Wpływ pozaustrojowego natlenienia błonowego na układ krzepnięcia

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do ustanowienia długoterminowego modelu pozaustrojowego natleniania błonowego (ECMO) u owiec. Szczególną uwagę zwrócono na zarządzanie i ocenę systemu krzepnięcia podczas modelu ECMO.

Streszczenie

To badanie miało na celu zbadanie wpływu długotrwałego pozaustrojowego natleniania błonowego (ECMO) na system krzepnięcia w modelu owiec. W badaniu wzięło udział łącznie dziesięć zdrowych owiec, po 5 owiec w każdej grupie. W grupie ECMO ŻYLNO-TĘTNICZEGO (V-A ECMO) wykonano kaniulację w prawej tętnicy szyjnej i prawej zewnętrznej żyle szyjnej. W grupie ECMO ŻYLNO-ŻYLNEGO (V-V ECMO) zastosowano cewnik dwuprzeźrowy do wprowadzenia do prawej żyły szyjnej zewnętrznej. Po rozpoczęciu ECMO owce zostały wyleczone ze znieczulenia i pozostały przytomne przez 7 dni. Docelowy czas krzepnięcia po aktywacji (ACT) ustalono na 220-250 s. W obu grupach rzeczywisty ACT oscylował wokół 250 s, a dawka heparyny stopniowo rosła, osiągając prawie 60 IU/kg/min pod koniec eksperymentów. Co więcej, wartości czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT) i czasu trombiny (TT) były istotnie wyższe w grupie V-A ECMO w porównaniu z grupą V-V ECMO, pomimo otrzymywania tych samych dawek heparyny. Chociaż wyniki badań laboratoryjnych wahały się w normalnym i rozsądnym zakresie, ogniska zawału nerek zaobserwowano w obu grupach pod koniec badania.

Wprowadzenie

Pozaustrojowe utlenowanie membranowe (ECMO) służy jako interwencja ratująca życie, zapewniając wsparcie krążeniowo-oddechowe ciężko chorym pacjentom. Dzieli się go na dwie podstawowe formy: ECMO ŻYLNO-TĘTNICZE (V-A ECMO) i ECMO ŻYLNO-ŻYLNE (V-V ECMO)^1,2. V-A ECMO jest stosowany u pacjentów z niewydolnością krążenia, podczas gdy V-V ECMO jest preferowany u osób z niewydolnością oddechową, ale bez ciężkiej dysfunkcji sercowo-naczyniowej^3,4.

Zakrzepica i krwawienie są powszechnymi powikłaniami u pacjentów z ECMO⁵. Obwód ECMO wystawia krew na działanie sztucznych powierzchni, inicjując złożone reakcje krzepnięcia⁶. Procesy te mogą prowadzić do uszkodzenia śródbłonka i zaburzeń mikrokrążenia, co w konsekwencji prowadzi do dysfunkcji ważnych narządów^7,8. W związku z tym uważa się, że skuteczne ogólnoustrojowe leczenie przeciwzakrzepowe ma kluczowe znaczenie dla pacjentów z ECMO. Mimo to nadal brakuje dowodów, które mogłyby kierować strategiami przeciwzakrzepowymi w różnych warunkach klinicznych związanych z ECMO.

Stworzenie stabilnego modelu zwierzęcego ECMO może dostarczyć wglądu w wpływ ECMO na organizm, znacząco przyczyniając się do optymalizacji strategii zarządzania ECMO, zmniejszenia powikłań związanych z ECMO i poprawy wyników leczenia pacjentów w praktyce klinicznej. Duże zwierzęta, takie jak owce i świnie, są głównym wyborem do tworzenia modeli ECMO ze względu na ich parametry fizjologiczne bardzo zbliżone do parametrów ludzkich^9,10. Jednak poprzednie modele ECMO dla dużych zwierząt miały czas konserwacji krótszy niż 24 godziny, co utrudniało kompleksową ocenę wpływu ECMO na system krzepnięcia¹¹. W związku z tym istnieje potrzeba stworzenia długoterminowych modeli dużych zwierząt ECMO, aby dokładnie zbadać patofizjologiczne mechanizmy ECMO. Wykorzystanie długoterminowych dużych modeli zwierzęcych do zbadania wpływu ECMO na układ krzepnięcia może dostarczyć bardziej wiarygodnych dowodów w praktyce klinicznej.

To badanie ma na celu ustalenie długoterminowego (7 dni) modelu ECMO V-A i V-V ECMO u zdrowych owiec. Głównym celem całego procesu tworzenia i oceny modelu jest zarządzanie antykoagulacją.

Protokół

Ten eksperymentalny protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitala Fuwai (nr 0101-2-20-HX(X)). Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi określonymi w Przewodniku National Institutes of Health dotyczącym użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Eksperyment odbył się w Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, Animal Experimental Center of Fuwai Hospital (nr rejestracyjny). CNAS LA0009). W badaniu wykorzystano zdrowe owce, które spełniały wymagane normy kwarantanny w Centrum Doświadczalnym dla Zwierząt Szpitala Fuwai. Co więcej, badania te były zgodne z wytycznymi Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments. Samce owiec rasy Small Tail Han o wadze 50-65 kg i wieku 12-24 miesięcy (patrz Tabela Materiałów) były trzymane w specyficznym środowisku wolnym od patogenów ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody przez co najmniej tydzień przed operacją. Owce zostały losowo przydzielone do dwóch grup, z których każda składała się z 5 osobników: grupy ECMO ŻYLNO-TĘTNICZEJ (V-A ECMO) i grupy ECMO ŻYLNO-ŻYLNEJ (V-V ECMO). Wybór zdrowych owiec był uzasadniony koniecznością dokładnej oceny wpływu wspomagania ECMO na organizm. Sprzęt i odczynniki użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Przed zabiegiem chirurgicznym należy pościć zdrowe dorosłe owce przez 48 godzin i pozbawić je wody przez 12 godzin.
2. Przed zabiegiem należy wysterylizować narzędzia chirurgiczne i parametry ECMO. Należy zapewnić wszystkim członkom zespołu chirurgicznego środki ochrony osobistej, w tym czepki chirurgiczne, jednorazowe maski na twarz, czysty strój chirurgiczny, ochraniacze na buty, sterylną odzież operacyjną i sterylne rękawice.
3. Podać wstrzyknięcie propofolu (5 mg/kg) przez żyłę uszną. Jak opisano wcześniej, zamocuj mankiet do pomiaru ciśnienia krwi na udzie i umieść przewody elektrokardiogramowe na wszystkich czterech kończynach. Podłącz mankiet do pomiaru ciśnienia krwi i przewody EKG do monitora medycznego w celu uzyskania EKG i nieinwazyjnego pomiaru ciśnienia krwi¹².
4. Włóż jednoprześwitową rurkę dotchawiczą do tchawicy i podłącz rurkę do respiratora w trybie kontroli objętości. Ustaw parametry w następujący sposób: objętość oddechowa: 8-10 ml / kg, częstość oddechów: 12-20 / min, początkowa frakcja tlenu wdechowego (FiO2): 60%.
5. Podawać kombinację znieczulenia dożylnego (propofol, 8-10 mg/kg/h) i znieczulenia wziewnego (izofluran 2%-3%) w celu utrzymania znieczulenia. Podawaj przerywany flurbiprofen (1-2 mg/kg) dożylnie w celu śródoperacyjnego znieczulenia.
6. Połóż owce na stole operacyjnym i zabezpiecz ich kończyny elastycznym pasem z tkaniny. Przystąp do izolacji lewej tętnicy szyjnej i żyły szyjnej i wprowadź odpowiednio jednokanałowy cewnik do żyły centralnej (18 Fr) i cewnik do żyły centralnej z potrójnym światłem (7 Fr). Podłącz cewnik 18 G na lewej tętnicy szyjnej do monitora medycznego w celu monitorowania hemodynamicznego. Podłącz trójkanałowy cewnik do żyły centralnej 7 Fr w lewej żyle szyjnej do pompy infuzyjnej i monitora medycznego w celu jednoczesnego dożylnego podawania płynów, wstrzykiwania leków i monitorowania centralnego ciśnienia żylnego. Wszystkie połączenia należy wykonać za pomocą zaworów trójdrogowych. Pobrać próbki krwi żylnej lub tętniczej przez zawór odcinający trójdrożny.
   UWAGA: Po wprowadzeniu cewnika należy podwiązać cewnik i naczynie za pomocą szwów chirurgicznych 2-0.
7. Odsłoń prawą tętnicę szyjną i żyłę. Uzyskać ogólnoustrojową antykoagulację za pomocą bolusa heparyny (120 j.m./kg) przez prawą żyłę szyjną.
   UWAGA: Docelowy czas krzepnięcia aktywowanego (ACT) dla kaniulacji wynosi powyżej 250 s.

2. Kaniulacja

1. Założenie obwodu V-A ECMO: Wprowadzić cewnik tętniczy (18 Fr) przez prawą tętnicę szyjną na głębokość 10-15 cm, a cewnik żylny (24 Fr) przez prawą żyłę szyjną zewnętrzną do prawego przedsionka.
2. Ustawienie obwodu V-V ECMO: Odsłonić prawą żyłę szyjną zewnętrzną i wprowadzić cewnik dwukanałowy (23 Fr) przez prawą żyłę szyjną zewnętrzną.
   UWAGA: Podczas tej procedury utrzymuj ciśnienie krwi i tętno owiec w granicach ±20% wartości wyjściowych. Utrzymuj ciśnienie parcjalne tętniczego dwutlenku węgla (PaCO2) w zakresie 35-40 mmHg. Upewnij się, że ciśnienie parcjalne końcowego pływowego dwutlenku węgla (EtCO2) utrzymuje się w zakresie 35-45 mmHg. Dostosuj głębokość znieczulenia, gdy napotkasz zmiany ciśnienia krwi i tętna u owiec. Jeśli okaże się to nieskuteczne lub w nagłych wypadkach, rozważ zastosowanie leków wazoaktywnych. Utrzymuj PaCO2 i EtCO2 w normalnych wartościach, dostosowując parametry respiratora, koncentrując się przede wszystkim na objętości oddechowej i częstości oddechów.
3. W V-V ECMO przeprowadź końcówkę cewnika przez prawy przedsionek (RA) i umieść ją w żyle głównej dolnej (IVC). Skieruj port odpływowy cewnika dwukanałowego w kierunku zastawki trójdzielnej (potwierdź położenie za pomocą ultradźwięków).
   UWAGA: Po wprowadzeniu cewnika należy podwiązać cewnik i naczynie za pomocą szwów chirurgicznych 2-0. Zamknij nacięcie skóry za pomocą szwów chirurgicznych 4-0.

3. Inicjacja ECMO

1. Podłącz wszystkie urządzenia ECMO zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Upewnij się, że nie ma wycieków.
   UWAGA: Podczas łączenia należy przestrzegać zasad aseptyki.
2. Roztwór konfekcjonujący składa się z soli fizjologicznej (1000 ml) i 2000 j.m. heparyny. Po ręcznym wlaniu roztworu zalewającego do obwodu ECMO i upewnieniu się, że w obwodzie nie ma pęcherzyków powietrza, należy uruchomić pompę odśrodkową do zalewania (1000-1500 obr./min).
3. Po zakończeniu zalewania wyłącz pompę odśrodkową. Podłącz cewnik dopływowy do wlotu pompy odśrodkowej i podłącz cewnik odpływowy do wylotu natleniacza. Wszystkie połączenia należy wykonać za pomocą zaworów trójdrogowych. Wypuścić powietrze z przyłącza przez zawór trójdrogowy. Podłącz źródło tlenu do systemu ECMO, zapewniając prawidłowy przepływ tlenu. Następnie uruchom pompę odśrodkową do pracy ECMO. Ustawić początkowy przepływ pompy na 2,0 l/min przy prędkości obrotowej pompy 3000 obr./min.
4. Owiń rurkę obwodu ECMO w połowie wokół szyi owcy, aby zapobiec przemieszczeniu lub załamaniu.

4. Postępowanie pooperacyjne i monitorowanie

1. Przenieść owce do klatki metabolicznej i odpowiednio je unieruchomić po zakończeniu operacji.
   UWAGA: Zabezpiecz głowę i ramiona owcy ze szczególnym naciskiem na zapobieganie przemieszczeniu lub załamaniu kaniuli. Stopniowo zmniejszaj głębokość znieczulenia. Zapewnić ochronę osobistą członkom pooperacyjnego zespołu pielęgniarskiego poprzez noszenie odzieży ochronnej (sterylna odzież, rękawiczki, maski i czepki).
2. Aby zapewnić stabilne wyniki oddychania i gazometrii krwi, wyjmij rurkę dotchawiczą.
3. W ciągu pierwszych 24 godzin po zabiegu należy podać dożylnie flurbiprofen (1-2 mg/kg) i deksmedetomidynę (0,2-0,3 μg/kg·h) w celu uspokojenia i złagodzenia bólu.
   UWAGA: Po pierwszych 24 godzinach należy rozważyć leki uspokajające i przeciwbólowe, jeśli występuje pobudzenie i wahania ciśnienia krwi u owiec z powodu bólu pooperacyjnego.
4. Wewnątrz klatki monitorującej należy upewnić się, że owce poruszają się swobodnie w określonym zakresie i mają nieograniczony dostęp do odpowiedniej ilości paszy i wody.
5. Utrzymuj ciągłą kontrolę podstawowych parametrów życiowych w czasie rzeczywistym (tętno i ciśnienie tętnicze krwi) wraz z parametrami hydraulicznymi ECMO (przepływ pompy, prędkość pompy, ciśnienie przed pompą, ciśnienie po pompie i ciśnienie po natleniaczu).
   UWAGA: Ustaw docelowe parametry zarządzania ECMO (przepływ pompy: 2,0-2,5 l/min, prędkość pompy: 3000-3500 obr/min, natężenie przepływu tlenu: 1,0-1,5 l/min przy FiO2 50%-80%). Dostosuj powyższe parametry zgodnie z wynikami gazometrii.
6. Mierz gazometrię krwi i ACT co 6 godzin i codziennie monitoruj morfologię krwi, skład chemiczny krwi i testy krzepnięcia. Dostosuj strategię przeciwzakrzepową w oparciu o wskaźniki krzepnięcia.
   UWAGA: Docelowy cel ACT: 220-250 s.
7. Dostosuj wlewy dożylne w oparciu o równowagę płynów, aby utrzymać centralne ciśnienie żylne (CVP) w zakresie 5-12 cm_H2O. Podawaj cefuroksym sodowy (1,5 g, i.v., bid) dziennie w celu zapobiegania infekcjom. Przeprowadzaj codzienną dezynfekcję nacięć i uważnie monitoruj objawy infekcji lub krwawienia.

5. Eutanazja

1. Po 7-dniowym okresie eksperymentalnym wyjmij obwód ECMO.
2. Podać dożylnie wstrzyknięcie chlorku potasu (100 mg/kg) do eutanazji w sedacji z propofolem (20 mg/kg).
   UWAGA: Po eutanazji główne narządy (serce, nerki, płuca, wątroba, mózg i jelita) zostały pobrane i wizualnie sprawdzone pod kątem obecności zawałów, krwotoków lub jawnych uszkodzeń. Wszystkie uszkodzenia narządów zostały szczegółowo zarejestrowane. Następnie organy pocięto na małe kawałki i utrwalono w 4% formaldehydzie, zatopiono w parafinie i podzielono na odcinki o długości 4 μm w celu barwienia hematoksyliną-eozyną (HE)¹³. Przeprowadź badanie histologiczne dla odcinków HE pod mikroskopem świetlnym przez co najmniej dwóch patologów niezależnie.

Wyniki

Łącznie dziesięć owiec zostało ocenionych podczas całego eksperymentu, z pięcioma owcami w każdej grupie (Tabela 1). Po rozpoczęciu ECMO wszystkie owce wyzdrowiały ze znieczulenia i pozostały przytomne przez 7 dni. W obu grupach przepływ ECMO przekroczył 1,8 l/min. W grupie V-V ECMO przepływ oscylował wokół 1,8 l/min, podczas gdy w grupie V-A ECMO wahał się od 2,3 l/min do 1,8 l/min (Rysunek 1A). Parametry życiowe każdej owcy pozostały stabilne. Poziom kwasu mlekowego we krwi wynosił ...

Dyskusja

W niniejszym badaniu przedstawiono procedurę tworzenia solidnych, długoterminowych modeli przeżycia dla V-V i V-A ECMO u owiec. Wszystkie zwierzęta, które przeżyły, wykazywały stabilne parametry życiowe i nie wystąpiły żadne poważne krwawienia ani krzepnięcia. Przepływ ECMO i wydajność natleniania pozostały stabilne, nie zaobserwowano żadnych poważnych urazów patologicznych. Badanie dostarcza szczegółowych informacji na temat postępowania przeciwzakrzepowego.

Postępowanie przeciwzakrzepowe odg...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Analizator ACT	Hemochron, USA	Jr Aparat
	Drager, Niemcy	Primus
	Edwards Lifescience, USA	18-Fr	Zapewnienie dostępu powrotnego do tętnicy dla VA-EMCO
Analizator biochemiczny krwi	IDEXX Laboratories, USA	Katalizator Jeden
Analizator gazometrii krwi	Abbott, Stany Zjednoczone	Pompa odśrodkowa Abbott i-STAT1
	Jiangsu STMed Technologies, Chiny	STM CP-24 I
Napęd pompy odśrodkowej i konsola	Jiangsu STMed Technologies, Chiny	OASSIST STM001
Analizator testu krzepnięcia	Beijing Succeeder Technology, Chiny	SF-8050
Kompletny analizator morfologii krwi	Siemens Healthcare, Niemcy	ADVIA 2120i
Dwukanałowa pompa mikroiniekcyjna	Zhejiang Smith Medical Instrument, Chiny	WZS-50F6
Cewnik dwukanałowy	MAQUET Avalon Elite, Niemcy	23-Fr	Zapewnij dostęp powrotny i drenaż do prawej zewnętrznej żyły szyjnej dla VV-ECMO
Flurbiprofen	Beijing Tide Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	5ml: 50mg
Oprogramowanie GraphPad	Oprogramowanie GraphPad, USA	GraphPad Prism v9.0	Analiza statystyczna
Heparyna	Shanghai Shangyao No.1 Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	2 ml: 12500 j.m
Elektrochirurgiczny	COVIDIEN, USA	Force F
Wieloparametrowy monitor medyczny	Philips, Holandia	MP60
Zestaw dotleniacza	Medos, Niemcy	Hilite 7000LT
Zestaw dotleniacza	Maquet, Niemcy	BE-PLS 2050
Propofol	Xi' an Libang Pharmaceutical Co. Ltd, Chiny	20 ml: 0,2 g
Jednokanałowy cewnik do żyły centralnej	TuoRen, Chiny	18Fr	Wkładka do lewej tętnicy szyjnej  do monitorowania hemodynamicznego i pobierania próbek krwi.
Owca Small Tail Han	Jinyutongfeng Commercial and Trade Co. Ltd, Chiny	waga: 50-65 kg, wiek: 12-24 miesiące
Trzykanałowy cewnik do żyły centralnej	TuoRen, Chiny	7Fr	Wkładka w lewej żyle szyjnej do dożylnego podawania płynów, wstrzykiwania leków i pobierania próbek krwi.
Aparat ultrasonograficzny	GE, USA	E9
Cewnik żylny	Edwards Lifescience, USA	24-Fr	Zapewnij dostęp do drenażu do żyły dla VA-ECMO
Respiratora	Drager, Niemcy	Savina

anestezjologiczny Signature Cewnik tętniczy .