gwałtowne drgania błony podstawnej, powodując nadmierne uwalnianie glutaminianu z IHC, co skutkuje zwyrodnieniem AN. LISW może replikować rodzaj toksyczności glutaminianu, który wpływa na ślimak, prowadząc do synaptopatii ślimaka i spadku liczby synaps bez uszkadzania HC. Innym możliwym mechanizmem jest to, że narażenie na LISW może uszkodzić komórki podporowe ślimaka, co przyczynia się do przeżycia ANF w zależności od uwalniania neurotrofin27. Ponadto LISW może być przesyłany bezpośrednio do ANF i powodować uszkodzenia neuronów. W związku z tym nasze modele uszkodzeń ślimaka indukowane przez LISW mogą być cenne zarówno dla badań nad wybuchami, jak i dla badania różnych form zwyrodnienia ślimaka, które obejmują synaptopatię ślimaka.

Istnieje pilna potrzeba interwencji terapeutycznych w celu rozwiązania problemu ubytku słuchu wywołanego przez wybuch, co podkreśla znaczenie strategii leczenia koncentrujących się na synaptopatii ślimakowej lub zaburzeniu pęczka stereorzęskowego w OHC. Podejścia te można również zastosować do innych rodzajów zaburzeń słuchu o podobnych mechanizmach patologicznych. Synaptopatię ślimakową zaobserwowano w naszym modelu dysfunkcji ślimaka wywołanej wybuchem, co sugeruje, że może to być obiecujący cel terapeutyczny. LISW może być używany do tworzenia modeli mysich, które dokładnie odtwarzają patofizjologię ślimaka spowodowaną blastami, a modele te mogą być wykorzystywane do badania różnych rodzajów dysfunkcji ślimaka.

Nasze badanie ma kilka ograniczeń. Najpierw zmierzyliśmy progi ABR na poziomie 12-24 kHz. Zgodnie z poprzednim badaniem, uszkodzenie ślimaka wywołane przez LISW powoduje utratę słuchu o wysokiej częstotliwości u zwierząt ze względu na charakterystykę SW i wrażliwość podstawy ślimaka. Konieczne są dalsze badania ABR w szerszych zakresach częstotliwości (>24 kHz). Po drugie, w tym badaniu przeprowadziliśmy tylko ocenę histologiczną ślimaka i nie oceniliśmy centralnej drogi słuchowej. Upośledzenie słuchu w wyniku urazu spowodowanego wybuchem nie ogranicza się tylko do ślimaka, ale jest skomplikowanym upośledzeniem pnia mózgu i centralnego układu słuchowego. W przyszłości pożądana byłaby ocena ośrodka słuchowego w modelach zwierzęcych narażonych na LISW.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez dwa granty od JSPS KAKENHI (Granty o numerach 21K09573 (K.M.) i 23K15901 (T.K.)).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laser Nd:YAG 532 nm z przełączaniem Q Oprogramowanie doBrilliant b
ABRMass Eye and EarN/AEPL Cochlear Function Test Suite
Klej do spawania żywicy akrylowej Acrysunday Co., LtdN/A
konfokalna mikroskopia fluorescencyjnaLeicaTCS SP8
Związek kriosekcyjnySakuraTissue-Tek OCT
CtBP2przeciwciało BD Transdukcja# 612044
Dielektryczne lustra wielowarstwoweSIGMAKOKI CO., LTDTFMHP-50C08-532M1-M3
OscyloskopcyfrowyTektronixDPO4104B
SłuchawkiCUICDMG15008-03A
HydrofonRP akustyka e.K.
Wtyczka oprogramowania FOPH2000 Image JLinia pomiarowaNIHhttps://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Mikroskop świetlnyKeyence CorporationBZ-X700
Przeciwciało Myosin 7AProteus Biosciences#25– 6790 
Przeciwciało neurofilamentoweSigma#AB5539
Soczewka płasko-wypukłaSIGMAKOKI CO., LTDSLSQ-30-200PM
Oprogramowanie pryzmatyczneGraphPadN/Aver.8.2.1
Skaningowy mikroskop elektronowyJEOL LtdJSM-6340F
Mały endoskop cyfrowyAVS Co., LtdAE-C1
Galaretka ultradźwiękowaHitachi Aloka MedicalN/A
Zmienny tłumikShowa Optronics Co.Nie dotyczyObecnie dostępny następca: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Rozpuszczalny w wodzie enkapsulant Dako#S1964
analizy pików Quantel

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arun, P., et al. Blast exposure causes long-term degeneration of neuronal cytoskeletal elements in the cochlear nucleus: A potential mechanism for chronic auditory dysfunctions. Front Neurol. 12, 652190(2021).
  2. Kurioka, T., Mizutari, K., Satoh, Y., Shiotani, A. Correlation of blast-induced tympanic membrane perforation with peripheral cochlear synaptopathy. J Neurotrauma. 39 (13-14), 999-1009 (2022).
  3. Liberman, M. C., Epstein, M. J., Cleveland, S. S., Wang, H., Maison, S. F. Toward a differential diagnosis of hidden hearing loss in humans. PLoS One. 11 (9), e0162726(2016).
  4. Koizumi, Y., et al. Y-27632, a rock inhibitor, improved laser-induced shock wave (lisw)-induced cochlear synaptopathy in mice. Mol Brain. 14 (1), 105(2021).
  5. Parthasarathy, A., Kujawa, S. G. Synaptopathy in the aging cochlea: Characterizing early-neural deficits in auditory temporal envelope processing. J Neurosci. 38 (32), 7108-7119 (2018).
  6. Kurioka, T., et al. Characteristics of laser-induced shock wave injury to the inner ear of rats. J Biomed Opt. 19 (12), 125001(2014).
  7. Paik, C. B., Pei, M., Oghalai, J. S. Review of blast noise and the auditory system. Hear Res. 425, 108459(2022).
  8. Bryden, D. W., Tilghman, J. I., Hinds, S. R. Blast-related traumatic brain injury: Current concepts and research considerations. J Exp Neurosci. 13, 1179069519872213(2019).
  9. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  10. Shao, N., et al. Central and peripheral auditory abnormalities in chinchilla animal model of blast-injury. Hear Res. 407, 108273(2021).
  11. Ou, Y., et al. Traumatic brain injury induced by exposure to blast overpressure via ear canal. Neural Regen Res. 17 (1), 115-121 (2022).
  12. Cho, S. I., et al. Mechanisms of hearing loss after blast injury to the ear. PLoS One. 8 (7), e67618(2013).
  13. Kurioka, T., Mizutari, K., Satoh, Y., Kobayashi, Y., Shiotani, A. Blast-induced central auditory neurodegeneration affects tinnitus development regardless of peripheral cochlear damage. J Neurotrauma. , (2023).
  14. Niwa, K., et al. Pathophysiology of the inner ear after blast injury caused by laser-induced shock wave. Sci Rep. 6, 31754(2016).
  15. Kimura, E., et al. Effect of shock wave power spectrum on the inner ear pathophysiology in blast-induced hearing loss. Sci Rep. 11 (1), 14704(2021).
  16. Satoh, Y., et al. Pulmonary blast injury in mice: A novel model for studying blast injury in the laboratory using laser-induced stress waves. Lasers Surg Med. 42 (4), 313-318 (2010).
  17. Kawauchi, S., et al. Effects of isolated and combined exposure of the brain and lungs to a laser-induced shock wave(s) on physiological and neurological responses in rats. J Neurotrauma. 39 (21-22), 1533-1546 (2022).
  18. Cassinotti, L. R., et al. Cochlear neurotrophin-3 overexpression at mid-life prevents age-related inner hair cell synaptopathy and slows age-related hearing loss. Aging Cell. 21 (10), e13708(2022).
  19. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: Cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  20. Hickman, T. T., Smalt, C., Bobrow, J., Quatieri, T., Liberman, M. C. Blast-induced cochlear synaptopathy in chinchillas. Sci Rep. 8 (1), 10740(2018).
  21. Jiang, S., Sanders, S., Gan, R. Z. Hearing protection and damage mitigation in chinchillas exposed to repeated low-intensity blasts. Hear Res. 429, 108703(2023).
  22. Nakagawa, A., et al. Mechanisms of primary blast-induced traumatic brain injury: Insights from shock-wave research. J Neurotrauma. 28 (6), 1101-1119 (2011).
  23. Wu, P. Z., Liberman, M. C. Age-related stereocilia pathology in the human cochlea. Hear Res. 422, 108551(2022).
  24. Kurabi, A., Keithley, E. M., Housley, G. D., Ryan, A. F., Wong, A. C. Cellular mechanisms of noise-induced hearing loss. Hear Res. 349, 129-137 (2017).
  25. Kim, J., Xia, A., Grillet, N., Applegate, B. E., Oghalai, J. S. Osmotic stabilization prevents cochlear synaptopathy after blast trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (21), E4853-E4860 (2018).
  26. Hu, N., Rutherford, M. A., Green, S. H. Protection of cochlear synapses from noise-induced excitotoxic trauma by blockade of ca(2+)-permeable ampa receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (7), 3828-3838 (2020).
  27. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, e03564(2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

zmys owa niedos uchowoodpowied pnia m zgu na bod ce s uchowekom rki rz sate limakaneurony zwoju spiralnegoperforacja b ony b benkowejmodel zwierz cy limakaliczba wst ek synaptycznychmapa cz stotliwo ci limaka

Powiązane artykuły