Wytwarzanie termoplastycznych kanałów mikroprzepływowych

Podsumowanie

W niniejszym materiale demonstrujemy sposób wytwarzania termoplastycznych chipów mikrofluidycznych z wykorzystaniem tłoczenia na gorąco i zgrzewania termicznego. Następnie pokazujemy, jak wykorzystać in situ szczepienie powierzchni sterowane światłem oraz polimeryzację przez zgrzany chip w celu utworzenia kompozytowych kolumn fazy stałej.

Streszczenie

W naszym laboratorium z powodzeniem wyizolowaliśmy kwasy nukleinowe bezpośrednio z mikrolitrowych i submikrolitrowych objętości ludzkiej krwi, moczu i kału, wykorzystując mikroskalową lizę opartą na kompozycie polimer/nanocząsteczka oraz kolumny do ekstrakcji w fazie stałej. Odzyskane próbki są skoncentrowanymi próbkami o małej objętości, które nadają się do reakcji PCR bez konieczności dodatkowego oczyszczania. W niniejszym materiale demonstrujemy sposób wytwarzania termoplastycznych chipów mikroprzepływowych przy użyciu tłoczenia na gorąco i zgrzewania termicznego. Następnie pokazujemy, jak wykorzystać in situ szczepienie powierzchni sterowane światłem oraz polimeryzację przez zgrzany chip w celu utworzenia kompozytowych kolumn do ekstrakcji w fazie stałej. Demonstrujemy szczepienie i polimeryzację kolumny z kompozytu nanorurek węglowych/polimeru do lizy komórek bakteryjnych. Następnie przedstawiamy proces lizy, po którym następuje ekstrakcja kwasów nukleinowych z próbki na chipie w fazie stałej przy użyciu kolumny z kompozytu krzemionka/polimer. Załączone protokoły zawierają szczegółowe instrukcje dotyczące wykonania zarówno kolumn do lizy, jak i kolumn do ekstrakcji w fazie stałej.

Protokół

Kanały mikroprzepływowe są wytwarzane w cyklicznej poliolefina (Zeonex® 690R, Zeon Chemical Inc., Louisville, KY). Zeonex posiada temperaturę przejścia szklistego (T_g) wynoszącą 136°C i jest przezroczysty dla promieniowania UV, co jest niezbędne dla chemii sterowanej światłem, wykorzystywanej w formowaniu porowatych monolitów. Mikrokanały są wytwarzane metodą mikroprasowania na gorąco z użyciem elektroformowanej matrycy z NiCo, która posiada negatywowe (odwrócone) cechy platformy mikroprzepływowej. Prasowanie na gorąco przebiega w następujący sposób:

1. Formę oraz polimerowy podłoże umieszcza się pomiędzy dwiema równoległymi metalowymi płytami grzejnymi.
2. Płyty są podgrzewane do temperatury tłoczenia (166°C), która jest o 30ºC wyższa od T_g materiału Zeonex.
3. Następnie płyty są dociskane do siebie przez około 5 min przy utrzymaniu ciśnienia na poziomie 250 psi.
4. Formę i podłoże wyjmuje się z podgrzanych płyt, pozostawia do ochłodzenia na 1-2 min, a następnie rozdziela się je ręcznie.
5. Na końcach kanałów wierci się otwory o średnicy 1,5 mm w celu wprowadzania i pobierania próbek.
6. Wytłoczone plastikowe podłoże jest następnie termicznie łączone z innym kawałkiem Zeonex w celu utworzenia zamkniętych kanałów mikrofluidycznych. Przed termicznym łączeniem wytłoczone podłoże i element przykrywowy mogą zostać poddane działaniu ozonu UV lub plazmy, aby zwiększyć szczelność i zapewnić wierność odwzorowania struktury zamkniętego kanału (Bhattacharyya and Klapperich, 2007).

Wytwarzanie kolumny do ekstrakcji w fazie stałej (SPE) wewnątrz plastikowych kanałów mikrofluidycznych

Wytwarzanie fazy stałej jest procesem dwuetapowym. W pierwszej kolejności wykonane mikrokanały poddawane są modyfikacji powierzchniowej w celu poprawy adhezji kolumny SPE do plastikowego urządzenia. W celu funkcjonalizacji ścianek polimerowych mikrokanałów stosuje się szczepienie poprzez fotopolimeryzację powierzchniową.

Procedura szczepienia przebiega w następujący sposób:

1. Mikrokanały wypełnia się mieszaniną etylenediakrylanu (EDA) i metakrylanu metylu (MMA) w stosunku 1:1 z dodatkiem 3% benzofenonu, który pełni rolę fotoinicjatora wyrywającego wodór. EDA, MMA oraz benzofenon zakupiono od firmy Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
2. Następnie chip poddaje się naświetlaniu promieniowaniem UV przez 10 min przy długości fali 254 nm i energii 200 mJ/cm² w urządzeniu do naświetlania ultrafioletowego (CL-1000 UV Crosslinker, UPV Inc., Upland, CA). Szczepienie zachodzi w procesie polimeryzacji z wyrywaniem wodoru, co prowadzi do powstania przytwierdzonych do powierzchni łańcuchów polimerowych, które zostają włączone w mieszaninę polimeryzacyjną wykorzystywaną do przygotowania monolitu w drugim etapie.
3. Nadmiar monomeru usuwa się z kanałów poprzez płukanie 15 μL metanolu z wykorzystaniem aspiracji próżniowej.

Po procesie fotoprzeszczepiania w mikrokanałach tworzy się mikroporowaty monolit polimerowy, który unieruchamia cząsteczki krzemionki służące do ekstrakcji DNA. Porowaty monolit jest przygotowywany in situ w następujący sposób:

1. Kanały z modyfikowaną powierzchnią wypełnia się mieszaniną prekursorów monolitu składającą się z BuMA (15% wag.), EDMA (10% wag.), 1-dodekanolu (52,5% wag.), cykloheksanolu (22,5% wag.), DMPAP (1% wag. w stosunku do monomerów) oraz cząstek krzemionki 0,7 μm (15% w stosunku do całkowitej objętości mieszaniny prepolimeru). Mikrosfery krzemionkowe zakupiono od Polysciences, Inc. (Warrington, PA), a monomery i rozpuszczalniki porogenne od Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
2. Chip poddaje się naświetlaniu UV w krzyżowniku UV dawką 200 mJ/cm² przez 1,1 min w celu zainicjowania polimeryzacji, a nadmiar monomeru usuwa się z kanałów, płucząc je 15 μL metanolu za pomocą aspiracji próżniowej.
3. Następnie do studzienek doprowadzających i zbierających w kanałach mikrofluidycznych mocuje się złącza fluidyczne (złącza NanoPorts^TM, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA).
4. Porowaty monolit płucze się ponownie metanolem przez co najmniej 30 min przy użyciu pompy strzykawkowej z przepływem 100mL/hour.

Wytwarzanie monolitu do lizy CNT wewnątrz plastikowych kanałów mikrofluidycznych

Wytwarzanie monolitu lizującego z CNT (nanorurek węglowych) jest procesem dwuetapowym. W pierwszym kroku powierzchnia wytworzonych mikrokanałów zostaje zmodyfikowana (zaszczepiona) w taki sam sposób, jak w przypadku kolumn SPE w urządzeniu plastikowym.

Po procesie fotoszczepiania w mikrokanale powstaje mikroporowaty monolit polimerowy impregnowany wielościennymi nanorurkami węglowymi. Porowaty monolit jest przygotowywany in situ w następujący sposób:

1. Wielościenne nanorurki resuspensuje się w cykloheksanolu do stężenia 2,27M. Zawiesinę poddaje się sonikacji przez 30 minut przy amplitudzie 50% i cyklu pracy 50% przy użyciu sonifikatora do rozbijania komórek (Sonifier S-250D, produkowany przez Branson Ultrasonic, Danbury, CT). Sonikacja pozwoliła na uzyskanie skutecznej i stabilnej zawiesiny CNT o stężeniu 0,5M. CNT zakupiono w firmie Nanolabs (Brighton, MA).
2. Kanały z modyfikowaną powierzchnią wypełnia się podobną mieszaniną prekursorów monolitu, z tą różnicą, że zastosowano roztwór cykloheksanolu + CNT. Mieszanina monolitu składa się z BuMA (15% wag.), EDMA (10% wag.), 1-dodekanolu (52,5% wag.) oraz cykloheksanolu + CNT (22,5% wag.). Do roztworu dodaje się fotoinicjator DMPAP (1,13% wag. w stosunku do monomerów). Monomery, rozpuszczalniki porogenne oraz DMPAPA zakupiono w firmie Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
3. Chip naświetla się promieniowaniem UV w sieciującym urządzeniu UV z dawką 120 mJ/cm² przez 0,9 min w celu zainicjowania polimeryzacji. Urządzenie obraca się o 180 stopni w sieciarku i naświetla przez kolejne 0,9 min przy 120 mJ/cm². Nadmiar monomeru usuwa się z kanałów poprzez płukanie 50 μL metanolu z wykorzystaniem aspiracji próżniowej.
4. Następnie do otworów wlotowych i wylotowych kanałów mikrofluidycznych mocuje się złącza fluidyczne (złącza NanoPorts^TM, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA).

Przygotowanie próbki bakteryjnej do zastosowania z monolitem lizującym z CNT

Przygotowanie próbki bakteryjnej obejmuje pomiar gęstości optycznej przy 600nm, aby upewnić się, że próbka nie jest zbyt skoncentrowana, co pozwoli uniknąć zapchania kanału.

1. Zmierz gęstość optyczną (OD) bakterii w medium przy 600nm za pomocą biofotometru (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY). Rozcieńcz próbkę tak, aby odczyty OD mieściły się w zakresie 0,18-0,25 A.
2. Wirowarkuj próbkę przy 6 500 rpm przez 5 minut, a następnie odlej nadsącz.

Lizowanie

1. Resuspenduj bakterie w GuSCN* + .01%SDS + 4% Proteinase K (0.8mg/ml). Krótko wymieszaj w wirówce typu vortex (1ml bakterii w medium należy resuspendować w 1ml GuSCN). Do roztworu dodano Proteinase K, aby wspomóc denaturację białek związanych z bakteryjnym DNA oraz zahamować działanie DNAaz i RNAaz. Dodatkową zaletą Proteinase K jest pomoc w rozkładzie białek ściany komórkowej, co jest pożądane, ponieważ ściany komórkowe bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych zawierają duże ilości białek (choć bakterie gram-ujemne zazwyczaj mają ich więcej). Bufor chaotropowy dodatkowo wspomaga Proteinase K w denaturacji białek, podczas gdy detergent niszczy ścianę komórkową. Proteinase K oraz tiocyjanian guanidyny (GuSCN) zakupiono w Qiagen Inc. (Valencia, CA). SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) zakupiono w Pierce (Rockford, IL).
2. Przenieś natychmiast próbkę do strzykawki połączonej z rurką PEEK. Odessij zawartość strzykawki tak, aby w układzie nie pozostało powietrze. Podłącz rurkę do nanoportu i kanału.

Do eksperymentów wykorzystano pompę strzykawkową KDS100 (produkowaną przez KD Scientific, Holliston, MA), a przepływ zastosowany we wszystkich etapach wynosił 450 μL/hour. Przesunąć próbkę przez kanał lizy z przepływem 450 μL/hour.

1. Pobrać próbkę i przystąpić do ekstrakcji DNA metodą SPE (patrz protokół ekstrakcji DNA). UWAGA: W przypadku tej próbki bakteryjnej nie należy wykonywać Kroku 2 obciążania, ponieważ zawiesina znajduje się w GuSCN*.

Protokół ekstrakcji DNA

Procedura ekstrakcji składa się z 3 etapów:

1. Załadowanie.
2. Przemywanie.
3. Elucja.

Do eksperymentów wykorzystano pompę strzykawkową KDS100 (produkowaną przez KD Scientific, Holliston, MA), a zastosowana szybkość przepływu we wszystkich etapach wynosiła 300 μL/hour.

Załaduj

1. Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj kanał, przepływając przez niego bufor chaotropowy (GuSCN^*, tiocyjanian guanidyny) przez 1-2 min.
2. Wymieszaj próbkę z buforem chaotropowym w stosunku 1:1.
3. Przepływaj mieszaninę próbki przez kanał przez 3 min.

Przemyć

1. Przemyj kanał 70% etanolem przez 2 min.
2. Przemyj kanał 100% etanolem przez 2 min.

Eluuj

1. Eluuj wyekstrahowane DNA w wodzie millipore przez 3 min. Pobierz 15 μL oczyszczonego DNA gotowego do reakcji PCR.

*Użyto GuSCN z zestawu Qiagen (bufor RLT).