Artykuł metodologiczny

Zadanie związane z przestrzenną pamięcią roboczą dla myszy w półautomatycznym 8-ramiennym labiryncie promieniowym, zmniejszające skojarzenia pamięci lękliwej w labiryncie

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66456

⸱

29 lipca 2025

 ,  ,  , 
1The Wolfson Institute for Biomedical Research, University College London, 2Gerald Choa Neuroscience Institute, The Chinese University of Hong Kong

W tym artykule

Podsumowanie

Większość eksperymentów behawioralnych dla gryzoni została pierwotnie opracowana dla szczurów. Ze względu na różnice behawioralne między szczurami a myszami, czasami wymagane są modyfikacje dla myszy. Przedstawiamy metodę badania przestrzennej pamięci roboczej u myszy, minimalizującą stres podczas zadania pamięci roboczej.

Streszczenie

Ten artykuł o metodzie szczegółowo opisuje protokół testowania przestrzennej pamięci roboczej u myszy za pomocą półautomatycznego promieniowego 8-ramiennego labiryntu (RAM). RAM jest częściowo zamkniętym aparatem z 8 poziomymi, równomiernie rozmieszczonymi ramionami rozchodzącymi się promieniście z centralnego piasty, z którego dostęp do każdego ramienia może być kontrolowany indywidualnie przez zmotoryzowane drzwi sterowane serwomechanizmem. Zwierzęta zaczynają w centralnym węźle i mogą eksplorować labirynt, aby zdobyć nagrodę w postaci jedzenia na końcu każdego ramienia lub wybranego ramienia. Zadanie pamięci RAM zostało pierwotnie zaprojektowane dla szczurów, ale dostosowaliśmy protokół dla myszy, na przykład poprzez włączenie większej liczby kroków przyzwyczajenia. W naszym protokole wszystkie ramiona są początkowo nęcone słodzonym skondensowanym mlekiem, a myszy są kolejno wpuszczane do czterech pseudolosowo wybranych ramion, aby zebrać nagrody ("wymuszony bieg") przed otwarciem wszystkich drzwi razem, aby umożliwić myszom swobodne bieganie i znalezienie pozostałych czterech nagród ("darmowy bieg"). Między przebiegami wymuszonymi i swobodnymi wprowadza się 5-sekundowe opóźnienie, aby rzucić wyzwanie pamięci roboczej; Błąd jest rejestrowany, jeśli mysz wejdzie w dowolną, wcześniej odwiedzoną broń arm podczas swobodnego biegu. Zadanie jest zakończone, gdy wszystkie nagrody zostaną odzyskane. Po 6 dniach przyzwyczajenia i 9 dniach treningu w labiryncie samce myszy C57BL/6 regularnie osiągają ≥ 80% dziennego wskaźnika sukcesu, zdefiniowanego jako 4/(4+E), gdzie E to liczba błędów. To półautomatyczne zadanie można w zasadzie połączyć z metodami monitorowania in vivo, takimi jak elektrofizjologia, mikroskopia wielofotonowa lub obrazowanie wapnia.

Wprowadzenie

Pamięć robocza1 to proces poznawczy, który może przechowywać ograniczoną ilość informacji przez krótki czas, podczas gdy jest ona manipulowana i wykorzystywana w planowaniu i wykonywaniu zadań umysłowych, takich jak zapamiętywanie numeru telefonu lub trasy do miejsca docelowego z innego miejsca. Jest to ściśle związane z inteligencją płynną, czyli zdolnością do szybkiego rozumowania i abstrakcyjnego myślenia. Uważa się, że trening pamięci roboczej może poprawić inteligencję płynną2. Pamięć robocza ma zatem kluczowe znaczenie dla badań naukowych.

Najpopularniejsze eksperymenty behawioralne na gryzoniach zostały pierwotnie opracowane dla szczurów w latach 80., a obecnie badacze często stosują te protokoły na myszach. Istnieją jednak stałe różnice w zachowaniu między szczurami a myszami3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Szczególnie radzenie sobie ze strachem jest ważnym czynnikiem, który może wpłynąć na wyniki eksperymentów, ponieważ myszy są bardziej podatne na stres w porównaniu ze szczurami3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę różnice podczas stosowania tych protokołów u myszy. W naszym protokole staraliśmy się zminimalizować czynniki stresogenne podczas zadania pamięci roboczej w labiryncie ramienia promieniowego. Dokonano tego poprzez staranne wyczucie czasu zamknięć drzwi za pomocą oprogramowania do śledzenia myszy i sterowania labiryntem. Uniknięto również łapania myszy pod koniec sesji w centralnym hubie. Takie podejście pozwoliło myszom wybrać następne ramię bez kojarzenia lokalizacji ze strachem przed złapaniem. Zwlekanie ze schwytaniem myszy do momentu, gdy wszystkie nagrody zostaną zebrane w labiryncie, zapewniało, że ostatnia nagroda nie była związana z doświadczeniem złapania.

Labirynt z lądowym ramieniem promieniowym (RAM) jest popularnym i powszechnie używanym urządzeniem do oceny przestrzennego i nieprzestrzennego uczenia się i pamięci, a także do testowania pamięci roboczej i referencyjnej u gryzoni. Jest to jeden z najpopularniejszych aparatów do uczenia się przestrzennego i zapamiętywania u myszy20,21,22. RAM wykorzystuje naturalną skłonność gryzoni do eksploracji labiryntu, znajdowania nowości i uczenia się informacji przestrzennych na zasadzie prób i błędów, a także do żerowania. Tendencję tę można wzmocnić, ograniczając ich dietę i nagradzając je preferowanym jedzeniem w labiryncie. Obecnie stosuje się kilka wariantów aparatu RAM, np. z 6, 8, 12 lub 16 ramionami i częściowo zamkniętym lub otwartym/podwyższonym aparatem23,24,25. Większość współczesnych protokołów opiera się na protokole Olton et al.20,26, ale używaj prostszych (6- lub 8-ramiennych) labiryntów9,24,27,28,29. Testowanie pamięci roboczej w labiryncie ramion promieniowych (6 lub 8 ramion) jest potężniejsze niż w labiryncie T (2 ramiona), ponieważ zwierzęta mają więcej opcji ramion do zbadania.

Oryginalny RAM został zaprojektowany przez Oltona i Samuelsona20 do oceny uczenia się przestrzennego i pamięci u szczurów za pomocą przynęt pokarmowych dla pozytywnego wzmocnienia, w przeciwieństwie do labiryntów wodnych, takich jak labirynt wodny Morris i 8-ramienny radialny labirynt wodny, które wykorzystują negatywne wzmocnienie, tj. zanurzenie w wodzie20,30,31,32. Olton i Samuelson20stwierdzili, że szczury mają doskonałe wspomnienia z miejsc, gdy przechodzą przez pamięć RAM. Wykazali, że hipokamp bierze udział w przetwarzaniu informacji przestrzennych. W związku z tym wprowadzili koncepcję systemu podwójnej pamięci, składającego się z pamięci roboczej i referencyjnej u gryzoni. Ten system podwójnej pamięci został wcześniej zasugerowany przez Honig36 na podstawie eksperymentów z gołębiami. Olton i in. odkryli, że funkcja hipokampa jest niezbędna dla pamięci roboczej. Osiągnięto to poprzez wykonanie zmian w obszarze śródwęchowym, ciele fimbrii-fornix, przed hipokampem, przegrodą lub sklepieniem postcommissuralnym, aby zakłócić każde z głównych połączeń włókien zewnętrznych formacji hipokampa26,33,34,35. Zmiany w otworze i fimbrii nie wpływały na pamięć referencyjną26.

W nowoczesnych protokołach, zwierzęta są przyzwyczajane do środowiska, pozwalając im swobodnie eksplorować labirynt przez 10-15 minut dziennie przez 3 kolejne dni, po czym następuje trening labiryntu przez 1-3 tygodnie z preferowanym jedzeniem na końcu wszystkich ramion lub ustalonym wybranym ramionom, testując pamięć roboczą lub pamięć roboczą i pamięć odniesienia w tym samym eksperymencie, odpowiednio9,29,37.

Często te protokoły nie są w pełni opisane, a różnice behawioralne między szczurami a myszami nie są dobrze przemyślane. Tutaj szczegółowo przedstawiamy nasz protokół i doświadczenie, zwłaszcza jak uniknąć kojarzenia przerażających doświadczeń z miejscami i czasem w oparciu o różnice w radzeniu sobie ze strachem między szczurami a myszami. Ten protokół jest przeznaczony dla naukowców, którzy chcą badać przestrzenną pamięć roboczą i stosować ją do elektrofizjologii, obrazowania w czasie rzeczywistym i histologii przy użyciu myszy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały wstępnie zatwierdzone przez Komitet Etyczny UCL i zatwierdzone na mocy Ustawy o Zwierzętach (Procedury Naukowe) z 1986 roku i późniejszej legislacji rządu Wielkiej Brytanii.

1. Przygotowanie programów do automatycznego sterowania labiryntem w aplikacji

UWAGA: Użyto zautomatyzowanego labiryntu z ramieniem promieniowym, jak pokazano na rysunku Rysunek 1A-C, oraz układu pomieszczenia w Rysunek 1D.

  1. Przygotuj eksperymentalny przepływ pracy dla zamykania drzwi zgodnie z opisem w Rysunek 2.
  2. Ustaw początek etapu habituacji 1 (Rysunek 2A) w aplikacji. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
    1. Ustaw początek wersji próbnej i nagrań wideo, a następnie zamknij wszystkie ramiona w oprogramowaniu. 5 s po tym, jak oprogramowanie rozpozna mysz w centralnym centrum labiryntu, rozpoczyna śledzenie i otwiera wszystkie drzwi.
    2. Gdy mysz znajdzie się w ramieniu i znajdzie się w odległości 4 cm od najbliższych drzwi centralnej piasty, zamknij wszystkie drzwiczki. Następnie, zaraz po zamknięciu wszystkich drzwiczek, otwórz drzwiczki ramienia, które wybrała mysz.
    3. Gdy mysz powróci do centralnego koncentratora, zamknij drzwiczki i ogranicz ją do centralnej piasty na 5 sekund. Powtarzaj to przez 30 minut.
    4. Zatrzymaj nagrywanie i śledzenie wideo po upływie 30 minut, a mysz powróci do centralnego koncentratora.
      UWAGA: Pozwól myszy swobodnie eksplorować labirynt według własnego uznania.
  3. Etap habituacji 2 (Rysunek 2B)
    1. Ustaw początek próby i nagrywania wideo w powiązanym oprogramowaniu i zamknij wszystkie drzwi.
    2. 5 s po tym, jak oprogramowanie rozpozna mysz w centralnym piaście labiryntu, rozpocznij jej śledzenie i otwórz wszystkie drzwi.
    3. Zakończ próbę, jeśli mysz wejdzie do każdego ramienia co najmniej dwa razy lub po 30 minutach, a następnie powróci do centralnego koncentratora. Pozwól myszy swobodnie eksplorować labirynt według własnego uznania.
  4. Etap habituacji 3 (Rysunek 2C)
    UWAGA: Ten etap jest połączeniem etapów 1 i 2.
    1. Ustaw oprogramowanie tak, aby rozpoczęło wersję próbną i nagrywanie wideo, a następnie zamknij wszystkie drzwi.
    2. Ustaw oprogramowanie tak, aby sterowało drzwiami labiryntu 5 sekund po tym, jak oprogramowanie rozpozna mysz w centralnym centrum. W tym momencie ustaw początek śledzenia i otwórz wszystkie drzwi.
    3. Zamknij wszystkie drzwiczki, gdy mysz znajdzie się w ramieniu i znajduje się w odległości 4 cm od najbliższych drzwiczek centralnej piasty. Następnie otwórz drzwi ramienia.
    4. Zamknij drzwi, gdy mysz całkowicie znajdzie się w centralnej piaście i ogranicz mysz w centralnej piaście na 3 sekundy. Powtarzaj tę sekwencję przez 30 minut lub do momentu, gdy mysz wejdzie do każdego ramienia przynajmniej raz.
    5. Ustaw koniec próby po spełnieniu warunku i gdy mysz całkowicie wejdzie do centralnego koncentratora.
      UWAGA: Pozwól myszy swobodnie eksplorować labirynt według własnego uznania.
  5. Zadanie pamięci roboczej (Rysunek 2D, E)
    1. Ustaw oprogramowanie tak, aby rozpoczęło próbę i nagrywanie, a następnie zamknij wszystkie drzwi.
    2. 5 s po tym, jak oprogramowanie rozpozna mysz w centralnym hubie, ustaw oprogramowanie tak, aby rozpoczęło śledzenie.
    3. Rozpocznij fazę wymuszonego uruchamiania. Przedstaw pseudo-losowo wybrane 4 ramiona jeden po drugim do myszki.
    4. Gdy mysz wejdzie do pierwszego ramienia i znajdzie się w odległości 3 cm od centralnej piasty, upewnij się, że drzwiczki zamykają się i zamykają ją w ramieniu na 15 sekund.
    5. Pozwól drzwiom się otworzyć i pozwól myszy wrócić do centralnego koncentratora.
    6. Zamknij drzwi, a następnie otwórz drugie ramię.
    7. Powtarzaj to aż do czwartego ramienia.
    8. Gdy mysz powróci do centralnego koncentratora po czwartym ramieniu fazy wymuszonego biegu, ogranicz ją do centralnego koncentratora na 5 s.
    9. Pozwól, aby wszystkie drzwi się otworzyły i rozpocznij fazę swobodnego biegu.
    10. Zakończ próbę, gdy mysz powróci do centralnego centrum po zebraniu wszystkich nagród/wejściu we wszystkie ramiona przynajmniej raz.

2. Przygotowanie klatek domowych do indywidualnego trzymania

  1. Skonfiguruj nowe klatki przy użyciu standardowych materiałów zagnieżdżających do nowego eksperymentu.
    1. Umieść nową ściółkę, trociny, papierowe igloo, papierowy tunel, papierowe paski do gniazdowania i drewniany klocek do gryzienia w nowych klatkach dla każdej myszy na czas eksperymentu.
    2. Umieść pojemnik na żywność i zamknij pokrywę.
      UWAGA: Myszy mogą uszkodzić części wentylacyjne, jeśli nie mają one zasobnika na żywność.

3. Obsługa, ważenie i ograniczenie diety w pomieszczeniu dla zwierząt (Dzień -7 do Dzień 0)

  1. Delikatnie poprowadź mysz do papierowego tunelu dostarczonego w klatce domowej.
  2. Podnieś mysz z klatki zgrupowanej za pomocą tunelu do papieru38,39,40 ręką, przytrzymaj ją na wysokości klatki piersiowej przez kilka sekund. Alternatywnie, pozwól myszy dobrowolnie wspiąć się na rękę.
    UWAGA: Obchodzenie się ze zwierzętami przy minimalnym stresie jest niezbędne do eksperymentów behawioralnych. Nigdy nie podnoś ich za ogon, co jest stresujące dla myszy. Ważne jest również przyzwyczajenie myszy do eksperymentatora. Myszy muszą być dobrze przyzwyczajone i zrelaksowane, w przeciwnym razie nie będą się dobrze uczyć w labiryncie później.
  3. Zawsze trzymaj mysz przy użyciu tej samej metody obsługi. Umieść mysz na wadze, aby monitorować masę ciała i zapisz jej masę ciała.
    UWAGA: Nie stresuj myszy szybkimi ruchami ciała ani głośnymi dźwiękami. Lepiej jest to zrobić w cichym otoczeniu. W przeciwnym razie mogą zeskoczyć z wagi lub ręki eksperymentatora. Ponadto, jeśli myszy są zestresowane, mogą mieć zmrużone oczy, piszczeć i mogą ugryźć rękę eksperymentatora41,42.
  4. Po zważeniu włóż mysz do nowej przygotowanej wcześniej klatki.
  5. Umieść myszy na diecie z ograniczoną ilością na tydzień przed ekspozycją na labirynt ramienia promieniowego. To motywuje ich do przeszukiwania labiryntu w poszukiwaniu nagród w postaci jedzenia. Nagrodą w postaci jedzenia podczas eksperymentu jest rozcieńczone słodzone mleko skondensowane.
  6. Umieść 2 ~ 3 g standardowej karmy w klatce i utrzymuj masę ciała między 85 ~ 90% masy wyjściowej przez cały czas trwania eksperymentu.
    UWAGA: Myszy C57BL/6 jedzą codziennie 3-4 g standardowej karmy43.
  7. Obserwuj nocny spadek masy ciała jako wskazówkę w celu ujednolicenia ilości pokarmu, który należy podać następnego dnia. Od tego momentu podawaj wystarczającą dzienną ilość standardowej karmy, aby utrzymać 85-90% początkowej masy ciała przez cały czas trwania eksperymentu.
    UWAGA: Te zwierzęta muszą powoli tracić na wadze. Monitoruj ich masę ciała i mimikę twarzy, aby uniknąć stresu.
  8. Podaj 1 ml rozcieńczonego mleka skondensowanego (nagroda; słodzone mleko skondensowane : woda = 1 : 1) w małym plastikowym kubku w klatce domowej, aby przyzwyczaić myszy do końca etapu przyzwyczajenia 1. Upewnij się, że myszy zjadają nagrodę. Zmień pokarm nagrody, jeśli szczep myszy wykazuje neofobię w stosunku do prezentowanego pokarmu.
    UWAGA: Od etapu przyzwyczajenia 2 nie podawaj nagrody w klatce domowej. Jeśli masa ciała jakiejkolwiek myszy spadnie poniżej 80% masy początkowej, powinna ona zostać poddana eutanazji zgodnie z wytycznymi IACUC i obowiązującymi w danym kraju. Jeśli mysz nie znajduje się w normalnym zakresie masy ciała dla używanej linii myszy (20-30 g w wieku 8-12 tygodni) podczas pierwszego sprawdzenia masy ciała, nie należy jej uwzględniać w kohorcie, aby uniknąć trudności z utrzymaniem masy ciała w wymaganym zakresie w późniejszym czasie.

4. Przyprowadzanie myszy do pokoju testowego

  1. Użyj wózka, aby powoli przynosić myszy do pokoju do testowania zachowania.
  2. Pozostaw myszy w spokoju na wózku na 5 minut.

5. Konfiguracja pokoju

  1. Ustaw oświetlenie pomieszczenia oświetlacz centralny koncentrator pośrednio, o natężeniu 80 luksów z ciepłymi białymi żarówkami i odtwarzaj biały szum na poziomie 70 dB mierzonym na centralnym hubie. UWAGA: Wiadomo, że narażenie na biały szum o umiarkowanym natężeniu powoduje, że szczury osiągają lepsze wyniki w geometrycznie złożonym labiryncie44,45. Biały szum wydaje się robić coś więcej niż tylko maskować nieunikniony hałas w otoczeniu; Biały szum o natężeniu 70 dB zwiększa wychwyt choliny w kilku obszarach mózgu szczurów, w tym w korze przedczołowej, podwzgórzu i hipokampie (ale nie w prążkowiu)46 Wiadomo, że wydajność pamięci roboczej pamięci RAM zależy od integralności szlaków cholinergicznych między hipokampem, korą czołową i przodomózgowiem32,47. Wiadomo również, że zwierzęta używają zarówno dystalnych, jak i proksymalnych wskazówek wizualnych, aby dokładnie poruszać się w swoim otoczeniu. Jednak myszy polegają na dystalnych wskazówkach wizualnych bardziej niż na proksymalnych wskazówkach do nawigacji podczas uczenia się przestrzennego48. W tym eksperymencie proksymalne wskazówki wydrukowane na małym kawałku papieru zostały wprowadzone do tylnych ścianek wszystkich ramion 8-ramiennej pamięci RAM, ale nie zmniejszyły one zachowania łączenia łańcuchowego. Z drugiej strony, geometrycznie asymetryczne dystalne wskazówki wizualne (na suficie i ścianach pomieszczenia) zmniejszyły łańcuchowość i były niezbędne do nawigacji przestrzennej w pamięci RAM.

6. Etap przyzwyczajenia 1 - Bez nagrody (Dzień 1 - 2)

UWAGA: W labiryncie nie ma przynęty na żadne nagrody. Ten etap ma na celu przyzwyczajenie myszy do drzwi labiryntu i ich dźwięków.

  1. Rozpocznij śledzenie myszy i nagrywanie wideo, klikając przycisk Start w oprogramowaniu i przenosząc mysz do labiryntu bez stresowania go. Zrób to, poruszając się powoli i powoli zmieniając wysokość, gdy mysz znajduje się w dłoni eksperymentatora. Umieść mysz w centralnym hubie.
    UWAGA: Jeśli myszy trzęsą się na dłoni eksperymentatora, zwolnij ruchy. To znak strachu. Myszy poruszają się podczas 5-sekundowego okresu uwięzienia w centralnym węźle przed rozpoczęciem fazy wymuszonego biegu. Mogą być skierowane w dowolną stronę po umieszczeniu w centralnej piaście.
  2. Obserwuj zachowanie myszy na monitorze komputera umieszczonym daleko od labiryntu lub poniżej poziomu ściany labiryntu. Jeśli mysz próbuje uciec z labiryntu, wspinając się na ścianę, po prostu wstań z krzesła, aby pokazać istnienie eksperymentatora i idź w jego kierunku, monitorując jego wydajność. W najgorszym przypadku wepchnij mysz z powrotem do labiryntu.
    UWAGA: Zwykle myszy wracają do labiryntu po usłyszeniu odgłosu tarcia ubrań eksperymentatora, gdy się do niego zbliżają. Trzeba to zrobić szybko. Jeśli eksperymentator będzie kontynuował to, myszy pozostaną w labiryncie po etapach przyzwyczajenia od 1 do 3. Jeśli myszy nadal wyskakują z labiryntu, zaleca się usunięcie ich z dalszych eksperymentów i analiz.
  3. Po próbie zbierz mysz z ramienia labiryntu, pozwalając myszy dobrowolnie wspiąć się na rękę eksperymentatora, podczas gdy druga ręka zakrywa ramię, aby zapobiec zeskoczeniu z labiryntu.
  4. Zetrzyj odchody myszy i przetrzyj labirynt suchą chusteczką, aby usunąć wszelkie ślady nagród. Następnie przetrzyj wilgotną chusteczką i osusz labirynt suchą chusteczką (około 2 min).
  5. Rób to dla każdej myszy po kolei przez dwa dni.
    UWAGA: Po 30 minutach myszy mogły nie odwiedzić wszystkich 8 ramion labiryntu. Jest to normalne i nie stanowi problemu. Myszy mają tendencję do odwiedzania ramion w niesystematyczny, niesekwencyjny sposób i poruszają się ostrożnie, spędzając nierówne czasy w każdym ramieniu. Na tym etapie myszy mogą wspinać się po ścianach labiryntu i/lub wyskakiwać z labiryntu. Jeśli tak się stanie (np. mysz próbuje wspiąć się na ściany), zapobiegnij temu, upewniając się, że eksperymentator uświadamia mysz swoją obecność, zbliżając się do labiryntu i robiąc jakiś dźwięk, taki jak szelest ubrań. Dlatego może być wymagana uważna obserwacja zachowania myszy w pamięci RAM i szybkie działanie. Po kilku powtórzeniach tej procedury myszy pozostaną w labiryncie. Jeśli mimo wszystko mysz nie pozostaje w pamięci RAM podczas habituacji, usuń ją z analizy.

7. Etap przyzwyczajenia 2 - Nagrodzony (Dzień 3 - 4)

UWAGA: Ten etap ma na celu zachęcenie myszy do swobodnego eksplorowania labiryntu w poszukiwaniu nagród w postaci jedzenia.

  1. Umieść 70 μl nagrody w postaci jedzenia w każdym dołku na żywność w każdym ramieniu.
  2. Rozpocznij śledzenie myszy i nagrywanie wideo, klikając przycisk Start w oprogramowaniu, a następnie umieszczając mysz w centralnym hubie labiryntu, jak wyjaśniono w 6.1.
  3. Obserwuj zachowanie myszy na monitorze komputera z odległego miejsca i zapisuj je w razie potrzeby, np. wspinając się na ścianę lub skacząc z labiryntu. Zakończ próbę, gdy mysz wejdzie do każdego ramienia co najmniej dwa razy lub po upływie 30 minut.
  4. Po próbie zbierz mysz z labiryntu w ramieniu, pozwalając myszy dobrowolnie wspiąć się na rękę eksperymentatora, podczas gdy druga ręka zakrywa ramię, aby zapobiec zeskoczeniu z labiryntu.
  5. Oczyść labirynt zgodnie z opisem w 6.4 (Etap przyzwyczajenia 1; około 2 min).
  6. Rób to dla każdej myszy po kolei dwa razy dziennie przez dwa dni.
    UWAGA: Na tym etapie myszy mogą wykazywać zachowanie łańcuchowe, ale nie ma potrzeby się martwić, ponieważ dodatkowe 4 wpisy ramienia w zadaniu pamięci roboczej mogą zniechęcić do tego ruchu. Na tym etapie myszy mogą zatrzymać się w ramieniu bez spożywania nagrody. W dniu 4 myszy powinny być bardziej wyszkolone niż w dniu 3, ale nadal mogą zatrzymać się w środku ramienia.

8. Etap przyzwyczajenia 3 - Nagrodzony (Dzień 5 - 6)

UWAGA: Ten etap ma na celu umożliwienie myszom przyzwyczajenia się do środowiska będącego kombinacją etapów 1 i 2.

  1. Zanęć wszystkie dołki pokarmowe 70 μl nagrody.
  2. Rozpocznij śledzenie myszy i nagrywanie wideo, klikając przycisk Start oprogramowania i umieszczając mysz w centralnym centrum labiryntu.
  3. Obserwuj zachowanie myszy na monitorze komputera z odległego miejsca, aż mysz wejdzie do każdego ramienia co najmniej raz lub nie upłynie 30 minut. Jeśli mysz próbuje uciec z labiryntu, działaj szybko, jak określono w Etapie Habituacji 1 (6.2).
  4. Po próbie usuń mysz z labiryntu, pozwalając jej dobrowolnie wspiąć się na rękę eksperymentatora, podczas gdy druga ręka zakrywa ramię, aby zapobiec wyskoczeniu z labiryntu.
  5. Oczyść labirynt zgodnie z opisem w 6.4 (etap przyzwyczajenia 1) (około 2 min).
  6. Rób to dla każdej myszy dwa razy dziennie przez dwa dni.
    UWAGA: Na tym etapie najlepiej jest usunąć z analizy wszelkie myszy próbujące uciec z labiryntu
    7. .

9. Zadanie pamięci roboczej - nagrodzone (Dzień 7 - Dzień 15)

  1. Zanęć wszystkie ramiona 40 μl nagrody. Umieść nagrodę w każdym dołku pokarmowym w pobliżu centralnego węzła, aby utrudnić myszom widzenie z centralnego węzła.
  2. Rozpocznij śledzenie i nagrywanie myszy, klikając przycisk Start oprogramowania, a następnie umieść mysz na centralnym koncentratorze labiryntu, nie obciążając go.
  3. Podczas 5-sekundowego zamknięcia w centralnym węźle odejdź i usiądź gdzieś z dala od labiryntu. Monitoruj zachowanie myszy i zapisz sekwencję ramienia, które mysz odwiedza w labiryncie (patrz Plik uzupełniający 1).
  4. Zatrzymaj sekwencję wizyty w ramieniu, gdy mysz zbierze wszystkie osiem nagród w postaci jedzenia, co jest końcem zadania pamięci roboczej, a następnie pozwól jej odwiedzić cztery dodatkowe ramiona.
    UWAGA: W ten sposób myszy mogą mieć trochę więcej czasu, zanim zostaną złapane, co pozwala myszom skupić się na zadaniu pamięci roboczej. Ten krok pozwala również myszom wzmocnić fakt, że nagrody nie są uzupełniane po zebraniu.
  5. Po czterech dodatkowych wizytach ramion wyjmij mysz z labiryntu pod koniec ostatniej wizyty ramienia, pozwalając jej wspiąć się na dłoń, jednocześnie zakrywając ramię drugą ręką.
    UWAGA: Nie łapiąc myszy w centralnym centrum, myszy nie będą kojarzyć złapania z centralnym węzłem, w którym myszy decydują, do którego ramienia udać się w następnej kolejności. Gdy myszy zapoznają się z zadaniem, w tym z dodatkowymi wizytami w ramionach, mogą swobodnie poruszać się w pobliżu ostatniej studzienki z jedzeniem lub spędzić trochę czasu w centralnym węźle. Powinni jednak zakończyć 4 dodatkowe wizyty w ramionach w ciągu 3 minut. Jeśli nie skończą go w ciągu 5 minut, odłóż go do klatki domowej.
  6. Wybierz następną klatkę, aby dostosować poziom pobudzenia, dotykając klatki, aby przejść do następnej próby.
  7. Oczyść labirynt zgodnie z opisem w 6.4 (etap przyzwyczajenia 1) (około 2 min).
  8. Przejdź do następnej myszy i powtórz to 6 razy dla każdej myszy po kolei przez 9 dni.
    UWAGA: Średni czas trwania czterech dodatkowych wizyt w ramionach powinien się wydłużyć w późniejszych próbach, ponieważ myszy uczą się rozpoznawać, kiedy nie są dostępne dalsze nagrody lub że nie ma nowych, nieodwiedzanych ramion, do których mogłyby się udać.

10. Punktacja

  1. Oblicz "dzienny wynik wskaźnika sukcesu" (%) = 4 (gole) / (całkowita liczba wpisów ramienia [4 + błędy]) x 100,
    UWAGA: Po wymuszonym biegu tylko cztery ramiona są wypełnione nagrodą, bramkami. Jeśli wejdą w ramię, które mysz odwiedziła w wymuszonym biegu, policz to jako jeden błąd, podobnie jak powtarzające się ręce w swobodnym biegu.
  2. Oblicz "doskonały wynik współczynnika prób" (%) w 6 próbach = [(liczba doskonałych prób) / 6 ] x 100
    UWAGA: Doskonały wynik oznacza, że nie ma błędu pamięci roboczej.
  3. Wybierz prędkość, odległość i przyspieszenie myszy w oprogramowaniu do analizy i oblicz średnie dla każdego dnia. Należy upewnić się, że z tych analiz wyłączone są cztery dodatkowe wizyty w ramieniu. Zmierz również czas trwania czterech dodatkowych wizyt w ramionach, przeglądając filmy ze śledzeniem myszy po eksperymencie.
    UWAGA: Myszy mogą wykonywać szybkie skręty natychmiast po wejściu w ramię. Nie licz i nie oceniaj tego jako wpisu, ponieważ jest to szybka korekta błędu, co oznacza, że pamięć robocza jest prawidłowa49. Jeśli jednak mysz przekroczy środek ramienia lub pozostanie w ramieniu dłużej niż 3 sekundy, policz i oceń wpis. Dzienne wskaźniki sukcesu wskazują na krzywe uczenia się myszy, a doskonałe wyniki współczynnika prób wskazują na skuteczność zachowywania pamięci roboczej.

11. Statystyki

  1. Jeśli badasz różnicę między kontrolką a linią myszy z nokautem, jak to zrobiono w poprzedniej publikacji50, wykonaj statystyki zgodnie z opisem poniżej.
    1. Porównaj uzyskane dane z grupy kontrolnej i eksperymentalnej za pomocą powtarzanych pomiarów, dwukierunkowej ANOVA z analizą post hoc (np. test Bonferroniego) [mierząc każdego uczestnika w 9 różnych punktach czasowych].
    2. Jeśli porównujesz grupy, przetestuj co najmniej 10, a najlepiej ~20 myszy w każdej grupie. Tam, gdzie efekt manipulacji genami, tworzenia zmian chorobowych lub leczenia farmakologicznego jest oczywisty, rozmiary próbek mogą być mniejsze do wniosku.

Wyniki

Niniejszy protokół został wykorzystany w naszej poprzedniej publikacji, w której badaliśmy, czy nowe oligodendrocyty i osłonki mielinowe są niezbędne do wykonania zadań związanych z pamięcią operacyjną w przestrzeni, wykorzystując myszy MyRF cKO oraz grupę kontrolną50. Stwierdziliśmy, że wyniki w zadaniu pamięci operacyjnej uległy poprawie u myszy kontrolnych, ale nie u myszy MyRF cKO. Zadanie pamięci operacyjnej stymulowało i promowało proliferację i różnicowanie komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPCs) oraz mielinizację oligodendrocytów (OL) w obszarach mózgu związanych z przetwarzaniem pamięci operacyjnej u myszy typu dzikiego. Przeprowadziliśmy również zadanie naprzemienne z nagrodą w labiryncie T (T-maze rewarded alternation task), aby ocenić pamięć operacyjną w przestrzeni. Zadanie to wykonano w celu wykrycia deficytów pamięci operacyjnej u myszy MyRF cKO. Jednak w analizie histologicznej nie zaobserwowano istotnych różnic między grupą myszy, która wykonywała zadanie naprzemienne w labiryncie T, a grupą kontrolną przebywającą w klatkach domowych. W związku z tym stwierdziliśmy, że przedstawiony tutaj protokół jest skuteczniejszy w badaniu pamięci operacyjnej niż zadanie naprzemienne z nagrodą w labiryncie T.

Każda mysz przechodziła 6 prób zadania pamięci operacyjnej dziennie, które łącznie trwały jedną godzinę. W związku z tym protokół ten pozwalał na włączenie maksymalnie 8 myszy do jednej kohorty. W pierwszych dniach habituacji myszy spędzały nierówną ilość czasu w ramionach labiryntu, a ich ruchy były powolne. Pozostawały one na końcach ramion przez długi czas. Do końca 5. dnia habituacji w labiryncie spędzały one zmiżny czas w ramionach i mogły powrócić do centralnego węzła bez dotknięcia nagród (Rycina 3A). Jednak w szóstym dniu zwierzęta weszły do każdego ramienia co najmniej raz w ciągu 8-15 min i spędziły w każdym ramieniu podobny czas, co wskazało, że zwierzęta zostały przyzwyczajone do labiryntu i są gotowe do wykonania zadania (Rycina 3A, dzień 6 dolny rząd oraz Rycina 3B).

Podczas etapów habituacji zwierzęta często stawały na tylnych kończynach i spoglądały w górę z ramion lub centralnego węzła. Podobne zachowanie obserwowano podczas zadania pamięci roboczej, jednak myszy niekoniecznie poruszały się w tym samym kierunku (np. 2 -> 3-> 5 -> 8 [zgodnie z ruchem wskazówek zegara] lub 8 -> 5 -> 3 ->2 [przeciwnie do ruchu wskazówek zegara]). Mogły one zmieniać swój kierunek (np. 5 -> 4 -> 6 -> 1). U poszczególnych myszy nie zaobserwowano wyraźnej wspólnej tendencji do wyboru określonej sekwencji ramion. Myszy miały tendencję do spędzania nieco więcej czasu na wyborze ostatniego nagrodzonego ramienia niż pierwszego nagrodzonego ramienia podczas swobodnego biegu. Prawdopodobnie wynikało to z faktu, że przy pierwszym wyborze w swobodnym biegu miały cztery dostępne opcje, a przy ostatniej nagrodzie tylko jedną opcję. Pierwsze ramię w fazie wymuszonego biegu było prezentowane myszom co najmniej 50 (15+15+15+5) s przed rozpoczęciem swobodnego biegu. W związku z tym to zadanie pamięci roboczej nie było łatwe do wykonania bez błędów pamięci roboczej. Wideo uzupełniające 1 przedstawia mysz wykonującą idealną próbę ósmego dnia treningu zadania pamięci roboczej.

Stosując dowolny z systemów punktacji, stwierdziliśmy, że ich wyniki były niemal stałe przez pierwsze 3 dni 9-dniowego okresu testowania w RAM, lecz uległy znaczącej poprawie po tym czasie (Rycina 4A, B). Po 6 dniach habituacji i 9 dniach treningu w labiryncie, samce myszy C57BL/6 regularnie osiągały od 8 i dnia dzienny wskaźnik sukcesu ≥ 80 %, zdefiniowany jako 4/(4+E), gdzie E oznacza liczbę błędów. Średnia odległość przebyta podczas biegów swobodnych ulegała skróceniu z czasem, natomiast średnia prędkość i przyspieszenie pozostawały w dość stałych wartościach z dnia na dzień (Rycina 4C-F). Myszy mogły wykształcić pamięć lękową związaną z byciem złapanymi podczas czterech dodatkowych wizyt w ramionach labiryntu, co mogło być jedną z przyczyn, dla których myszy spędzały więcej czasu pod koniec eksperymentu (Rycina 4G).

W niniejszym protokole etapy habituacji trwały 6 dni, co mogło doprowadzić do dostosowania zegara biologicznego do eksperymentu, nawet jeśli cykl światło/ciemność nie został odwrócony w pomieszczeniu dla zwierząt.

Układ labiryntu radialnego do eksperymentów behawioralnych; schemat z modułowymi ramionami, otworem na pokarm i układem laboratorium.
Rysunek 1: Specyfikacje i cechy RAM. (A) Widoki labiryntu z zamontowanej na suficie kamery CCD oraz z boku, a także wymiary. (B) Otwór na pokarm został umieszczony 1,5 cm poniżej poziomu podłogi labiryntu, aby myszy nie mogły zobaczyć zawartości z odległości >10 cm. (C) Ustawienie areny labiryntu. Przedstawiono centralny punkt oraz ramiona 1-8. (D) Schemat pomieszczenia eksperymentalnego oraz zewnętrznych wskazówek wizualnych wraz z fotografią pomieszczenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat etapów habituacji; śledzenie zachowania myszy w labiryncie; obejmuje przepływ zadań i warunków.
Rycina 2: Schematy blokowe programów sterujących labiryntem. (A) Etap habituacji 1 (dni 1 i 2). (B) Etap habituacji 2 (dni 3 i 4). (C) Etap habituacji 3 (dni 5 i 6). (D) Zadanie pamięci roboczej (dni 7-15). (E) Schemat paradygmatu zadania pamięci roboczej. Myszy przechodziły przez cztery pseudolosowo wybrane ramiona biegu wymuszonego, były zatrzymywane w centralnym hubie przez 5 s, a następnie przechodziły do biegu swobodnego w celu zebrania pozostałych nagród. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces habituacji myszy; eksperyment w labiryncie z wynikami śledzenia ścieżki i tabelą czasu trwania prób.
Rysunek 3: Mapy ciepła i mapy gniazd ptasich podczas 6-dniowej habituacji. (A) Mapy ciepła trajektorii myszy podczas dni habituacji 1–6 dla trzech myszy. W dniach habituacji 3–6 myszy przechodziły dwie próby dziennie; górne mapy ciepła przedstawiają pierwsze próby, a dolne drugie próby. (B) Mapy gniazd ptasich dla 6. dnia habituacji. Górne trzy mapy przedstawiają pierwsze próby, a dolne trzy drugie próby myszy 1, 2 i 3. Dolna tabela zawiera czasy trwania prób dla tych samych trzech myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy analizujące wskaźniki behawioralne myszy w ciągu 9 dni: wskaźnik sukcesu, cm, cm/s, cm/s², sekundy.
Rysunek 4: Zadanie RAM oceniające pamięć roboczą. (A) Średni dzienny wskaźnik sukcesu (%), obliczony według wzoru [4/(liczba wejść do ramion podczas wolnego biegu) x 100]. Wyniki z 6 prób uśredniono dla danego dnia. (B) Liczba prób wykonanych perfekcyjnie w ciągu 9 dni zadania. (C) Indywidualne dystanse przebyte oraz średnia. (D) Indywidualne prędkości biegu myszy podczas zadania oraz średnia. (E) Indywidualne przyspieszenia myszy oraz średnia. (F) Indywidualne opóźnienia myszy oraz średnia. (G) Indywidualne i średnie czasy trwania dodatkowych 4 wizyt w ramionach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo uzupełniające 1: Mysz wykonuje próbę bezbłędną w 8. dniu treningu zadania pamięci roboczej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Przykładowy arkusz rejestracji. Zapisuj sekwencję odwiedzin ramion podczas obserwacji zachowania myszy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Trenowanie i testowanie pamięci roboczej w RAM
Pamięć robocza to proces poznawczy, który pozwala na przechowywanie ograniczonej ilości informacji przez krótki czas, podczas gdy są one manipulowane i wykorzystywane w planowaniu oraz wykonywaniu zadania umysłowego. Przykłady obejmują zapamiętanie kodu wejściowego do drzwi w odległym miejscu lub zapamiętanie drogi do konkretnego celu. Zadanie dual N-back oraz zadanie zakresu przestrzennego (spatial span task) to powszechnie stosowane zadania badające wizuoprzestrzenną pamięć roboczą, w których badani ludzie są proszeni o zapamiętanie lokalizacji, tożsamości i kolejności czasowej bodźców. Takeuchi i wsp. odkryli w swoim badaniu z użyciem MRI, że stopień treningu w skutecznych zadaniach pamięci roboczej u ludzi, w tym zadania dual N-back, koreluje ze zwiększoną anizotropią frakcyjną w przedniej części ciała spoidła wielkiego51. W naszym wcześniejszym badaniu50, z wykorzystaniem protokołu opisanego w niniejszej pracy, stwierdziliśmy, że liczba mielinizujących oligodendrocytów wzrosła w przednim spoidle wielkim oraz w innych obszarach mózgu, które uważa się za zaangażowane w przetwarzanie pamięci roboczej, w tym w przedniej części kory zakrętu obręczy, która prawdopodobnie odpowiada za uwagę. Wzrost liczby oligodendrocytów ściśle koreluje z wynikami w zadaniu pamięci roboczej, co jest zgodne z badaniami u ludzi przeprowadzonymi przez Takeuchi i wsp.50,51,52. Konieczne jest jednak nadal zbadanie, czy istnieją podobieństwa w procesach psychologicznych między ludźmi a myszami (np. w elektrofizjologii). Pamięć robocza jest ściśle powiązana z uwagą. Koreluje ona z miarami „inteligencji płynnej” u ludzi i jest istotna dla uczenia się, dlatego jej badanie jest ważne. Olton i Samuelson opisali zadanie w 8-ramiennym labiryncie radialnym (RAM) służące do trenowania i oceny pamięci przestrzennej u szczurów20. W eksperymencie z wolnym wyborem w każdym ramieniu labiryntu umieszczono 0,1 g paszy dla szczurów, której nie uzupełniano podczas testu. W związku z tym w jednym teście można było uzyskać tylko osiem nagród. Wszystkie ramiona były otwarte, a szczury miały bezpośredni dostęp do każdego z nich podczas eksperymentu. Ponieważ nagrody pokarmowe nie były uzupełniane, szczury musiały korzystać z pamięci roboczej, aby uniknąć ponownego odwiedzania wcześniej odwiedzonych ramion, w celu odzyskania jak największej liczby nagród przed zakończeniem zadania. Każdego szczura umieszczano na początku w centralnym punkcie i pozwalano mu wchodzić do dowolnego ramienia według uznania, aby odzyskać nagrodę pokarmową, aż do momentu dokonania 16 wyborów ramion lub upływu 10 min. Olton i wsp. zliczyli liczbę różnych ramion odwiedzonych przez szczury w ciągu pierwszych 8 wyborów i stwierdzili, że w ciągu 10 dni wszystkie szczury wybrały średnio ponad 7 różnych ramion20. Przetestowaliśmy podobny protokół u myszy i odkryliśmy, że myszy, w przeciwieństwie do szczurów, przez kilka dni wykazywały zachowanie typu „daisy-chaining” (odwiedzanie ramion sekwencyjnie) i nie zmieniły swojej strategii później, co niweczyło cel oceny ich pamięci roboczej. Dlatego mysz była więziona w centralnym punkcie pomiędzy wizytami w ramionach, z nadzieją, że ograniczenie ruchu w punkcie centralnym zapobiegnie zachowaniu typu daisy-chaining.

Olton i wsp. zamykali szczury w centralnym węźle na 1 min lub 15 s, aby zakłócić każdą sekwencję wyborów. Zapobiegło to przyjęciu przez zwierzęta typowej tendencji do ciągłego poruszania się po labiryncie zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do nich20,53. Jeśli wybór każdego ramienia jest losowy, jednakowo prawdopodobny i całkowicie niezależny od poprzednich wyborów, eksperyment stanowi przykład klasycznego „problemu zajętości” (occupancy problem)20, zatem prawdopodobieństwa p(n,8) wybrania n różnych ramion podczas pierwszych ośmiu kolejnych wizyt w ramionach wynoszą: p(1,8)=4.8x10-7, p(2,8)=4.2x10-4, p(3,8)=0.019, p(4,8)=0.17, p(5,8)=0.42, p(6,8)=0.32, p(7,8)=0.067, p(8,8)=0.0024. Na podstawie tych prawdopodobieństw można obliczyć, że średnie prawdopodobieństwo losowego wyboru różnych ramion wynosi 5,3 (wartość oczekiwana = Formuła sumowania dla rozkładu prawdopodobieństwa; Σi=1^8 i×p(i,8); równanie matematyczne. = 5,25; 5,3/8= 66%) z 8. Olton i wsp. zgłosili, że w ciągu 10-dniowego okresu treningu szczury wchodziły średnio do 5,7/8 różnych ramion (71%; zakres: 4,2-6,6) w dniach 1-5, co wzrosło do 7,6/ 8 różnych ramion (95%; zakres: 7,2-8,0) w dniach 6-1020, co jest wartością istotnie wyższą niż wynik losowy. Wskazało to, że szczury wykorzystują pamięć roboczą, aby unikać ramion, w których zabrakło pożywienia. Spróbowaliśmy podobnego podejścia u myszy, zamykając je w centralnym węźle na 5 s pomiędzy wizytami w ramionach. Myszy wchodziły średnio do 5,7/ 8 różnych ramion podczas próby 8-ramiennej w dniach 1-5 (71%; zakres: 5,2-5,8; jedenaście myszy C57BL/6) oraz do 5,9/ 8 ramion w dniach 6-10 (74%; zakres: 5,7-6,5; jedenaście myszy C57BL/6). W związku z tym myszy nie były w stanie nauczyć się lub uczyły się bardzo powoli poprawiać swojej skuteczności w znajdowaniu nagrody istotnie powyżej poziomu losowego w ciągu 10 dni eksperymentu. Zatem powyższe protokoły uznano za nieodpowiednie dla myszy, decydując się zamiast tego na paradygmat „biegu wymuszonego/biegu wolnego” (forced run/free run), podobny do opisanego dla szczurów przez Sasaki i wsp.27

W protokole Sasaki i wsp.27 wszystkie ramiona zostały zwabione przynętami na początku eksperymentu, nagrody nie były uzupełniane, a każdy szczur został początkowo zamknięty w centralnym hubie otwartego, wyniesionego 8-ramiennego labiryntu RAM. Następnie szczury były uwalniane do każdego z 4 wcześniej wybranych ramion, po jednym ramieniu na raz, bez zamykania ich w ramionach i hubie centralnym pomiędzy wizytami w ramionach (tzw. „wymuszony bieg” – forced run). Po wizycie w 4tym ramieniu szczur wracał do hubu centralnego, a następnie natychmiast otwierano wszystkie drzwi, aby umożliwić szczurowi dowolne odwiedzanie wszystkich ramion (tzw. „wolny bieg” – free run). Aby w najbardziej efektywny sposób zebrać wszystkie pozostałe nagrody żywieniowe podczas wolnego biegu, zwierzęta muszą zapamiętać i unikać ramion, które odwiedziły już podczas biegów wymuszonych lub wolnych. Zastosowaliśmy bardzo podobne podejście (Rycina 2E) u myszy. Dziesięciominutowe okresy habituacji na początku każdego dnia treningu RAM w pracy Sasaki i wsp.27 zastąpiono jednorazowym 6-dniowym okresem habituacji przed rozpoczęciem treningu. Kolejną wprowadzoną modyfikacją było umożliwienie myszom wykonania czterech dodatkowych wizyt w ramionach na koniec każdej próby, po odzyskaniu wszystkich nagród. Miało to na celu wzmocnienie faktu, że nagrody w wcześniej odwiedzonych ramionach nie są uzupełniane. Ponadto, ponieważ myszy uczą się „unikać żalu” (avoid regret)54,55, może to zniechęcać do zachowań typu „daisy-chaining” (szeregowe odwiedzanie sąsiadujących ramion) w następnej próbie, ponieważ takie zachowanie nie zostałoby nagrodzone podczas czterech dodatkowych wizyt w ramionach bezpośrednio przed rozpoczęciem kolejnej próby. Innym powodem wprowadzenia czterech dodatkowych wizyt w ramionach była chęć zapobieżenia kojarzeniu przez myszy sukcesu w odzyskaniu wszystkich nagród z potencjalnie stresującym doświadczeniem złapania przez eksperymentatora na koniec zadania. Myszy mogły wykształcić pamięć lękową podczas łapania ich w trakcie czterech dodatkowych wizyt w ramionach, co mogło być jedną z przyczyn dłuższego czasu spędzanego przez nie pod koniec eksperymentu (Rycina 4G). Rzeczywiście, myszy przerywały zachowania typu daisy-chaining podczas czterech dodatkowych wizyt w ramionach, jeśli wykazywały je w trakcie próby. Ponadto, podczas wymuszonego biegu myszy były zamykane w każdym ramieniu na 15 s, a następnie w hubie centralnym na 5 s przed otwarciem wszystkich drzwi w celu rozpoczęcia wolnego biegu. Bez zamykania myszy w hubie centralnym, zwierzęta miały tendencję do daisy-chainingu, jak opisano powyżej.

W przypadku wymuszonego biegu wybrano jedną z pięciu 4-ramiennych sekwencji pseudolosowych, które zawierają maksymalnie 3 sąsiadujące ramiona. Były to sekwencje (1,3,5,7), (2,4,5,8), (1,4,5,7), (2,3,4,7), (1,2,5,6) oraz ich warianty o różnej kolejności ramion i rotacjach, przy numerowaniu ramion od 1 do 8 zgodnie z ruchem wskazówek zegara, zaczynając od góry (Rysunek 1C). Każda mysz w kohorcie przechodziła sześć prób (jedna próba = wymuszony bieg + 5 s uwięzienia w centralnym węźle + bieg swobodny) dziennie podczas 9-dniowego etapu po habituacji w teście RAM. Jeśli podczas biegu swobodnego mysz odwiedziła tylko cztery ramiona, aby odebrać wszystkie cztery nagrody pozostałe po wymuszonym biegu, uznawano to za „próbę idealną”. Wyniki z 9 dni treningu określano za pomocą „dziennego wskaźnika sukcesu”, obliczanego jako 4/(4+E), gdzie E oznacza liczbę błędów podczas biegu swobodnego, lub jako proporcję prób, które były „próbami idealnymi” (tj. E=0). Na przykład, jeśli mysz potrzebowała 7 wizyt w ramionach, aby odebrać 4 pozostałe nagrody podczas biegu swobodnego, „dzienny wskaźnik sukcesu” wynosiłby 4/7 = 0,57 lub 57%, natomiast próba idealna otrzymałaby 100% w tej skali; jeśli mysz wykonała 5 prób idealnych w ciągu dnia, wskaźnik prób idealnych wynosiłby 5/6 = 83,3%.

Dzienne wskaźniki skuteczności osiągane poprzez strategię łańcuchową (daisy-chaining) zostały obliczone ręcznie dla każdego z zastosowanych 4-ramiennych wzorców wymuszonego biegu (opisanych w poprzednim akapicie), przy założeniu, że myszy rozpoczynają swój bieg swobodny losowo w dowolnym z 8 ramion RAM. Średni wynik uzyskany w wielu próbach dzięki strategii łańcuchowej wynosi od 53% do 56% dla poszczególnych wzorców wymuszonego biegu w ramionach, lub ~55% dla ogólnych wzorców ramion. Prawdopodobieństwo uzyskania wyniku idealnego (100%) poprzez strategię łańcuchową wynosi zero, a prawdopodobieństwo uzyskania go poprzez losowe odwiedzanie ramion wynosi <1% (4/8 x 3/7 x 2/7 x 1/7 = 0,87%), przy założeniu, że myszy nigdy nie wracają do ramienia, z którego właśnie wyszły. Zatem średnie dzienne wskaźniki skuteczności (>80%) oraz procent idealnych wyników prób (>60%) osiągnięte przez nasze myszy w ciągu ostatnich 2 dni 9-dniowego okresu testowego (Rysunek 4A,B) mogły być osiągane konsekwentnie wyłącznie przy użyciu strategii opartej na pamięci roboczej.

Myszy zaznajomione z zadaniem miały tendencję do przebywania przy ostatniej studni z pokarmem lub w centralnym węźle po spożyciu wszystkich nagród, a także spędzały więcej czasu podczas dodatkowych czterech wizyt w ramionach na koniec zadania (Rysunek 4G). Sugeruje to, że nauczyły się „zasady”, iż każde ramię zawiera dokładnie jedną nagrodę, oraz że potrafią śledzić fakt, iż odwiedziły wszystkie dostępne ramiona. W przypadku myszy o innym tle genetycznym niż stosowane w niniejszym badaniu (C57BL/6) wyniki mogą się różnić, ponieważ tło genetyczne ma znaczenie w eksperymentach behawioralnych56,57,58. Jednak w naszym poprzednim badaniu50, z wykorzystaniem myszy o mieszanym tle C57BL/6, CBA, 129P2, ale krzyżowanych wstecznie z myszami C57BL/6J, stwierdzono, że ich wyniki w zadaniu pamięci roboczej znacznie poprawiły się przy zastosowaniu opisanego tutaj protokołu, a mniej myszy stosowało strategię łańcuchową (daisy-chaining) podczas swobodnego biegu. Koike i wsp.59 donosili, że wszystkie inbredowe podlinie myszy 129 niosą polimorfizm delecyjny Disc-1, składający się z delecji 25 bp w eksonie 6 genu Disc-1, co powoduje przesunięcie ramki odczytu i trunkację białka DISC-1, wpływając na jego funkcjonalność60,61. Mutacja ta spowodowała upośledzenie pamięci roboczej w badaniu z wykorzystaniem zadania opóźnionej alternacji w labiryncie T59, który jest innym labiryntowym zadaniem typu win-shift motywowanym apetytem, co może wyjaśniać, dlaczego myszy kontrolne w naszym poprzednim badaniu50 uzyskały nieco niższe wyniki pamięci roboczej niż inbredowe myszy C57BL/6. Zawsze używamy myszy, których masa ciała mieści się w normalnym zakresie dla danego wieku i szczepu, aby uniknąć trudności w utrzymaniu ich wagi na poziomie od 85% do 90%. Wielkość miotu może wpływać na pamięć przestrzenną i zachowania lękowe ze względu na nadmierne karmienie we wczesnej fazie życia w szczepie zwanym NMRI62. Mała wielkość miotu powoduje nadmierne karmienie i zwiększenie masy ciała w obu szczepach myszy, NMRI i C57BL/6. Jednak oba szczepy różnie rozwiązywały zadania uczenia przestrzennego. Podczas gdy myszy C57BL/6 nie wykazały różnic między małym a kontrolnym rozmiarem miotu, myszy NMRI wykazały istotne upośledzenie w fazie uczenia się w teście wodnego labiryntu Morrisa (MWM) oraz lekkie upośledzenie w zadaniu spontanicznej alternacji w labiryncie Y, choć nie było ono istotne statystycznie. Co więcej, mała wielkość miotu znacząco obniżyła poziom białka neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) w hipokampie i zwiększyła zawartość białka interleukiny-1b (IL-1b) w hipokampie po testach MWM i w labiryncie Y u szczepu NMRI. Zmiany te nie zostały jednak zaobserwowane u szczepu C57BL/6. Szczep myszy NMRI wykazał istotny wzrost zachowań lękowych i poziomu kortykosteronu indukowanego stresem przy wychowywaniu w małych miotach. W przeciwieństwie do tego, małe mioty u szczepu C57BL/6 prowadziły do redukcji zarówno zachowań lękowych, jak i poziomów kortykosteronu. Dlatego podczas projektowania eksperymentów behawioralnych ważne jest uwzględnienie wielkości miotu szczepu myszy.

Różnice behawioralne między szczurami a myszami
Większość zadań poznawczych została pierwotnie zaprojektowana dla szczurów. Ponadto uczenie się i pamięć przestrzenna były szeroko badane u szczurów. Ze względu na przewagę współczesnych technologii transgenicznych i modyfikacji genomu u myszy, badacze często stosują protokoły opracowane dla szczurów w odniesieniu do myszy. Istnieją jednak stałe różnice behawioralne między szczurami a myszami3,4,5,6,7. Na przykład wykazują one odmienne preferencje (preferencje społeczne u szczurów i preferencje pokarmowe u myszy)3 oraz stosują różne strategie w rozwiązywaniu zadań w labiryntach (labirynty wodne lub lądowe)4. Ponadto myszy mają tendencję do dłuższego czasu osiągania dobrych wyników w uczeniu przestrzennym w 8-ramiennym RAM4,8,9, co jest jednym z powodów, dla których myszy są ogólnie uważane za mniej sprawne od szczurów w zadaniach z zakresu uczenia przestrzennego.

Szczury i myszy różnią się również w zakresie ogólnego zachowania i charakteru, w tym w reakcjach na stres oraz w zarządzaniu lękiem3,4,5,6,7,10. Na przykład wcześniejsze badania wykazały upośledzone uczenie się wygaszania lęku u myszy w okresie dojrzewania11,12,13,14, czego nie zaobserwowano u szczurów15,16,17,18. Ponadto myszy są bardziej podatne na stres i nie lubią być dotykane w porównaniu ze szczurami, które po oswojeniu z kontaktem z człowiekiem najwyraźniej lubią być łaskotane przez badacza i próbują wchodzić z nim w interakcje, aby uzyskać więcej łaskotania19. Zatem zarządzanie lękiem jest istotnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę podczas badania zachowania myszy. Ponadto Borrow i wsp.63 zgłosili, że przewlekły stres zmienny obniża poziom mRNA oksytocyny i zwiększa objętość somy neuronów oksytocynowych w jądrze przykomorowym. Dodatkowo ostatnie badania wykazały, że transport w tunelach może zmniejszyć stres i poprawić wyniki w eksperymentach behawioralnych38,39,40. W związku z tym ważne jest unikanie stresowania myszy podczas lub przed eksperymentami behawioralnymi.

Myszy nie lubią przebywać na otwartej przestrzeni, na przykład w teście otwartego pola lub w labiryncie podwyższonego krzyża, preferując miejsca bardziej zamknięte i ciemniejsze64,65. W kontekście RAM centralny węzeł jest najbardziej otwartą przestrzenią i to stamtąd myszy decydują, do którego ramienia udać się w następnej kolejności. Jeśli odczuwają lęk w centralnym węźle, mogą zostać rozproszone i uzyskać wyniki poniżej normy. Z tego powodu zdecydowaliśmy się chwytać myszy w jednym z ramion promieniowych (patrz część procedura), a nie w centralnym węźle, aby nie kojarzyły one węzła z lękowym doświadczeniem.

Podczas eksploracji 8-ramiennego labiryntu radialnego (RAM) w celu zdobycia nagród pokarmowych, szczury wychodzące z danego ramienia mają tendencję do skręcania pod kątem prostym w kierunku następnego ramienia, pomijając ramię pośrednie, i rzadko odwiedzają ramiona sekwencyjnie (co określamy mianem „strategii łańcuchowej”); innymi słowy, szczury mają tendencję do odwiedzin w kolejności 1,3,5,7, a nie 1,2,3,4 20,53,66. W przeciwieństwie do nich, myszy często przyjmują strategię łańcuchową, co wynika prawdopodobnie z ich wielkości ciała i elastyczności. Strategia łańcuchowa jest dla myszy dość efektywnym sposobem odzyskiwania nagród pokarmowych, jednak stanowi ona istotną wadę dla eksperymentatora próbującego przetestować przestrzenną pamięć roboczą, ponieważ omija ona cel eksperymentu67. Jednakże ekspozycja na stres może wpływać na zdolność uczenia się i zmieniać strategię uczenia się68. Ponieważ podejście łańcuchowe może wskazywać na stres, ważne jest upewnienie się, że myszy nie są zestresowane. Opisujemy nasz obecny protokół jako bezstresowy dla myszy podczas zadania pamięci roboczej, ponieważ myszy nie stosują w nim strategii łańcuchowej.

Znane jest, że myszy podczas nawigowania w labiryncie w większym stopniu polegają na dystalnych wskazówkach wizualnych niż na wskazówkach proksymalnych48,69,70. Stwierdziliśmy, że wprowadzenie dodatkowych proksymalnych wskazówek wizualnych, wydrukowanych na kartkach papieru i umieszczonych na tylnych ścianach wszystkich ramion, nie ograniczyło takiego zachowania, co jest zgodne z twierdzeniem Oltona i współpracowników w odniesieniu do szczurów20. Jednakże w jednym z eksperymentów umieszczenie znaczników w ramionach docelowych jako wskazówek wewnątrzlabiryntowych pomogło myszom w rozwiązaniu zadania testowania pamięci referencyjnej i pamięci roboczej w radialnym labiryncie 6-ramiennym w większym stopniu niż wskazówki zewnątrzlabiryntowe71. Co więcej, różne linie myszy wykazują odmienne zdolności wizualne72, ale ich zdolność do uczenia się wizualno-przestrzennego i pamięć testowane w labiryncie Barnesa niekoniecznie odzwierciedlały ich sprawność wzrokową, co sugeruje, że myszy o słabych zdolnościach wizualnych, takie jak BALB/c, mogą polegać na innych procesach mózgowych. Zatem badacze muszą rozważyć, jakie wskazówki chcą wykorzystać, aby najlepiej dostosować je do swoich eksperymentów.

Redukcja lęku u myszy podczas manipulacji
Dobrze wiadomo, że stres związany z manipulacją wpływa na fizjologię i zachowanie zwierząt73,74,75,76,77. Ponadto Sandi i wsp. wykazali, że upośledzenie pamięci przestrzennej wywołane ostrym stresem wiąże się ze zmniejszoną ekspresją cząsteczki adhezyjnej komórek neuronalnych (NCAM) w hipokampie i korze przedczołowej; badanie przeprowadzono na szczurach w zadaniu wodnego labiryntu zależnym od hipokampu, wykorzystując samicę kota jako stresor pomiędzy ostatnią próbą uczenia a testem sprawdzającym78, co sugeruje, że hipokamp i kora przedczołowa są podatne na wysokie poziomy stresu. Dlatego ważne jest ograniczenie stresu i lęku u zwierząt doświadczalnych, aby uniknąć niewyjaśnionych różnic w obrębie i pomiędzy badaniami zwierzęcymi. W szczególności zadania sprawdzające pamięć roboczą wymagają od zwierząt koncentracji, dlatego należy unikać niepotrzebnych rozpraszaczy. Publikowane protokoły testowania pamięci roboczej u szczurów, lub jednocześnie pamięci roboczej i referencyjnej, często nie zawierają istotnych szczegółów, takich jak sposób, czas i miejsce usuwania zwierząt z labiryntu po zakończeniu zadania. Ponieważ myszy wykazują mniejszą socjalizację z opiekunem niż szczury i są bardziej podatne na stres, takie szczegóły są ważniejsze w eksperymentach z myszami. Gryzonie mogą rozwijać pamięć epizodyczną, która jest formą jawnej pamięci długotrwałej obejmującej zapamiętywanie czasu, lokalizacji i związanych z nimi emocji79,80,81. Dlatego zdecydowaliśmy, aby nie usuwać myszy z labiryntu natychmiast po zebraniu wszystkich nagród pokarmowych w RAM, lecz pozwolić im na wykonanie czterech kolejnych wizyt w ramionach bez otrzymania nagród. Zrobiono to, aby zapobiec kojarzeniu pomyślnego odzyskania wszystkich nagród z potencjalnie lękowym doświadczeniem chwytania przez eksperymentatora, co jest istotne zwłaszcza w początkowej fazie uczenia w RAM. Ponadto dodatkowe cztery nienagradzane wizyty w ramionach mogą wzmocnić fakt, że nagrody pokarmowe nie są uzupełniane w ramionach, które myszy już odwiedziły. Jeśli manipulacja nie jest zbyt stresująca dla myszy, częściej wchodzą one w interakcję z eksperymentatorem38. Aby uniknąć stresu, na początku eksperymentu RAM należy podnieść mysz z klatki domowej za pomocą papierowej rurki znajdującej się w klatce, dostarczonej podczas oddzielania ich z klatki grupowej do eksperymentu38, lub pozwolić myszy dobrowolnie wejść na dłoń eksperymentatora podczas manipulacji w klatce domowej przed eksperymentem oraz podczas przenoszenia z klatki domowej do labiryntu. Podczas wyjmowania myszy z labiryntu na koniec eksperymentu, nie należy ich gonić w labiryncie, lecz zablokować wejście do ramienia labiryntu jedną ręką i pozwolić myszom dobrowolnie na nią wejść, jednocześnie zakrywając ramię labiryntu drugą ręką, aby zapobiec wyskoczeniu myszy z labiryntu. Redukuje to stres związany z byciem ściganym w labiryncie lub chwytaniem za ogon. W przypadku myszy eksperymentatorzy mężczyźni bywają czasami bardziej stresujący niż eksperymentatorki82. Jednakże, zwracając uwagę na opisane tutaj kroki redukujące stres, stwierdzono, że eksperymentatorzy mężczyźni mogli przeprowadzać testy RAM bez większych problemów. Zatem sposób manipulacji myszami jest ważniejszy.

Różnice ze względu na płeć
W opisanych tutaj eksperymentach wykorzystano wyłącznie myszy samce ze względu na zróżnicowany wpływ płci na poznawanie, uczenie się i pamięć obserwowany u różnych gatunków (gryzoni i ludzi), a także ze względu na różnice w odpowiedziach na stres między samcami a samicami63,83,84,85,86,87. Jednakże, interpretując wyniki uzyskane na gryzoniach pod kątem potencjalnych korzyści dla ludzi, istotne jest badanie obu płci. Wytyczne NIH oraz innych rad finansujących sugerują również stosowanie zarówno zwierząt samców, jak i samic.

Zalety protokołu
Nasz półautomatyczny radialny labirynt 8-ramienny to zamknięty labirynt z nieprzezroczystymi białymi ściankami akrylowymi, ale bez pokryw (wymiary przedstawiono na Rysunku 1A). Podczas nawigacji po labiryncie myszy nie widzą eksperymentatora, co w przypadku labiryntów z przezroczystymi ściankami lub otwartymi, wyniesionymi ramionami może rozpraszać, natomiast widzą one zewnętrzne sygnały wizualne znajdujące się powyżej labiryntu (patrz Rysunek 1). Ponadto protokół ten jest w zasadzie możliwy do zastosowania w obrazowaniu in vivo i elektrofizjologii w czasie rzeczywistym, ponieważ nad labiryntem nie ma okablowania, a myszy mogą efektywnie nauczyć się tego zadania.

Kierunki przyszłych badań
Obecny protokół trwa 15 dni, od habituacji do zakończenia zadania z pamięcią roboczą. Wykonaliśmy protokół bez przerw w weekendy; jednakże przerwa weekendowa po 6-dniowej habituacji nie powinna znacząco wpłynąć na kolejne 9-dniowe zadanie z pamięcią roboczą. Zastosowanie przerwy weekendowej w trakcie 9-dniowego zadania z pamięcią roboczą może spowolnić proces uczenia się u myszy. W związku z tym obecność dwóch eksperymentatorów, dobrze przeszkolonych w obchodzeniu się z myszami, może pomóc w redukcji stresu u badaczy bez spowolnienia tempa uczenia się zwierząt. Zgodnie z ryciną 4A, B, pierwsze trzy dni są kluczowe, ponieważ po czwartym dniu myszy osiągają średnio więcej niż jedną idealną próbę. Dlatego zaleca się unikanie przerw podczas pierwszych trzech dni. Jeśli zadanie z pamięcią roboczą okaże się zbyt łatwe dla badanej grupy myszy, konieczne może być wydłużenie czasu ograniczenia po wymuszonych biegach. Parametry te powinny być dostosowane do indywidualnych przypadków.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy naszym kolegom z Wolfson Institute for Biomedical Research za pomocne dyskusje oraz Davidowi Bannermanowi (University of Oxford) za porady dotyczące zachowania myszy i za przejrzenie wczesnego szkicu artykułu. Dziękujemy również Matthew Grist za wsparcie techniczne i administracyjne. Badania te zostały sfinansowane przez Wellcome Trust [108726/Z/15/Z i 214286/Z/18/Z] oraz Gerald Choa Neuroscience Institute [PJ8425013].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kleszcze tętnicze lub szczypceDowolnaNie dotyczy Docięcia standardowej karmy
C57BL/6J myszylaboratoryjne Jackson0006642 ~ 3 miesiące
Mleko skondensowane (goździk)NestleNie dotyczyUżywane jako nagroda w zadaniu
Woda destylowanaDowolnanie dotyczyDo czyszczenia i rozcieńczania mleka skondensowanego
EthovisionXT13 NoldusN/A Kontrolujdrzwi labiryntu i mysz śledzącą
- Moduł wielu punktów ciałaNoldusNie dotyczy Dośledzenia wielu punktów ciała
- Próba i Sprzętowy moduł sterującyNoldusN/Ana próbę i Kontrola sprzętu
- skrzynka I/ONoldusN/A Kontrolujdrzwi labiryntu
Dodatkowe wskazówki wizualne ExtramazeDowolnaNie dotyczyDo mapowania labiryntu przez myszy
Kamera o wysokiej rozdzielczościTracksysNie dotyczyDo śledzenia i filmowania myszy
PędzelDowolnyNie dotyczyDo czyszczenia
Tunel papierowyDowolnaNie dotyczyDo obsługi myszy
Papierowe iglooDowolnaN/ADo zagnieżdżania
Papierowe paskiDowolnydotyczyDo zagnieżdżania
Pipetman P1000 GilsonF144059MDo dostarczania rozcieńczonego mleka skondensowanego do klatki domowej
Końcówka pipety P1000Dowolna
pipeta P200GilsonF144058MDo nęcenia labiryntu
Końcówka pipety P200DowolnaDowolna
Labirynt ramienia promieniowegoTracksysN/AWykonane na zamówienie
Lampy pokojoweDowolnaNie dotyczyDla równych Oświetlenie w labiryncie
Mały plastikowy kubekDowolnaNie dotyczyDo dostarczania rozcieńczonego mleka skondensowanego do klatki domowej
Głośniki do białego szumuDowolnaNie dotyczy Doodtwarzania białego szumu
Standardowa chowDowolnaNie dotyczyDo bibuły z ograniczeniami dietetycznymi
DowolnaNie dotyczy Doczyszczenia
soczewek VerifocalTracksysNie dotyczy5-50 mm, ręczne ustawianie ostrości, ręczna przysłona
Drewniany blok do gryzieniaDowolnaNie dotyczyDo zagnieżdżania
probówki wirówkowej 50 mlFalconFalcon™ 352070Do mieszania mleka skondensowanego z wodą destylowaną (1:1)
Nie

Bibliografia

  1. Baddeley, A. Working memory. Science. 255 (5044), 556-559 (1992).
  2. Wang, L., Sheng, A., Chang, L., Zhou, R. Improving fluid intelligence of children through working memory training: The role of inhibition control. Front Psychol. 13, 1025036(2022).
  3. Reppucci, J. C., Brown, L. A., Chambers, A. Q., Veenema, A. H. Wistar rats and C57BL/6 mice differ in their motivation to seek social interaction versus food in the Social versus Food Preference Test. Physiol Behav. 227, 113162(2020).
  4. Whishaw, I. Q., Tomie, J. Of mice and mazes: similarities between mice and rats on dry land but not water mazes. Physiol Behav. 60 (5), 1191-1197 (1996).
  5. Cressant, A., Besson, M., Suarez, S., Cormier, A., Granon, S. Spatial learning in Long-Evans Hooded rats and C57BL/6J mice: different strategies for different performance. Behav Brain Res. 177 (1), 22-29 (2007).
  6. Hok, V., Poucet, B., Duvelle, E., Save, E., Sargolini, F. Spatial cognition in mice and rats: similarities and differences in brain and behavior. Wiley Interdiscip Rev Cogn Sci. 7 (6), 406-421 (2016).
  7. Bisby, M. A., Stylianakis, A. A., Baker, K. D., Richardson, R. Fear extinction learning and retention during adolescence in rats and mice: A systematic review. Neurosci Biobehav Rev. , 1264-1274 (2021).
  8. Mizuno, M., Yamada, K., Olariu, A., Nawa, H., Nabeshima, T. Involvement of brain-derived neurotrophic factor in spatial memory formation and maintenance in a radial arm maze test in rats. J Neurosci. 20 (18), 7116-7121 (2000).
  9. Rai, R., Singh, H. K., Prasad, S. A special extract of Bacopa monnieri (CDRI-08) restores learning and memory by upregulating expression of the NMDA receptor subunit GluN2B in the brain of scopolamine-induced amnesic mice. Evid Based Complement Alternat Med. 2015, 254303(2015).
  10. Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: is it a rat race. Dis Model Mech. 9 (10), 1079-1087 (2016).
  11. Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 176 (2), 210-215 (2007).
  12. Pattwell, S. S., et al. Altered fear learning across development in both mouse and human. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (40), 16318-16323 (2012).
  13. Pattwell, S. S., et al. Dynamic changes in neural circuitry during adolescence are associated with persistent attenuation of fear memories. Nat Commun. 7, 11475(2016).
  14. Riddle, M. C., et al. Caloric restriction enhances fear extinction learning in mice. Neuropsychopharmacology. 38 (6), 930-937 (2013).
  15. Cruz, E., Lopez, A. V., Porter, J. T. Spontaneous recovery of fear reverses extinction-induced excitability of infralimbic neurons. PLoS One. 9 (8), e103596(2014).
  16. Barbayannis, G., et al. Differential effects of stress on fear learning and activation of the amygdala in pre-adolescent and adult male rats. Neuroscience. 360, 210-219 (2017).
  17. Chen, C. V., Chaby, L. E., Nazeer, S., Liberzon, I. Effects of trauma in adulthood and adolescence on fear extinction and extinction retention: advancing animal models of posttraumatic stress disorder. Front Behav Neurosci. 12, 247(2018).
  18. Schipper, P., et al. Impaired fear extinction recall in serotonin transporter knockout rats is transiently alleviated during adolescence. Brain Sci. 9 (5), 9050118(2019).
  19. Ishiyama, S., Brecht, M. Neural correlates of ticklishness in the rat somatosensory cortex. Science. 354 (6313), 757-760 (2016).
  20. Olton, D. S., Samuelson, R. J. Remembrance of places passed - spatial memory in rats. J Exp Psychol Anim Behav Process. 2 (2), (1976).
  21. Kraemer, P. J., Gilbert, M. E., Innis, N. K. The influence of cue type and configuration upon radial-maze performance in the rat. Animal Learning & Behavior. 11, 373-380 (1983).
  22. Wenk, G. L. Assessment of spatial memory using the radial arm maze and Morris water maze. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8 5A), (2004).
  23. Harper, D. N., Dalrymple-Alford, J. C., McLean, A. P. Production of a serial position effect in rats using a 12-arm radial maze. J Neurosci Methods. 44 (2-3), 197-207 (1992).
  24. Schmitt, W. B., Deacon, R. M., Seeburg, P. H., Rawlins, J. N., Bannerman, D. M. A within-subjects, within-task demonstration of intact spatial reference memory and impaired spatial working memory in glutamate receptor-A-deficient mice. J Neurosci. 23 (9), 3953-3959 (2003).
  25. Brown, M. F. The effects of maze-arm length on performance in the radial-arm maze. Animal Learning & Behavior. 18, 13-22 (1990).
  26. Olton, D. S., Papas, B. C. Spatial memory and hippocampal function. Neuropsychologia. 17 (6), 669-682 (1979).
  27. Sasaki, T., et al. Dentate network activity is necessary for spatial working memory by supporting CA3 sharp-wave ripple generation and prospective firing of CA3 neurons. Nat Neurosci. 21 (2), 258-269 (2018).
  28. Jew, K., et al. Selective memory and behavioral alterations after ambient ultrafine particulate matter exposure in aged 3xTgAD Alzheimer's disease mice. Part Fibre Toxicol. 16 (1), 45(2019).
  29. Harvey, R. E., Thompson, S. M., Sanchez, L. M., Yoder, R. M., Clark, B. J. Post-training inactivation of the anterior thalamic nuclei impairs spatial performance on the radial arm maze. Front Neurosci. 11, 94(2017).
  30. Morris, R. G. M. Spatial localization does not require the presence of local cues. Learning and Motivation. 12 (2), (1981).
  31. Buresova, O., Bures, J., Oitzl, M. S., Zahalka, A. Radial maze in the water tank: an aversively motivated spatial working memory task. Physiol Behav. 34 (6), 1003-1005 (1985).
  32. Buresova, O., Bolhuis, J. J., Bures, J. Differential effects of cholinergic blockade on performance of rats in the water tank navigation task and in a radial water maze. Behav Neurosci. 100 (4), 476-482 (1986).
  33. Olton, D. S., Walker, J. A., Gage, F. H. Hippocampal connections and spatial discrimination. Brain Res. 139 (2), 295-308 (1978).
  34. Olton, D. S., Werz, M. A. Hippocampal function and behavior: spatial discrimination and response inhibition. Physiol Behav. 20 (5), 597-605 (1978).
  35. Olton, D. S., Branch, M., Best, P. J. Spatial correlates of hippocampal unit activity. Exp Neurol. 58 (3), 387-409 (1978).
  36. Honig, W. K. Studies of Working Memory in the Pigeon. 38, 1 edn, (1978).
  37. Brolese, G., Lunardi, P., Lopes, F., Gonçalves, C. -A. Chapter 2 - Prenatal Alcohol Exposure and Neuroglial Changes in Neurochemistry and Behavior in Animal Models. , Academic Press. 11-22 (2017).
  38. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing mouse anxiety during handling: Effect of experience with handling tunnels. PLoS One. 8 (6), e66401(2013).
  39. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Sci Rep. 7, 44999(2017).
  40. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Sci Rep. 9 (1), 20305(2019).
  41. Ebbesen, C. L., Froemke, R. C. Body language signals for rodent social communication. Curr Opin Neurobiol. 68, 91-106 (2021).
  42. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  43. Tordoff, M. G., Pilchak, D. M., Williams, J. A., McDaniel, A. H., Bachmanov, A. A. The maintenance diets of C57BL/6J and 129X1/SvJ mice influence their taste solution preferences: implications for large-scale phenotyping projects. J Nutr. 132 (8), 2288-2297 (2002).
  44. Prior, H. Effects of the acoustic environment on learning in rats. Physiol Behav. 87 (1), 162-165 (2006).
  45. Prior, H., Schwegler, H., Ducker, G. Dissociation of spatial reference memory, spatial working memory, and hippocampal mossy fiber distribution in two rat strains differing in emotionality. Behav Brain Res. 87 (2), 183-194 (1997).
  46. Lai, H. Acute exposure to noise affects sodium-dependent high-affinity choline uptake in the central nervous system of the rat. Pharmacol Biochem Behav. 28 (2), 147-151 (1987).
  47. Granon, S., Poucet, B., Thinus-Blanc, C., Changeux, J. P., Vidal, C. Nicotinic and muscarinic receptors in the rat prefrontal cortex: differential roles in working memory, response selection and effortful processing. Psychopharmacology (Berl). 119 (2), 139-144 (1995).
  48. Hebert, M., Bulla, J., Vivien, D., Agin, V. Are distal and proximal visual cues equally important during spatial learning in mice? a pilot study of overshadowing in the spatial domain. Front Behav Neurosci. 11, 109(2017).
  49. Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations. Cell. 157 (4), 845-857 (2014).
  50. Shimizu, T., et al. Oligodendrocyte dynamics dictate cognitive performance outcomes of working memory training in mice. Nat Commun. 14 (1), 6499(2023).
  51. Takeuchi, H., et al. Training of working memory impacts structural connectivity. J Neurosci. 30 (9), 3297-3303 (2010).
  52. Wu, D., et al. Persistent neuronal activity in anterior cingulate cortex correlates with sustained attention in rats regardless of sensory modality. Sci Rep. 7, 43101(2017).
  53. David, S., Olton, C. C., Ann Werz Mary, Spatial memory and radial arm maze performance of rats. Learning and Motivation. 8 (3), 289-314 (1977).
  54. Steiner, A. P., Redish, A. D. Behavioral and neurophysiological correlates of regret in rat decision-making on a neuroeconomic task. Nat Neurosci. 17 (7), 995-1002 (2014).
  55. Sweis, B. M., Thomas, M. J., Redish, A. D. Mice learn to avoid regret. PLoS Biol. 16 (6), e2005853(2018).
  56. Sultana, R., Ogundele, O. M., Lee, C. C. Contrasting characteristic behaviours among common laboratory mouse strains. R Soc Open Sci. 6 (6), 190574(2019).
  57. Marchette, R. C. N., Bicca, M. A., Santos, E., de Lima, T. C. M. Distinctive stress sensitivity and anxiety-like behavior in female mice: Strain differences matter. Neurobiol Stress. 9, 55-63 (2018).
  58. Brooks, S. P., Pask, T., Jones, L., Dunnett, S. B. Behavioural profiles of inbred mouse strains used as transgenic backgrounds. I: motor tests. Genes Brain Behav. 3 (4), 206-215 (2004).
  59. Koike, H., Arguello, P. A., Kvajo, M., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Disc1 is mutated in the 129S6/SvEv strain and modulates working memory in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (10), 3693-3697 (2006).
  60. Gomez-Sintes, R., Kvajo, M., Gogos, J. A., Lucas, J. J. Mice with a naturally occurring DISC1 mutation display a broad spectrum of behaviors associated to psychiatric disorders. Front Behav Neurosci. 8, 253(2014).
  61. Clapcote, S. J., Roder, J. C. Deletion polymorphism of Disc1 is common to all 129 mouse substrains: implications for gene-targeting studies of brain function. Genetics. 173 (4), 2407-2410 (2006).
  62. Salari, A. A., Samadi, H., Homberg, J. R., Kosari-Nasab, M. Small litter size impairs spatial memory and increases anxiety- like behavior in a strain-dependent manner in male mice. Sci Rep. 8 (1), 11281(2018).
  63. Borrow, A. P., Bales, N. J., Stover, S. A., Handa, R. J. Chronic Variable Stress Induces Sex-Specific Alterations in Social Behavior and Neuropeptide Expression in the Mouse. Endocrinology. 159 (7), 2803-2814 (2018).
  64. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).
  65. Võikar, V., Stanford, S. C. The Open Field Test. 190, Humana. New York, NY. 9-29 (2023).
  66. Haga, Y. Effects of food deprivation and food reward on the behavior of rats in the radial-arm maze. Jpn. Psychol. Res. 37 (4), 252-257 (1995).
  67. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55 (2), 310-332 (2014).
  68. Schwabe, L. Stress and the engagement of multiple memory systems: integration of animal and human studies. Hippocampus. 23 (11), 1035-1043 (2013).
  69. Bannerman, D. M., et al. Dissecting spatial knowledge from spatial choice by hippocampal NMDA receptor deletion. Nat Neurosci. 15 (8), 1153-1159 (2012).
  70. Bannerman, D. M., et al. Hippocampal synaptic plasticity, spatial memory and anxiety. Nat Rev Neurosci. 15 (3), 181-192 (2014).
  71. Yoder, R. M., Kirby, S. L. Otoconia-deficient mice show selective spatial deficits. Hippocampus. 24 (10), 1169-1177 (2014).
  72. Wong, A. A., Brown, R. E. Visual detection, pattern discrimination and visual acuity in 14 strains of mice. Genes Brain Behav. 5 (5), 389-403 (2006).
  73. Meaney, M. J., et al. Early environmental regulation of forebrain glucocorticoid receptor gene expression: implications for adrenocortical responses to stress. Dev Neurosci. 18 (1-2), 49-72 (1996).
  74. Nunez, J. F., Ferre, P., Escorihuela, R. M., Tobena, A., Fernandez-Teruel, A. Effects of postnatal handling of rats on emotional, HPA-axis, and prolactin reactivity to novelty and conflict. Physiol Behav. 60 (5), 1355-1359 (1996).
  75. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp Top Lab Anim Sci. 43 (6), 42-51 (2004).
  76. Meijer, M. K., Sommer, R., Spruijt, B. M., van Zutphen, L. F., Baumans, V. Influence of environmental enrichment and handling on the acute stress response in individually housed mice. Lab Anim. 41 (2), 161-173 (2007).
  77. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiol Behav. 150, 31-37 (2015).
  78. Sandi, C., et al. Acute stress-induced impairment of spatial memory is associated with decreased expression of neural cell adhesion molecule in the hippocampus and prefrontal cortex. Biol Psychiatry. 57 (8), 856-864 (2005).
  79. Tulving, E. Organization of Memory. Tulving, E., Donaldson, W. , Academic Press. (1972).
  80. Panoz-Brown, D., et al. Rats Remember Items in Context Using Episodic Memory. Curr Biol. 26 (20), 2821-2826 (2016).
  81. Fellini, L., Morellini, F. Mice create what-where-when hippocampus-dependent memories of unique experiences. J Neurosci. 33 (3), 1038-1043 (2013).
  82. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nat Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  83. Pawluski, J. L., Kokras, N., Charlier, T. D., Dalla, C. Sex matters in neuroscience and neuropsychopharmacology. Eur J Neurosci. 52 (1), 2423-2428 (2020).
  84. Gogos, A., Sbisa, A., Witkamp, D., van den Buuse, M. Sex differences in the effect of maternal immune activation on cognitive and psychosis-like behaviour in Long Evans rats. Eur J Neurosci. 52 (1), 2614-2626 (2020).
  85. Espinosa-Garcia, C., et al. Sex differences in the performance of cognitive tasks in a murine model of metabolic syndrome. Eur J Neurosci. 52 (1), 2724-2736 (2020).
  86. Conner, M. R., Adeyemi, O. M., Anderson, B. J., Kritzer, M. F. Domain-specific contributions of biological sex and sex hormones to what, where and when components of episodic-like memory in adult rats. Eur J Neurosci. 52 (1), 2705-2723 (2020).
  87. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Sci Rep. 10 (1), 17281(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Labirynt z ramionami promieni cie rozmieszczonymizachowanie myszyp automatyczny labiryntmotywacja nagrod w postaci pokarmuhabituacja behawioralnaprotok wymuszonego bieguprotok swobodnego bieguintegracja z elektrofizjologi
Zadanie związane z przestrzenną pamięcią roboczą dla myszy w półautomatycznym 8-ramiennym labiryncie promieniowym, zmniejszające skojarzenia pamięci lękliwej w labiryncie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.