Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66451

⸱

22 marca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Chapman University School of Pharmacy

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawiony w tym badaniu ilustruje skuteczność detektora różnic cAMP In Situ w pomiarze cAMP za pomocą dwóch metod. Jedna z metod wykorzystuje 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek z ogniwami HEK-293. Druga metoda polega na demonstracji pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Streszczenie

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) to nowatorski biosensor, który pozwala na ciągły pomiar poziomów cAMP w żywych komórkach. Bioczujnik jest tworzony z cyrkularnie permutowanego białka fluorescencyjnego połączonego z obszarem zawiasowym Epac2. W ten sposób powstaje pojedynczy bioczujnik fluoroforowy, który wykazuje zwiększoną lub zmniejszoną fluorescencję po związaniu cAMP. Biosensor występuje w wersjach czerwonej i zielonej skierowanej w górę, a także w wersji zielonej skierowanej w dół oraz w kilku wersjach czerwonych i zielonych ukierunkowanych na lokalizacje subkomórkowe. Aby zilustrować skuteczność biosensora, wykorzystano zieloną wersję skierowaną w dół, która zmniejsza fluorescencję po związaniu cAMP. Zademonstrowano dwa protokoły wykorzystujące ten czujnik: jeden wykorzystujący 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek kompatybilny z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi, a drugi wykorzystujący obrazowanie pojedynczych komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym. Na czytniku płytek komórki HEK-293 hodowane na płytkach 96-dołkowych stymulowano 10 μM forskoliną lub izoproterenolem 10 nM, co wywołało szybkie i duże spadki fluorescencji w wersji zielonej skierowanej w dół. Bioczujnik wykorzystano do pomiaru poziomu cAMP w pojedynczych komórkach mięśni gładkich ludzkich dróg oddechowych (HASM) monitorowanych pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zielony bioczujnik skierowany w dół wykazywał podobne reakcje na populacje komórek, gdy był stymulowany forskoliną lub izoproterenolem. Ten test jednokomórkowy umożliwia wizualizację lokalizacji biosensora przy 20-krotnym i 40-krotnym powiększeniu. Dzięki temu ten bioczujnik cAMP jest czuły i elastyczny, umożliwiając pomiar cAMP w czasie rzeczywistym zarówno w komórkach unieśmiertelnionych, jak i pierwotnych, a także w pojedynczych komórkach lub populacjach komórek. Te cechy sprawiają, że cADD jest cennym narzędziem do badania dynamiki sygnalizacji cAMP w żywych komórkach.

Wprowadzenie

Adenozyno-3′,5′-cykliczny monofosforan, cAMP, odgrywa kluczową rolę w komunikacji komórkowej i koordynacji różnych procesów fizjologicznych. cAMP działa jako drugi przekaźnik, przekazując zewnętrzne sygnały z hormonów, neuroprzekaźników lub innych cząsteczek zewnątrzkomórkowych, aby zainicjować kaskadę zdarzeń wewnątrzkomórkowych1. Co więcej, cAMP jest misternie zaangażowany w różne szlaki sygnałowe, w tym te związane z receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCR) i cyklazami adenylowymi. Zrozumienie roli cAMP w sygnalizacji komórkowej ma fundamentalne znaczenie dla rozwikłania złożonych mechanizmów, które leżą u podstaw normalnych funkcji komórkowych i opracowania potencjalnych terapii dla szerokiego zakresu schorzeń2.

W przeszłości stosowano różne metody bezpośredniego lub pośredniego pomiaru cAMP. Obejmowały one znakowanie radioaktywne komórkowych pul ATP, a następnie oczyszczanie kolumny, HPLC, testy radioimmunologiczne i testy immunologiczne sprzężone z enzymami1,2. Te starsze testy są ograniczone przez fakt, że są to pomiary punktu końcowego, wymagające dużej liczby próbek do skonstruowania odpowiedzi zależnych od czasu. Niedawno opracowano czujniki rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do tworzenia testów w żywych komórkach, generując dynamiczne dane w czasie rzeczywistym i umożliwiając celowanie czujników w różne lokalizacje subkomórkowe3. FRET wykorzystuje dwa fluorofory, jeden donor fluorescencyjny i jeden akceptor fluorescencyjny, które w bliskiej odległości fluorofory akceptorowe zostaną wzbudzone przez moc fluorescencyjną donora. Dwa najczęściej stosowane fluorofory to białko cyjanowej fluorescencji (CFP) i żółte białko fluorescencyjne (YFP), ponieważ mają one kompatybilne właściwości wzbudzenia i emisji. Oprócz CFP i YFP, wykorzystanie białka zielonej fluorescencji (GFP) i białka czerwonej fluorescencji (RFP) jest powszechnie stosowane w bioczujnikach FRET. Bioczujniki cAMP FRET działają dzięki temu, że donor i akceptor znajdują się na przeciwległych końcach białka wiążącego Epac2 cAMP. Wiązanie cAMP zmienia potwierdzenie Epac i zwiększa odległość między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi3,4. Ta zmiana konformacyjna jest wykrywana przez utratę FRET, czyli wzbudzenie fluoroforu akceptorowego przez energię przekazaną z kropli fluoroforu donorowego3. Chociaż wydaje się to prostym procesem, istnieje wiele ograniczeń i problemów związanych z biosensorem FRET do badań cAMP5. Jednym z nich jest selekcja białek fluorescencyjnych, na przykład GFP, które mogą dimeryzować w sposób naturalny, zmniejszając w ten sposób czułość6. Biosensory cAMP oparte na FRET zostały ukierunkowane na określone mikrodomeny7, ale mogą istnieć ograniczenia ze względu na duży rozmiar konstrukcji z dwoma fluoroforami6. Innym istotnym problemem jest niski stosunek sygnału do szumu sygnałów FRET wynikający z nakładania się wzbudzenia i emisji fluoroforu, co skutkuje wysoką częstotliwością próbkowania i komplikuje analizę wyników4,5.

Ostatnio, nowatorski biosensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis rozwiązał te i inne ograniczenia, jeśli chodzi o badanie regulacji sygnalizacji cAMP8. Jedną z ważnych ulepszeń jest uzależnienie od jednego fluoroforu. Pozwala to na uzyskanie szybkiego i wydajnego sygnału o szerszym zakresie dynamiki i wysokim stosunku sygnału do szumu. W rezultacie może być większa dokładność, ponieważ istnieje mniej szeroki zakres długości fal do przeczesania8. Podobnie jak sondy FRET, biosensor został ukierunkowany na lokalizacje subkomórkowe, co umożliwiło badania nad teorią kompartmentacji i eksploracją tratw lipidowych i nie-tratw oraz innych domen subkomórkowych9. Być może najważniejsza jest przydatność pojedynczego biosensora fluoroforowego do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, które poprawiły czułość i odtwarzalność w porównaniu z biosensorami opartymi na FRET. Biosensor jest umieszczony w wektorze BacMam w celu łatwej transdukcji szerokiej gamy typów komórek i precyzyjnej kontroli ekspresji białek.

Kontrola wyrażeń za pomocą wektora BacMam może być szczególnie przydatna w testach z użyciem ortologów GPCR różnych gatunków, aby ułatwić interpretację danych z badań na zwierzętach. Co więcej, kontrola ekspresji receptora ma kluczowe znaczenie dla pomiaru różnych stopni skuteczności leku (np. odwrotnych agonistów i częściowych agonistów), a niskie poziomy ekspresji receptora są przydatne do naśladowania niskich poziomów występujących w tkance zwierzęcej. BacMam to wektor bakulowirusa, który został zmodyfikowany w celu transdukcji komórek ssaków, takich jak pierwotne hodowle komórkowe i linie HEK-29310. Dominujące markery selekcyjne pozwalają BacMam zapewnić większą stabilność w porównaniu z tradycyjnymi infekcjami plazmidowymi11. Takie selektywne promotory pozwalają na bardziej efektywne dostarczanie i ekspresję genów. Ponadto dodanie trichostatyny A (inhibitora deacetylazy histonowej) zwiększa poziom białka reporterowego11. Poziomy ekspresji mogą być kontrolowane za pomocą miana używanego wirusa BacMam i powinny być zoptymalizowane dla każdego typu komórek. W przypadku tego biosensora czerwone lub zielone białko fluorescencyjne jest połączone z Epac na końcach N i C. Kiedy cAMP się wiąże, zmiana konformacyjna w biosensorze przesuwa aminokwasy sąsiadujące z białkiem fluorescencyjnym. Takie przesunięcie przesuwa absorbancję ze stanu anionowego do stanu obojętnego przy 400 nm, zmniejszając w ten sposób fluorescencję.

W pojedynczej komórce występuje 90-120 GPCR, które reagują na różnorodne sygnały neurohumoralne12. Dlatego można postawić hipotezę, że co najmniej kilkadziesiąt GPCR na komórkę może stymulować lub hamować cAMP odpowiednio poprzez sprzężenie Gs lub Gi. Chociaż poczyniono postępy w monitorowaniu tego drugiego komunikatora w czasie rzeczywistym, takiego jak FRET, potrzebne są bardziej wydajne metody. Przedstawiono metodologię monitorowania syntezy i degradacji sygnałów cAMP za pomocą cADDis w czasie rzeczywistym. Zmiana fluorescencji może być monitorowana w czasie rzeczywistym za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych do testów o wysokiej przepustowości lub za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego do testów jednokomórkowych. Metody te są przydatne w szerokim zakresie pytań biologicznych dotyczących sygnalizacji GPCR za pośrednictwem cAMP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Szczegóły dotyczące wszystkich odczynników i sprzętu użytego do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Test wysokoprzepustowy spektrofotometru do odczytu płytek

  1. Wysiewanie komórek HEK-293 wektorem cADDis BacMam w 96-dołkowej płytce (dzień 1)
    1. Podziel i zainfekuj komórki w wirusowym kapturze.
      1. Ciepłe podłoże HEK (Tabela 1) i 0,25% trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      2. Zdezynfekuj kaptur i materiały, przecierając je chusteczkami nasączonymi EtOH.
      3. Usunąć i wyrzucić pożywkę HEK z kolby za pomocą pipety serologicznej.
      4. Dodać 5 ml DPBS wolnego od Mg2+ i Ca2+ (37 °C) za pomocą pipety serologicznej. Przechylić kolbę do przodu i do tyłu, aby umyć dno DPBS. Usunąć i wyrzucić DPBS za pomocą pipety serologicznej.
      5. Trypsynizuj komórki, dodając 3 ml podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA za pomocą pipety serologicznej. Przechylić kolbę tak, aby odczynnik całkowicie pokrył dno kolby. Przykryć kolbę pokrywką i pozostawić odczynnik na 3-5 minut, aby komórki mogły oderwać się od kolby.
        UWAGA: Ten eksperyment jest zoptymalizowany dla kolby o średnicy75 cm2; Może być konieczne dostosowanie objętości odczynników, jeśli używany jest aparat do hodowli o różnych rozmiarach.
      6. Pobrać 5 ml świeżej pożywki zawierającej antybiotyki. Wydalić i pobrać objętość kolby, aby umyć ścianki kolby i fizycznie odłączyć komórki.
      7. Zebrać całkowitą objętość kolby (8 ml) i odwirować (25 °C) w probówce o pojemności 15 ml o sile 200 x g przez 5 minut.
      8. Po odwirowaniu usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej, uważając, aby nie naruszyć osadu.
      9. Aby umyć komórki bez naruszania osadu, dodaj 500 μl DPBS bez Mg2+ i Ca2+ DPBS z boku probówki 15 ml. Po delikatnym dodaniu DPBS należy usunąć i wyrzucić jak najwięcej buforu, nie naruszając osadu. Powtórz jeszcze raz.
      10. Policz komórki i dostosuj do gęstości komórek 250 000 komórek/ml komórek.
      11. Przygotuj mieszankę wzorcową w oparciu o to, jakie objętości odczynników są potrzebne na studzienkę czarnej, przezroczystej dolnej 96-dołkowej płytki. Nazywa się to "płytką tkankową". Patrz tomy poniżej:
        UWAGA: Przykład 1 dołka (całkowita objętość 200 μL): 40 μL wektora biosensora BacMam (zapas 2 x 1010 genów wirusowych / ml), 2 μL trichostatyny A (zapas 100 μM; stężenie końcowe 1 μM), 158 μL 250 000 komórek/ml gęstości komórek. Przykład 10 studzienek (całkowita objętość 2 ml): 400 μl wektora biosensora BacMam (zapas 2 x 1010 genów wirusowych / ml), 20 μl trichostatyny A (zapas 100 μM), 1 580 μl pożywki o gęstości komórek 250 000 / ml.
      12. Dodać 200 μl mieszanki wzorcowej do dołka. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze przez 24 godziny, a następnie uruchomić na spektrofotometrze do odczytu płytki.
  2. Uruchamianie na czytniku płytek
    1. Na blacie ostrożnie usuń wszystkie podłoża z każdej studzienki i zastąp je 180 μl DPBS z Mg2+ i Ca2+ w temperaturze 37 °C.
    2. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić ich zdrowie.
    3. Owinąć płytkę w folię aluminiową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min-1 h.
    4. Podczas inkubacji należy przygotować leki do odczytu w rozcieńczeniu 1:10 (zwanym również 10-krotnym) w celu uzyskania pożądanej dawki końcowej. W ten sposób przygotuj 100 μM forskoliny i 100 nM izoproterenolu.
    5. Dodać 60 μl każdego leku w sposób kolumnowy do przezroczystej 96-dołkowej płytki (zwanej "płytką leku").
      UWAGA: Przy odpowiednim rozcieńczeniu leku i w celu optymalizacji odczytu, leki dodaje się do przezroczystej 96-dołkowej płytki, zwanej "płytką leku", która w momencie odczytu jest przenoszona na "płytkę tkankową" za pomocą 96-wielokrotnego pipetatora, co pozwala na dodanie leku do wszystkich studzienek jednocześnie i szybki odczyt przez spektrofotometr fluorescencyjny.
  3. Konfiguracja czytnika płytek fluorescencyjnych
    1. Dostosuj ustawienia czytnika płytek fluorescencyjnych.
      1. Tryb odczytu: fluorescencja. Typ odczytu: kinetyczny. Odczyt długości fal: 494 nm i 522 nm.
      2. Czas czytania: Wprowadź 3 minuty dla podstawowego odczytu fluorescencyjnego i 7 minut dla dodania po dodaniu leku."Interwał" jest wprowadzany jako 00:00:30 przez 30 s między każdym odczytem.
        UWAGA: Czas czytania można zoptymalizować i wydłużyć w zależności od wymaganego czasu.
  4. Akwizycja danych
    1. Wyjąć płytkę tkankową z inkubatora, zdjąć folię aluminiową i pokrywkę płytki, a następnie umieścić płytkę z bibułką w czytniku płytek. Zamknąć szufladę czytnika, aby płytka tkankowa spocząła i zrównoważyła się z temperaturą czytnika (37 °C).
    2. Umieść przezroczystą 96-dołkową płytkę (płytkę leku) z rozcieńczonymi lekami pod 96-wielokrotną pipetą i ćwicz pobieranie 20 μl z dołków. Upewnij się, że w końcówkach pipetora znajduje się równomierna objętość leku.
    3. Zainicjuj "bazowy" przebieg pomiaru.
      UWAGA: 40 RFU lub więcej jest uważane za realne dane. Jeśli dane są poniżej tej wartości, eksperyment należy przerwać i odrzucić.
    4. Płytka tkankowa zostanie wyrzucona z czytnika pod koniec przebiegu linii bazowej. Szybko i ostrożnie dodać 20 μl z przezroczystej płytki leku do czarnej płytki tkankowej. Następnie szybko rozpocznij przebieg "leczenia". Płytka z tkanką nie powinna znajdować się poza czytnikiem przez więcej niż 30 sekund po dodaniu leków.
      UWAGA: Jeśli lek zostanie dodany zbyt szybko, komórki odrywają się od płytki tkankowej, tworząc bezużyteczny eksperyment. Ponadto komórki są zakażone światłoczułym zielonym białkiem fluorescencyjnym; W związku z tym, szybkie i natychmiastowe dodanie leków i rozpoczęcie drugiego czytania jest konieczne, aby uniknąć pominięcia wczesnej części odpowiedzi.
    5. Po zakończeniu drugiego odczytu upewnij się, że płytka tkankowa została wyrzucona z czytnika i zbieranie danych zostało zakończone.
      UWAGA: Przed wyrzuceniem płytki tkankowej najlepszą praktyką jest sprawdzenie, czy komórki są nadal przymocowane do płytki. Obserwuj komórki pod mikroskopem. Jeśli komórki zostaną odłączone, wyniki są nieważne i należy je odrzucić. Eksperyment będzie musiał zostać powtórzony.
    6. Wyeksportuj wynikowe dane jako plik Excel.
    7. Otwórz wyeksportowane dane czytelne dla programu Excel z czytnika płytek, a następnie skopiuj i wklej odpowiednie informacje do szablonu konwersji programu Excel. Dane zostaną przekształcone z czytnika płytek ustawionych na pojedynczą studzienkę, odczyty kolumn po prawej stronie skopiowanych danych.
      UWAGA: Kolumny fluorescencji dla dobrze rozłożonego w czasie są wymienione w RFU (zatytułowane przekształcenie kolumny) i jako zmiana dziesiętna w stosunku do odczytu RFU przy początkowym odczycie (t0 zatytułowane Delta F). W szablonie programu Excel tabela Delta F jest ustawiana na ostatni odczyt linii bazowej przed dodaniem leku. Jest to 6punkt zbierania danych.
    8. Po przekształceniu danych skopiuj dane z Delta F i wklej je do oprogramowania do analizy danych jako rozpad lub względny zanik fluorescencji w czasie.
    9. Zmień tytuł X na "czas (s)" i tytuł Y na "ΔF/F0" dla względnych wartości dziesiętnych.

2. Test jednokomórkowy przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego

  1. Wysiewanie komórek (HASM) wektorem cADDis BacMam w szalce 35 mm (Dzień 1)
    1. Podziel i zainfekuj komórki w wirusowym kapturze.
      1. Ciepłe podłoże HASM (Tabela 1), 0,25% trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      2. Zdezynfekuj kaptur i materiały, a następnie przetrzyj kaptur chusteczkami nasączonymi EtOH.
      3. Wyjąć i wyrzucić pożywkę HASM z kolby za pomocą pipety serologicznej.
      4. Dodać 5 ml DPBS wolnego od Mg2+ i Ca2+ (37 °C) za pomocą nowej pipety serologicznej i przechylić kolbę w celu przemycia dna DPBS.
      5. Trypsynizuj komórki, dodając 3 ml podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA za pomocą pipety serologicznej. Przechylić kolbę tak, aby odczynnik całkowicie pokrył dno kolby. Pozostawić odczynnik na 3-5 minut, aby umożliwić odłączenie komórek od kolby.
      6. Pobrać 5 ml świeżej pożywki zawierającej antybiotyki i usunąć pipetę, aby usunąć komórki z dna kolby.
      7. Zebrać całkowitą objętość wirówki z kolby (8 ml) w probówce wirówkowej o sile 200 x g przez 5 minut.
      8. Po odwirowaniu usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej, uważając, aby nie naruszyć osadu.
      9. Nie naruszając osadu, dodać 500 μL DPBS bez Mg2+ i Ca2+ DPBS z boku probówki wirówkowej. Usuń i wylej jak najwięcej płynu i powtórz jeszcze raz.
        UWAGA: Ten eksperyment jest zoptymalizowany dla kolby o średnicy75 cm2; Może być konieczne dostosowanie objętości odczynników, jeśli używany jest aparat do hodowli o różnych rozmiarach.
      10. Policz komórki i dostosuj do gęstości komórek 40 000 komórek/ml.
      11. Przygotować mieszankę wzorcową w oparciu o objętość odczynnika potrzebną na studzienkę naczynia o średnicy 35 mm. Zobacz tomy poniżej:
        UWAGA: Przykład 1 dołka (całkowita objętość 500 μL): 20 μL wektora biosensora BacMam (zapas 2 x 1010 genów wirusowych / ml), 5 μL trichostatyny A (zapas 100 μM, stężenie końcowe 1 μM), 500 μL 40 000 komórek/ml gęstości komórek. Przykład dla 4 studzienek (całkowita objętość 2 ml): 80 μL wektora biosensora BacMam (zapas genów wirusa / ml), 20 μl trichostatyny A (zapas 100 μM, stężenie końcowe 1 μM), 2000 μl podłoża 40 000 komórek/ml gęstości komórek.
      12. Dodać 500 μl mieszanki wzorcowej do dołka. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny przed kontynuowaniem doświadczenia.
        UWAGA: Numer komórki może się różnić w zależności od linii komórkowej. Aby uniknąć nakładania się komórek na potrzeby analizy, należy używać małych liczb komórek.
  2. Przygotowanie środków farmakologicznych (Dzień 2)
    1. Ostrożnie usunąć pożywkę z każdej studzienki i zastąpić 450 μl DPBS z Mg2+ i Ca2+ w temperaturze 37 °C.
    2. Owinąć płytkę w folię aluminiową i inkubować krążek o średnicy 35 mm w temperaturze 37 °C przez 30 min-1 h.
    3. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić ich zdrowie.
    4. W międzyczasie przygotuj leki do odczytu 1 jednostki logarytmicznej powyżej pożądanego stężenia końcowego (10-krotnie większego). W ten sposób przygotuj 100 μM forskoliny i 100 nM izoproterenolu.
    5. W przypadku mian logarytmicznych dawek należy przygotować lek w stężeniu 10 mM i stosować seryjne rozcieńczenia, aby osiągnąć 100 μM forskoliny i 100 nM izoproterenolu.
  3. Akwizycja danych
    UWAGA: Poniższe ustawienia dotyczą fluorescencyjnego mikroskopu odwróconego. Oprogramowanie dołączone do każdego mikroskopu może się różnić; Ogólne ustawienia używane w bieżącym protokole są opisane tutaj.
    1. Włącz centralną piastę, a następnie odwrócony mikroskop fluorescencyjny.
    2. Otwórz oprogramowanie, które będzie używane do przechwytywania i wybierz opcję przechwytywania poklatkowego.
    3. Umieścić uchwyt na próbkę naczynia o średnicy 35 mm w stoliku mikroskopu.
    4. Ustaw soczewkę obiektywu na x20.
    5. Użyj autofokusa i uzyskaj tak wyraźny obraz, jak to tylko możliwe. Jeśli trudno jest znaleźć pojedyncze komórki, zacznij od obiektywu 4x, a następnie przejdź do 20x. Ustaw ostrość próbki ręcznie, jeśli mikroskop nie ma funkcji autofokusa.
      UWAGA: Powiększenie 40x może być użyte, jeśli potrzebne są bardziej znaczące szczegóły morfologiczne komórki.
    6. Dostosuj następujące ustawienia, aby uzyskać optymalne pozyskiwanie danych: Automatyczna jasność (ekspozycja), Długość fali wzbudzenia, Balans czerni (w celu redukcji szumów tła), Automatyczne ustawianie ostrości.
    7. Po znalezieniu obszaru widzenia z kilkoma cytoplazmatycznymi komórkami fluorescencyjnymi, uzyskaj dane za pomocą przechwytywania poklatkowego przez 20 minut co 30 s.
    8. Kliknij dalej, aby rozpocząć czytanie.
    9. Biegaj przez 3 minuty, aby zebrać punkt odniesienia. Jak tylko 3-minutowe wychwytywanie zostanie wykonane, delikatnie dodaj 50 μl leku do odpowiedniego dołka. Po dodaniu leków końcowe stężenie na talerzu wyniesie 10 μM forskoliny i 10 nM izoproterenolu.
      UWAGA: Lek należy dodawać ostrożnie; Nie dotykaj płytki końcówką pipety, ponieważ może to przesunąć utworzone pole widzenia i uniemożliwić analizę próbki.
    10. Pozostaw eksperyment na kolejne 17 minut z przechwytywaniem danych co 30 sekund.
    11. Po zakończeniu testu upewnij się, że dane są gotowe do analizy.
      UWAGA: Chociaż obecny protokół nie obejmuje kontroli dryfu ogniskowej, korzystne może być włączenie jej do eksperymentu. Na przykład zastosowanie barwników jądrowych może pomóc w kontrolowaniu dryfu ogniskowej podczas analizy mikroskopowej, zwłaszcza podczas przechwytywania obrazów żywych komórek przez dłuższy czas. Biosensory cADDis są zazwyczaj szeroko rozmieszczone w komórce, co sprawia, że szeroka płaszczyzna ogniskowa jest najbardziej efektywnym przechwytywaniem i zmniejsza potrzebę kontrolowania dryfu ogniskowego9.
  4. Analizowanie danych
    UWAGA: Oprogramowanie dołączone do każdego mikroskopu może się różnić, dlatego tutaj opisano ogólne ustawienia, których należy użyć do analizy zarejestrowanych obrazów.
    1. Otwórz pliki obrazów przechwycone podczas eksperymentu.
    2. Użyj narzędzia wielokąt lub okrąg, aby wybrać obszar zainteresowania każdej komórki w celu przeprowadzenia analizy. Analiza powinna podać jasność każdej komórki w każdym punkcie czasowym.
      UWAGA: Najlepszą praktyką jest wybieranie pojedynczych komórek, a nie komórek dotykających ścianki naczynia lub innych komórek. Zapewnia to najlepsze możliwe gromadzenie danych. Wybierz co najmniej 5 komórek do analizy w każdym warunku i powtórz eksperyment co najmniej trzy razy.
    3. Po przeanalizowaniu danych otwórz dane w arkuszu Excela i oblicz średnią jasność dla każdego stanu na każdym zdjęciu, zaczynając od zdjęcia tuż przed dodaniem środków farmakologicznych lub nośnika. W tym przykładzie po 3 minutach lub 6 zdjęciu wykonanym pod mikroskopem, ponieważ każde zdjęcie jest robione co 30 sekund.
    4. Obliczyć ΔF/F0 dla każdej wartości średniej w każdym warunku.
    5. Załadować do oprogramowania do analizy statystycznej i wykreślić ΔF/F0 w funkcji czasu w s.
      UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd głównych kroków protokołów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu zwalidowano cytozolowy biosensor zarówno w testach z użyciem czytnika płytek, jak i mikroskopu. Po ekspresji biosensora w komórkach, stymulowano je za pomocą 10 µM forskoliny (bezpośredniego aktywatora cyklazy adenylowej), 10 nM izoproterenolu (agonisty receptorów ß1AR i ß2AR) lub nośnika (Rysunek 1). Następujące zmiany fluorescencji, wskazujące na produkcję cAMP, rejestrowano co 30 s.

Dane przekształcono jako zmianę fluo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dokładny i czuły pomiar cAMP ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia jego roli w różnych procesach komórkowych oraz dla badania aktywności szlaków sygnałowych zależnych od cAMP. Istnieje kilka metod powszechnie stosowanych do pomiaru poziomów cAMP, w tym ELISA, test radioimmunologiczny, bioczujniki FRET i test cAMP GloSensor 14,15,16,17,18. Każdy test cAMP ma mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 96-dołkowa (przezroczysta)Fisherbrand21-377-203
Naczynie 35 mmGreiner Bio-One627870Szalki do hodowli komórkowych ze szklanym dnem
Płytka 96-dołkowa Corning3904z przezroczystym płaskim dnem
Antybiotyk-Antybiotyk (100x)Gibco15240062Do mediów HEK i HASM
Mikroskop fluorescencyjny BZ-XKeyence
Chlorek wapnia (IM)Quality Biological IncE506Do pożywki HASM
Probówka wirówkowa (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM ( 1x)Gibco11965092HEK media
DPBS z Mg2+ i Ca2+ Gibco14040-133
DPBS bez Mg2+ i Ca2+Corning14040-133
Surowica bydlęca płodu (FBS)R& Systemy DS11195Dla pożywek HEK i HASM
ForskolinMillipore344270Lek
Green Down cADDis cAMP Zestaw testowyMontana Molekularny#D0200Godczynnik
Ham's F-12K Gibco21127022Do pożywek HASM
HEPES (1M)Gibco15630080Do mediów HASM
IsoproterenolSigmaI6504Lek
L-glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081Do podłoża HASM
Probówka do mikrowirówek (2 ml)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antybiotyk do pożywek HASM
RNAse awayThermo Scientific700511Odczynnik
Roztwór wodorotlenku soduSigmaS2770Do mediów HASM
Czytnik płytek Spectrmax M5Urządzenia
OdczynnikTrichostatyna ATCI AmericaT2477
Trypsyna EDTAGibco25200-056
molekularne

Bibliografia

  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
  2. Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
  3. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  4. Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769(2020).
  5. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
  6. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  7. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332(2018).
  8. Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
  9. Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
  10. Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
  11. Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
  12. Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
  13. Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
  14. Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
  15. Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
  16. Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
  17. Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
  18. Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
  19. Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
  20. Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
  21. Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
  22. De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646(2022).
  23. Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
  24. Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
  25. Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
  26. Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297(2022).
  27. Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Biosensor cAMPobrazowanie żywych komórekfluorescencyjny biosensorsensor cADDisludzkie mięśnie gładkie dróg oddechowychobrazowanie pojedynczych komórekmikroskopia fluorescencyjnaprzesiewanie wysokoprzepustowe
Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.