Tutaj opisujemy protokół chirurgicznego tworzenia urazu objętościowej utraty mięśni (VML) u żwacza szczura, dostarczając powtarzalnego i dostępnego modelu do badania urazów mięśni twarzoczaszki i ich leczenia za pomocą biomateriałów, takich jak nowy hydrożel.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model utraty objętości mięśni żwaczy u gryzoni do badania materiałów bioinżynieryjnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Utrata objętości mięśni twarzoczaszki (VML) może wystąpić w wyniku ciężkiego urazu, chirurgicznego wycięcia, stanu zapalnego oraz wrodzonych lub innych nabytych schorzeń. Leczenie VML twarzoczaszki polega na chirurgicznym, funkcjonalnym transferze mięśni. Jednak procedury te nie są w stanie przywrócić normalnych funkcji, czucia lub ekspresji, a częściej schorzenia te nie są leczone. Przeprowadzono bardzo niewiele badań nad regeneracją mięśni szkieletowych w zwierzęcych modelach VML twarzoczaszki. W artykule opisano model szczurzy do badania uszkodzenia VML twarzoczaszki oraz protokół oceny histologicznej biomateriałów w leczeniu tych urazów. Płynny hydrożel i liofilizowane rusztowania są stosowane w momencie chirurgicznego tworzenia VML, a żwacze są wycinane w końcowych punktach czasowych do 12 tygodni z wysokimi wskaźnikami retencji i znikomymi powikłaniami. Hematoksylina i eozyna (HE), trichrom Massona oraz analiza immunohistochemiczna służą do oceny parametrów regeneracji mięśni szkieletowych oraz biokompatybilności i immunomodulacji. Podczas gdy pokazujemy badanie hydrożelu na bazie kwasu hialuronowego, model ten zapewnia środki do oceny kolejnych iteracji materiałów w urazach VML.
Wprowadzenie
Ciężkie urazy, chirurgiczne wycięcia, stany zapalne i inne nabyte stany mogą spowodować utratę tkanek w takim stopniu, który przytłacza mechanizmy naprawy endogennych mięśni szkieletowych. Utrata rezydujących komórek i struktur, które promują pierwotny proces regeneracyjny, może skutkować patologicznym przebudową i zwłóknieniem tkanek, co skutkuje długotrwałymi deficytami funkcji i czucia i jest określane jako wolumetryczna utrata mięśni (VML)1,2,3. Reakcja zapalna na urazy VML obejmuje dobrze udokumentowany i złożony mechanizm obejmujący makrofagi, cytokiny i komórki miogenne, który przedstawia wiele teoretycznych celów w medycynie regeneracyjnej4. Podczas gdy w wielu badaniach in vitro wykorzystano te cele w zwierzęcych modelach leczenia VML kończyn, brakuje badań nad regeneracją mięśni szkieletowych w modelach zwierzęcych twarzoczaszki VML5,6,7.
Utrata tkanki twarzoczaszki może wynikać z warunków opisanych wcześniej, a niedobór tkanki twarzoczaszki może również wystąpić w stanach wrodzonych, takich jak rozszczep, który w niektórych przypadkach wiąże się z prawdziwym niedoborem objętości tkanki mięśniowej8,9. Ponieważ mięśnie okolicy twarzoczaszki są ważne dla funkcji, a także estetycznego wyglądu, długoterminowe skutki VML mogą mieć poważne dolegliwości psychiczne. Kilka aspektów mięśni szkieletowych twarzoczaszki różni się od mięśni szkieletowych pochodzących z somitu znajdujących się w kończynach, w tym różnice w ekspresji genów, pochodzenie embrionalne, fenotyp komórek satelitarnych, ilość komórek satelitarnych, skład włókien i architektura10,11,12,13. Te różnice mogą powodować urazy VML wpływające na mięśnie twarzoczaszki inaczej niż mięśnie pochodzące z somitów14,15. Do tej pory wykazano, że podejścia inżynierii tkankowej zwiększają regenerację w zwierzęcych modelach VML kończyn, nie przekładały się równoważnie na modele zwierzęce VML twarzoczaszki16. Podkreśla to potrzebę optymalizacji podejść in vivo do zwierzęcych modeli VML twarzoczaszki.
Chociaż przeprowadzono kilka badań in vivo VML twarzoczaszki, badania są niewielkie, a stworzenie solidnego defektu mięśnia twarzoczaszki w modelach zwierzęcych jest wyzwaniem8,13. Kim i wsp. poinformowali o opracowaniu modelu VML żwacza u myszy. Jednak w tym badaniu oceniano histologię tylko do 28 dni po urazie i miało niejasną moc wykrywania różnic w wynikach histologicznych między punktami czasowymi17. Rodriguez i wsp. poinformowali o opracowaniu modelu VML twarzoczaszki owcy. Stwierdzili jednak dużą zmienność w grupach eksperymentalnych, co sugeruje niejednorodność w ciężkości początkowego urazu chirurgicznego16. W tym miejscu przedstawiamy protokół naszego modelu VML żwacza szczurów i demonstrujemy jego przydatność w ocenie podejść inżynierii tkankowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi obowiązującymi przepisami, w tym z przestrzeganiem zaleceń zawartych w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych. Instytucjonalny Program Opieki i Użytkowania Zwierząt UCSF zatwierdził wszystkie procedury i opiekę pooperacyjną dla zwierząt (protokół IACUC #AN195944-01).
1. Chirurgia VML
- Samce szczurów Sprague-Dawley należy znieczulić w wieku 12 tygodni o wadze 276-300 g w szczelnie zamkniętym pojemniku przy użyciu znieczulenia ogólnego izofluoranem w ilości 1%-5% przed przeniesieniem do sterylnego pola operacyjnego.
- Ułóż gryzonie na lewym boku w taki sposób, aby szyja była wyciągnięta w pozycji neutralnej, a nos dopasowany do nosa znieczulającego, umożliwiając ekspozycję na prawą stronę twarzy.
- Stożkowe natężenie przepływu izofluoranu od indukcji do konserwacji (około 2%).
- Nałóż maść okulistyczną na oczy gryzoni.
- Oczyść miejsce operacji, otoczone linią między prawym kącikiem ust, podstawą prawego ucha powyżej, a kątem żuchwy niżej, sierści za pomocą kremu do depilacji.
- Zdezynfekować miejsce operacyjne kilkakrotnie okrężnymi ruchami, używając zarówno etanolu, jak i peelingu betadynowego.
UWAGA: W tym protokole nie stosuje się sterylnego obłożenia, biorąc pod uwagę rozmiar i miejsce dostępu. Zabieg przeprowadzany jest z zachowaniem techniki aseptycznej zgodnie z wytycznymi dotyczącymi pielęgnacji zwierząt.
- Zdezynfekować miejsce operacyjne kilkakrotnie okrężnymi ruchami, używając zarówno etanolu, jak i peelingu betadynowego.
- Wykonaj podłużne nacięcie o długości 3-4 cm, rozciągające się od dolnej prawej opuszki wąsów do prawego ucha.
- Podnieś płat skóry, umożliwiając wizualizację prawego żwacza, a także gałęzi policzkowych i żuchwowych nerwu twarzowego (Rysunek 1A).
- Oczyść skórę z leżącej poniżej powięzi za pomocą separacji i przytrzymaj krawędzie skóry w cofniętej pozycji za pomocą zacisków chirurgicznych, aby uzyskać optymalną wizualizację leżącego pod spodem mięśnia.
- Wykonaj poprzeczne nacięcie o długości 1-2 cm w powięzi nad przednią częścią żwacza. Użyj separacji, aby rozszerzyć przestrzeń między powięzią a żwaczem, uważając, aby zachować ogólną integralność pozostałej powięzi.
- Używając nacięcia powięziowego jako okna do powierzchownego żwacza, stwórz okrężny uraz w mięśniu o średnicy 5 mm i głębokości 5 mm za pomocą wysterylizowanej jednorazowej biopsji stempla. Upewnij się, że wada jest wyśrodkowana między gałęziami policzkowymi i żuchwowymi nerwu twarzowego, uważając, aby uniknąć urazu nerwów (Rysunek 1B).
- Dodaj biomateriał do urazu żwacza okrągłego (Rysunek 1C).
- Gdy środek jest już odpowiednio na miejscu, zszyj okno powięziowe inwestujące w mięśnie za pomocą pojedynczego szwu monofilamentowego 5-0, aby uniknąć migracji.
UWAGA: Środki w postaci stałej są umieszczane bezpośrednio w ranie, a tkanka może być zaburzona, aby promować nasycenie krwią, podczas gdy środki płynne są dodawane i pozostawiane do żelowania, jeśli to konieczne, lub natychmiast zamykane na miejscu za pomocą powięzi, aby uniknąć niepożądanego ruchu. W przedstawionym tutaj eksperymencie podaje się arylowany kriożel na bazie kwasu hialuronowego. - Zamknij skórę za pomocą prostej techniki przerywanej lub podskórnej za pomocą żyłki 5-0.
- Nałóż klej do skóry na szwy, aby zapobiec rozejściu się nacięcia pooperacyjnego.
- Pozwól szczurom dojść do siebie w klatce z zewnętrznym źródłem ciepła (poduszka grzewcza pod klatką lub sterylne ogrzewacze do rąk w klatce) i obserwuj przez 30 minut po operacji.
- Rozcieńczyć antybiotyk trimetoprim-sulfametoksazol (200 mg trimetoprimu i 40 mg sulfametoksazolu w 5 ml) w wodzie do picia (5 ml/200 ml wody) i podawać go gryzoniom pijącym wodę przez 7 dni po operacji. Upewnij się, że analgezja okołooperacyjna jest przeprowadzana zgodnie z protokołami instytucjonalnymi.
UWAGA: W tym badaniu 0,25% bupiwakainy SC podawano przed nacięciem chirurgicznym, 0,05 mg/kg buprenorfiny SC podawano przed wyzdrowieniem ze znieczulenia, a 2 mg/kg meloksykamu IP podawano przed wyzdrowieniem ze znieczulenia i ponownie następnego ranka.
2. Zbieranie, zamrażanie i analiza żwaczy
- W określonych punktach czasowych należy złożyć szczury w ofierze, wywołując przedawkowanie środka chemicznego (np. CO2 lub środka znieczulającego) w komorze indukcyjnej znieczulenia.
- Potwierdź ofiarę gryzonia, przeprowadzając obustronną torakotomię za pomocą pojedynczego nacięcia skalpela przez 4. żebro brzusznie w celu nakłucia płuc (torakotomia obustronna).
- Ponownie otwórz nacięcie chirurgiczne, aby umożliwić wizualizację żwacza, i usuń skórę leżącą nad żwaczem, aby ułatwić dostęp.
- Wypreparuj i usuń żwacz z żuchwy, zaczynając od oddzielenia pod kątem żuchwy. Upewnij się, że rozwarstwienie odbywa się wzdłuż powierzchni kości, aby uchwycić całą grubość żwacza.
- Rozetnij do przodu wzdłuż żuchwy, przecinając punkt przyczepu ścięgna. Następnie wypreparuj wzdłuż łuku jarzmowego z tyłu (Ryc. 1D). Na koniec przeprowadź sekcję tylnego przyczepu, ponieważ istnieje zwiększone ryzyko krwawienia.
- Wycięty żwacz opłukać w 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT) i usunąć nadmiar wilgoci, dokładnie osuszając próbkę ręcznikiem papierowym.
- Umieść mięsień w kriomold i zanurz go w pożywce do osadzania w optymalnej temperaturze cięcia (OCT), z przednim końcem skierowanym w dół, a tylnym końcem skierowanym do góry.
- Dodaj izopentan do metalowego kubka i schłodź go, zanurzając go w ciekłym azocie, uważając, aby zapobiec przedostawaniu się ciekłego azotu.
- Gdy izopentan osiągnie optymalną temperaturę (od -140 do -149 °C) i lekko zagęści, należy przytrzymać kriomodan zawierający OCT i żwacz częściowo zanurzony w izopentanie, aż OCT zamarznie. Zamrożony kriom należy przechowywać na suchym lodzie do momentu przeniesienia do zamrażarki w temperaturze -80 °C.
- Kriosekcja zamrożonych próbek żwaczy w orientacji takiej, że przedni biegun jest najpierw przecięty, przesuwając się do tyłu przez próbkę. Ustaw temperaturę bloku tkankowego na -20 °C, a temperaturę ostrza kriosekcji na -15 °C. Na każde 200 μm należy wyciąć 4 szkiełka podstawowe (2 z sekcjami 10 μm, 2 z sekcjami 6 μm), a następnie przesunąć się o 200 μm dalej, wycinając 4 dodatkowe szkiełka i powtarzając w całej próbce.
- Użyj skrawków 10 μm do analizy histologicznej (trichrom Massona, hematoksylina i eozyna, czerwień Picrosiriusa itp.), a skrawki 6 μm do immunohistochemii.
UWAGA: Do badań histologicznych można również stosować skrawki 6 μm. - Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej.
- Zmierz pola przekroju poprzecznego ~200 włókien mięśniowych mięśnia żwacza za pomocą oprogramowania Image J.
3. Analiza immunohistochemiczna
- Do analizy immunohistochemicznej embrionalnego łańcucha ciężkiego miozyny należy utrwalić szkiełka w 4% PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Umyj szkiełka w PBS 3 razy w temperaturze pokojowej, pozostawiając każde pranie na 10 minut.
- Przepuszczalność tkanek poprzez inkubację szkiełek z 0,5% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
- Umyj szkiełka w PBS 3 razy w temperaturze pokojowej, pozostawiając każde pranie na 10 minut.
- Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem monoklonalnym od myszy gospodarza (1:200) w 2% normalnej surowicy koziej (NGS) w temperaturze 4 °C przez noc.
- Umyj szkiełka w PBS-Tween 3 razy w temperaturze pokojowej, pozostawiając każde pranie na 10 minut.
- Inkubować z wtórnym przeciwciałem anty-mysim znakowanym fluoroforem od gospodarza królika (1:500) w 2% NGS w RT przez 2 godziny.
- Umyj szkiełka w PBS-Tween 3 razy w temperaturze pokojowej, pozostawiając każde pranie na 10 minut.
- Zamontuj szkiełka za pomocą 3 kropli uchwytu fluorescencyjnego DAPI przed założeniem szkiełka nakrywkowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki oceny utraty masy kostnej (VML) w obrębie czaszkomożnej oraz regeneracji tkanek z wykorzystaniem biomateriałów obejmują zarówno dane ilościowe, jak i jakościowe.
Rysunek 2 przedstawia przykład oceny jakościowej z wykorzystaniem wcześniej opisanego modelu. Obserwacja wzrostu włókien mięśniowych de novo w obrębie naszego hydrożelu jest jakościowym wynikiem pozytywnym (Rysunek 2A) i sugeruje, że biomateriał może zapewnić ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W protokole znajduje się kilka krytycznych etapów, na które należy zwrócić szczególną uwagę, aby osiągnąć optymalny wynik. Krok 1.4 opisuje początkowe nacięcie i oddzielenie skóry od powierzchownej powięzi żwaczy. rozwarstwienie powinno być wykonane bezpośrednio wzdłuż skóry nożyczkami skierowanymi od leżącego poniżej mięśnia i powięzi, aby zapobiec nacięciom i niezamierzonemu tworzeniu okna przez powięź. Należy unikać ogonowego aspektu powierzchownego żwacza, aby zapobiec niezamierzonemu uszkodzeniu żyły podżuchwowej lu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Te badania są wspierane przez UCSF Yearlong Research Fellowship Program oraz C-Doctor Interdisciplinary Translational Project Program. Podziękowania dla członków Pomerantz Lab i Craniofacial Biology Program na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco za ich wkład.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| F1.652 Przeciwciało monoklonalne o ciężkim łańcuchu miozyny (embrionalne) | DSHB | F1.652 | |
| Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG2b z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21242 | |
| Kozia anty-królicza IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Standardowe stemple do biopsji Integra, jednorazowy standardowy dziurkacz do biopsji; 5 mm, Średnica: 0,19 cala, 0,5 cm | Integra | 12460411 | |
| Medium montażowe z DAPI - Wodne, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | |
| Królik Przeciw Myszom IgG H& L (Alexa Fluor 647) wstępnie zaadsorbowany | Abcam | ab150127 | |
| Sulfametoksazol/trimetoprim zawiesina doustna, o smaku wiśniowym, 473 ml | Med-Vet International | SKU: RXBAC-SUSP |
Bibliografia
- Gilbert-Honick, J., Grayson, W. Vascularized and innervated skeletal muscle tissue engineering. Adv Healthc Mater. 9 (1), 1900626(2020).
- Aguilar, C. A., et al. Multiscale analysis of a regenerative therapy for treatment of volumetric muscle loss injury. Cell Death Discov. 4, 33(2018).
- Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
- Kiran, S., Dwivedi, P., Kumar, V., Price, R., Singh, U. Immunomodulation and biomaterials: Key players to repair volumetric muscle loss. Cells. 10 (8), 2016(2021).
- Greising, S. M., Corona, B. T., McGann, C., Frankum, J. K., Warren, G. L. Therapeutic approaches for volumetric muscle loss injury: A systematic review and meta-analysis. Tissue Eng Part B: Rev. 25 (6), 510-525 (2019).
- Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. N Engl J Med. 347 (24), 1924-1931 (2002).
- Testa, S., et al. The War after war: Volumetric muscle loss incidence, implication, current therapies and emerging reconstructive strategies, a comprehensive review. Biomedicines. 9 (5), 564(2021).
- Emara, A., Shah, R. Recent update on craniofacial tissue engineering. J Tissue Eng. 12, 204173142110037(2021).
- Dado, D. V., Kernahan, D. A. Anatomy of the orbicularis oris muscle in incomplete unilateral cleft lip based on histological examination. Ann Plast Surg. 15 (2), 90-98 (1985).
- Stål, P., Eriksson, P. O., Eriksson, A., Thornell, L. E. Enzyme-histochemical and morphological characteristics of muscle fibre types in the human buccinator and orbicularis oris. Arch Oral Biol. 35 (6), 449-458 (1990).
- Raposio, E., Bado, M., Verrina, G., Santi, P. Mitochondrial activity of orbicularis oris muscle in unilateral cleft lip patients. Plast Reconstr Surg. 102 (4), 968-971 (1998).
- Cheng, X., Shi, B., Li, J. Distinct embryonic origin and injury response of resident stem cells in craniofacial muscles. Front Physiol. 12, 690248(2021).
- Carvajal Monroy, P. L., et al. A rat model for muscle regeneration in the soft palate. PLoS One. 8 (3), e59193(2013).
- Ono, Y., Boldrin, L., Knopp, P., Morgan, J. E., Zammit, P. S. Muscle satellite cells are a functionally heterogeneous population in both somite-derived and branchiomeric muscles. Dev Biol. 337 (1), 29-41 (2010).
- Pavlath, G. K., Thaloor, D., Rando, T. A., Cheong, M., English, A. W., Zheng, B. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Dev Dyn. 212 (4), 495-508 (1998).
- Rodriguez, B. L., Vega-Soto, E. E., Kennedy, C. S., Nguyen, M. H., Cederna, P. S., Larkin, L. M. A tissue engineering approach for repairing craniofacial volumetric muscle loss in a sheep following a 2, 4, and 6-month recovery. PLoS One. 15 (9), e0239152(2020).
- Kim, H., et al. Real-time functional assay of volumetric muscle loss injured mouse masseter muscles via nanomembrane electronics. Adv Sci. 8 (17), e2101037(2021).
- Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet Muscle. 5, 22(2015).
- Agarwal, M., et al. Myosin heavy chain-embryonic regulates skeletal muscle differentiation during mammalian development. Development. 147 (7), (2020).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), e51586(2014).
- Kim, J. H., et al. Neural cell integration into 3D bioprinted skeletal muscle constructs accelerates restoration of muscle function. Nat Commun. 11 (1), 1025(2020).
- Anderson, S. E., et al. Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps. Tissue Eng Part C Methods. 25 (2), 59-70 (2019).
- Kim, J. T., Kasukonis, B. M., Brown, L. A., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Recovery from volumetric muscle loss injury: A comparison between young and aged rats. Exp Gerontol. 83, 37-46 (2016).
- Guédat, C., Stergiopulos, O., Kiliaridis, S., Antonarakis, G. S. Association of masseter muscles thickness and facial morphology with facial expressions in children. Clin Exp Dent Res. 7 (5), 877-883 (2021).
- VanSwearingen, J. M., Cohn, J. F., Bajaj-Luthra, A. Specific impairment of smiling increases the severity of depressive symptoms in patients with facial neuromuscular disorders. Aesthetic Plast Surg. 23 (6), 416-423 (1999).
- Versnel, S. L., Duivenvoorden, H. J., Passchier, J., Mathijssen, I. M. J. Satisfaction with facial appearance and its determinants in adults with severe congenital facial disfigurement: A case-referent study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63 (10), 1642-1649 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
