Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Interakcje między biomolekułami są najbardziej podstawową częścią zjawisk biologicznych. Oddziaływania białko-białko stanowią istotną część takich interakcji. W związku z tym identyfikacja partnera (partnerów) interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania ma kluczowe znaczenie dla dalszego wyjaśnienia funkcji białka/genu będącego przedmiotem zainteresowania. Metoda dwuhybrydowa drożdży (Y2H) jest popularną techniką identyfikacji interakcji białko-białko in vivo¹. W tym systemie dwa białka (X i Y), których interakcja ma być badana, są połączone odpowiednio z domeną wiążącą DNA (DB) i domeną aktywacji transkrypcyjnej (AD). Białko fuzyjne DB-X wiąże się z sekwencją rozpoznającą domenę DB; w związku z tym, gdy białka X i Y oddziałują na siebie, białko fuzyjne AD-Y znajduje się w pobliżu sekwencji rozpoznawania. W związku z tym aktywowana jest transkrypcja genu reporterowego za sekwencją rozpoznawania. W związku z tym obecność lub brak aktywności genu reporterowego może być wykorzystana do określenia obecności lub braku interakcji białko-białko¹.

Po zidentyfikowaniu konkretnego partnera interakcji interesującego białka, należy przeprowadzić dalsze analizy, aby wyjaśnić biologiczną funkcję tej interakcji. W tym celu, jeśli uda się wyizolować mutanty białek, które upośledzają lub usuwają specyficzną interakcję białko-białko, posłużą one jako potężne narzędzia. System Y2H może być używany bezpośrednio do izolowania takich mutantów poprzez badania przesiewowe klonów "ujemnych pod względem interakcji", zaczynając od klonu typu dzikiego "dodatniego pod względem interakcji". Aby przyspieszyć ten proces, opracowano systemy "odwrócone" Y2H (rY2H)^2,3. W systemach rY2H szczepy drożdży gospodarza zawierają geny markerowe podlegające kontrselekcji jako geny reporterowe, co oznacza, że komórki drożdży rosną tylko wtedy, gdy białka AD-Y i DB-X nie wchodzą w interakcje.

Chociaż zarówno systemy Y2H, jak i rY2H pozwalają na izolację mutantów negatywnych pod względem interakcji, proces izolowania mutantów jest pracochłonny, ponieważ nie wszyscy kandydaci uzyskani przez badania przesiewowe posiadają pożądany typ mutacji (zwykle mutacje typu missense). Najpoważniejszym problemem jest to, że znaczna część kandydatów jest nosicielami mutacji z przesunięciem ramki odczytu lub mutacji nonsensownych i konieczne jest przeprowadzenie western blotting w celu wykluczenia niepożądanych klonów. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowano nowe wektory plazmidowe⁴. W tych wektorach KanMX, marker oporności na leki, jest umieszczony poza ramką za domeną DB lub AD. Gen markerowy staje się w ramce z domeną DB lub AD tylko wtedy, gdy wstawiony jest gen będący przedmiotem zainteresowania. Gdy losowa mutacja (mutacje) zostanie wprowadzona do genu będącego przedmiotem zainteresowania, niepożądane mutanty, takie jak te z mutacjami z przesunięciem ramki odczytu lub mutacjami nonsensownymi, mogą być łatwo wyeliminowane przez przeprowadzenie selekcji oporności na leki, a kandydaci z pożądanymi mutacjami missense mogą być łatwo zidentyfikowani za pomocą Y2H screen⁴. W artykule przedstawiono protokół izolacji mutantów o zerowej/upośledzonej interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej strategii.

1. Budowa biblioteki mutantów

1. Ustaw reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) (przykład pokazano poniżej). Ogólnie rzecz biorąc, należy przygotować 50 μl reakcji, która jest podzielona na dziesięć podwielokrotności po 5 μl, i amplifikować docelowy fragment genu w maszynie do PCR⁴.
   UWAGA: Użytkownicy powinni dobrać odpowiednią polimerazę, aby skutecznie wprowadzać mutacje. Jeśli fragment DNA, który ma być amplifikowany, jest krótki, potrzebna jest polimeraza o wyższym wskaźniku błędów, taka jak polimeraza Taq, która nie ma aktywności korektorskiej. Jeśli fragment DNA, który ma być amplifikowany, jest długi, potrzebna jest polimeraza o wyższej wierności, aby zmniejszyć liczbę mutacji. Mutacje zachodzą co kilkaset par zasad po 30 cyklach amplifikacji zwykłą polimerazą Taq⁴. W wynikach reprezentatywnych zastosowano inną polimerazę Taq (patrz tabela materiałów), która ma wyższą wierność niż zwykła polimeraza Taq, a częstość mutacji wynosiła jedną na 600 par zasad. Przykład mieszanin PCR, szczegółowe informacje na temat startera i warunki reakcji znajdują się w pliku uzupełniającym 1.
2. Po zakończeniu PCR połącz wszystkie podwielokrotności reakcji, potwierdź, że interesujące nas fragmenty DNA zostały amplifikowane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym itp., a następnie oczyść DNA⁵.
3. Złóż fragment DNA wygenerowany w kroku 1.2 z odpowiednim wektorem Y2H, stosując "bezszwową" strategię klonowania (Rysunek 1).
   UWAGA: Bezproblemowy system klonowania, taki jak Gibson assembly⁶, minimalizuje zanieczyszczenie skonstruowanej biblioteki mutantów pustymi wektorami generowanymi przez samoligację. Lista wektorów Y2H znajduje się w tabeli 1. Można je przygotować przez trawienie BamHI przed montażem. Wszystkie plazmidy są dostępne w National BioResource Project - drożdże (patrz Tabela materiałów).
4. Wprowadzić mieszaninę reakcyjną wytworzoną w kroku 1.3 do komórek kompetentnych Escherichia coli przygotowanych zgodnie z wysoce wydajnym protokołem transformacji E. coli (np. Inoue i wsp.⁷). Rozłóż wszystkie kompetentne komórki na kilku płytkach LB (1% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1% NaCl i 2% agaru) zawierających odpowiednie antybiotyki (patrz Tabela materiałów). W tym momencie rozprowadź niewielką ilość (~1/100 całkowitej reakcji) na tej samej płytce selekcyjnej, aby obliczyć miano biblioteki. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
5. Gdy pojawi się duża liczba kolonii E. coli, zeskrob wszystkie komórki z powierzchni płytki za pomocą jednorazowej plastikowej pętli. Odzyskaj plazmidowe DNA z tych komórek za pomocą popularnych metod, takich jak alkaliczna liza⁸. W tym samym czasie policz liczbę kolonii, które pojawiają się po rozprowadzeniu małych porcji mieszaniny transformacyjnej na płytce. Korzystając z tej liczby, oszacuj całkowitą liczbę niezależnych klonów w bibliotece.
   UWAGA: W tym momencie zbierz kilka niezależnych kolonii (4-6), które pojawiają się na płytce, na której rozprowadzono małe porcje reakcji transformacji, hoduj je oddzielnie i wyizoluj z nich plazmidy, aby potwierdzić, że praktycznie wszystkie klony zawierają pożądane fragmenty DNA⁵. Dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów do izolowania plazmidów z E. coli. Liczbę kolonii, które pojawiają się na talerzu po rozrzuceniu małych porcji, można policzyć ręcznie.
6. Zmierz stężenie w puli DNA biblioteki. Zazwyczaj kilkaset nanogramów bibliotecznego DNA wystarcza do uzyskania kilku tysięcy transformantów w kolejnym kroku.
   UWAGA: Zaleca się pomiar stężenia DNA za pomocą barwnika fluorescencyjnego, który wiąże się z DNA, ponieważ pomiar A₂₆₀ jest często niedokładny.

2. Transformacja drożdży za pomocą biblioteki mutantów i posiewu repliki

1. Wprowadź zmutowaną bibliotekę do szczepu drożdży gospodarza (TAT-7 (L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)_8-lacZ) do testu Y2H przy użyciu około 100 ng DNA. Wstępnie przekształc komórki gospodarza za pomocą plazmidu "przynęty".
   1. Po procedurze przemiany zawiesić komórki drożdży w sterylnej wodzie i rozprowadzić porcje o różnych ilościach na odpowiednich płytkach (zwykle pożywka SC pozbawiona leucyny i tryptofanu: SC-LW [0,67% drożdżowej bazy azotowej, 2% glukozy, 1,546 g/L SC double drop-out mix -Leu -Trp, i 2% agar, patrz Tabela Materiałów]). Inkubować te płytki przez noc w temperaturze 30 °C.
      UWAGA: Standardowy protokół, taki jak metoda octanu litu-PEG¹¹ z ~5 × 10⁶ logarytmicznie rosnącymi komórkami, jest wystarczający do transformacji drożdży. Można również zastosować inną metodę o wysokiej sprawności przemiany, taką jak elektroporacja.
2. Następnego dnia, gdy pojawią się maleńkie kolonie, wybierz płytki z odpowiednią liczbą komórek (500-2000) i wykonaj z nich repliki w następujący sposób.
3. Umieść dwa arkusze bibuły filtracyjnej na bloku repliki, aby wykonać kilka replik (medium to SC-LW i SC-LW zawierające kanamycynę) (patrz Tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 30 °C przez 1-2 dni.
   UWAGA: Stężenie kanamycyny (G418) wynosi 600 μg/ml. Nie używaj aksamitu do powlekania replik, ponieważ rozdzielczość kolonii zostanie utracona.
4. Gdy kolonie wyrosną, porównaj talerze i wybierz kandydatów. Wykonaj test koloru Y2H (patrz krok 3), jeśli lacZ jest używany jako reporter.
   UWAGA: W przypadku reportera Y2H, lacZ jest zwykle lepszy w wykrywaniu słabych oddziaływań niż HIS3.

3. Test koloru Y2H

1. Umieść arkusz bibuły filtracyjnej przycięty wcześniej do odpowiedniego rozmiaru na płycie repliki przygotowanej w kroku 2. Należy uważać, aby między bibułą filtracyjną a płytką nie tworzyły się pęcherzyki powietrza.
   UWAGA: Użyj bibuły filtracyjnej nr 4A lub bibuły filtracyjnej klasy 50 (patrz tabela materiałów). Do testu barwy można użyć dowolnych płytek SC-LW lub SC-LW zawierających kanamycynę, które są wytwarzane przez replikowanie posiewu.
2. Gdy bibuła filtracyjna na talerzu jest całkowicie zwilżona (gdy kolor bibuły filtracyjnej całkowicie się zmieni), połóż kilka arkuszy ręcznika papierowego na wierzchu i doprowadź go do kontaktu z bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar wilgoci. Zdejmij ręcznik papierowy, gdy wchłonie wodę i zmieni kolor. Powtórz ten proces dwa lub trzy razy.
3. Podnieś krawędzie bibuły filtracyjnej pęsetą, szybko oderwij ją od płytki, zanurz w ciekłym azocie i zamroź. Jeśli ciekły azot nie jest dostępny, umieść bibułę filtracyjną na plastikowej tacy stroną z kolonią do góry i natychmiast umieść ją w zamrażarce (-20 °C do -80 °C) do całkowitego zamrożenia.
4. Wyjmij zamrożoną bibułę filtracyjną i umieść ją kolonią do góry na suchym ręczniku papierowym do rozmrożenia. Natychmiast po rozmrożeniu umieścić bibułę filtracyjną stroną z kolonią do góry na innej bibule filtracyjnej, która została umieszczona na plastikowej tacy lub zamykanym pojemniku i nasączona buforem Z (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl i 1 mM_MgSO4, pH 7,0) zawierającą X-gal (5-bromo-5-chloro-3-indolilo-β-D-galaktozyd) i 2-merkaptoetanol⁹ (patrz Tabela materiałów). Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza między górną i dolną bibułą filtracyjną.
5. Przykryj plastikową tackę zawierającą bibułę filtracyjną i włóż ją do hermetycznego pojemnika lub plastikowej torby. Zamknąć hermetyczny pojemnik lub plastikową torbę i inkubować w temperaturze 37 °C, aż pojawi się niebieski kolor.
6. Gdy pojawi się niebieski kolor, umieść bibułę filtracyjną stroną z kolonią do góry na około 500 μl roztworu zatrzymującego (1 M Na₂CO₃) umieszczonego na czystej plastikowej tacce. Roztwór zatrzymujący szybko wsiąka; Dlatego natychmiast wyjmij filtr, połóż go na świeżym ręczniku papierowym stroną z kolonią do góry i pozostaw do wyschnięcia.
7. Po wymianie ręcznika papierowego i wyschnięciu filtra użyj skanera lub innego urządzenia, aby przechwycić dane.

4. Odzyskiwanie i potwierdzanie kandydatów na klony

1. Wybierz białe i kandydujące klony Kan^R z oryginalnej tabliczki repliki (lub zduplikowanej płytki, która nie jest używana do testu koloru). Przykłady są pokazane w Rysunek 1C. Potwierdzić, że kandydujące klony są białe i Kan^R, ponownie nanosząc je jako mały plaster na pożywce SC-LW zawierającej kanamycynę i inkubując je w temperaturze 30 °C przez 1-2 dni. Wykonaj co najmniej dwie serie lub powtórz je następnego dnia.
   UWAGA: Białe kolonie powinny być wybierane, ponieważ bladoniebieskie kolonie mogą zachować interakcję.
2. Gdy potencjalne klony dobrze odrosną, powtórz test koloru z co najmniej jedną płytką wygenerowaną w kroku 4.1, jak opisano w kroku 3, i potwierdź, że pozostają białe i nie zmieniają koloru na niebieski (Rysunek 2A).
   UWAGA: Podczas ponownego nakładania pasków na kandydatów nie należy przenosić dużych ilości komórek. Zbyt wiele komórek uniemożliwia rozróżnienie klonów Kan^R i Kan^S.
3. Weź klony, które są nadal białe i Kan^R wygenerowany w kroku 4.2 z resztek płytki i hoduj je niezależnie w 1 ml pożywki selekcyjnej (SC-L lub SC-W, w zależności od tego, który wektor jest używany do budowy biblioteki) przez noc w temperaturze 30 °C.
4. Przenieś kulturę do mikroprobówki i zbierz komórki przez odwirowanie (~15 000 × g, przez 10-30 sekund w temperaturze pokojowej). Wyizoluj całe DNA z osadu komórkowego w następujący sposób.
5. Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu do lizy (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8,0) i 1 mM EDTA) zawierającym po 1 μl 2-merkaptoetanolu i 20 mg/ml zymoliazy 100T (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu wytrawienia ścian komórkowych. W tym czasie delikatnie mieszaj, odwracając probówkę co 5-10 minut.
6. Gdy zawiesina komórek stanie się nieprzezroczysta lub przezroczysta, dodać równą objętość mieszaniny alkoholu fenolowo-chloroformowo-izoamylowego (25:24:1) i dobrze wymieszać, wirując z umiarkowaną prędkością przez 10-20 s.
7. Odwirować mikroprobówki w mikrowirówce przez 5 minut na pełnych obrotach (~15 000 × g, w temperaturze pokojowej) i odzyskać fazę wodną zawierającą DNA w nowej mikroprobówce. Dodać 0,8 objętości izopropanolu i dobrze wymieszać, odwracając rurkę.
8. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 2-3 minuty, a następnie odwiruj w mikrowirówce przez 4-5 minut na pełnych obrotach (~15 000 × g, w temperaturze pokojowej), aby wytrącić DNA.
9. Usunąć supernatant i przemyć osad około 500 μl 70% etanolu. Całkowicie usunąć etanol i krótko wysuszyć osad.
10. Dodać 20 μl buforu TE (10 mM Tris-Cl (8,0) i 1 mM EDTA) do osadu, krótko wymieszać i pozostawić probówkę na noc w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia osadu.
    UWAGA: Jeśli użytkownicy się spieszą, utrzymuj probówki w temperaturze 37-50 °C. Osad DNA rozpuści się w ciągu kilku godzin.
11. Gdy osad całkowicie się rozpuści, przekształć E. coli za pomocą niewielkiej ilości tego roztworu DNA.
    UWAGA: Około 0,5 μl roztworu DNA jest wystarczające, jeśli stosuje się E. coli o wysokiej wydajności transformacji.
12. Kiedy pojawią się kolonie E. coli, wybierz kilka niezależnych kolonii, hoduj je i odzyskuj plazmidy standardowymi metodami, takimi jak liza alkaliczna.
13. Wprowadzić plazmidowe DNA uzyskane w kroku 4.12 do komórek gospodarza Y2H, w których znajduje się plazmid przynęty. Gdy pojawią się transformanty, sprawdź je za pomocą testu kolorów (powinny wyglądać na białe) i western blotting⁴ (powinny wyrażać białko o pożądanej wielkości).
    UWAGA: Metoda postalkaliczna¹² to łatwy i szybki sposób na przygotowanie ekstraktu z całych komórek drożdży.
14. Jeśli powyższe dwa kryteria są spełnione, określ miejsce mutacji klonów za pomocą sekwencjonowania nukleotydów⁴.

Ostatnio odkryto, że C-końcowa połowa białka Pol2 (Pol2-C) oddziałuje z Mcm10. Oba białka są niezbędne do inicjacji replikacji DNA, a tym samym do wzrostu komórek w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae13,14,15. Aby pomóc w zrozumieniu biologicznego znaczenia tej interakcji, mutanty Pol2-C, które nie mają interakcji z Mcm10 lub mają ją zmniejszoną przy użyciu metody opisanej tutaj.

Biblioteka mutacji została skonstruowana zgodnie z metodą opisaną w kroku 1. Fragmenty DNA Pol2-C amplifikowano polimerazą GoTaq i sklonowano do wektora Gal4AD (pST2525) przy użyciu enzymu In-Fusion. Liczbę niezależnych klonów w bibliotece oszacowano na 5000.

Jak opisano w kroku 2, DNA plazmidu z biblioteki zostało wprowadzone do szczepu gospodarza Y2H TAT-7, który został wstępnie przekształcony za pomocą plazmidu LexA-Mcm10. Komórki rozprowadzono na płytce SC-LW i zreplikowano na płytki SC-LW i SC-LW+G418 następnego dnia. Kontrpróby poddano testowi barwy opisanemu w kroku 3. Niektóre z wyników testu koloru są pokazane w Rysunek 1C.

Czterdzieści siedem kolonii, które były białe w teście koloru i odporne na G418, zostało wyizolowanych jako pierwsi kandydaci z około 8500 transformantów. Zostały one ponownie przetestowane za pomocą testu koloru i potwierdzono, że 25 z 47 klonów jest białych (Rysunek 2A). Te 25 klonów zostało zachowanych jako kandydaci. Kandydujące plazmidowe DNA pobrano od każdego z 25 kandydatów, jak opisano w kroku 4. Zostały one ponownie wprowadzone do komórek gospodarza drożdży Y2H zawierających LexA-Mcm10 i przetestowane za pomocą testu koloru, a następnie wybrano 16 klonów, które nie miały koloru. Aby jeszcze bardziej potwierdzić, że były to mutanty Missense Pol2-C, ekspresję białka Pol2-C potwierdzono za pomocą western blot. Dwunastu kandydatów wykazywało prążek w pozycji, która była prawie taka sama jak w kontroli pozytywnej (białko fuzyjne Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX, obliczone m.w.: 158,8 kDa) (Figura 2B). Test koloru wykazał, że te 12 klonów nie wchodziło w interakcje z Mcm10 (Rysunek 2C). Po określeniu sekwencji nukleotydowych tych klonów potwierdzono, że wszystkie z nich miały mutację (mutacje) typu missense. Liczba mutacji typu missense wahała się od jednego do pięciu (dane nie pokazane). Średnio na 1000 zasad występowała około jedna mutacja typu missense.

Rysunek 1: Schematy podejścia opartego na Y2H do badania przesiewowego mutantów o zerowej/upośledzonej interakcji. (A) System Y2H. (B) Strategia izolowania mutantów o zerowej/upośledzonej interakcji. 1: Nowo skonstruowany wektor Y2H zawiera kopię genu KanMX poniżej znacznika Y2H, domeny DB i AD. Co ważne, ten gen KanMX nie ma kodonu start i jest poza ramką ze znacznikiem Y2H. Dlatego nie oczekuje się, że gen KanMX zostanie wyrażony z tego wektora. Kiedy fragment DNA amplifikowany PCR jest wprowadzany do wektora, gen KanMX znajduje się w ramce ze znacznikiem Y2H i ulega ekspresji. W związku z tym tylko plazmidy zawierające wstawkę typu dzikiego lub wstawkę z mutacją typu missense mogą wyrażać gen KanMX, który nadaje oporność na G418. Plazmidy z mutacją nonsensowną lub mutacją (mutacjami) przesunięcia ramki odczytu nie mogą wyrażać genu KanMX. 2: Biblioteka mutantów skonstruowana w kroku 1 jest wprowadzana do komórek drożdży gospodarza Y2H. Kiedy pojawiają się transformanty, powstają repliki. Porównując ekspresję genu reporterowego (genów) i oporność na G418, można wybrać kandydatów mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych. (C) Przykład badania przesiewowego. Biblioteka plazmidowa, która zawierała Gal4-AD i zmutagenizowany PCR fragment DNA Pol2-C, została wprowadzona do szczepu gospodarza Y2H TAT-7, który został wstępnie przekształcony plazmidem LexA-Mcm10. Pokazano obrazy komórek przed (po lewej) i po (w środku) testu barwy oraz komórek wyhodowanych na płytce SC-LW+G418 (po prawej). Przykłady kandydatów mutantów bez interakcji/upośledzonych i fałszywych kandydatów są oznaczone odpowiednio białymi i czarnymi grotami strzałek. (D) sekwencja DNA wokół miejsca klonowania wektorów Y2H, wektorów AD (na górze) i DB (na dole). Pokazana jest sekwencja od ostatnich dziesięciu aminokwasów (aa) znacznika Y2H (czerwony) do części odpowiadającej pierwszym dziesięciu atomom KanMX (zielony). Pokazane są również miejsca rozpoznania SmaI i BamHI. Pozycje starterów PCR są pokazane na dole, gdy miejsce BamHI jest używane jako miejsce klonowania. Te same startery stosuje się do klonowania interesującego genu do innych plazmidów (pST2303/2523). Ten rysunek został zmodyfikowany z Tanaka et al.4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykład procesu przesiewowego mutantów bez interakcji/upośledzonych. (A) 47 kolonii wyizolowanych jako kandydujące klony, jak pokazano w Rysunek 1C, zostało ponownie wyhodowanych na pożywce SC-LW zawierającej G418 i poddanych testowi koloru. +: kontrola dodatnia (Wt Pol2-C), -: kontrola ujemna (wektor). Kandydujące klony o numerach 1-25 zostały wyhodowane w celu odzyskania plazmidów. (B) Plazmidy odzyskano z każdego kandydującego klonu w (A), wprowadzono do komórek gospodarza Y2H i ponownie poddano testowi koloru. Szesnaście z nich było białych (brakowało im koloru). Przygotowano z nich ekstrakty z całych komórek i przeprowadzono western blot przeciwciałem monoklonalnym anty-HA. Liczba na panelu odpowiada liczbie w (A). Przeprowadzono analizy kilku niezależnych klonów plazmidów odzyskanych od każdego kandydata, z wyjątkiem #6. (C) Wyniki testu barwy dla końcowych 12 klonów. Numery odpowiadają numerom w (A). #16, który zachował interakcję z Mcm10, został użyty jako kontrola pozytywna w teście koloru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista wektorów Y2H zawierających KanMX poza ramką ze znacznikiem Y2H.

Plik uzupełniający 1: Przykład mieszanin PCR, szczegóły startera i warunki reakcji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.