Ilościowa i niedroga bezkomórkowa metoda fluorescencyjna potwierdzająca zdolność nowych związków do chelatowania żelaza

Podsumowanie

Opisujemy test fluorescencyjny, który może szybko i tanio potwierdzić zdolność nowych związków do chelatowania żelaza. Test mierzy zdolność związków do konkurowania z aktywnością wiązania żelaza przez słabą sondę fluorescencyjną chelatującą żelazo Calceinę, co skutkuje wymiernym wzrostem fluorescencji, gdy zachodzi chelatacja.

Streszczenie

Komórki rakowe wymagają dużych ilości żelaza, aby utrzymać swoją proliferację. Metabolizm żelaza jest uważany za cechę charakterystyczną raka, co sprawia, że żelazo jest ważnym celem w podejściach przeciwnowotworowych. Opracowywanie nowych związków i identyfikacja tropów do dalszej modyfikacji wymaga przeprowadzenia testów potwierdzających działanie mechanizmu. Istnieje wiele testów oceniających wpływ na proliferację; Jednak zdolność do chelatowania żelaza jest ważnym, a czasem pomijanym wskaźnikiem punktu końcowego ze względu na wysokie koszty sprzętu i wyzwanie związane z szybkim i powtarzalnym określeniem ilościowym siły chelatacji. W tym miejscu opisujemy wymierną i niedrogą metodę fluorescencji bezkomórkowej, aby potwierdzić zdolność nowych związków do chelatowania żelaza. Nasz test opiera się na dostępnym na rynku, niedrogim barwniku fluorescencyjnym Calcein, którego fluorescencję można określić ilościowo na większości fluorescencyjnych czytników płytek do mikromiareczkowania. Kalceina jest słabym chelatorem żelaza, a jej fluorescencja jest wygaszona, gdy wiąże Fe^{2 + / 3 +}; fluorescencja jest przywracana, gdy nowy chelator konkuruje z kalceiną o związany Fe^{2 +/3 +}. Usunięcie wygaszania fluorescencyjnego i wynikający z tego wzrost fluorescencji pozwala na określenie zdolności chelatacyjnej nowego przypuszczalnego chelatora. Dlatego oferujemy niedrogi, wysokoprzepustowy test, który umożliwia szybkie badanie przesiewowe nowych potencjalnych związków chelatorowych.

Wprowadzenie

Zmiany fenotypowe w komórkach, które odnoszą się do rozwoju raka poprzez wspólny zestaw zmienionych zdolności biologicznych, są teraz powszechnie określane jako cechy charakterystyczne raka. Wśród nich są zmiany wynikające z przeprogramowania metabolizmu energetycznego, które są szeroko rozpowszechnione w biologii komórek nowotworowych¹. Takie przeprogramowanie metaboliczne obejmuje zwiększone zapotrzebowanie na żelazo, aby wspierać szybką proliferację i wzrost guza². To pragnienie żelaza prowadzi do rozregulowanego metabolizmu żelaza, który sam w sobie jest uważany za cechę charakterystyczną raka^3,4, przy czym dysregulacja występuje na wszystkich etapach⁵. Cechy charakterystyczne przerzutów, ostatnio zaproponowane przez Welcha i Hursta, obejmują rolę iron⁶, ponieważ żelazo może indukować stres oksydacyjny, a to z kolei może pośredniczyć w zmianach w genomie, epigenomie i proteomie, zwiększając możliwość przerzutów⁷. Związek między poziomem żelaza a zwiększoną częstością występowania raka wykazano w badaniach epidemiologicznych⁸.

Ponieważ komórki rakowe wymagają dużych ilości żelaza, są podatne na niedobór żelaza, a co za tym idzie, chelatację żelaza. Niedawno opublikowaliśmy artykuł przeglądowy, w którym podkreśliliśmy potencjał chelatacji żelaza w odwracaniu kilku cech charakterystycznych raka poprzez NDRG1 zakłócający onkogenne szlaki sygnałowe⁹. Jednak zastosowanie chelatacji żelaza jako samodzielnej terapii przeciwnowotworowej nie przyniosło pozytywnych wyników w badaniach klinicznych ze względu na ich toksyczność, krótki okres półtrwania, szybki metabolizm i pojawiające się mechanizmy oporności. Niemniej jednak chelatory żelaza okazały się obiecujące w badaniach in vitro i in vivo, co wskazuje, że potrzebne są dalsze prace nad opracowaniem skutecznych chelatorów żelaza w terapii raka. Specyficzna chelatacja żelaza jest sprawdzoną strategią w odkrywaniu leków przeciwnowotworowych, ale do tej pory zgłoszono tylko kilka klas¹⁰.

Identyfikacja i charakterystyka nowych chelatorów żelaza wymaga możliwości zmierzenia ich wpływu na kilka punktów końcowych. Wiele z nich (takich jak proliferacja, apoptoza, powstawanie reaktywnych form tlenu) jest rutynowo mierzonych i zostało opisanych i zrecenzowanych w literaturze jako metody oceny cech charakterystycznych raka¹¹. Oceniając nowy chelator żelaza, wiele grup rutynowo bada wpływ na aktywność antyproliferacyjną i redoks, a także wpływ na napływ lub odpływ żelaza. Techniki przewidywania in silico¹² dodatkowo zwiększają rosnącą pulę chelatorów żelaza, które można badać.

Stworzenie chelatatorów żelaza wymaga możliwości zmierzenia ich wpływu na poziom żelaza, aby skutecznie zademonstrować dowód zasady. Obecnie najpowszechniejszą metodą jest cytometria przepływowa¹³, która jest kosztowna, czasochłonna i słabo kwantyfikowalna. Wybór testu często opiera się na dostępności sprzętu eksperymentalnego, szybkości i koszcie testu. W związku z tym zdolność do chelatowania żelaza może być pomijaną miarą punktu końcowego ze względu na wysokie koszty sprzętu oraz wyzwanie związane z szybkim i powtarzalnym określeniem ilościowym siły chelatacji. W tym miejscu opisujemy wymierną i niedrogą metodę fluorescencyjną bez komórek, aby potwierdzić zdolność nowych związków do chelatowania żelaza.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu podstawowego

1. Przygotowując roztwory wyjściowe Calcein, należy zapobiegać fotodegradacji, trzymając roztwory w ciemności. Przygotuj 1 mM roztwór kalceiny w PBS firmy Dulbecco, bez magnezu i wapnia¹⁴. Na 5 ml 1 ml roztworu kalceiny dodać 3,1 mg kalceiny (622,5 g/M) do 5 ml PBS firmy Dulbecco. Używając 1 mM skarpety Calcein, przygotuj 1 ml porcji wtórnych roztworów podstawowych w probówce do mikrofuge, jak opisano w Tabeli 1.
2. Przygotować sześciowodny roztwór siarczanu żelazowo-amonowego, rozpuszczając 19 mg sześciowodnego FAS (392,1 g/M) w 5 ml PBS firmy Dulbecco w celu otrzymania 10 mM roztworu siarczanu żelazowo-amonowego (FAS). Przygotować zapasy wtórne FAS przez rozcieńczenie. Aby przygotować zapas 2 mM FAS (fA), rozcieńczyć 200 μL z 10 mM FAS z PBS z 800 μL PBS firmy Dulbecco. Aby przygotować zapas 100 μM FAS (fB), rozcieńczyć 50 μL naczyń fA 950 μL PBS firmy Dulbecco.
3. Aby przygotować 10 mM wywaru deferypronu, rozpuść 2,8 mg (139,15 g/M) w 2 ml PBS firmy Dulbecco. Przygotować zapasy wtórne chelatora żelaza 2 mM, rozcieńczając 200 μl 10 mM zapasów 800 μl PBS.
   firmy Dulbecco. UWAGA: W tym teście wybrany chelator żelaza powinien być rozpuszczony w PBS firmy Dulbecco bez magnezu i wapnia. Jako działający przykład użyliśmy chelatora żelaza Deferypronu.

2. Walidacja testu poprzez określenie liniowego zakresu fluorescencji kalceiny

1. Przygotować szereg wywarów kalceiny od 1 mM do 1 μM, zgodnie z opisem w tabeli roztworu podstawowego (patrz Tabela 1). Roztwory podstawowe należy przechowywać w ciemności, aby zapobiec degradacji fotochemicznej.
2. Odpipetować 90 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do studzienek od A do H i od 1 do 12 z płytki 96-dołkowej za pomocą jednokanałowej pipety ręcznej lub wielokanałowej pipety ręcznej.
3. Dodać 10 μl 1 mM bulionu kalceinowego do kolumny 12, rzędy od A do H, płytki 96-dołkowej za pomocą jednokanałowej pipety ręcznej.
4. Dodać 10 μl wstępnie przygotowanego bulionu kalceinowego o wielkości 800 μM (Tabela 1) do 96-dołkowej płytki w kolumnie 11, rzędy od A do H, używając jednokanałowej pipety ręcznej.
5. Powtórzyć procedurę dodawania z wsadami z tabeli 1 tak, aby kolumna 10 zawierała 10 μl wsadu 400 μM, a kolumna 9 zawierała 10 μl wsadu 200 μM itd. Kontynuuj tę procedurę krok po kroku we wszystkich kolumnach, aż kolumna 2 będzie zawierała 10 μl wsadu 1 μM.
   UWAGA: Końcowe stężenie kalceiny w każdym dołku jest 10-krotnie niższe niż w roztworach podstawowych ze względu na rozcieńczenie 1:10.
6. Dodać 10 μl PBS do kolumny 1, wierszy A–E.
7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut i ustawić analizator na czytniku mikropłytek na wzbudzenie 490 nm i detekcję 530 nm (lub odpowiedni zestaw filtrów do fluorescencji Calcien).

3. Walidacja testu za pomocąhartowania jonów Fe2⁺ w celu zmniejszenia fluorescencji kalceiny

1. Przygotować zapas kalceiny (cB) o pojemności 10 μM i zapas FAS (fA) o wielkości 2 mM (patrz tabela materiałów). Trzymaj bulion Calcein w ciemności, aby zapobiec fotodegradacji.
2. Używając jednokanałowej pipety ręcznej lub wielokanałowej pipety ręcznej, dodaj 50 μl PBS do kolumn od 2 do 10, rzędów od A do E. Nie dodawaj PBS do kolumny 11.
3. Dodać 100 μl zapasu FAS (fA) o pojemności 2 mM do 96-dołkowej płytki w kolumnie 11 (rzędy od A do E) za pomocą jednokanałowej pipety ręcznej.
4. Za pomocą wielokanałowej pipety ręcznej usunąć 50 μl fA z kolumny 11 i odpipetować go do PBS już w kolumnie 10, dokładnie wymieszać pipetując.
5. Kontynuować tę stopniową procedurę podwójnego rozcieńczania w kolumnach 9-2, rzędach od A do E płytki 96-dołkowej i mieszać pipetując.
6. Pobrać 50 μl roztworu przez pipetowanie z kolumny 2 i wyrzucić roztwór do odpadów.
7. Dodać 40 μl PBS do wszystkich studzienek z roztworem w nich, kolumny 2-12, rzędy od A do E.
8. Dodać 90 μl PBS do studzienek kolumna 1, rzędy A-E. Studzienki te działają jako pozytywna kontrola 1 μM Calcein i 0 μM FAS.
9. Dodać 10 μl 10 μM bulionu kalceinowego (cB) do każdej studzienki z roztworem w niej (kolumny od 1 do 12, rzędy od A do E). Daje to najwyższe stężenie 1000 μM FAS w kolumnie 11, przy czym stężenie FAS zmniejsza się o połowę w kolumnach 10, 9, 8 w poprzek kolumny 2. Każda z otrzymanych studzienek z kolumn zawiera 1 μM kalceiny i rozcieńczenie FAS.
10. Dodać 100 μl PBS do wiersza F kolumn 1–5 dla samej kontroli PBS. Dodać 100 μl z 2 mM FAS do rzędu F w kolumnach 6–10 dla samej kontroli FAS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.
11. Analizę przeprowadzić na czytniku mikropłytek ustawionym na wzbudzenie 490 nm i detekcję 530 nm (lub odpowiednim zestawie filtrów do fluorescencji kalceiny).

4. Test do ilościowego określenia zdolności chelatorów żelaza do konkurowania ze słabym chelatorem Kalceiną ojony Fe²⁺

1. Przygotować zapas kalceiny (cB) 10 μM, zapas FAS (fB) 100 μM i zapas chelatora żelaza 2 mM, jak przedstawiono w tabeli 1. Przechowuj bulion Calcein w ciemności, aby zapobiec fotodegradacji.
2. Używając jednokanałowej pipety ręcznej lub wielokanałowej pipety ręcznej, dodaj 50 μl PBS do kolumn od 2 do 10, rzędy od A do E, płytki 96-dołkowej. Nie dodawaj PBS do kolumny 11.
3. Dodać 100 μl 2 mM zapasu (fA) chelatorów żelaza do 96-dołkowej płytki w kolumnie 11, rzędy od A do E, używając jednokanałowej pipety ręcznej.
4. Za pomocą wielokanałowej pipety ręcznej usunąć 50 μl fA z kolumny 11 i odpipetować go do PBS w kolumnie 10, rzędy od A do E, dokładnie mieszając przez pipetowanie.
5. Kontynuować tę stopniową procedurę podwójnego rozcieńczania w pozostałych kolumnach 9-2, rzędy od A do E płytki, wymieszać każdą studzienkę pipetując. Usunąć 50 μl z kolumny 2 i wyrzucić. Zapewnia to podwójne rozcieńczenie 2 mM chelatora żelaza (deferypronu) w 96 kolumnach z płytkami dołkowymi 11 do 2, rzędy od A do E.
6. Odpipetować 30 μl PBS do wszystkich studzienek z roztworem w nich (np. kolumny 2-11 rzędów od A do E).
7. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 10 μl 100 μM FAS (fB) do kolumn 2-12, wierszy od A do E. Powoduje to stężenie 1 μM kalceiny i 10 μM FAS w każdym dołku oraz podwójne rozcieńczenie chelatorów, przy czym stężenie zmniejsza o połowę każdą kolumnę w poprzek płytki, kolumny 11-2, przy najwyższym stężeniu chelatora żelaza na poziomie 1000 μM w kolumnie 11 dołków od A do E.
8. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 10 μl 10 μM wywaru kalceinowego (cB) do kolumn 2-12, rzędy od A do E.
9. Odpipetować pipetą 80 μl PBS i 10 μl bulionu kalceiny (cB) i 10 μl bulionu FAS (fB) do kolumny 1, rzędy A-E. Wymieszać próbki przez pipetowanie. Zapewnia to kontrolę 1 μM kalceiny za pomocą 10 μM FAS i bez chelatora.
10. Odpipetować 100 μl PBS do kolumn 1 do 5 rzędu F. Zapewnia to kontrolę ujemną PBS.
11. Dodać 100 μl 2 mM chelatora żelaza (deferypronu) do rzędu F, kolumny 6-10. Zapewnia to kontrolę samego chelatora.
12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności. Analizę przeprowadzić na multimodalnym czytniku mikropłytek ustawionym na wzbudzenie przy 490 nm i detekcję przy 530 nm (lub odpowiednim zestawie filtrów do fluorescencji Calciena).

5. Analiza danych

1. Analiza w celu walidacji testu poprzez określenie liniowego zakresu fluorescencji kalceiny.
   1. Obliczyć średnie względne jednostki fluorescencji (RFU) w wierszach A-H dla każdego stężenia kalceiny w kolumnach płytki 96-dołkowej z kroku 1 i wykreślić w stosunku do stężenia. Wykreśl wykres liniowy stężenia kalceiny na osi x w stosunku do średniej RFU na osi y i użyj regresji liniowej, aby zapewnić linię najlepszego dopasowania.
   2. Określ ilościowo istotność statystyczną, porównując stężenia kalceiny w każdej kolumnie (2-11) z kontrolą PBS w kolumnie 1 wiersze od A do E. Przeprowadź analizę wariancji (ANOVA) i zastosuj analizę post hoc przy użyciu najmniejszej istotnej różnicy (LSD) z progiem p <0,001 w celu określenia istotności statystycznej (oznaczonej przez ** w Rysunek 1).
2. Analiza w celu walidacji testu przez wygaszanie jonów Fe²⁺ w celu zmniejszenia fluorescencji kalceiny.
   1. Obliczyć średnie względne jednostki fluorescencji (RFU) w wierszach od A do E dla każdego stężenia FAS w kolumnach 2-11. Wykreślić średnią RFU dla każdego stężenia FAS na osi y. Na osi x wykreśla się stężenia FAS za pomocą skali Log2, ponieważ lepiej rozprowadza dane. Wykreśl linię najlepszego dopasowania przy użyciu regresji liniowej.
   2. Określić ilościowo istotność statystyczną, porównując średnią z każdej kolumny ze średnią RFU kontroli PBS, 1 μM Calcein, 0 μM FAS (kolumna 1 wiersz A do E). Przeprowadzić analizę post hoc ANOVA z LSD z progiem p <0,001 w celu określenia istotności statystycznej.
3. Analiza do testu: Kwantyfikacja zdolności chelatorów żelaza do konkurowania ze słabym chelatorem Calceina o jony Fe²⁺.
   1. Obliczyć średnie względne jednostki fluorescencji (RFU) w wierszach od A do E dla każdego stężenia chelatora w kolumnach 2-11. Wykreślić średnią RFU dla każdego stężenia chelatora na osi y. Na osi x wykreśl stężenia chelatora za pomocą skali Log2, ponieważ lepiej rozprowadza dane.
   2. Określić ilościowo istotność statystyczną, porównując średnią z każdej kolumny ze średnią RFU kontroli PBS 1 μM Calcein i 10 μM FAS (kolumna 1 wiersz A–E). Przeprowadzić analizę post hoc ANOVA z LSD z progiem p <0,001 w celu określenia istotności statystycznej.

Wyniki

W odniesieniu do metody przedstawionej w kroku 2, ten pierwszy eksperyment (Rysunek 1) pozwolił na określenie zakresu liniowego mikroplo płytkowego czytnika fluorescencji podczas wykrywania emisji fluorescencyjnych kalceiny. Nasze reprezentatywne wyniki wykazują szeroki zakres liniowy fluorescencji kalceiny od 0-100 µM. Analiza ANOVA z testem post hoc LSD wykazuje, że istnieją statystycznie istotne różnice w średnich RFU dla wszystkich stężeń kalceiny w porównaniu z kontrolą 0 µM kalceiny. W...

Dyskusja

Nadmierne uzależnienie nowotworów od żelaza w celu napędzania ich metabolizmu sprawia, że chelatacja żelaza jest potencjalnym dodatkiem do schematów terapeutycznych⁴. Istnieje jednak ograniczona zdolność do szybkiego badania przesiewowego nowych chelatatorów jonów metali pod kątem ich zdolności do wiązania jonów żelaza. Powszechnie stosowana i powszechnie dostępna sonda fluorescencyjna Calcein jest znana z tego, że działa jako słaby chelator żelaza, a wiązanie przez jony żelaza wygasza fluorescenc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sześciowodny siarczan amonu żelaza(II)	Sigma-Aldrich	215406	inny znany jako FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferypran	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	D5652	bez magnezu i wapnia
Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytki	Sigma-Aldrich	M0812	każda optycznie przezroczysta płytka 96-dołkowa będzie działać