Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stymulowana elektromiografia pojedynczych włókien (SFEMG) do oceny transmisji połączeń nerwowo-mięśniowych w modelach gryzoni

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66452

⸱

8 marca 2024

 ,  , 
1NextGen Precision Health, University of Missouri, 2Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Missouri, 3Department of Neurology, University of Missouri, 4Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu demonstrujemy wyrafinowany protokół elektromiografii pojedynczego włókna (SFEMG), który umożliwia pomiar in vivo transmisji połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) w modelach gryzoni. Opisano podejście krok po kroku do techniki SFEMG, aby umożliwić ilościowe określenie zmienności transmisji NMJ i niewydolności mięśnia brzuchatego łydki szczura.

Streszczenie

Jako końcowe połączenie między układem nerwowym a mięśniami, transmisja w połączeniu nerwowo-mięśniowym (NMJ) jest kluczowa dla prawidłowych funkcji motorycznych. Elektromiografia pojedynczych włókien (SFEMG) jest klinicznie istotną i czułą techniką, która mierzy potencjalne odpowiedzi na pojedyncze włókna mięśniowe podczas dobrowolnych skurczów lub stymulacji nerwów w celu oceny transmisji NMJ. Ocena i kwantyfikacja transmisji NMJ obejmuje dwa parametry: jitter i blokowanie. Jitter odnosi się do zmienności czasu (opóźnienia) między kolejnymi potencjałami czynnościowymi pojedynczego włókna (SFAP). Blokowanie oznacza, że transmisja NMJ nie inicjuje odpowiedzi SFAP. Chociaż SFEMG jest dobrze ugruntowanym i czułym testem w warunkach klinicznych, jego zastosowanie w badaniach przedklinicznych było stosunkowo rzadkie. W niniejszym raporcie przedstawiono kroki i kryteria stosowane w wykonywaniu stymulowanego SFEMG w celu ilościowego określenia jittera i blokowania w modelach gryzoni. Technika ta może być wykorzystana w badaniach przedklinicznych i klinicznych w celu uzyskania wglądu w funkcję NMJ w kontekście zdrowia, starzenia się i choroby.

Wprowadzenie

Elektromiografia pojedynczego włókna (SFEMG) została początkowo opracowana przez Stålberga i Ekstedta w latach 60. w celu identyfikacji i analizy potencjałów czynnościowych z poszczególnych włókien mięśniowych, głównie do badania zmęczenia mięśni1. SFEMG jest najbardziej czułą techniką kliniczną do oceny transmisji połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) 2. SFEMG jest prowadzony przez selektywne rejestrowanie potencjałów czynnościowych pojedynczego włókna (SFAPs)3. Transmisja NMJ może być zagrożona z powodu takich czynników, jak starzenie się4,5 oraz różne zaburzenia nerwowo-mięśniowe, takie jak miastenia i stwardnienie zanikowe boczne6. Ponadto stany takie jak niedokrwienie, wahania temperatury i stosowanie środków blokujących przewodnictwo nerwowo-mięśniowe mogą powodować niedobory w transmisji NMJ, objawiające się zwiększoną zmiennością transmisji NMJ i występowaniem niepowodzenia NMJ2.

Istnieją dwa podejścia do nagrywania SFEMG: stymulowane i dobrowolne SFEMG. Dobrowolna SFEMG polega na rejestrowaniu SFAP z dwóch NMJ dostarczanych przez ten sam akson motoryczny za pomocą koncentrycznej elektrody igłowej wprowadzonej do badanego mięśnia podczas dobrowolnej aktywacji7. W związku z tym, dobrowolny SFEMG wymaga współpracy ze strony podmiotu i może oceniać tylko niskoprogowe jednostki motoryczne (aktywowane podczas słabych skurczów)3. Stymulowany SFEMG wykorzystuje parę elektrod stymulujących do stymulacji aksonów motorycznych podczas rejestrowania SFAP z elektrodą igłową SFEMG włożoną do badanego mięśnia7.

Zarówno w dobrowolnym, jak i stymulowanym SFEMG, jitter i blokowanie to dwa parametry używane do oceny i ilościowego określenia transmisji NMJ8. Jitter opisuje zmienność czasu (opóźnienie) między kolejnymi SFAP. Podczas dobrowolnego SFEMG jitter jest określany ilościowo poprzez ocenę różnic opóźnień między parą SFAP (dostarczanych przez ten sam akson motoryczny) podczas 50 do 100 kolejnych wyładowań. Podczas stymulowanego SFEMG jitter jest określany ilościowo, oceniając różnice opóźnień między czasem stymulacji a początkiem SFAP podczas 50 do 100 kolejnych wyładowań. Blokowanie wskazuje na niepowodzenie transmisji NMJ w celu wyzwolenia odpowiedzi SFAP i może być określone ilościowo jako obecność lub brak każdej pary SFAP podczas dobrowolnego SFEMG lub dla każdego NMJ podczas stymulowanego SFEMG2,7.

Chociaż SFEMG jest uznanym i czułym testem w warunkach klinicznych, rzadko był stosowany w badaniach przedklinicznych4,5,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. W niniejszym raporcie przedstawiamy podejście do wykonywania i analizy nagrań SFEMG w przedklinicznych modelach gryzoni. Ponadto przedstawiamy reprezentatywne dane, które podkreślają reprezentatywne wyniki dotyczące SFEMG, które wskazują na upośledzenie transmisji NMJ po podaniu niedepolaryzującego środka blokującego nerwowo-mięśniowe, rokuronium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z przepisami ustanowionymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Uniwersytecie Missouri.

1. Przygotowanie zwierząt i podanie znieczulenia

  1. Założyć odpowiedni sprzęt ochrony osobistej.
  2. Przed rozpoczęciem procedury zmierzyć masę ciała szczura, aby określić odpowiednią dawkę leków obliczaną na podstawie masy ciała oraz ustawienia respiratora.
  3. Wprowadzić w stan anestezji przy użyciu 3%-5% izofluranu drogą inhalacyjną. Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu znieczulenia ułożyć szczura w pozycji brzusznej i podtrzymywać anestezię, stosując 1%-3% izofluranu drogą inhalacyjną.
  4. Zweryfikować głębokość anestezji, delikatnie uciskając pęciny kończyny tylnej pęsetą w celu sprawdzenia braku odruchu cofania.
  5. Utrzymywać temperaturę ciała na poziomie 37 °C.
  6. Nanieść na oczy zatwierdzoną przez lekarza weterynarii maść na bazie wazeliny, aby zapobiec ich wysuszeniu. Monitorować głębokość anestezji, obserwując częstość oddechów i oceniając występowanie odruchów cofania podczas wywierania nacisku na pęcinę za pomocą pęsety.
  7. Ogolić kończynę tylną przeznaczoną do oceny za pomocą trymera. Po skutecznym usunięciu włosów, przy użyciu taśmy klejącej, ustabilizować badaną kończynę tak, aby staw skokowy był zgięty grzbietowo pod kątem około 90°, kolano wyprostowane, a biodro w odwiedzeniu.
  8. Przez cały czas trwania eksperymentu stale monitorować oddech i częstość akcji serca szczura.
    UWAGA: Wzrost częstości akcji serca jest powszechnie stosowany jako wskaźnik niewystarczającej głębokości znieczulenia.
  9. Podać izofluran w dawce 5% lub wyższej w celu eutanazji szczura, aż do ustania oddechu na co najmniej 3 min. Potwierdzić eutanazję poprzez dekapitację.

2. Rozmieszczenie i konfiguracja elektrod

UWAGA: Przewodnictwo NMJ nerwu kulszowego i mięśnia brzuchate łydki jest oceniane przy użyciu systemu elektromiografii (EMG). Należy zapoznać się z Tabelą materiałów.

  1. Wprowadź parę izolowanych jednobiegunowych igieł 28 G do stymulacji nerwu kulszowego, umieszczając katodę w obszarze bliższym kończyny tylnej, natomiast anodę bardziej proksymalnie w tkance podskórnej nad kością krzyżową.
  2. Upewnij się, że elektrody stymulujące nie są umieszczone w bezpośrednim sąsiedztwie nerwu kulszowego ani zbyt głęboko, aby uniknąć bezpośredniego uszkodzenia nerwu kulszowego lub innych przyległych struktur.
  3. Umieść jednorazową elektrodę uziemiającą na przeciwległej kończynie tylnej lub ogonie.
  4. Ostrożnie wprowadź elektrodę igłową o rozmiarze 27 G i długości 25 mm, przeznaczoną specjalnie do SFEMG, z powierzchnią rejestrującą wykonaną z materiału platyno-irydowego, do prawego mięśnia brzuchatego łydki. Przed każdym użyciem upewnij się, że elektrody SFEMG zostały poddane autoklawowaniu w celu zachowania sterylności.
  5. Wprowadź igłową elektrodę SFEMG równolegle do włókien mięśnia brzuchatego łydki, aby zarejestrować potencjały czynnościowe pojedynczych włókien (SFAPs).
  6. Unikaj uszkodzenia mięśnia podczas wprowadzania i manewrowania igłą SFEMG w obrębie mięśnia.

3. Procedura stymulowanej elektromiografii pojedynczego włókna (SFEMG)

  1. Zastosuj stymulację prądem stałym prawego nerwu kulszowego z częstotliwością 10 Hz, przy zakresie natężenia od 0,3-10 mA i czasie trwania impulsu 0,1 ms.
  2. Skonfiguruj ustawienia filtrów, stosując filtr niskich częstotliwości 1 kHz oraz filtr wysokich częstotliwości 10 kHz. Dostosuj wzmocnienie (Gain) od 200 µV do 1000 µV na dywizję, aby ułatwić wizualizację potencjałów. Ustaw prędkość przesuwu na 500 µs na dywizję.
  3. Dostosuj natężenie bodźca, aby wywołać i wyizolować SFAP do zapisu i późniejszej analizy.
    1. Aby zidentyfikować i przeanalizować odpowiedź jako SFAP, upewnij się, że spełnione są następujące kryteria: czas narastania od szczytu linii bazowej do fazy ujemnej musi być krótszy niż 500 µs, minimalna amplituda (od szczytu linii bazowej do fazy ujemnej) musi wynosić co najmniej 200 µV, a odpowiedź musi konsekwentnie wykazywać charakterystykę „wszystko albo nic” (stabilna wielkość i kształt między odpowiedziami).
      UWAGA: Niezbędne jest, aby powtarzające się odpowiedzi wykazywały spójne fazy wzrostowe bez żadnych wcięć lub punktów przegięcia. Należy pamiętać, że ostatnie kryterium jest kluczowe dla odróżnienia sygnału wysokiej jakości od sumowania wielu sygnałów.
  4. Oblicz jitter, czyli zmienność latencji SFAP (czas między stymulacją a fazą narastającą ujemnego szczytu SFAP) pomiędzy kolejnymi wyładowaniami, po co najmniej 50 stymulacjach (50-100 stymulacji), a następnie oceń i ilościowo określ blokowanie.
    UWAGA: Blokowanie można oceniać jako obecność lub brak w każdej synapsie lub jako procent stymulacji, które nie wywołały generowania potencjału czynnościowego pojedynczego włókna. Jitter oblicza się za pomocą następującego równania7 (jitter jest zazwyczaj automatycznie obliczany przez kliniczne systemy elektromiograficzne):
    Schemat formuły MCD Jitter; oblicza różnice międzyinterwałowe dla analizy sygnału.
    MCD = średnia wartość różnicy kolejnych pomiarów (Mean value of Consecutive Difference)
    IPI = interwał między potencjałami (Interpotential Interval)
  5. Powtórz proces dla dodatkowych odpowiedzi SFAP. Średnio oceń 10 synaps z każdego zwierzęcia, aby obliczyć jitter, a następnie wyznacz wartości średnie dla każdego zwierzęcia.
  6. Wyklucz z analiz SFAP z jitterem mniejszym niż 4 µs, aby uniknąć włączenia potencjałów, które mogły zostać wywołane bezpośrednią stymulacją mięśni11.
  7. Podczas rejestracji potencjałów wykazujących przerywane blokowanie, zwiększ natężenie bodźca, aby zweryfikować, czy brak SFAP nie wynika ze stymulacji podmaksymalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować zwiększony jitter oraz blokowanie w kontekście niewydolności przekaźnictwa NMJ, przeprowadzono stymulowane SFEMG z dożylną administracją rokuronium oraz bez niej. Rokuronium jest średnio działającym, niedepolaryzującym lekiem blokującym przewodnictwo nerwowo-mięśniowe, powszechnie stosowanym w warunkach klinicznych do wywoływania paraliżu mięśni podczas operacji lub procedur medycznych. Działa on poprzez konkurencyjne wiązanie się z nikotynowymi receptorami acetylocholiny w NMJ19

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

SFEMG jest powszechnie stosowany do badań diagnostycznych u pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznych, nabytych i genetycznych postaci choroby NMJ. SFEMG jest uważany za najbardziej czuły test w diagnostyce zaburzenia NMJ, miastenii20,21. Powtarzalna stymulacja nerwów (RNS) to kolejna metoda, która jest częściej stosowana w klinicznych testach diagnostycznych i polega na stymulacji nerwu obwodowego za pomocą ciągu bodźców i ilościowym określeniu zsumowanej zł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

W. David Arnold otrzymał fundusze na badania od NMD Pharma i Avidity Biosciences i jest konsultantem dla NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics i Catalyst Pharmaceuticals.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Martinowi Brandhøj Skovowi z NMD Pharma za cenne porady dotyczące dawkowania rokuronium oraz Arashowi Karimi z Wydziału Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Stony Brook za pomoc w obliczeniach. Badanie to było częściowo wspierane przez finansowanie z NIH dla WDA (R01AG067758 i R01AG078129).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Elektroda igłowa wielokrotnego użytku wielokrotnego użytku z pojedynczym włóknemTechnomed202860-000Elektroda nagrywająca z pojedynczym włóknem
2 ml Szklana strzykawkaKent Scientific CorporationSOMNO-2ML
OdłączanyTechnomed202845-0000do podłączenia elektrody rejestratora do maszyny elektrodiagnostycznej
Jednorazowa elektroda tarczowa 2" x 2" z przewodamiCadwell302290-000elektroda uziemiająca
jednorazowe igły monopolarne 28 GTechnomed202270-000elektrody stymulujące katodę i anodę
igłowy EMG (skrzynka przełączników Amp/stim)Cadwell190266-200do podłączenia elektrod monopolarnych do stymulatora elektrodiagnostycznego
Helping Hands zacisk krokodylkowy z żelazną podstawąRadio Shack64-079Utrzymanie umieszczenia elektrody nagrywającej 
Izofluran (butelka 250 ml)Piramal HealthcareNA
strzykawka do irygacji z zakrzywioną końcówką81412012Covidien służy do nakładania żelu elektrodowego
System monitorowania fizjologicznego PhysioSuite z homeotermicznym ociepleniem RightTempScientific CorporationPS-RTZawiera podkładkę rozgrzewającą na podczerwień, sondę doodbytniczą i sondę temperatury podkładki
Profesjonalny trymer Pet Zestaw do pielęgnacjiOster078577-010-003maszynki do strzyżenia do depilacji
Rurki dotchawicze dla szczurów (16 g)Kent Scientific Corporation
Bromek rocroniumSigmaPHR2397-500MGblokujący nerwowo-mięśniowy
System EMG Sierra SummitCadwell Industries, Inc., Kennewick, WAPrzenośnysystem elektrodiagnostyczny
NA SomnoSuite Low-Flow Cyfrowy system anestezjologicznyKent Scientific CorporationSOMNOZawiera adapter do butelki z zabezpieczeniem przed rozlaniem i parą; Rurka adaptera Y; Filtr przedmuchujący węgiel drzewny
Weterynaryjna maść okulistyczna na bazie ropy naftowej Puralube26870stosowany podczas znieczulenia w celu uniknięcia uszkodzenia rogówki
Kent środek

Bibliografia

  1. Stalberg, E. Propagation velocity in human muscle fibers in situ. Acta Physiol Scand Suppl. 287, 1-112 (1966).
  2. Stålberg, E., Trontelj, J. V. The study of normal and abnormal neuromuscular transmission with single fibre electromyography. J Neurosci Methods. 74 (2), 145-154 (1997).
  3. Sanders, D. B., et al. Guidelines for single fiber EMG. Clin Neurophysiol. 130 (8), 1417-1439 (2019).
  4. Chugh, D., et al. Neuromuscular junction transmission failure is a late phenotype in aging mice. Neurobiol Aging. 86, 182-190 (2020).
  5. Padilla, C. J., et al. Profiling age-related muscle weakness and wasting: Neuromuscular junction transmission as a driver of age-related physical decline. GeroScience. 43 (3), 1265-1281 (2021).
  6. Selvan, V. A. Single-fiber EMG: A review. Ann Indian Acad Neurol. 14 (1), 64-67 (2011).
  7. Sanders, D. B., Kouyoumdjian, J. A., Stålberg, E. V. Single fiber electromyography and measuring jitter with concentric needle electrodes. Muscle Nerve. 66 (2), 118-130 (2022).
  8. Juel, V. C. Single fiber electromyography. Handb Clin Neurol. 160, 303-310 (2019).
  9. Chung, T., et al. Evidence for dying-back axonal degeneration in age-associated skeletal muscle decline. Muscle Nerve. 55 (6), 894-901 (2017).
  10. Iyer, C. C., et al. Follistatin-induced muscle hypertrophy in aged mice improves neuromuscular junction innervation and function. Neurobiol Aging. 104, 32-41 (2021).
  11. Meekins, G. D., Carter, G. T., Emery, M. J., Weiss, M. D. Axonal degeneration in the trembler-j mouse demonstrated by stimulated single-fiber electromyography. Muscle Nerve. 36 (1), 81-86 (2007).
  12. Gooch, C. L., Mosier, D. R. Stimulated single fiber electromyography in the mouse: Techniques and normative data. Muscle Nerve. 24 (7), 941-945 (2001).
  13. Chung, T., Tian, Y., Walston, J., Hoke, A. Increased single-fiber jitter level is associated with reduction in motor function with aging. Am J Phys Med Rehabil. 97 (8), 551-556 (2018).
  14. Sokolow, S., et al. Impaired neuromuscular transmission and skeletal muscle fiber necrosis in mice lacking na/ca exchanger 3. J Clin Investig. 113 (2), 265-273 (2004).
  15. Añor, S., et al. Evaluation of jitter by stimulated single-fiber electromyography in normal dogs. J Vet Intern Med. 17 (4), 545-550 (2003).
  16. Mizrachi, T., et al. NMO-IgG and AQP4 peptide can induce aggravation of eamg and immune-mediated muscle weakness. J Immunol Res. 2018, 5389282(2018).
  17. Lin, T. S., Cheng, T. J. Stimulated single-fiber electromyography in the rat. Muscle Nerve. 21 (4), 482-489 (1998).
  18. Finley, D. B., Wang, X., Graff, J. E., Herr, D. W. Single fiber electromyographic jitter and detection of acute changes in neuromuscular function in young and adult rats. J Pharmacol Toxicol Methods. 59 (2), 108-119 (2009).
  19. Khan, Z. H., Hajipour, A., Zebardast, J., Alomairi, S. R. Muscle relaxants in anesthesia practice: A narrative review. Arch Anesthesiol Crit Care. 4 (4), 547-552 (2018).
  20. Padua, L., Caliandro, P., Stålberg, E. A novel approach to the measurement of motor conduction velocity using a single fibre emg electrode. Clin Neurophysiol. 118 (9), 1985-1990 (2007).
  21. Khoo, A., Hay Mar, H., Borghi, M. V., Catania, S. Electrophysiologic evaluation of myasthenia gravis and its mimics: Real-world experience with single-fiber electromyography. Hosp Pract. 50 (5), 373-378 (2022).
  22. Nannan, G., et al. A role of lamin a/c in preventing neuromuscular junction decline in mice. J Neurosci. 40 (38), 7203(2020).
  23. Alley, D. E., et al. Grip strength cutpoints for the identification of clinically relevant weakness. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 559-566 (2014).
  24. Juel, V. C. Clinical Neurophysiology of Neuromuscular Junction Disease. Handbook of Clinical Neurology. 161, Elsevier. 291-303 (2019).
  25. Rich, M. M. The control of neuromuscular transmission in health and disease. Neuroscientist. 12 (2), 134-142 (2006).
  26. Juel, V. C. Evaluation of neuromuscular junction disorders in the electromyography laboratory. Neurol Clin. 30 (2), 621-639 (2012).
  27. Arnold, W. D., Clark, B. C. Neuromuscular junction transmission failure in aging and sarcopenia: The nexus of the neurological and muscular systems. Ageing Res Rev. 89, 101966(2023).
  28. Kokubun, N. Reference values for concentric needle single fiber EMG. Rinsho Shinkeigaku. 52 (11), 1246-1248 (2012).
  29. Testelmans, D., et al. Rocuronium exacerbates mechanical ventilation-induced diaphragm dysfunction in rats. Crit Care Med. 34 (12), 3018-3023 (2006).
  30. Suzuki, K., et al. Intravenous infusion of rocuronium bromide prolongs emergence from propofol anesthesia in rats. PLoS One. 16 (2), e0246858(2021).
  31. Stålberg, E., et al. Reference values for jitter recorded by concentric needle electrodes in healthy controls: A multicenter study. Muscle Nerve. 53 (3), 351-362 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Elektromiografia pojedynczego włóknaprzewodnictwo w NMJpomiar jitteraocena blokowaniapotencjały czynnościowe włókien mięśniowychprzedkliniczna elektromiografiamodele chorób nerwowo-mięśniowychtranslacyjna fizjologia nerwowo-mięśniowa
Stymulowana elektromiografia pojedynczych włókien (SFEMG) do oceny transmisji połączeń nerwowo-mięśniowych w modelach gryzoni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.