Skuteczność i mechanizmy leżące u podstaw leczenia wyprysku odbytu ShiDuGao na podstawie zestawów danych GEO i farmakologii sieciowej

Egzema odbytu to alergiczna choroba skóry, która wpływa na okolicę odbytu i błonę śluzową, wykazując różne objawy kliniczne¹. Charakterystyczne objawy to rumień odbytu, grudki, pęcherze, erozja, wysięk i strupy. Objawy te powstają głównie z powodu zadrapania, pogrubienia i szorstkości dotkniętego obszaru².

Egzema analna, charakteryzująca się długim czasem trwania choroby, nawracającymi atakami i trudnym leczeniem, może mieć niekorzystny wpływ na zdrowie fizyczne i psychiczne pacjentów³. Patogeneza wyprysku odbytu nie jest jeszcze jasna, a współczesna medycyna sugeruje, że może być związana z miejscowymi zmianami w odbycie, dietą, środowiskiem, genetyką i innymi czynnikami⁴. Oprócz unikania kontaktu z czynnikami drażniącymi i potencjalnymi alergenami, leczenie egzemy odbytu koncentruje się głównie na metodach takich jak hamowanie stanu zapalnego, przeciwalergiczne i łagodzenie swędzenia⁵.

SDG jest szeroko stosowany w leczeniu egzemy odbytu i innych schorzeń odbytu. SDG reguluje wysięk ze skóry odbytu, zmniejsza nawilżenie, naprawia skórę odbytu i skutecznie zwalcza świąd^6,7,8. Co więcej, SDG ma potencjał do regulowania mikrobioty okołoodbytowej, poprawiając w ten sposób egzemę odbytu^9,10.

Farmakologia sieciowa, nowatorskie i interdyscyplinarne, nowatorskie podejście bioinformatyczne w dziedzinie sztucznej inteligencji i dużych zbiorów danych, zapewnia dogłębną eksplorację tradycyjnej medycyny chińskiej. Dyscyplina ta kładzie nacisk na systemowe wyjaśnianie reguł korelacji molekularnej między lekami a chorobami z perspektywy sieci ekologicznej. Został szeroko przyjęty w różnych aspektach, w tym identyfikacji kluczowych składników aktywnych w ekstraktach ziołowych, rozszyfrowywania ich globalnych mechanizmów działania, formułowania kombinacji leków i badania zgodności na receptę. Tradycyjne chińskie receptury wykazują cechy wieloskładnikowe i wielocelowe, co oznacza ich znaczną zdolność adaptacji do dziedziny farmakologii sieciowej. Kierując się tą metodologią, pojawiły się nowe perspektywy w badaniu złożonych systemów tradycyjnej medycyny chińskiej, zapewniając solidne wsparcie techniczne dla racjonalizacji zastosowań klinicznych i innowacji w zakresie leków^11,12,13,14.

To badanie ma na celu zbadanie mechanizmu skuteczności SDG w leczeniu egzemy odbytu. Wysiłki badawcze miały na celu wyjaśnienie mechanizmu miejscowego podawania leków przy użyciu synergicznej integracji farmakologii sieciowej i zestawów danych GEO. Odkrycia dostarczają cennych informacji na temat skuteczności i mechanizmów leżących u podstaw SDG w leczeniu egzemy odbytu, wskazując na jej potencjał jako skutecznego podejścia terapeutycznego w przypadku tego schorzenia. Szczegółowy diagram przebiegu badania przedstawiono w Rysunek 1.

To badanie nie odnosi się do etycznego zatwierdzenia i zgody na uczestnictwo. Dane wykorzystane w tym badaniu uzyskano z baz danych genów.

1. Przewidywanie celów chorobowych

1. Uzyskaj dostęp do bazy danych GeneCards (https://www.genecards.org) i internetowej bazy danych dziedziczenia mendlowskiego u ludzi (OMIM, https://www.omim.org), wykorzystując "egzemę odbytu" jako termin wyszukiwania celów choroby.
2. Pobierz arkusze kalkulacyjne z celami chorobowymi. Usuń powtarzające się cele, aby uzyskać cele egzemy odbytu.

2. Wybór aktywnych komponentów

1. Wyszukaj słowo kluczowe "indygo naturalis, złoty cyprys, gips kalcynowany, kalamina i żółć chińska" w bazie danych farmakologicznej systemu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) uzyskanie wykazu potencjalnych składników aktywnych i celów SDG.
2. Powierz komponent szwajcarskiej bazie danych ADME (http://www.swissadme.ch/index.php), wyodrębniając szczegóły dotyczące osób wykazujących "wysoką" absorpcję IG, w połączeniu z co najmniej dwiema wartościami DL "Tak" jako elementami aktywnymi.
   UWAGA: Zwykle tylko składniki o wartościach podobnych do leków (DL) ≥0,18 w bazie danych są uwzględniane jako składniki aktywne.

3. Budowa sieci PPI i badania przesiewowe białek rdzeniowych

1. W Venny2.1 ( https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) wprowadź cele SDG i egzemy odbytu odpowiednio do LIST1 i LIST2. Wizualna reprezentacja skrzyżowania jest generowana natychmiast. Kliknij obszar współdzielony, aby wyświetlić wspólne cele w sekcji Wyniki.
2. Uzyskaj dostęp do bazy danych STRING (https://string-db.org/). Wprowadź cele w polu Lista nazw. Następnie wybierz Homo sapiens jako organizm i przejdź do wyszukiwania > kontynuowania.
3. Gdy wyniki będą dostępne, otwórz Ustawienia zaawansowane i wybierz opcję ukryj rozłączone węzły w sieci. W polu Minimalny wymagany wynik interakcji ustaw najwyższy poziom ufności (0,900), a następnie kliknij przycisk Aktualizuj.
4. Kliknij Eksporty, aby pobrać tekst sieci interakcji białko-białko (PPI) w formacie .png i .tsv.

4. Budowa sieci lek-składnik-choroba-cel

1. Otwórz Cytoscape 3.9.1 i zaimportuj plik .tsv wymieniony w kroku 3.4. Kliknij pasek stylu w panelu sterowania, aby zoptymalizować kolor, czcionkę i bok węzłów sieci.
2. Do analizy topologii sieci należy użyć funkcji Analizuj sieć. Aby uzyskać geny huba, użyj CytoHubba w oprogramowaniu Cytoscape. Ustal sieć lek-składnik-choroba-cel.

5. Analiza wzbogacenia GO i KEGG

1. Wejdź na stronę Metascape (https://metascape.org/). Wybierz plik lub wklej listę genów w oknie dialogowym i kliknij przycisk Prześlij. Następnie wybierz H. sapiens zarówno w Danych wejściowych jako gatunek, jak i Analiza jako gatunek; następnie włącz funkcję Analiza niestandardowa.
2. W opcji wzbogacania wybierz GO Molecular Functions, GO Biological Processes, GO Cellular Components i bazę danych KEGG Pathway. Zaznacz opcję Wybierz selektywne klastry GO, a następnie kliknij przycisk Analiza wzbogacenia. Po zakończeniu działania paska postępu zainicjuj kliknięcie strony raportu analizy, aby pobrać wyniki wzbogacania.

6. Analiza zestawu danych GEO gene chip

1. Przeszukuj i analizuj zestaw danych GEO gene chip (GDS3806) za pomocą narzędzia GEO2R (https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) w celu zbadania ekspresji centralnych genów w różnych grupach danych (grupa kontrolna – nietopowe zapalenie skóry; eksperymentalne grupowe atopowe zapalenie skóry).
2. Wejdź na stronę internetową bazy danych GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Wprowadź słowo kluczowe lub GEO Accession i kliknij przycisk Szukaj. Wybierz najlepiej pasujący wynik. Znajdź serię referencyjną (GSE26952).
3. Wejdź na stronę narzędzia GEO2R (https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/), wprowadź serię referencyjną w polu GEO Accession (Akcesja GEO) i kliknij przycisk Set (Ustaw). Wybierz Atopowe zapalenie skóry jako grupę eksperymentalną, wybierz Kontrola nietopowa jako grupa kontrolna i kliknij przycisk Analizuj. Po zakończeniu obliczeń pojawi się wynik.

7. Dokowanie molekularne

1. Otwórz bazę danych TCMSP i pobierz strukturę 3D wybranych składników. Użyj pola wyszukiwania Nazwa chemiczna i wyszukaj wybrane nazwy składników, aby pobrać odpowiednie pliki struktury 3D w formacie mol2.
2. Otwórz bazę danych białek RCSB (http://www.pdb.org/) i pobierz struktury krystaliczne kluczowych celów. W polu wyszukiwania wyszukaj nazwy docelowe i pobierz odpowiednie pliki struktury krystalicznej w formacie pdb.
3. Importuj składniki i pliki struktury docelowej do oprogramowania analitycznego. Usuń cząsteczki wody, klikając Edytuj > Usuń wodę. Dodaj wodór, klikając Edytuj > Wodory > Dodaj. Ustaw składniki jako ligand, wybierz całe cele jako receptor i wykonaj dokowanie na ślepo.
4. Określ zakres dokowania molekularnego.
   1. Wybierz kolejno receptor i ligand. Kliknij opcję Siatka > pole siatki, aby dostosować pole siatki tak, aby obejmowało cały model. Kliknij Plik > Zamknij zapisywanie prądu, aby zapisać stan skrzynki siatki. Zapisz pliki w formacie gpf.
   2. Kliknij Uruchom > Uruchom Autogrid4 > Nazwa pliku parametrów > Przeglądaj, wybierz plik gpf, a następnie kliknij przycisk Uruchom.
5. Użyj AutoDock 4, aby wykonać dokowanie molekularne.
   1. Kliknij Dokowanie > Makromolekuły > Ustaw sztywną nazwę pliku, aby wybrać receptor. Kliknij Dokowanie > Ligand > Otwórz/ Wybierz, aby wybrać ligand.
   2. Kliknij Dokowanie > Parametry wyszukiwania, aby ustawić algorytmy operacyjne i Dokowanie > Parametry dokowania, aby ustawić parametry dokowania. Wybierz plik dpf, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Zapisywanie plików w formacie dpf.
   3. Kliknij Analizuj > dokowanie > Otwórz, wybierz plik dlg, kliknij Analizuj >makrocząsteczkę, aby otworzyć receptor, kliknij Analizuj > konformacje > graj, Uszeregowane według energii, aby przeanalizować wyniki. Kliknij przycisk Ustaw odtwarzanie > zapis złożony, aby zapisać wyniki w formacie pdbqt.
6. Zaimportuj pliki dokowania do oprogramowania PyMOL, aby skonstruować dalszą wizualizację.
   1. Wybierz ligand i kliknij Akcja > Znajdź > Kontakty biegunowe > do innych atomów w obiekcie, aby wyświetlić wiązania wodorowe między ligandami a środowiskiem zewnętrznym. Kliknij c, aby zmienić kolor.
   2. Kliknij Akcja > Wyodrębnij obiekt. Kliknij na Show > Sticks, aby pokazać strukturę receptora w patyczku. Zidentyfikuj pozostałości połączone z ligandami i pokaż strukturę pałeczek.
   3. Kliknij Ukryj > patyczki, aby ukryć strukturę patyczków receptora. Kliknij Kreator > pomiarów i kliknij kolejno dwa atomy. Kliknij Etykieta > pozostałości, aby wyświetlić etykietę pozostałości. W razie potrzeby dostosuj kolor tła i przezroczystość. Kliknij Plik > Eksportuj obraz jako, aby zapisać zdjęcie.

Geny związane z egzemą odbytu, geny docelowe SDG i wspólne cele
W sumie 958 potencjalnych kandydatów na geny zostało przebadanych w kartach genowych i 634 w bazach danych OMIM, podczas gdy duplikaty zostały wykluczone. Aby uzyskać kompleksowe zrozumienie genów związanych z egzemą odbytu, połączono wyniki z wielu baz danych, uzyskując w sumie 958 odrębnych genów. W związku z tym skrupulatnie sformułowano sieć interakcji białko-białko (PPI) specyficzną dla wyprysku odbytu. SDG składa się z pięciu tradycyjnych chińskich leków, a mianowicie indygo naturalis, złotego cyprysu, kalcynowanego gipsu, kalaminy i chińskiego Gall15,16. Głównym składnikiem gipsu kalcynowanego jest bezwodny siarczan wapnia (CaSO4), natomiast głównym składnikiem kalaminy jest węglan (ZnCO3). Indygo naturalis, cyprys złoty i żółć chińska mają złożone składniki. Z bazy danych TCMSP wynika, że leki zawierają 92 składniki złożone, co daje w sumie 867 wiarygodnych celów dla leków (Tabela 1).

Poprzez nałożenie na siebie zestawów danych obu genów docelowych, zidentyfikowano łącznie 149 często współwystępujących genów docelowych (Rysunek 2A), a następnie zbudowano niezbędną sieć interakcji białko-białko (PPI) (Rysunek 2B). Dzięki metodzie badań przesiewowych opartej na medianie pod kątem stopnia, bliskości i między, wybrano 59 kluczowych celów jako potencjalne cele leków na egzemę odbytu. Mediana stopni, bliskość i międzyść wyników dla kluczowych celów wynosiła odpowiednio 49, 40,31947 i 0,522. 10 najważniejszych genów z wysokim wynikiem stopnia obejmowało AKT1, TNF, TP53, EGFR, STAT3, SRC, JUN, CASP3, HRAS i PTGS2 (Tabela 2). Geny te są bardzo istotne dla egzemy odbytu.

Ścieżki i sieci o wspólnych celach
Metody wzbogacania KEGG i GO wykorzystano do analizy 59 kluczowych celów, ujawniając 218 powiązanych szlaków i ponad 3000 powiązanych procesów biologicznych. Analiza ujawniła szlaki, które silnie korelują z SDG i białkami wyprysku odbytu, w tym zakażenie wirusem Cherry simplex 1, Shigelozę, szlak sygnałowy TNF, oporność na inhibitory kinazy tyrozynowej EGFR, zakażenie ludzkim wirusem cytomegalii i szlak sygnałowy receptora limfocytów T (Figura 3A). Szlaki te odnoszą się przede wszystkim do genów takich jak AKT1, TNF, TP53, STAT3, SRC, EGFR i CASP3. Rysunek 3B przedstawia szczegółowy opis docelowych genów i ścieżek. Analizę GO przeprowadzono na procesach biologicznych (BP), składzie komórek (CC) i funkcji molekularnej (MF) (Rysunek 4A). Wyniki sugerują, że badanie to koncentruje się przede wszystkim na wspólnych celach SDG i egzemy odbytu w procesach biologicznych, z kilkoma istotnymi dla CC i MF. Funkcje biologiczne, które były szczególnie istotne, obejmują fosforylację peptydylo-tyrozyny, modyfikację peptydylo-tyrozyny, regulację adhezji komórka-komórka, pozytywną regulację adhezji komórek, aktywację limfocytów T, regulację adhezji leukocytów komórka-komórka (Rysunek 4B-D).

Przewidywanie wiązania składników aktywnych SDG z celami egzemy odbytu
Na podstawie mediany wartości stopnia, bliskości i pośredniości przebadano 59 kluczowych celów, w tym AKT1, TNF, TP53, EGFR, STAT3, SRC, JUN, CASP3, HRAS i PTGS2. Dalsza analiza bazy danych GEO wykazała regulację w górę PPARG, EGFR i TNF, podczas gdy PTPRC, MMP9, MAPK14 i CASP3 były regulowane w dół w grupie eksperymentalnej (atopowe zapalenie skóry) (Ryc. 5). Poprzez analizę wspólnego wzbogacania szlaków genowych ustalono, że geny te głównie uczestniczyły w kaskadzie sygnałowej TNF i szlaku sygnałowym MAPK. W szlaku sygnałowym TNF ekspresja TNF była regulowana w górę, podczas gdy ekspresja MMP9, MAPK14 i CASP3 była regulowana w dół. W szlaku sygnałowym MAPK ekspresja EGFR i TNF była regulowana w górę, podczas gdy MAPK14 i CASP3 były regulowane w dół (Figura 6). Na podstawie tych ustaleń TNF, MAPK14 i CASP3 uznano za potencjalne cele w terapii SDG.

Aby zweryfikować potencjalne cele w aktywnych składnikach SDG, użyto analizy dokowania do sprawdzenia dokładności między strukturą aktywnego składnika a potencjalnymi białkami docelowymi. Te docelowe białka są zaangażowane w różne połączenia funkcjonalne i są wysokimi węzłami w sieci, co sugeruje, że odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi SDG na egzemę odbytu. Ujemna wartość energii wiązania dokowania wskazuje na zdolność SDG do dokowania z celami choroby in vivo, przy czym bardziej ujemna wartość wskazuje na łatwiejsze dokowanie. W tym badaniu osiągnięto pomyślne dokowanie molekularne podstawowych składników aktywnych z kluczowym celem, a energia wiązania dokowania była ujemna, przy wartościach mniejszych niż -1 kcal/mol. Indygo i berberrubina mają dobrą aktywność wiązania, a energia wiązania jest mniejsza niż -5 kcal/mol (Tabela 3, Rysunek 7). Podsumowując, wyniki te dostarczają dalszych dowodów na to, że białka odpowiadające loci genów mogą działać jako cele SDG w egzemie odbytu.

Rysunek 1: Przebieg analizy farmakologicznej sieci. GO, Ontologia genów; KEGG, Encyklopedia genów i genomów z Kioto; TCMSP, Baza Danych i Platforma Analizy Farmakologii Tradycyjnej Medycyny Chińskiej; GEO, Omnibus Ekspresji Genów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Diagram Venna i sieć PPI wspólnych celów. (A) Diagram Venna przecięcia celu leku i celu choroby. (B) Wspólna docelowa sieć PPI według STRING. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza wzbogacenia szlaku KEGG. (A) Analiza wzbogacenia szlaku KEGG. 10 najlepszych ścieżek KEGG jest uszeregowanych według wartości P w kolejności rosnącej. (B) Połączenie między szlakiem a celem: szlak (żółty), cele (czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza wzbogacenia GO. (A) Wyniki GO trzech ontologii. (B) Wykres bąbelkowy procesu biologicznego (BP). (C) Wykres bąbelkowy składnika komórki (CC). (D) Wykres bąbelkowy funkcji molekularnej (MF). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przewidywanie wyników potencjalnych celów. (A) Mapa cieplna ekspresji genów piasty w bazie danych GEO, grupa A to grupa eksperymentalna (atopowe zapalenie skóry), a grupa B to grupa kontrolna (nieatopowe zapalenie skóry); (B) Węzły sieci PPI reprezentują białka, brzeg reprezentuje relacje. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Ścieżka sygnałowa. (A) Ścieżka sygnałowa MAPK. (B) Szlak sygnałowy TNF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Molekularne dokowanie podstawowych genów i składników. Purpurowy reprezentuje podstawowe składniki SDG, a niebieski reprezentuje reszty podstawowych genów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Składniki aktywne w SDG.

Tabela 2: Charakterystyka 10 najważniejszych genów centralnych.

Tabela 3: Molekularna energia wiązania składników i genów rdzeniowych.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.