Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Podsumowanie

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Streszczenie

Karmienie jest niezbędnym procesem biologicznym dla wzrostu, rozmnażania i przetrwania organizmu. Test ten ma na celu zmierzenie spożycia pokarmu przez Caenorhabditis elegans (C. elegans), ważny parametr podczas badania genetyki starzenia się lub metabolizmu. U większości gatunków żywienie określa się poprzez pomiar różnicy między ilością dostarczonego pokarmu a ilością pozostałą po określonym czasie. Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje tę samą strategię do określenia żywienia C. elegans. Mierzy ilość bakterii, źródła pożywienia C. elegans, usuniętych w ciągu 72 godzin. Metoda ta wykorzystuje 96-dołkowe płytki mikromiareczkowe i umożliwiła badanie przesiewowe setek leków pod kątem ich zdolności do modulowania przyjmowania pokarmu z prędkością i głębokością niemożliwą w innych modelach zwierzęcych. Mocną stroną tego testu jest to, że pozwala on na jednoczesny pomiar żerowania i długości życia oraz bezpośrednio mierzy zanik pokarmu, a zatem opiera się na tych samych zasadach, które są stosowane w przypadku innych organizmów, ułatwiając porównywanie między gatunkami.

Wprowadzenie

Caenorhabditis elegans jest szeroko stosowany w badaniach nad starzeniem się. Był to potężny model do badania genetyki leżącej u podstaw długowieczności zależnej od metabolizmu, indukowanej ograniczeniami dietetycznymi, zmniejszoną aktywnością mitochondriów lub zmniejszoną sygnalizacją insuliny. 1,2,3,4,5,6,7. Jednak pomiar karmienia w kontekście długowieczności okazał się trudny dla C. elegans ze względu na mały rozmiar zwierzęcia 3,8,9,10,11,12,13,14,15.

Karmienie jest podstawowym zachowaniem biologicznym wymaganym do przetrwania, a jego ścisła regulacja leży u podstaw utrzymania zdrowia metabolicznego, reprodukcji i starzenia się. Zachowania żywieniowe są kontrolowane przez wiele szlaków sygnałowych zarówno w układzie nerwowym, jak i na obrzeżach, a zatem mogą być badane tylko in vivo 16,17,18,19. Odżywianie stanowi pierwszy z trzech filarów: (i) pobór energii, (ii) magazynowanie energii oraz (iii) wydatek energetyczny, który rządzi homeostazą energetyczną organizmu. Żerowanie u C. elegans badano głównie poprzez pomiar pompowania gardła, zdefiniowanego przez szybkość skurczów gardła. Podejście to dostarczyło kluczowych informacji na temat zachowań żywieniowych C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; Jednak pompowanie gardła, zwłaszcza mierzone w krótkich odstępach czasu, niekoniecznie jest skorelowane ze spożyciem pokarmu.

Spożycie pokarmu zależy nie tylko od szybkości pompowania przez gardło, ale także od takich parametrów, jak czas trwania i częstotliwość napadów karmienia oraz zagęszczenie bakterii pokarmowych. Zwierzę może mieć bardzo wysokie pompowanie gardło, ale długość jego napadów karmienia może być krótsza, co równoważy zwiększoną szybkość. Innym czynnikiem zakłócającym jest wydajność, z jaką pompowanie może, ale nie musi, połykać i mielić bakterie. Skrajnym przykładem odłączenia pobierania pokarmu od pompowania gardłowego jest dodanie serotoniny bez obecności pokarmu (bakterii). W obecności egzogennej serotoniny zwierzęta pompują z dużą prędkością, ale bez obecności bakterii, wysoka szybkość pompowania nie prowadzi do przyjmowania pokarmu 2,6,13,22,23.

Przedstawiona tutaj metoda usuwania bakterii mierzy pobieranie pokarmu przez populacje robaków w poszczególnych studzienkach jako spadek stężeń bakterii w czasie (ryc. 1). Podejście to jest podobne do tych stosowanych u innych gatunków, w których zniknięcie pokarmu stanowi miarę spożycia pokarmu 10,11,24,25,26,27,28. W oryginalnej publikacji zwalidowaliśmy tę metodę pomiaru spożycia pokarmu poprzez karmienie C. elegans bakteriami znakowanymi ^{izotopem 15}N¹¹. Późniejsze pomiary za pomocą spektrometrii mas wykazały, że pomiar znikania bakterii silnie korelował z występowaniem znakowania izotopowego, ujawniając faktyczny wychwyt bakterii przez zwierzę¹¹. W związku z tym jesteśmy przekonani, że test klirensu bakteryjnego reprezentuje przyjmowanie pokarmu w większości przypadków. Celem testu nie jest zastąpienie testu pompowania gardłowego, ale dodanie do zestawu narzędzi do badania karmienia i metabolizmu C. elegans oraz ich związku ze starzeniem się i długowiecznością.

Protokół

Rysunek 1: Schemat testu klirensu bakteryjnego.Graficzny zarys głównych sekcji protokołu (od góry do dołu): Przygotowanie bakterii, synchronizacja populacji robaków, wysiew na 96-dołkowych płytkach, sterylizacja robaków, dodawanie leków, pomiar OD₆₀₀ w dniu 1 i dniu 4. Szczegółowy opis tych konkretnych kroków znajduje się po lewej stronie każdego obrazu. Skróty: OD = gęstość optyczna; FUdR = fluorodeoksyurydyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie bakterii

UWAGA: W tej sekcji szczegółowo opisano przygotowanie bakterii pokarmowych stosowanych w tym teście. Specyficzny szczep E. coli użyty w teście nazywa się OP50. OP50 jest najczęściej stosowanym szczepem do karmienia C. elegans. Zastosowany szczep OP50 jest oporny na karbenicylinę/ampicylinę, co zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu kultury robaków z innymi bakteriami⁹.

1. Przygotuj OP50 4-5 dni wcześniej, a dzień przed użyciem prześwietlaj prześwietlić. Upewnij się, że wszystkie materiały napotykające OP50 są sterylne^29,30.
2. Dzień -8: Środa (tydzień 1):
   1. Przygotować preinokulum przez zaszczepienie 5 ml LB 100 μg/ml ampicyliny i 0,1 μg/ml amfoterycyny B oraz pojedynczej kolonii OP50 i inkubować przez około 6 godzin w temperaturze 37 °C w wytrząsarce bakteryjnej. Zaszczepić wcześnie, aby umożliwić wystarczający wzrost, aby kultura stała się mętna.
   2. Gdy hodowla jest mętna, rozcieńczyć kulturę preinokulum OP50 w stosunku 1:2,000 w 250 ml gruźlicy zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować kulturę przez noc w wytrząsarce bakteryjnej przez 17-19 godzin w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Kultura nie powinna rosnąć dłużej niż 19 godzin.
3. Dzień -7: Czwartek (tydzień 1)
   1. Po 17-19 godzinach inkubacji przenieść płynną kulturę OP50 do sterylnej probówki wirówkowej i wirować przez 15 minut w temperaturze 3 100 × g w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C.
   2. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad OP50 sterylną wodą i ponownie odwirować. Powtórz to pranie 2x.
   3. Po drugim przepłukaniu wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulat OP50 w sterylnej wodzie do objętości 50 ml i przenieść go do wstępnie zważonej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Granulować OP50 przez odwirowywanie przez 20 minut w temperaturze 3 100 × g w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C.
   4. Po trzecim praniu ostrożnie usuń cały pozostały supernatant, upewniając się, że w probówce nie pozostała woda. Obliczyć masę osadu, odejmując masę pustej probówki wirówkowej od masy probówki wirówkowej z osadem.
      UWAGA: Waga pelletu zwykle waha się od 3-3,5 g.
   5. Dokładnie zawiesić granulat OP50 w buforze S-complete do stężenia 100 mg/ml, upewniając się, że nie ma grudek.
   6. Upewnij się, że stężenie OP50 przy 100 mg/ml odpowiada 2 ×^{10 10} bakteriom/ml. Jeśli znana jest zależność między gęstością optyczną a liczbą bakterii na ml, należy określić stężenie bakterii na ml spektrofotometrycznie. W razie potrzeby użyj buforu S-complete, aby dostosować stężenie roztworu zasilającego OP50 do 2 × 10¹⁰ bakterii/ml.
   7. Przetestuj OP50 na płytce agarowej, aby określić, czy został zanieczyszczony.
   8. Przechowywać OP50 zawieszony w buforze S-complete w temperaturze 4 °C.

4. Dzień -3: Poniedziałek (tydzień 2)
   1. Zabij bakterie za pomocą promieniowania rentgenowskiego, aby zapobiec rozwojowi bakterii podczas testu.

2. Synchroniczne przygotowanie hodowli robaków

UWAGA: W tej sekcji omówiono przygotowanie synchronicznej populacji robaków. Wszystkie materiały, które mają kontakt z populacjami robaków, są sterylne. Wszystkie tabliczki są przechowywane w temperaturze 20 °C, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Dzień -6: Piątek (tydzień 1), godz. 16:00
   1. Przełóż zwierzęta na świeży talerz.
      1. Weźmy płytkę NGM, na której większość populacji robaków składa się z wygłodzonych larw L1.
         UWAGA: Mieszana populacja również przyniesie wyniki. Używanie robaków L1, które były głodzone przez długi czas, może wpływać na zachowania żywieniowe w obecnych lub przyszłych pokoleniach, ponieważ głód może pozostawić ślady epigenetyczne przez co najmniej trzy pokolenia.
      2. Zmyj robaki nie więcej niż 1 ml sterylnej wody. Porcja ~300 μL zmytej populacji robaków na płytki NGM wysiane skoncentrowanym OP50 (~300 mg/mL). Pozostaw talerze do wyschnięcia pod suszarką do płyt lub palnikiem Bunsena. Inkubować płytki w temperaturze 20°C, aż większość populacji będzie zawierała ciężarne dorosłe osobniki (poniedziałek).
         UWAGA: Ten przedział czasowy jest zoptymalizowany pod kątem populacji robaków N2 typu dzikiego i może się różnić w zależności od szczepu. Robaki z opóźnieniami w rozwoju powinny być brane pod uwagę i wcześniej pokrojone i/lub wysiane, tak aby wszystkie testowane szczepy osiągnęły dorosłość jednocześnie.
2. Dzień -3: Poniedziałek (tydzień 2) godz. 10:00
   1. Ustanawianie populacji synchronicznej
      OSTROŻNOŚĆ! Wybielacz działa żrąco na skórę i oczy. Obchodzenie się z nim wymaga rękawic i okularów ochronnych.
      1. Zbierz robaki, zmywając je z talerza do 10 ml sterylnej wody. Przenieś ten roztwór robaka/wody do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      2. Umyj robaki w zlewie grawitacyjnym na blacie przez około 4 minuty (odwrotnie, myj przez wirowanie przez 2 minuty w wirówce stołowej o masie 310 × g.
      3. Wyrzucić supernatant przez aspirację za pomocą małej końcówki i dodać do 15 ml sterylnej wody. Powtórz 3 razy.
      4. Usunąć sklarowany osad i dodać 5 ml świeżo przygotowanego roztworu wybielacza/NaOH (1,8 ml wybielacza domowego, 0,5 ml 10 N NaOH, 7,7 ml dH₂O).
      5. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy robaki pękną. Wiruj delikatnie co minutę przez co najmniej 10 s. Monitoruj postęp pod mikroskopem preparacyjnym.
         UWAGA: Czas potrzebny do otwarcia robaków może się różnić w zależności od odmiany. Pozostawienie robaków w roztworze wybielacza zbyt długo może spowodować, że jaja nie będą zdolne do życia.
      6. Dodać bufor M9 w celu zneutralizowania reakcji, gdy wszystkie dorosłe osobniki pękną lub rozpuszczą się (końcowa objętość powinna wynosić 15 ml) i odwirować przez 2 minuty przy 1 300 × g.
      7. Umyj jajka 3x 13 ml buforu M9.
      8. Umyć jaja raz 10 ml buforu S-complete, odwirowując przez 2 minuty przy 1 300 × g.
      9. Odessać supernatant, dodać 10 ml S-complete i przenieść zawiesinę do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie obróć rurkę w temperaturze pokojowej przez noc na nutatorze lub podobnym urządzeniu.
      10. Fakultatywnie: Jeżeli po końcowym odwirowaniu w buforze S-complete znajdują się dorosłe tusze, przefiltrować roztwór robaka przez sitko o wielkości 40 μm.
3. Dzień -2: Wtorek (tydzień 2), godz. 13:00
   1. Wysiewanie zwierząt na talerze
      1. Za pomocą lunety sekcyjnej sprawdź, czy robaki się wykluły. Określić stężenie robaków w buforze S-complete, zliczając populację robaków w kroplach o objętości 10 μl za pomocą lunety preparcyjnej; Policz 5-10 kropli na każdą próbkę. Jeśli stężenie robaków w każdej kropli o objętości 10 μl przekracza 30 robaków na kroplę, należy rozcieńczyć cały materiał z S-complete do niższej gęstości robaków na kroplę, aby ułatwić liczenie.
      2. Wysiewać płynną mieszaninę robaków do każdego dołka 96-dołkowej płytki o objętości 120 μl w następujący sposób (stężenia końcowe): 60 robaków/ml w S-complete, 50 μg/ml karbenicyliny, 0,1 μg/ml amfoterycyny i 6 mg/ml OP50 przygotowanych w sekcji 1.
         UWAGA: Całkowita objętość do przygotowania zależy od liczby płytek (~12 ml na płytkę 96-dołkową). W każdej studzience powinno znajdować się 6-12 robaków. Alternatywnie, cytometria przepływowa dużych cząstek, taka jak COPAS FP firmy Union Biometrica, może być użyta do precyzyjnego sortowania 10 robaków do każdej studzienki (patrz sekcja Efekt stłoczenia).
      3. Dołącz również płynną mieszaninę bez robaków : 50 μg/ml karbenicyliny, 0,1 μg/ml amfoterycyny i 6 mg/ml OP50 przygotowanej w sekcji 1.
      4. Umieść 120 μl mieszaniny bez robaków w rzędzie H 96-dołkowej płytki, która służy do określania wartości samolizy, jak wspomniano wcześniej. Umieść 120 μl na studzienkę mieszaniny z robakami w rzędach A-G.
         UWAGA: Upewnij się, że ślimaki są utrzymywane w zawiesinie podczas pipetowania (patrz Rysunek 2A, B). Używamy przezroczystych 96-dołkowych płytek z płaskim dnem. Nasz układ płytek dzieli płytkę, aby uzyskać 4 lub 6 warunków, w których każda para kolumn będzie innym lekiem lub szczepem robaka, a dolny rząd będzie służył jako kontrola "bez robaków" (Rysunek 2A, B).
      5. Aby uniknąć zanieczyszczenia i parowania, uszczelnij płytkę za pomocą zgrzewarki taśmowej. Inkubować płytki przez około 65 godzin w temperaturze 20 °C, aż zwierzęta staną się robakami L4.
4. Dzień 0: Czwartek (tydzień 2) przed południem.
   1. Sterylizacja populacji robaków poprzez dodanie fluorodeoksyurydyny (FUdR).
      1. Dodać 30 μl 0,6 mM roztworu podstawowego FUdR, aby wysterylizować zwierzęta w każdym dołku. Ponownie uszczelnić płytkę za pomocą taśmy uszczelniającej i potrząsać płytkami przez 20 minut na wytrząsarce do płytek do mikromiareczkowania z prędkością 800 obr./min. Włożyć płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 20 °C.
         UWAGA: Na tym etapie końcowe stężenie OP50 zmniejsza się z 6 mg/ml do 5 mg/ml (1 × 10⁹ bakterii/ml), a każda studzienka ma końcową objętość 150 μl. Bardzo ważne jest, aby dodać FUdR do etapu L4, zanim zwierzęta osiągną dorosłość.
5. Dzień 1: Piątek (tydzień 2)
   1. Dodaj leki do kultury.
      1. Do godziny 9:00 upewnij się, że większość zwierząt jest ciężarna, a każda studzienka zawiera kilka jaj. W razie potrzeby dodaj dowolne leki do pożądanego stężenia (patrz dyskusja).
      2. Po dodaniu leku należy uszczelnić płytki taśmą uszczelniającą i wstrząsać płytkami przez 20 minut z prędkością 800 obr./min na wytrząsarce do płyt.
         UWAGA: Potrząsanie zapewnia, że wszystkie grudki bakteryjne zostaną rozpuszczone bez dotykania uszczelniacza. Zarówno grudki bakteryjne, jak i płyn na uszczelniaczu zniekształcą odczyt OD₆₀₀ . Jeśli na zgrzewarce znajdują się krople cieczy, krótko obracaj ją przez 10-20 s w temperaturze 310 × g. Wstrząsaj ponownie na wytrząsarce przez 5 minut i odmierz.
      3. Po 20 minutach wytrząsania na płytce do mikromiareczkowania, zdjąć pokrywę i uszczelkę, a następnie zmierzyć średnicę zewnętrzną₆₀₀ w czytniku płytek; jest to pomiar OD₆₀₀ dnia 1. Uszczelnić i zwrócić płytki do inkubatora o temperaturze 20 °C.
         UWAGA: Ponieważ bakterie szybko się osadzają, odczyt powinien nastąpić w ciągu 10 minut po potrząśnięciu płytkami.
      4. Użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić populację robaków pod kątem oznak zanieczyszczenia lub toksyczności, jeśli dodano lek. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 20 °C.
6. Dzień 4: Poniedziałek (tydzień 3)
   1. Weź odczyt dnia 4 OD₆₀₀ .
      1. Powtórz procedurę odczytu od dnia 1 (krok 2.5.1.3), aby uzyskać wartość OD dnia 4 ₆₀₀ . Przed pomiarem średnicy zewnętrznej₆₀₀ należy wstrząsać płytkami przez 20 minut z prędkością 800 obr./min na wytrząsarce płytki do mikromiareczkowania.
      2. Na odwróconym mikroskopie, najlepiej z obiektywem 2x, policz populację robaków w każdej studzience i zapisz ją w arkuszu kalkulacyjnym. Po przeliczeniu należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 20 °C.
         UWAGA: Zobacz próbkę naszego arkusza punktacji znajdującego się w materiałach uzupełniających.
      3. Po odczycie z dnia 4 pomiary spożycia pokarmu są zakończone. W razie potrzeby zachowaj te tabliczki do analizy żywotności.
         UWAGA: Ten protokół jest kompatybilny z Solis i Petrascheck³¹.

3. Analiza danych dotyczących spożycia żywności

Rysunek 2: Projektowanie i analiza.(A, B) Możliwe konstrukcje płyt dla 4 i 6 warunków z studzienkami kontrolnymi "bez ślimaka" w rzędzie H. Studnie te są niezbędne do określenia szybkości samolizy. Na każdej tabliczce należy zawsze uwzględnić nieleczoną populację kontrolną N2 jako odniesienie. (C) Przykładowe dane zebrane w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym z liczbą robaków (zielona ramka), dwoma pomiarami OD₆₀₀ w dniu 1 i 4 (pomarańczowe pola), wartościami samolizy (niebieska ramka) oraz oceną przy użyciu wzoru (2) ((OD₆₀₀ -samoliza)/X0) w czerwonej ramce. W konkretnym przykładzie pokazanym tutaj wykorzystano konstrukcję płyty pokazaną w (B). Skróty: OD = gęstość optyczna; X0 = liczba robaków w studzience. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: W tej sekcji opisano, w jaki sposób analizowane są dane dotyczące spożycia pokarmu z sekcji 2 niniejszego protokołu. Pierwszymi wartościami, które należy obliczyć, są wartości kontroli samolizy . Bakterie z czasem ulegają lizie w płynie, nawet przy braku robaków. Na tę wartość autolizy może również wpływać wiele substancji chemicznych i należy ją kontrolować, ponieważ jest ona stosunkowo duża w porównaniu z pokarmem pobieranym przez robaka. Jak opisano w kroku 2.3.1.4 i pokazano w układzie tabliczek na rysunku 2A, B, wiersz H zawiera ten sam roztwór, z wyjątkiem robaków. W naszym układzie płyt pokazanym na rysunku 2B znajduje się 14 studzienek na warunek z dwoma odpowiednimi studzienkami kontrolnymi samolizy (rząd H, "bez robaków").

1. Obliczyć wartości kontroli samolizy dla studzienek kontrolnych bez robaków w każdym stanie, korzystając z równania ( 1). Dla każdej powtórzonej grupy studzienek upewnij się, że istnieją co najmniej dwie studzienki kontrolne bez robaków , jak wspomniano w kroku 2.3.1.4. Użyj średniej ze wszystkich studzienek kontrolnych bez robaków dla wartości samolizy dla grupy powtórzonej.
   Selfysis = średnia(OD6₀₀ Dzień 1 - OD6₀₀ Dzień 4) (1)
   UWAGA: Dla konfiguracji płytek pokazanej na rysunku 2B obliczylibyśmy sześć wartości samolizy , po jednej dla każdej z sześciu grup, obliczając średnią z dwóch studzienek kontrolnych samolizy w rzędzie H.
2. Oblicz spożycie pokarmu na robaka za pomocą równania
   (2).
   UWAGA: Wzór użyty w arkuszu kalkulacyjnym (czerwona ramka, rysunek 2C), gdzie X0 to liczba robaków na studzienkę.
3. Po określeniu spożycia pokarmu przez robaka dla każdej studzienki oblicz średnie i odchylenie standardowe dla całego stanu.
   UWAGA: W przypadku konfiguracji płytek pokazanej na rysunku 2B do porównań statystycznych wystarczy 14 powtórzonych studzienek na warunek.
4. Znormalizuj każdy stan do odpowiedniej nieleczonej populacji kontrolnej N2. Wskaż zmianę karmienia jako zmianę fałdu lub procent karmienia N2.
   UWAGA: Normalizacja jest wykonywana, ponieważ wartości bezwzględne OD6₀₀/X0 z równania (2) mogą się różnić między eksperymentami przeprowadzonymi w różnych dniach.

Wyniki

Rysunek 3: Dane reprezentatywne. (A) Wykres przedstawia krzywe dawka-odpowiedź zmiany krotności spożycia pokarmu w funkcji stężenia serotoniny. Wszystkie dane wskazują, że niestymulowane podstawowe spożycie pokarmu znormalizowane do nawożenia podstawowego N2. Należy zauważyć, że zwierzęta daf-16 (mu86) jedzą więcej niż dzikie typy N2, gdy nie dodano serotoniny, ale wykazują stępiony zakres w swojej zdolności do kontrolowania karmienia. (B) Wykres przedstawia wykres skrzypcowy zmiany fałdowania w przyjmowaniu pokarmu u robaków potraktowanych 50 μM przeciwpsychotycznej loksapiny, ale karmionych bakteriami zabitymi przez promieniowanie rentgenowskie, γ-promienie lub paraformaldehyd (C) Wykres pokazuje wykres skrzypcowy zmiany fałdowania w przyjmowaniu pokarmu przez różne mutanty z ich genotypami wskazanymi na osi x. Dane te sugerują, że mutanty exc-4 i cgr-1 jedzą mniej, podczas gdy mutanty srp-6 jedzą więcej. Gwiazdki reprezentują ** p < 0,001, ****p < 0,0001 zgodnie z ustaleniami ANOVA i Browna-Forsythe'a-Welcha, skorygowanymi post hoc w celu uwzględnienia testów wielu hipotez. Słupki błędów pokazują ±S.E.M. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 1 przedstawia ogólny przebieg pracy tego protokołu. Ilustruje cały proces, od wytworzenia bakterii do uzyskania odczytu OD₆₀₀ w dniu 1 i 4. Ponadto infografika odnosi się do konkretnych etapów stosowanych metod. Rysunek 2A, B pokazuje dwa możliwe eksperymentalne układy płytek, w tym studzienki kontrolne "bez robaków" w rzędzie H, niezbędne do obliczenia wskaźników samolizy opisanych w sekcji dyskusji. Z doświadczenia naszego laboratorium wynika, że konieczne jest, aby jeden z warunków, który nie był leczony, kontrola N2, aby uwzględnić zmienność spożycia bakterii przez robaki obserwowaną między eksperymentami (patrz dyskusja: Planowanie [populacja referencyjna N2]).

Rysunek 2C jest przykładem arkusza kalkulacyjnego używanego do analizy danych generowanych w tym protokole. Na zielono zaznaczona jest liczba robaków, na niebiesko samoliza , dzień 1 OD₆₀₀ i dzień 4 OD₆₀₀ na pomarańczowo, a spożycie pokarmu przez robaka na czerwono. Ponadto każdy studzienka jest śledzony pod kątem szczepu, leku, stężenia, daty eksperymentu i innych dodanych zabiegów. Więcej informacji na temat konkretnych stosowanych równań można znaleźć w rozdziale 3 protokołu. Ogólnie rzecz biorąc, te arkusze kalkulacyjne (szablon dostarczony jako materiały uzupełniające) zapewniają wydajne gromadzenie i analizę danych tego protokołu.

Rycina 3A przedstawia reprezentatywne wyniki dla krzywej dawka-odpowiedź pokazującej, w jaki sposób serotonina moduluje karmienie mutantów N2 i daf-16 przy użyciu tego protokołu. W tym eksperymencie zmiana krotności w stosunku do podstawowego spożycia pokarmu (pierwsza kropka na krzywej) została obliczona dla pięciu rosnących dawek serotoniny. Jak pokazują te wyniki, szczep N2 jest w stanie przejadać się w sposób zależny od dawki. Jednak w przypadku mutanta daf-16 (mu86), chociaż żywienie podstawowe jest wyższe niż N2, mutant nie może reagować na serotoninę w taki sam sposób zależny od dawki, jak szczep N2. Protokół ten pozwala nam określić zachowania żywieniowe między dwoma szczepami, w których stężenie serotoniny było zmiennym czynnikiem generującym krzywe dawka-odpowiedź. Rycina 3B przedstawia sposób przyjmowania pokarmu przez robaki leczone lekiem przeciwpsychotycznym loksapiną, ale karmione bakteriami zabitymi przez promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie γ lub paraformaldehyd. Należy zauważyć, że eksperymenty te nie były prowadzone równolegle i że różnice nie są reprezentatywne dla różnych metod zabijania bakterii, ale wynikają ze zmienności międzyeksperymentalnej. Rycina 3C przedstawia spożycie pokarmu przez szereg szczepów genetycznych, przy czym dwa szczepy wykazują spadek, a jeden szczep wykazuje wzrost zachowań żywieniowych w stosunku do N2. Takie zastosowanie protokołu umożliwia testowanie jednego leku w jednym stężeniu na różnych podłożach genetycznych. Nadaje się do identyfikacji tła genetycznego, które wykazuje inną reakcję na przyjmowanie pokarmu niż grupy kontrolne N2 typu dzikiego po podaniu tego samego leku. Można go sparować z naszym protokołem długości życia, aby szybko przebadać spożycie pokarmu i długość życia w tej samej konfiguracji talerzy³¹.

Materiał uzupełniający: Szablony arkuszy kalkulacyjnych pokazane na rysunku 2C. Kliknij tutaj, aby pobrać te materiały.

Dyskusja

W przedstawionym protokole mierzono klirens bakteryjny jako odczyt dla pobrania pokarmu przez C. elegans na 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych. Krzywe dawka-odpowiedź w sekcji reprezentatywnych wyników pokazują, że test ilościowo mierzy spożycie pokarmu, co zostało niezależnie potwierdzone przy użyciu bakterii znakowanych izotopowo¹¹. Korzystając z tego testu, z powodzeniem przetestowaliśmy leki zatwierdzone przez FDA, takie jak leki przeciwpsychotyczne ze znanymi metabolicznymi skutkami ubocznymi u ludzi i wykazaliśmy, że leki te zwiększają żerowanie u C. elegans^10,26. Test jest przydatny do badania genetyki lub farmakologii żywienia i dodaje nowe narzędzie do badań nad C. elegans w celu zbadania metabolizmu. Test ten zapewnia tanią metodę badania karmienia w sposób skalowalny i przyjazny dla czasu, co nie jest możliwe w przypadku większości innych organizmów. Nasza praca nad lekami zatwierdzonymi przez FDA pokazuje, że wiele skutków ubocznych obserwowanych u ludzi obserwuje się również u C. elegans, ujawniając zachowanie ewolucyjne 24,26,32.

Test jest ograniczony stężeniem bakterii, które można zmierzyć w liniowym zakresie pomiaru OD₆₀₀ . W rezultacie liczba robaków i zakres stężeń bakterii, które można oznaczyć, są ograniczone. Zbyt wiele robaków wpłynie na OD₆₀₀ poprzez zbyt szybkie zjadanie bakterii, a tym samym "zjadanie" stężenia bakterii z liniowego OD₆₀₀. Z naszego doświadczenia wynika, że zmienność w przygotowaniu bakterii jest krytycznym parametrem, który powoduje, że wyniki różnią się w zależności od eksperymentu. Bezskutecznie próbowaliśmy zamrażać duże partie bakterii lub stosować bakterie liofilizowane. W tych przypadkach albo wskaźnik samolizy stał się zbyt wysoki, albo bakterie miały jakość, która spowalniała rozwój C. elegans . Jednak nasze testy nie były wyczerpujące, a ten problem może być rozwiązany.

Ogólnie rzecz biorąc, szybkość samolizy bakterii jest najtrudniejsza do kontrolowania i może powodować znaczną zmienność. Odkryliśmy, że niektóre leki mogą zwiększać wskaźnik samolizy do poziomów, których test nie był w stanie wiarygodnie określić spożycia pokarmu. Ponieważ wskaźnik samolizy wzrasta z czasem w teście, nie mierzyliśmy spożycia pokarmu po 5 dniu dorosłości. W tym wieku bakterie są ~10 dni w hodowli. Aby zmierzyć spożycie pokarmu po 5 dniu dorosłości, stare bakterie muszą zostać zmyte i zastąpione świeżymi.

Prezentowany test jest rozszerzeniem naszego 96-dołkowego testu żywotności opartego na płytkach mikromiareczkowych³¹. Ta kombinacja umożliwia pomiar długości życia i spożycia pokarmu w tej samej populacji. Chociaż przedstawiony tutaj test klirensu bakteryjnego nie pozwala na określenie spożycia pokarmu przez całe życie C. elegans z powodu samolizy bakteryjnej, dostarcza solidnych danych dla pierwszych czterech dni dorosłości, czyli czasu z najwyższym spożyciem pokarmu. Szczególnie w przypadku odkrywania leków małocząsteczkowych kontrola spożycia pokarmu jest niezbędna. Podsumowując, przewidujemy, że zaprezentowany test będzie przydatny dla społeczności C. elegans i rozszerzy zestaw narzędzi do badania metabolizmu lub jego kontroli w kontekście badań nad starzeniem się i długością życia.

Planowanie:

Przed planowaniem pomiaru spożycia pokarmu należy wziąć pod uwagę kilka kwestii.

Zabijanie bakterii:

Zabijamy bakterie poprzez naświetlanie promieniami rentgenowskimi w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (900 Grayów przez 4 godziny ustawione na 160,0 kV i 25,0 mA). Do naświetlania używamy RS2000 firmy Rad Source. W zależności od sprzętu, konkretny czas i dawka promieniowania mogą się różnić w zależności od placówki. Całkowite zabicie bakterii musi zostać określone przez posiew bakterii po napromieniowaniu w celu wykrycia ocalałych przez wzrost. Konieczne jest zabicie wszystkich bakterii, aby zapobiec wzrostowi podczas testu, ponieważ spowoduje to niedoszacowanie wartości karmienia lub nawet ujemne. Co ważne, bakterie muszą zostać zabite, aby C. elegans nadal je zjadały. Z naszego doświadczenia wynika, że istnieją trzy sposoby niezawodnego zabijania dużych ilości bakterii: (i) naświetlanie promieniami rentgenowskimi, (ii) promieniami γ oraz (iii) dodanie formaldehydu^29,30. Wskaźniki samolizy między tymi trzema metodami są porównywalne, z 8% współczynnikiem zmienności między wskaźnikami samolizy dla eksperymentów pokazanych na rysunku 3B. Metody, które nie działały niezawodnie w naszych rękach to naświetlanie promieniami UV, koktajle antybiotykowe, inaktywacja termiczna i azydek sodu. Metody te albo nie są w stanie całkowicie zabić bakterii (promieniowanie UV i antybiotyki), albo wytworzyć bakterie, których C. elegans nie zjada (ciepło), albo zmienić sposób przyjmowania pokarmu (azydek sodu).

Liczba powtórzeń:

Z naszego doświadczenia wynika, że zmiany fałdowania w karmieniu są na ogół niewielkie w porównaniu z obserwowaną zmiennością. W związku z tym pomiar zmian w spożyciu pokarmu wymaga kilku powtórzonych studzienek. Rysunek 2A,B przedstawia 96-dołkowe płytki zaprojektowane dla czterech lub sześciu różnych warunków, z 21 lub 14 dołamkami replikowanymi i dwoma studzienkami kontrolnymi samolizy bez ślimaków. Biorąc pod uwagę dużą zmienność i stosunkowo niewielkie zmiany, których należy się spodziewać, 0,5-2,5-krotne zmiany w karmieniu są zwykle dolną i górną granicą. Zalecamy od 14 do 21 studzienek replikowanych dla każdego stanu i co najmniej dwóch studzienek kontrolnych samolizy, opisanych poniżej. Te kontrpróby są wystarczające do wygenerowania ilościowych krzywych dawka-odpowiedź dla leków, które zmieniają karmienie^11,26.

Kontrole samolizy:

OD₆₀₀ mierzy liczbę cząstek w roztworze, w większości niezależnie od wielkości cząstek. Jednak martwe bakterie ulegną lizie, tracąc swój charakter cząsteczkowy. Nazywamy to samolizą, która zachodzi niezależnie w obecności robaków i obniża pomiary OD₆₀₀ bez jedzenia przez robaki. Samoliza zachodzi podczas testu i musi być niezależnie mierzona w co najmniej dwóch studzienkach na warunek. Studnie te są traktowane tak samo jak inne w tym samym stanie, z wyjątkiem tego, że nie zawierają żadnych robaków. Odkryliśmy, że wiele leków może również zmieniać wskaźnik samolizy. W związku z tym każdy stan wymaga niezależnych studzienek kontrolnych samolizy o odpowiednim stężeniu. Rysunek 2 przedstawia konfigurację płytek dla czterech lub sześciu warunków ze wszystkimi studzienkami kontrolnymi samolizy na dole płytki w rzędzie H.

Populacja referencyjna N2:

Zauważyliśmy również, że bezwzględna ilość spożywanych bakterii może się wahać między eksperymentami, najprawdopodobniej związana z jakością bakterii. Pomimo naszych najlepszych starań, aby za każdym razem przygotowywać je dokładnie w ten sam sposób, występują wahania. Na przykład bakterie mogą być zbierane w stanie podziału w fazie wzrostu logarytmicznego, a zatem mogą być znacznie większe niż bakterie zebrane w fazie stacjonarnej. W związku z tym te proste różnice w wielkości bakterii mogą prowadzić do zmian w liczbie spożywanych bakterii i różnych wartości OD₆₀₀ , ponieważ pomiary OD₆₀₀ nie rozróżniają rozmiarów. Z tego powodu zawsze uwzględniamy jedną populację nieleczonych zwierząt kontrolnych N2, które służą jako wartość referencyjna, ustawiona na 1 lub 100%, aby określić, czy grupy eksperymentalne jedzą więcej czy mniej niż grupa kontrolna N2. Ta praktyka umożliwia porównania między eksperymentami, nawet jeśli wartości OD₆₀₀ są różne.

Przedziały czasowe:

Użycie wartości OD₆₀₀ do pomiaru spożycia pokarmu wymaga, aby stężenie bakterii spadło w mierzalny sposób. Ponieważ objętość hodowli jest znacznie większa niż w przypadku robaków, muszą one zjeść znaczną ilość bakterii, aby uzyskać wykrywalną różnicę. Utrzymanie w zakresie liniowym dla wartości OD₆₀₀ wymaga, aby stężenie bakterii utrzymywało się między ~1 mg/ml a 10 mg/mL, tak aby znaczna ilość bakterii musiała zniknąć, aby je wykryć. Robaki jedzą najwięcej od późnego L4 do 4 dnia dorosłości ze względu na produkcję jaj. Dlatego ten interwał jest idealny. Krótsze interwały, takie jak 24 godziny, można zmierzyć¹¹, ale jest to znacznie trudniejsze i wymaga ~40 dołków na warunek. Inną opcją pomiaru spożycia pokarmu przez larwy jest podwojenie liczby zwierząt w studzience. Jednak problem z tym podejściem polega na tym, że zbyt wiele robaków zacznie wpływać na odczyty OD₆₀₀ , gdy dorosną.

Roztwory podstawowe dla leków, które mają być badane:

Jeśli leki takie jak serotonina są testowane pod kątem ich zdolności do modulowania karmienia, podczas przygotowywania roztworów podstawowych należy wziąć pod uwagę następujące kwestie. Zazwyczaj przygotowujemy 50-krotny zapas dla leków rozpuszczalnych w wodzie i dodajemy 3 μl do każdego dołka (1:50), ale inne stężenia podstawowe (100x, 300x) również działają. Jeśli jednak leki są rozcieńczane w rozpuszczalnikach innych niż woda (np. DMSO), końcowe stężenie nie powinno przekraczać 0,5%. Rozpuszczalniki szybko stają się szkodliwe dla C. elegan. W związku z tym roztwory podstawowe leków rozpuszczonych w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak DMSO, muszą być 300x lub wyższe.

Punktacja żywych i martwych robaków:

Określanie żywych i martwych zwierząt opiera się na ruchu robaka. Silne światło, zwłaszcza światło niebieskie, jest używane, ponieważ powoduje ruch zwierząt. Co więcej, ocena liczby zwierząt w studni ujawni, czy występuje nadmiarowa liczba zgonów. Nadmierne zgony mogą wystąpić w przypadku substancji toksycznych lub wysokich stężeń (>0,5%) kilku rozpuszczalników, w tym DMSO. Ogólnie rzecz biorąc, powinno być mniej niż 1:100 (1%) martwych zwierząt. Talerze można wstrząsać przez 30 s z prędkością 800 obr./min na wytrząsarce do płytek do mikromiareczkowania, jeśli żywność osiadła, a populacja staje się trudna do policzenia. Zignoruj studnie z samcami lub więcej niż 16 robakami (patrz problemy).

Potencjalne problemy:

Nieodpowiednie potrząsanie:

W płynnym podłożu bakterie mogą łatwo zbrylać się i osadzać na dnie studzienek. Z naszego doświadczenia wynika, że potrząsanie przez mniej niż 20 minut może nie rozbić grudek bakteryjnych i spowodować ich ponowne zawieszenie, powodując niedokładne pomiary OD₆₀₀ . Pomiary OD₆₀₀ w obecności grudek bakteryjnych zaniżą stężenie bakterii. Nadmierne ustawienia wytrząsarki mogą spowodować przyklejenie się płynu do zgrzewarki. Po wyjęciu uszczelniacza w celu odczytu OD₆₀₀ , płyn przyklejony do uszczelniacza spowoduje niższy odczyt OD₆₀₀ . Jeśli na zgrzewarce znajduje się płyn, szybko zakręć płytką na niskich obrotach (500-1 000 obr./min) i ponownie potrząśnij przez 5 minut. Ponadto upewnij się, że zgodnie z odczytami z dnia 1 i dnia 4 przeczytałeś w ciągu 10 minut od potrząśnięcia płytkami, aby uniknąć osiedlenia się bakterii.

Różne bezwzględne wartości spożycia pokarmu między eksperymentami:

Pomimo naszych najlepszych starań w celu standaryzacji preparatów bakteryjnych, często różnią się one sposobem, w jaki wpływają na przyjmowanie pokarmu przez robaki. Na przykład, ze względu na stan podziału, bakterie różnią się wielkością w zależności od tego, czy zostały zebrane w fazie wzrostu logarytmicznego, czy stacjonarnego, przy czym bakterie logarytmiczne są większe. Ze względu na to, że pomiary OD₆₀₀ nie rozróżniają rozmiarów, różnice w wielkości bakterii wynikające z fazy, w której bakterie zostały zebrane, mogą prowadzić do pozornych różnic obserwowanych w podstawowym pobieraniu pokarmu między preparatami bakteryjnymi. Najlepszym sposobem porównywania eksperymentów jest zawsze uwzględnianie nieleczonej populacji kontrolnej N2 i normalizacja wyników do tej populacji N2.

Efekty zatłoczenia:

Stężenie bakterii w tym protokole jest wystarczające, aby utrzymać OD₆₀₀ w zakresie liniowym dla 2-16 robaków na studzienkę przez ~72 godziny. W zależności od interesującego leku, studzienka zawierająca więcej niż 16 robaków może obniżyć stężenie bakterii przed drugim pomiarem. Odkryliśmy również, że studnie z jednym zwierzęciem są zwykle zawodne. Czynnik lizy przeważa nad tym, co zjada pojedynczy robak. W związku z tym drobne błędy w określaniu współczynnika lizy nieproporcjonalnie wpływają na studnie z mniejszą liczbą robaków.

Zalecamy wyłączenie odwiertów z analiz statystycznych, jeśli spełniony jest jeden z poniższych warunków. W studni są samce (nie mamy danych porównujących spożycie pokarmu przez samce i hermafrodyty); w studni są mniej niż 2 robaki lub więcej niż 16 robaków w studni; Robaki są martwe w drugim czytaniu; lub jeśli w studniach znajduje się potomstwo, ponieważ FUdR zawiódł. FUdR jest wrażliwy na ciepło i dezaktywuje się nawet przy temperaturach tak niskich jak 37 °C. FUdR należy zawsze rozmrażać w wodzie o temperaturze pokojowej.

Ujemne wartości spożycia pokarmu:

Wartości spożycia pokarmu są czasami ujemne, co sugeruje więcej jedzenia w dniu 4 niż w dniu 1. Ujemne wartości spożycia pokarmu mogą wskazywać na jeden z następujących czynników: wysoki wskaźnik samolizy , prawdopodobnie spowodowany dodatkiem leku działającego na bakterie, lub ujemne wartości spożycia pokarmu, co może sugerować, że studnia jest skażona i rośnie w niej coś innego niż robaki. Wskaźniki samolizy również rosną wraz z wiekiem bakterii; Dlatego zalecamy stosowanie bakterii nie starszych niż tydzień. Dodano lek, który wytrąca się z czasem, wpływając na wartość OD₆₀₀ . Niewystarczające potrząsanie w dniu 1 może prowadzić do niższego odczytu OD₆₀₀ z powodu grudek bakteryjnych. Robaki zostały poddane stresowi hipoksyjnemu. Dzieje się tak, gdy stosunek powierzchni do powietrza nie jest wystarczający, aby umożliwić wymianę tlenu. Używaj specjalnej płytki 96-dołkowej w materiałach i nie przekraczaj 150 μl (120 μl + 30 μl FUdR) na studzienkę. Odległość między powierzchnią studni a dnem, w którym żyją robaki, określa stężenie tlenu.

Ograniczenia:

Ten test jest ograniczony do płynnej hodowli. Zachowania żywieniowe obserwowane na solidnych płytach, takie jak poruszanie się po trawnikach spożywczych i poza nimi, nie mogą być oceniane za pomocą testu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Amfoterycyna B	RPI	A40030-0.1	rozpuszczalnik: EtOH
Ampicyliny	Fisher Naukowy	BP176025	Rozpuszczalnik: woda
Pepton baktonowy	BD Nauki biologiczne	211677	służy do produkcji płyt NGM
Karbenicylina	Fisher Naukowy	46-100-RG	Rozpuszczalnik: woda
Sitko do komórek	Fisher Naukowy	22363547	40 i mikro; m, aby usunąć osoby dorosłe
Cholesterol	MP Biomedycyna	Numer katalogowy 02101380-CF	Zapas 5 mg/ml
Difco, agar, bakteriologiczne	BD Nauki biologiczne	214510	służy do produkcji płyt NGM
Fluorodeoksyurydyna	Sigma Aldrich	F0503 powiedział:	do sterylizacji robaków na L4
Rosół z Lurii	RPI	L24045-1000.0	otwarta kapsułka, wymieszać z 1 l wody, autoklaw
Bufor M9	Przygotowane laboratorium		Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Aby przygotować 1 L:   15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136)   5 g NaCl (FW: 58), 0,25 g MgSO4*7H2O (FW: 246)   autoklaw
Zgrzewarka do mikropłytek	Fisher Naukowy	236707
Zobacz materiał OP50	Centrum Genetyki Caenorhabditis
Talerz 96-dołkowy	Sokół	351172
Czytnik płytek	Tecan (tekan)	30016056	Użyj obiektywu z filtrem 600 nm
Cytrynian potasu, 1 M, pH 6	Przygotowane laboratorium		Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Przygotowanie 1 L: 268,8 g cytrynianu potasu trójzasadowego jednowodnego (FW: 324) 26,3 g monohydratu kwasu cytrynowego (FW: 210) 900 ml dH2O pH do 6 przy użyciu 5 M autoklawu KOH
Fosforan potasu, 1 m, pH 6	Przygotowane laboratorium		Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Aby przygotować 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O   pH do 6 przy użyciu autoklawu 5 M KOH
S-Podstawowy	Przygotowane laboratorium		Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Aby przygotować 1 L: 5,9 g NaCl (FW: 58)   50 ml 1 M fosforanu potasu (pH 6) dodać 900 ml autoklawu dH2O , schłodzić do 55 °; C
S-kompletny	Przygotowane laboratorium		Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Aby przygotować 1 l: Dodać do 1 l S-basal (schłodzony do 55 & stopni; C lub RT)   10 ml 1 M cytrynianu potasu   pH 6, 10 ml roztworów metali śladowych   3 ml 1 M CaCl2 3 ml 1 M MgSO4
Chlorowodorek serotoniny	Thermo Scientific	AAB2126309	używany przy 5 mM
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S7653-5KG	do wykonywania zderzaków i płyt NGM
Wspaniały rosół	Thermo Scientific	Zobacz materiał J75856-A1	12,5 g w 250 ml wody, autoklaw
Wytrząsarka z płytą mianowania	Thermo Scientific	88880023	Wytrząsany przy 800 obr./min, w zależności od wytrząsarki
Roztwór metali śladowych	Przygotowane laboratorium		Przechowywać w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej Aby przygotować 1 L: 1,86 g Na2EDTA (FW: 372,24) 0,69 g FeSO4*7H2O (FW: 278)   0,20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0,29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287)   0,016 g CuSO4 (FW: 158) autoklawu zawinąć w folię aluminiową, aby przechowywać w ciemności