Tutaj prezentujemy unikalny, drukowalny w 3D implant dla szczurów, nazwany TD Drive, zdolny do symetrycznych, obustronnych zapisów elektrod drucianych, obecnie w maksymalnie dziesięciu rozproszonych obszarach mózgu jednocześnie.
Artykuł metodologiczny
TD Drive: parametryczny implant o otwartym kodzie źródłowym do wieloobszarowych zapisów elektrofizjologicznych u zachowujących się i śpiących szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skomplikowane interakcje między wieloma obszarami mózgu leżą u podstaw większości funkcji przypisywanych mózgowi. Proces uczenia się, a także tworzenie i konsolidacja wspomnień to dwa przykłady, które w dużym stopniu opierają się na funkcjonalnej łączności w mózgu. Ponadto badanie podobieństw i/lub różnic na półkulach idzie w parze z tymi wieloobszarowymi interakcjami. Badania elektrofizjologiczne mające na celu dokładniejsze wyjaśnienie tych złożonych procesów polegają zatem na rejestrowaniu aktywności mózgu w wielu miejscach jednocześnie, często w sposób dwustronny. Prezentowany jest implant do druku 3D dla szczurów, nazwany TD Drive, zdolny do symetrycznych, obustronnych zapisów elektrod drucianych, obecnie w maksymalnie dziesięciu rozproszonych obszarach mózgu jednocześnie. Projekt typu open source został stworzony przy użyciu zasad projektowania parametrycznego, co pozwala potencjalnym użytkownikom łatwo dostosować projekt napędu do swoich potrzeb, po prostu dostosowując parametry wysokiego poziomu, takie jak współrzędne przednie-tylne i przyśrodkowe lokalizacji elektrod rejestrujących. Projekt implantu został zweryfikowany na n = 20 szczurach z kapturem Listera, które wykonywały różne zadania. Implant był kompatybilny z nagraniami snu na uwięzi i nagraniami w otwartym terenie (Object Exploration), a także z nagrywaniem bezprzewodowym w dużym labiryncie przy użyciu dwóch różnych komercyjnych systemów nagrywania i scen czołowych. W związku z tym przedstawiono adaptowalny projekt i montaż nowego implantu elektrofizjologicznego, ułatwiający szybkie przygotowanie i wszczepienie.
Wprowadzenie
Wielobaszkowy charakter oddziaływań mózgowych podczas czuwania i snu utrudnia wyczerpujące badanie trwających procesów fizjologicznych. Choć podejścia takie jak funkcjonalny rezonans magnetyczny (fMRI) i funkcjonalne ultrasonograficzne obrazowanie (fUS) umożliwiają próbkowanie aktywności całego mózgu1,2, wykorzystują one sprzężenie naczyniowo-neuronalne do wnioskowania o aktywności mózgu na podstawie aktywności hemodynamicznej, co ogranicza ich rozdzielczość czasową2. Ponadto fMRI wymaga umieszczenia badanego obiektu w skanerze MRI, co wyklucza eksperymenty z dowolnie poruszającymi się zwierzętami. Optyczne obrazowanie dynamiki wapnia za pomocą obrazowania jedno- lub wielofotonowego umożliwia specyficzne dla typu komórek rejestrowanie setek neuronów jednocześnie3. Jednak mikroskopy montowane na głowie, takie jak Miniscope3, które pozwalają na swobodne poruszanie się, są zazwyczaj ograniczone do obrazowania powierzchownych obszarów kory w nienaruszonych mózgach4. Chociaż średnica ich pola widzenia na korze może wynosić około 1 mm, wymagania przestrzenne tych mikroskopów mogą utrudniać celowanie w kilka, zwłaszcza sąsiadujących, obszarów. Dlatego w celu dokładnego uchwycenia wielobaszkowej dynamiki mózgu podczas czuwania i snu, elektrofizjologia zewnątrzkomórkowa, rejestrowana za pomocą elektrod implantowanych w interesujących obszarach mózgu, jest jedną z preferowanych metod ze względu na wysoką rozdzielczość czasową i precyzję przestrzenną5. Dodatkowo pozwala ona na charakterystykę dynamiki snu u zwierząt w sposób kompatybilny z analizami uzyskanymi z ludzkiego EEG, co zwiększa wartość translacyjną tej metody6.
W badaniach rejestrujących aktywność mózgu za pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych klasycznie stosowano pojedyncze elektrody drutowe lub wiązki elektrod, takie jak tetrody7. Nowoczesne sondy, takie jak sonda Neuropixels8, umożliwiają jednoczesne celowanie w kilka obszarów, pod warunkiem, że są one wyrównane wzdłuż osi pozwalającej na implantację sondy bezyzywania zwierzęcia. Niemniej jednak dokładne, jednoczesne rejestrowanie sygnałów z wielu, oddalonych przestrzennie obszarów wciąż stanowi wyzwanie, a istniejące metody są albo kosztowne, albo czasochłonne.
W ostatnich latach metody wytwarzania addytywnego, takie jak stereolitografia, stały się powszechnie dostępne. Pozwoliło to badaczom na opracowanie nowoczesnych implantów elektrod, które można dostosować do ich wymagań eksperymentalnych9, na przykład w celu uproszczonego i powtarzalnego celowania w wiele obszarów mózgu. Często projekty tych implantów są udostępniane społeczności akademickiej jako sprzęt open-source, co pozwala innym badaczom na ich adaptację do własnych celów. Stopień modyfikowalności konkretnych implantów różni się zarówno w zależności od sposobu zaprojektowania implantu, jak i sposobu jego udostępnienia. Modelowanie parametryczne10 jest popularnym podejściem w projektowaniu wspomaganym komputerowo, w którym poszczególne elementy projektu są powiązane za pomocą współzależnych parametrów i zdefiniowanej historii projektu. Wdrożenie podejścia parametrycznego w projektowaniu implantów zwiększa ich możliwości ponownego wykorzystania i adaptacji10, ponieważ zmiana poszczególnych parametrów automatycznie aktualizuje kompletne projekty bez konieczności przeprowadzania złożonego ponownego modelowania. Niezbędnym warunkiem jest, aby sam projekt był udostępniany w edytowalnym formacie, który zachowuje relacje parametryczne i historię projektu. Formaty plików reprezentujące jedynie prymitywy geometryczne, takie jak STL lub STEP, uniemożliwiają późniejsze modyfikacje parametryczne opublikowanych modeli.
Chociaż napędy tetrodowe (hyperdrives)11,12,13 umożliwiają rejestrację z dziesiątek tetrod, ich montaż i implantacja są czasochłonne, a ich jakość w dużej mierze zależy od umiejętności i doświadczenia poszczególnych badaczy. Ponadto zazwyczaj łączą one rurki prowadzące, które kierują elektrody rejestrujące do docelowej lokalizacji, w jeden lub dwa większe wiązki, co ogranicza liczbę i rozproszenie obszarów, które można efektywnie celować.
Inne implanty14,15 odsłaniają całą czaszkę i umożliwiają swobodne umieszczanie wielu pojedynczych mikrosuwaków (microdrives), które prowadzą elektrody rejestrujące. Choć rozmieszczenie niezależnych mikrosuwaków16 podczas operacji zapewnia maksymalną elastyczność, wydłuża to czas zabiegu i może utrudniać celowanie w wiele sąsiadujących obszarów ze względu na zapotrzebowanie na miejsce dla poszczególnych mikrosuwaków. Ponadto, mimo że implanty te są open source, są one publikowane wyłącznie jako pliki STL, co utrudnia wprowadzanie modyfikacji.
Przykładem urządzenia o bardziej wrodzonej filozofii parametrycznej jest RatHat17. Dzięki zastosowaniu szablonu chirurgicznego pokrywającego całą grzbietową powierzchnię czaszki, pozwala on na precyzyjne celowanie w wiele obszarów mózgu bez konieczności użycia ramy stereotaktycznej podczas operacji. Dostępnych jest wiele wariantów implantów dla kaniul, optrod lub tetrod. Jednakże, mimo że urządzenie jest bezpłatne do celów akademickich, nie zostało ono opublikowane jako open-source, co stanowi przeszkodę dla badaczy chcących ocenić i wykorzystać ten implant.
W niniejszym artykule przedstawiono TD Drive (patrz Rysunek 1), nowatorski implant do druku 3D przeznaczony do pozakomórkowych rejestracji elektrodowych u szczurów. Celem TD Drive jest wyeliminowanie niektórych wad istniejących rozwiązań: pozwala on na jednoczesne celowanie w wiele obszarów mózgu, symetrycznie w obu półkulach, przy użyciu niezależnych elektrod drutowych. Dzięki prostej konstrukcji może on zostać zmontowany w ciągu kilku godzin przy stosunkowo niskim koszcie przez mniej doświadczonych badaczy. TD Drive jest publikowany jako projekt open-source w łatwo modyfikowalnych formatach plików, co pozwala badaczom na dostosowanie go do ich konkretnych potrzeb. Zastosowanie parametrycznego podejścia do modelowania 3D od początku procesu projektowania TD Drive umożliwia abstrakcję parametrów wymagających zmiany: aby zmienić lokalizacje docelowe, badacze mogą po prostu edytować parametry reprezentujące współrzędne grzbietowo-brzuszne oraz przednio-tylne, bez konieczności samodzielnego przeprojektowywania implantu. Pliki umożliwiające modyfikację i wykonanie TD Drive znajdują się pod adresem https://github.com/3Dneuro/TD_Drive.
Rycina 1: Przegląd TD Drive. (A) Render TD Drive z nasadką ochronną. (B) Render z widocznymi częściami wewnętrznymi. TD Drive posiada (a) wiele parametrycznie regulowanych miejsc rejestracji dla stałych i ruchomych przewodów elektrod, EIB z (b) gęstym konektorem Omnetics kompatybilnym z powszechnymi przewodowymi i bezprzewodowymi systemami akwizycji danych, (c) intuicyjne mapowanie kanałów zoptymalizowane pod kątem rejestracji w systemach Intan/Open Ephys (patrz Rycina uzupełniająca 1) oraz (d) nasadkę chroniącą implant podczas rejestracji przewodowych oraz w przypadku braku podłączonego wzmacniacza głowowego. (C) Szablon prowadzący na spodzie TD Drive ułatwia umieszczanie kaniul prowadzących i służy jako redundantna weryfikacja lokalizacji implantów podczas operacji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Projekt implantu został przetestowany pilotażowo na n = 4, zwalidowany na n = 8 i potwierdzony na n = 8 szczurach rasy Lister Hooded, które wykonywały różne zadania. Pierwsze 4 zwierzęta posłużyły do opracowania napędu i dostrojenia parametrów. Następnie przeprowadzono pełny pilotaż z udziałem 8 zwierząt (przedstawiony w wynikach). Druga kohorta 8 zwierząt została poddana analizie przeżywalności implantu. Implant był kompatybilny z rejestracją snu w systemie przewodowym oraz rejestracjami w otwartym polu (eksploracja obiektów), a także z bezprzewodową rejestracją w dużym labiryncie (HexMaze 9 m x 5 m) przy użyciu dwóch różnych komercyjnych systemów rejestracji i wzmacniaczy głowicowych. Dwie kohorty po 8 zwierząt były rejestrowane za pomocą dwóch różnych systemów akwizycji – przewodowego dla dłuższych rejestracji snu oraz bezprzewodowego dla rejestracji eksploracji dużego labiryntu. Można wywnioskować, że ten prosty napęd drutowy pozwala mniej doświadczonym badaczom na prowadzenie długotrwałych eksperymentów na większych kohortach zwierząt, co umożliwia analizę faz snu oraz analizę oscylacji w wielu obszarach mózgu. Stoi to w kontraście do większości implantów elektrofizjologicznych dostępnych do dziś, które ze względu na trudność i pracochłonność ograniczają wielkość kohort zwierząt i zazwyczaj wymagają bardzo doświadczonych eksperymentatorów. Jednakże, przy zastosowaniu tego napędu, nie można rejestrować aktywności pojedynczych neuronów; tym samym zastosowanie metody ogranicza się do badań lokalnego potencjału polowego (LFP) i aktywności sumarycznej.
Protokół
Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez holenderską Centralną Komisję ds. Doświadczeń na Zwierzętach (CCD) i przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Doświadczeniach na Zwierzętach (kody protokołów: 2020-0020-006 i 2020-0020-010). Wykorzystano samce szczurów linii Lister Hooded w wieku 9–12 tygodni w momencie dostarczenia. Odczynniki i sprzęt użyte w protokole wymieniono w Tabeli Materiałów. Etapy procesu budowy napędu przedstawiono na Ryc. uzupełniającej 1 oraz Ryc. uzupełniającej 2.
1. Dostosowanie i tworzenie modeli 3D oraz danych płyty interfejsu elektrod (EIB)
- Otwórz projekt korpusu prowadnicy w programie Autodesk Fusion. Kliknij Change Parameters w zakładce Modify. Dostosuj współrzędne dla pierwszej lokalizacji rejestracji, wprowadzając współrzędną przednio-tylną w polu anteroPosteriorSite1 oraz współrzędną przyśrodkowo-boczną w polu medioLateralSite1. Średnicę otworu dla rurki prowadzącej lub elektrod można zmienić, dostosowując parametr diameterSite1. Powtórz tę czynność dla lokalizacji rejestracji 2 i 3, a projekt modelu zostanie automatycznie zaktualizowany.
UWAGA: Trzy lokalizacje wykorzystane w obecnym protokole to hipokamp (HPC), zawierający ruchome wiązki przewodów, oraz kora przedczołowa (PFC) i retrosplenialna (RSC), obie z nieruchomymi wiązkami przewodów (wiązka przewodów PFC celuje zarówno w korę przedlimbiczną (PRL), jak i przednią część zakrętu obręczy (ACC)). Tabela 1 przedstawia ręcznie wprowadzone ograniczenia parametrów sterujących współrzędnymi przyśrodkowo-bocznymi miejsc rejestracji. - Wyeksportuj zaktualizowany korpus prowadnicy, klikając go prawym przyciskiem myszy w przeglądarce i wybierając Save As Mesh. Wybierz typ STL (binary), jednostki mm oraz stopień wygładzenia high.
- Wybierz odpowiednio przygotowane pliki STL dla standardowej zaślepki lub, w razie potrzeby (na przykład gdy cele znajdują się bardzo bocznie), przygotowane pliki STL dla dużych zaślepek.
- W zależności od wybranej zaślepki, wybierz do produkcji standardową lub dużą płytkę EIB. Pliki produkcyjne Gerbera dla obu płytek EIB są dostarczone w archiwach zip, które można przesłać bezpośrednio do serwisu wykonawczego.
2. Drukowanie modeli 3D i wykonanie EIB
UWAGA: W niniejszym badaniu do produkcji części wykorzystano dostępną komercyjnie drukarkę 3D (patrz Tabela materiałów). W przypadku korzystania z różnych drukarek lub outsourcingu produkcji, do wytworzenia części konieczne może być zastosowanie innych, porównywalnych żywic.
- Wydrukuj korpus napędu oraz czółenka za pomocą stereolitografii9 w wysokiej rozdzielczości, używając zwykłej lub biokompatybilnej żywicy (np. żywicy Clear, Black lub White) z wysokością warstwy 25 µm. Elementy nasadki wydrukuj z żywicy o wysokiej wytrzymałości i sztywności (np. Tough 2000).
- Wytnij płytkę EIB we własnym zakresie lub zamów jej wykonanie u zewnętrznego dostawcy. Przylutuj złącze o wysokiej gęstości do EIB, stosując techniki lutowania SMD (Surface Mounted Device).
UWAGA: W przypadku braku doświadczenia w lutowaniu precyzyjnych komponentów elektronicznych zaleca się zlecenie lutowania na zewnątrz, np. w uniwersyteckim warsztacie elektroniki lub zewnętrznemu dostawcy. Wzmocnij przylutowane złącze o wysokiej gęstości, nakładając wokół niego mocną żywicę epoksydową. Należy uważać, aby nie zakryć żywicą epoksydową otworów dla elektrod.
3. Obróbka końcowa wydrukowanego w 3D korpusu
UWAGA: Nakrętka i czółenka nie powinny wymagać obróbki końcowej. W zależności od jakości wydruków 3D może być konieczne ich delikatne oszlifowanie lub usunięcie pozostałości struktur wsporczych. Podczas szlifowania i wiercenia należy uważać, aby nie uszkodzić ścianek korpusu napędu. W razie potrzeby części po obróbce należy oczyścić izopropanolem i miękką ściereczką i/lub sprężonym powietrzem.
- Wywierć otwory na prowadnice na górze i na dole korpusu napędu, używając wiertła 0,5 mm zamocowanego w wiertarce ręcznej. Zapewni to poprawność i spójność wymiarów we wszystkich punktach.
- Wywierć dwa otwory z pogłębiaczem (jak na Rysunku 2E) w korpusie napędu dla mosiężnej wkładki czółenka, używając wiertła 2 mm w wiertarce ręcznej.
- Oczyść otwory z pogłębiaczem z pozostałości po wierceniu za pomocą sprężonego powietrza. Następnie nagwintuj otwory prowadzące dla śrub czółenka, będące przedłużeniem otworów z pogłębiaczem, używając gwintownika M1. Wykonaj gwintowanie w dwóch lub więcej iteracjach, usuwając między nimi zanieczyszczenia z gwintownika i otworu. Opcjonalnie nasmaruj gwintownik kroplą oleju mineralnego.
- Oczyść korpus napędu z pozostałości po wierceniu i gwintowaniu za pomocą sprężonego powietrza.
Rysunek 2: Render TD Drive. (A,B) TD Drive (A) bez oraz (B) z nasadką ochronną na modelu czaszki szczura. (C) Polimidowe rurki prowadzące prawidłowo wprowadzone do każdego z sześciu miejsc rejestracji. (D) Odizolowany, kompletny zespół czółenka, składający się ze śruby prowadzącej, wydrukowanego w 3D czółenka oraz przylutowanej mosiężnej wkładki. (E) Korpus TD Drive z dwoma włożonymi czółenkami. Zaznaczone na czerwono: (a) otwory z pogłębieniem dla czółenka, (b) prowadnica czółenka, (c) cokoły centralne korpusu napędu, (d) szablon prowadzący.(F,G) Ważne miejsca na górze (F) i na dole (G) korpusu napędu, które mogą wymagać obróbki wykończeniowej po druku 3D, są wskazane czerwonymi strzałkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
4. Zespoły transportowe
- Nasunąć wydrukowany w technologii 3D element przesuwny (shuttle) na śrubę M1x16. Użyć mosiężnej wkładki M1, aby utrzymać element przesuwny na miejscu. Po umieszczeniu wkładki element przesuwny musi być w stanie swobodnie obracać się bez przemieszczania w górę lub w dół.
OSTRZEŻENIE: Kolejne kroki wiążą się z ryzykiem oparzeń (lutowanie). W zależności od zastosowanego spoiwa i topnika lutowniczego mogą one obejmować ekspozycję na substancje drażniące drogi oddechowe oraz ołów. Podczas lutowania zawsze należy stosować ochronę oczu (ponieważ spoiwo może pryskać) i przestrzegać odpowiednich wytycznych dotyczących bezpiecznego obchodzenia się z potencjalnie szkodliwymi substancjami, w tym zapewnić odpowiednią wentylację miejsca pracy w celu odsysania oparów lutowniczych. Należy przestrzegać lokalnych przepisów i procedur operacyjnych lub zapoznać się z dostępnymi materiałami online18,19. - Używając niewielkiej ilości pasty lutowniczej, przylutować mosiężną wkładkę do śruby. Należy uważać, aby nie przegrzać wkładki i śruby, aby nie stopić wydrukowanego w technologii 3D elementu przesuwanego. W zależności od żywicy użytej do druku elementu przesuwanego, niewielkie stopienie (a w konsekwencji przyklejenie się elementu do wkładki) jest trudne do uniknięcia.
UWAGA: Przy użyciu śrub ze stali nierdzewnej może być wymagany topnik lutowniczy. Zaleca się stosowanie śrub mosiężnych lub stalowych (maszynowych), ponieważ łatwiej je przylutować. - Po ostygnięciu zespołu elementu przesuwanego, delikatnie i kilkukrotnie obrócić wydrukowany w technologii 3D element wokół śruby. Jeśli element przylegał do wkładki podczas lutowania, czynność ta powinna go odblokować.
UWAGA: Należy upewnić się, że element przesuwny obraca się swobodnie i nie chwieje się. Jeśli tak się dzieje, należy odrzucić zespół elementu przesuwanego i przygotować nowy. Należy ostrożnie spróbować obrócić mosiężną wkładkę. Jeśli obraca się ona względem śruby, należy powtórzyć proces lutowania.
5. Montaż napędu
- Przeciąć dostępne w sprzedaży rurki polimidowe na odcinki o długości około 25 mm, lecz na tyle długie, aby przechodziły przez całe ciało napędu.
- Wprowadź polimidowe rurki prowadzące do korpusu napędu. Każda rurka powinna zostać włożona przez jeden otwór na górze napędu oraz odpowiadający mu otwór w szablonie prowadzącym na spodzie napędu („d” w Rysunek 2EProbówki należy wsunąć tak, aby ich górna krawędź zrównała się z górną krawędzią korpusu napędu.
- Za pomocą cienkiej igły lub wykałaczki nanieś niewielką ilość płynnego kleju cyjanoakrylowego do otworów w górnej części korpusu napędu, aby unieruchomić rurki prowadzące. Klej należy nanosić od dolnej strony korpusu, aby zapobiec jego przedostaniu się do wnętrza rurek prowadzących. Dzięki siłom kapilarnym klej zostanie wciągnięty w przestrzeń między korpusem napędu a rurką prowadzącą, co zapewni ich połączenie.
- Nanieś niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na styk między prowadnicami a szablonem prowadzącym u podstawy korpusu napędu. Ponownie należy uważać, aby nie zapchać prowadnic klejem. Pozostaw klej do wyschnięcia na kilka minut.
UWAGA: Dokładny czas niezbędny do wykonania tej czynności zależy od materiału prowadnika oraz luzu pomiędzy korpusem prowadnika a rurkami prowadzącymi. Zazwyczaj wystarczający powinien być czas od 5 do 10 minut. - Odwróć korpus napędu do góry dnem i odetnij polimidowe rurki prowadzące na spodzie tak, aby wystawały około 1 mm poza cokoły centralne korpusu napędu („c” w Rysunek 2E i Rycina dodatkowa 2). W tej konfiguracji końce prowadnic będą zlicowane z powierzchnią mózgu w momencie implantacji.
UWAGA: Urządzenie zostało opracowane z myślą o obszarach głębszych mózgu. W przypadku celowania w powierzchowne obszary kory konieczne może być zastosowanie krótszych polimidowych prowadnic, aby uniknąć uszkodzenia powierzchni mózgu w razie wystąpienia początkowego obrzęku. - Wprowadź dwa zespoły czółenek do korpusu napędu. Podczas wkręcania ich w gwintowane otwory prowadzące upewnij się, że śruby są równoległe do prowadnic czółenek („b” w Rysunek 2E). Palcami delikatnie ustawić krawężniki w prowadnicach.
- Wkręć całkowicie czółenka w otwory z pogłębieniem, aby upewnić się, że mosiężne wkładki zespołu czółenka nie blokują się w korpusie napędu i nie kolidują z polimidowymi rurkami prowadzącymi. W tym protokole wymagane jest minimum 16 pełnych obrotów. Jeśli wartość ta nie zostanie osiągnięta, należy dodatkowo przyciąć polimidową rurkę nad korpusem napędu, aby zwiększyć przestrzeń. Nie dokręcaj zbyt mocno czółenka w korpusie napędu – może to doprowadzić do uszkodzenia gwintów w korpusie napędu oraz połączenia lutowniczego zespołu czółenka.
UWAGA: W przypadku zablokowania się zespołu czółenka należy go całkowicie wyjąć i sprawdzić, czy połączenie lutowane nie poluzowało się. W takim przypadku należy użyć nowego zespołu czółenka. Jeśli zespół czółenka koliduje z rurką prowadzącą, należy skrócić rurkę prowadzącą tak, aby nie wystawała poza korpus napędu. - Przykręć płytkę EIB do korpusu napędu za pomocą śrub polimidowych M2,5x5. Nanieś kilka kropel kleju cyjanoakrylowego pomiędzy korpus napędu a płytkę EIB. Upewnij się, że otwory przelotowe do połączenia elektrod nie zostały zapchane.
6. Przygotowanie osłony ochronnej
- Włóż stalową nakrętkę M2 w wybrzuszenie w lewej połowie nakrętki i utrwal ją za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
- W razie potrzeby wywierć otwór z przodu lewej nakrętki wiertłem M1 w uchwycie ręcznym. Nawierć otwór z przodu prawej połowy nakrętki gwintownikiem M1.
7. Przygotowanie elektrod drucianych
- Przygotuj dwie metalowe płytki, które będą służyć jako powierzchnia do tworzenia wiązek drutów elektrod. Płytki stanowią płaską, stabilną, ale przesuwalną powierzchnię, na której będzie odbywać się składanie, klejenie i cięcie wiązek drutów. Do pierwszej płytki przyklej papier milimetrowy, a do drugiej przytwierdź dwa kawałki lepkiej taśmy malarskiej, stroną klejącą do góry.
- Trzy z czterech drutów w wiązkach HPC zostaną ucięte pod kątem 60 stopni, aby stworzyć przesunięcie w kierunku grzbietowo-brzusznym. Pozwoli to na umieszczenie drutów odpowiednio powyżej, w obrębie i poniżej warstwy piramidalnej hipokampa. Aby ułatwić cięcie, narysuj na papierze milimetrowym wyraźną linię pod kątem 60 stopni (linia 60 stopni).
- Dla każdej wiązki elektrod HPC utnij 4 odcinki drutu elektrodowego o długości 4,5 cm każdy. Dla każdej wiązki elektrod PFC i RSC utnij 4 odcinki drutu elektrodowego o długości 3,5 cm każdy.
- Delikatnie podnieś 4 druty, dotykając ich opuszkiem palca (przykleją się do niego), a następnie ułóż je jak najbliżej siebie na taśmie malarskiej. Upewnij się, że nie nakładają się na siebie.
- Pod mikroskopem, za pomocą pęsety, ułóż druty jak najbliżej siebie. Na pierwsze 2 cm górnej części wiązki nałóż cienką warstwę płynnego kleju cyjanoakrylowego. W przypadku wiązki HPC zaklej od > 2 cm do < 3,5 cm drutu. Odczekaj, aż klej wyschnie.
- Pod mikroskopem delikatnie dotknij drutów pęsetą. Jeśli się nie rozdzielają, oznacza to, że są prawidłowo sklejone. W ramach kontroli upewnij się, że warstwa kleju błyszczy w świetle mikroskopu.
- Po całkowitym wyschnięciu zdejmij wiązkę drutów z taśmy i przenieś ją na płytkę z papierem milimetrowym. Pod mikroskopem sprawdź, czy na górze lub po bokach wiązki nie ma nadmiaru kleju, a jeśli występuje, ostrożnie usuń go ostrzem skalpela.
- W przypadku wiązek RSC wykonaj proste cięcie u dołu macierzy, prostopadle do kierunku drutów.
- W przypadku wiązek HPC ułóż macierz na papierze milimetrowym tak, aby przecinała linię 60 stopni, i użyj linii jako prowadnicy do wykonania cięcia pod kątem 60 stopni względem kierunku drutów.
- Następnie, używając ostrza skalpela, ostrożnie oddziel najkrótszy z 4 drutów od wiązki. Utnij drut prostopadle do jego kierunku, skracając go o około 0,75 mm w porównaniu do drugiego najdłuższego drutu w wiązce.
- W przypadku wiązek PFC rozdziel dół macierzy na dwie dwudrutowe wiązki. Upewnij się, że dwa druty są dobrze ze sobą sklejone. Skróć jedną z dwudrutowych wiązek o 1 mm, przecinając ją prostopadle do kierunku drutu. Zdjęcia uciętych wiązek drutów znajdują się na Rysunku uzupełniającym 1 (na dole) oraz na Rysunku uzupełniającym 2b.
8. Przygotowanie przewodu uziemiającego i przewodów EEG
- Wypchnij co najmniej 10 pinów SIP/DIP z listwy gniazd SIP/DIP o skoku 1,27 mm.
- Odetnij 2 kawałki przewodu uziemiającego (GND) o długości 6 cm. Odetnij 8 kawałków przewodu EEG o długości 6 cm. Używając ostrza skalpela, ostrożnie usuń izolację z obu końców wszystkich przewodów.
- Umieść śrubę ze stali nierdzewnej M1x3 w uchwycie typu „trzecia ręka”, pozostawiając jak największą przestrzeń pod łbem śruby. Owiń pozbawioną izolacji stronę przewodu GND lub EEG wokół trzpienia śruby, tuż pod jej łbem.
- Nanieś niewielką ilość topnika lutowniczego za pomocą cienkiej igły lub wykałaczki. Przylutuj przewód do śruby. Upewnij się, że szczelina w łbie śruby nie została przypadkowo zapchana.
- Umieść pin SIP/DIP w uchwycie tak, aby dostępna była strona żeńska. Wsuń pozbawioną izolacji drugą stronę przewodu do pinu SIP/DIP. Nanieś niewielką ilość topnika i przylutuj przewód do pinu.
- Wyjmij przylutowany zespół śruba-przewód z uchwytu. Zespół ten zostanie wszczepiony do czaszki podczas operacji implantacji.
- Umieść kolejny pin SIP/DIP w uchwycie, obracając go o 180 stopni (tak, aby dostępna była strona męska). Nanieś niewielką ilość topnika i przylutuj pozbawioną izolacji stronę drugiego przewodu do strony męskiej pinu.
- Wyjmij przylutowany zespół przewód-pin z uchwytu. Zespół ten zostanie później podłączony do EIB, a zespół śruba-przewód oraz zespół przewód-pin zostaną ze sobą połączone podczas operacji implantacji za pomocą ich dwóch pinów.
- Aby wzmocnić luty, nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na połączenia między przewodami a pinami.
- Po wyschnięciu kleju sprawdź, czy piny SIP/DIP obu zespołów można swobodnie połączyć. Użyj funkcji pomiaru ciągłości multimetru, aby zweryfikować, czy istnieje ciągłe połączenie między śrubą a pozbawionym izolacji końcem przewodu w zespole przewód-pin po połączeniu obu elementów. Opcjonalnie można oznaczyć kolorystycznie każdy zestaw przewodów lakierem do paznokci (patrz Tabela materiałów), aby ułatwić poprawne połączenie podczas operacji wszczepienia.
9. Wprowadzanie wiązek drutów do napędu
- Zamocuj napęd w uchwycie. Należy uważać, aby na tym etapie nie wywrzeć zbyt dużego nacisku na płytkę EIB ani nie uszkodzić złącza o wysokiej gęstości.
- Gdy korpus napędu znajdzie się w stabilnej pozycji, należy wziąć jeden z pęczków przewodów i ostrożnie wsunąć go do odpowiedniej rurki polimidowej, ręcznie lub za pomocą pęsety precyzyjnej. Należy upewnić się, że zespół przewodów został umieszczony w prawidłowej orientacji (np. w przypadku zespołu PFC dwa dłuższe przewody powinny być skierowane przyśrodkowo) i uważać, aby nie zagiąć zespołu przewodów.
- Powtórz ostatni krok dla wszystkich pozostałych wiązek przewodów.
- Za pomocą cienkiej pęsety chwyć jeden z drutów i ostrożnie zegnij go w kierunku otworu, do którego ma zostać wprowadzony. Po wprowadzeniu użyj złotego pinu, aby przymocować drut w otworze EIB. Powtórz tę czynność dla wszystkich drutów w wiązce oraz dla wszystkich wiązek.
- Należy upewnić się, że na tym etapie przewody tworzą wyraźną pętlę nad EIB (dzięki temu pozostanie miejsce na przesuwanie wiązki w górę i w dół rurki polimidowej w celu dostosowania długości w dolnej części rurki) oraz że macierz wystająca z dołu rurki polimidowej nie zostanie przypadkowo zgięta. Należy odnotować, który przewód z każdej wiązki łączy się z poszczególnymi kanałami na EIB. Patrz Rycina uzupełniająca 1 w celu szczegółowego omówienia mapowania kanałów w TD Drive.
UWAGA: Alternatywnie, po załadowaniu każdego wiązkowego zestawu przewodów (krok 9.2), można bezpośrednio podłączyć przewody do EIB (krok 9.4), a następnie powtórzyć kroki 9.2 + 9.4 dla pozostałych wiązek przewodów. Kolejność tę można dostosować do osobistych preferencji eksperymentatora. Patrz Rycina uzupełniająca 2b jako przykład załadowanego napędu TD.
- Należy upewnić się, że na tym etapie przewody tworzą wyraźną pętlę nad EIB (dzięki temu pozostanie miejsce na przesuwanie wiązki w górę i w dół rurki polimidowej w celu dostosowania długości w dolnej części rurki) oraz że macierz wystająca z dołu rurki polimidowej nie zostanie przypadkowo zgięta. Należy odnotować, który przewód z każdej wiązki łączy się z poszczególnymi kanałami na EIB. Patrz Rycina uzupełniająca 1 w celu szczegółowego omówienia mapowania kanałów w TD Drive.
- Dostosuj długość wiązek przewodów, aby prawidłowo skierować je w miejsca rejestracji, delikatnie wpychając lub wyciągając wiązki przewodów z rurki prowadzącej (patrz Rycina uzupełniająca 2d).
UWAGA: Ponieważ rurki prowadzące są przycinane tak, aby zrównać się z powierzchnią mózgu, odległość, na jaką wiązka przewodów wystaje poza rurkę prowadzącą, odpowiada lokalizacji grzbietowo-brzusznej obszaru docelowego. Ruchome wiązki przewodów HPC powinny być zrównane z dnem rurki prowadzącej, stałe wiązki RSC powinny wystawać o 1,5 mm, a stałe wiązki PFC powinny wystawać o 3,5 mm poza rurki prowadzące. Podczas wpychania lub wyciągania zespołów przewodów należy uważać, aby nie wyciągnąć poszczególnych przewodów z EIB na górze oraz nie wygiąć dolnej części wiązki przewodów. - Po wyrównaniu stałych macierzy drutów (RSC i PFC), nanieś niewielką ilość mocnego kleju epoksydowego na górną część prowadnic, przyklejając wiązki w miejscu ich ułożenia. Podczas utwardzania żywicy epoksydowej upewnij się, że wiązki drutów są nadal prawidłowo wyrównane w dolnej części.
- Aby przymocować ruchome macierze drutów HPC, należy najpierw przesunąć wózek do najwyższej wymaganej pozycji (w eksperymentach opisanych w niniejszym artykule: co najmniej 16 pełnych obrotów/4 mm powyżej najniższej pozycji). Następnie należy wsunąć wiązki drutów do otworu w kształcie litery U w wózku i przykleić je w tym miejscu, używając niewielkiej ilości mocnego kleju epoksydowego.
UWAGA: Należy upewnić się, że żywica epoksydowa nie ścieknie po wiązce do rurki poliimidowej. Po utwardzeniu żywicy należy nałożyć drugą warstwę w tym samym miejscu, aby wzmocnić połączenie i zmniejszyć prawdopodobieństwo jego przerwania podczas przesuwania czółenka. - Ostrożnie wsuń otwarty koniec zestawu drut-pin przewodu uziemiającego (GND) przez jeden z otworów przelotowych oznaczonych jako GND. Przymocuj go za pomocą złotego pinu.
UWAGA: W przypadku korzystania z głowicy wzmacniacza, w której kanały uziemienia (GND) i referencyjne (REF) są zwarte, dla większej wygody można użyć również kanału REF. - Wyjmij napęd z uchwytu, dbając o to, aby nie wygiąć żadnego z zestawów przewodów. Ponownie zamocuj przednią część napędu w tym samym uchwycie, włóż 4 zestawy pinów przewodów EEG do otworów przelotowych dla kanałów EEG (oznaczonych jako 2, 4, 29, 31) i utrwal każdy z nich złotym pinem.
- W przypadku wszystkich przewodów masy (GND) i EEG należy użyć multimetru z ustawionym pomiarem ciągłości obwodu, aby zweryfikować ciągłość połączenia pomiędzy złotym pinem na płytce EIB a pinem połączonego zespołu przewód-pin.
- Przechowywać napęd. Można to zrobić na przykład, mocując zakrętkę do korpusu napędu i przechowując go do góry nogami.
UWAGA: Przed implantacją chirurgiczną należy wysterylizować dno napędu za pomocą etanolu. Wszystkie śruby kostne oraz zestawy przewodów GND/EEG powinny zostać wysterylizowane w etanolu. Instrumenty chirurgiczne należy wysterylizować poprzez autoklaw
10. Chirurgia wszczepiania implantów
UWAGA: Ten krok krótko opisuje procedury chirurgiczne implantacji TD Drive. Bardziej szczegółowy protokół implantacji, zawierający opis narzędzi oraz dawki i stężenia leków, znajduje się w Supplementary File 1.
- Sterylizować narzędzia chirurgiczne oraz oczyścić i zdezynfekować obszar operacyjny zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi. W celu sterylizacji implantów części przewodów elektrod, które będą miały kontakt z mózgiem, należy umieścić w etanolu na co najmniej jedną minutę.
UWAGA: Długotrwała ekspozycja na etanol lub jego opary może osłabić klej cyjanoakrylowy. Jeśli opary nie są uwięzione, należy wydłużyć czas zanurzenia przewodów w etanolu. W celu weryfikacji integralności kleju zaleca się ustalenie optymalnego czasu na implancie testowym, który nie jest wykorzystywany w rzeczywistym eksperymencie. - Zastosować niezbędną profilaktyczną analgezję, antybiotyki oraz znieczulenie gazowe (izoflurane) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i lokalnymi.
- Umieścić szczura w aparacie stereotaktycznym. Ogolić górną część głowy i zdezynfekować skórę jodkiem powidonowym. Podskórnie podać miejscowe znieczulenie (lidokaina) i wykonać niewielkie nacięcie czaszki wzdłuż linii środkowej.
- Odsłonić czaszkę, odsuwając skórę na bok. Usunąć tkankę łączną z powierzchni czaszki, osuszyć i oczyścić powierzchnię czaszki. Delikatnie odsunąć mięśnie po bokach czaszki, aby umożliwić umieszczenie śrub kotwiczących.
- Zmierzyć współrzędne bregma i lambda. Aby zapewnić precyzyjne celowanie, należy upewnić się, że powierzchnia czaszki jest równoległa do płaszczyzny przednio-tylnej i przyśrodkowo-bocznej stereotaksu, mierząc różnicę w pozycji grzbietowo-brzusznej bregma i lambda. Jeśli współrzędne się różnią, należy skorygować pozycję szczura w stereotaksie poprzez podniesienie lub obniżenie uchwytu pyska.
- Wyznaczyć miejsca kraniotomii wokół obszarów docelowych (kora przedlimbiczna (AP +3.5 mm i ML + -1 mm), obszar retrosplenialny (AP+5.8 mm i ML +-1mm) oraz hipokamp (AP -3.8 mm i ML + - 2.5 mm)).
- Wywiercić otwory pod śruby GND/EEG oraz śruby kotwiczące. Wkręcić śruby i pokryć je płynnym akrylem dentystycznym. Wykonać kraniotomie i ostrożnie usunąć oponę twardą. Zapobiegać wysychaniu obszarów kraniotomii, aplikując sterylną sól fizjologiczną.
- Ostrożnie ustawić TD Drive nad miejscami kraniotomii, upewniając się, że rurki prowadzące przylegają do czaszki. Zabezpieczyć rurki prowadzące wazeliną i przymocować TD Drive do czaszki za pomocą akrylu dentystycznego.
- Powoli obniżyć macierze przewodów celowane w HPC z ich początkowej lokalizacji (~1.5 mm DV od powierzchni mózgu) w kierunku warstwy piramidowej obszaru CA1 hipokampa. Warstwa piramidowa była osiągana stopniowo w kolejnych dniach podczas kontroli sygnału w okresie rekonwalescencji szczurów.
- Założyć osłonową nasadkę wokół napędu.
- Wyłączyć znieczulenie gazowe i wyjąć szczura z ramy stereotaktycznej. Umieścić szczura w czystej klatce w podgrzewanej komorze i zapewnić mokrą karmę oraz wodę na czas rekonwalescencji. Monitorować szczura aż do momentu, gdy stanie się ponownie aktywny, zacznie poruszać się w klatce, jeść i pić.
- Przenieść szczura z powrotem do pomieszczenia hodowlanego. Zapewnić pooperacyjną analgezję i opiekę zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Przykładowy protokół chirurgiczny znajduje się w Supplementary File 1.
11. Odzyskiwanie EIB
- Po zakończeniu eksperymentu odzyskaj napęd i zdejmij osłonę ochronną.
- Wyjmij złote piny i ostrożnie podłącz przewody elektrod. Odkręć EIB od korpusu napędu. Delikatnie wsuwając miękką pęsetę między EIB a korpus napędu lub ostrożnie podnosząc EIB ręką, zerwij pozostały spoiwo z cyjanoakrylanu, które łączy EIB z korpusem.
- Oczyść EIB i złote piny w celu ponownego wykorzystania w kolejnych implantach TD Drive. Przed ponownym użyciem EIB sprawdź otwory przelotowe (vias) złotych pinów oraz złącze o wysokiej gęstości pod kątem zużycia. Ponownie użyj EIB tylko wtedy, gdy otwory przelotowe są w stanie umożliwiającym dobre połączenie między złotymi pinami, przewodami elektrod a EIB oraz jeśli połączenie złącza o wysokiej gęstości z głowicą wzmacniacza (headstage) jest nadal wystarczająco stabilne.
Wyniki
Kierując się instrukcjami zawartymi w protokole, urządzenie TD Drive mogło zostać z łatwością zbudowane przez wielu badaczy. Po opracowaniu napędu (n = 4) przeprowadzono pełne badanie pilotażowe z udziałem ośmiu zwierząt. Zaimplantowano kolejną grupę ośmiu zwierząt i przeprowadzono zbieranie danych eksperymentalnych. Ponieważ analiza danych dla tych zwierząt nie została zakończona, zostały one uwzględnione w analizie przeżywalności, ale nie w innych analizach (np. celowaniu lub histologii). Operację implantacji przeprowadzono 2 tygodnie po przybyciu zwierząt (patrz Rysunek 3A w celu sprawdzenia lokalizacji celu wykorzystanych w badaniu pilotażowym). Implantacja została wykonana zgodnie ze standardowymi procedurami chirurgicznymi i trwała ok. 3 h. Pierwsze implantacje wykonał doświadczony chirurg, który po 2-3 operacjach był w stanie przeszkolić zarówno doświadczonych, jak i początkujących badaczy do poziomu samodzielności.
Rysunek 3: Operacja implantacji, dane dotyczące snu i aktywność szerokopasmowa. (A) Schematyczny przegląd przedstawiający docelowe miejsca kraniotomii (niebieskie kółka) i śrub czaszkowych (zielone: EEG, niebieskie: GND, szare: śruby kotwiczące; zauważmy, że dwie śruby kotwiczące znajdują się z boku czaszki). (B) Fotografia implantowanych zwierząt z podłączoną głowicą pomiarową podczas snu i czuwania. (C) Przykładowe dane dotyczące snu z PFC (przedlimbiczej) i HPC (Ca1) zwierzęcia podłączonego do aparatury, podzielone na sen REM z falami theta oraz sen NonREM z falami delta, wrzecionami i riplami. Oś Y: mikrowolty, oś X: sekundy. Dane te mogą służyć na przykład do oceny faz snu lub detekcji i analizy zdarzeń oscylacyjnych. (D) Przykład aktywności szerokopasmowej rejestrowanej bezprzewodowo u czuwającego zwierzęcia (zakłócone kanały po lewej stronie nie były podłączone). Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 4: Trwałość implantu, detekcje fal delta i histologia. (A) Wykres przeżywalności dla implantu z dwóch serii dłuższych eksperymentów. Warto zauważyć, że w 85. dniu n = 8 zwierząt zakończyło eksperyment i zaplanowano ich perfuzję. (B) Przykład danych dotyczących stabilności. Przedstawiono liczbę detekcji fal delta w kanale hipokampa w dniach rejestracji (~3 dni w tygodniu). U każdego zwierzęcia wystąpiła normalna zmienność zależna od ilości snu, jednak nie odnotowano ogólnego dryfu sygnału, a tym samym detekcji, w czasie. (C) Reprezentatywna histologia pokazująca obustronne celowanie u jednego szczura. Lewa kolumna: lewa półkula, prawa kolumna: prawa półkula. Współrzędne AP wskazują współrzędne przednio-tylne przedstawionego przekroju, a strzałki wskazują uszkodzenia w obszarach docelowych. Powiększenie: 1,6x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Wszystkie zwierzęta dobrze przeszły rekonwalescencję i tolerowały implant (Rysunek 3B). Elektrody czołowe i retrosplenialne były stabilne, natomiast wiązki hipokampalne pozostawały ruchome. Wiązki hipokampalne wszczepiano na głębokość grzbietowo-brzuszną 2 mm i korygowano ich położenie w celu maksymalizacji pokrycia obszaru HPC podczas 2-tygodniowego okresu rekonwalescencji pooperacyjnej, podczas którego sygnał sprawdzano na żywo w okresach habituacji do snu. U 7 z 8 zwierząt wszystkie miejsca docelowe zostały osiągnięte w co najmniej jednej półkuli (Tabela 2 dla wskaźników trafienia, patrz Rysunek 4C dla reprezentatywnej histologii). Pomyślnie przeprowadzono rejestracje podczas czuwania i snu w pudełku rejestracyjnym z wykorzystaniem kabla, a także rejestracje bezprzewodowe w większym labiryncie (przykładowe dane Rysunek 3C,D). Zwierzęta zachowały implanty przez 2 miesiące, po których u pojedynczych osobników zaczęły one być tracone; jednak większość zwierząt zachowała implanty do dnia zakończenia eksperymentu, tj. 85-100 dni po wszczepieniu (Rysunek 4A). W tym czasie sygnał LFP pozostawał stabilny, co widać w przykładowej analizie, w której wykryto oscylacje delta (Rysunek 4B). Odnotowano normalną zmienność w czasie, ale nie stwierdzono systematycznego dryftu sygnału w żadnym z rejestrowanych obszarów mózgu (w tym w warstwie piramidowej CA1). Zaleca się zakończenie eksperymentów w ciągu 10-15 tygodni po operacji. Wszystkie EIB zostały odzyskane.
Zastosowaliśmy ten implant głównie do pomiaru faz snu i oscylacji podczas snu w odpowiedzi na proces uczenia się oraz inne interwencje. Na przykład, aby zbadać, jak doustne przyjmowanie CBD wpływa na występowanie oscylacji i ich koherencję w różnych obszarach mózgu (patrz Samanta et al.20).
| Parametr | Wartość minimalna (mm) | Wartość maksymalna (mm) |
| medioLateralSite1 | 0.75 | 2 |
| medioLateralSite2 | 1.5 | 5 |
| medioLateralSite3 | 0.75 | 2 |
Tabela 1: Przegląd ręcznie nałożonych ograniczeń na parametry kontrolujące współrzędne mediolateralne miejsc rejestracji.
| Półkula | PFC | RSC | CA1 pyr. |
| Prawa | 8 z 8 | 5 z 8 | 6 z 8 |
| Lewa | 8 z 8 | 7 z 8 | 7 z 8 |
Tabela 2: Odsetek trafień w badaniu pilotażowym na 8 zwierzętach. U 4 z 8 zwierząt wszystkie elektrody zostały umieszczone prawidłowo. Jednak u 7 z 8 zwierząt wszystkie obszary mózgu zostały prawidłowo trafione w co najmniej jednej półkuli (z wyjątkiem jednej szczura, u którego nie osiągnięto warstwy piramidalnej CA1).
Rysunek uzupełniający 1: Architektura TD Drive. (Góra) Przegląd mapowania kanałów dla TD Drive przy użyciu przedwzmacniacza Intan RHD32. (Dół) Dodniowa ilustracja konfiguracji wiązek przewodów.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina uzupełniająca 2: Dodatkowe zdjęcia napędu TD na kilku etapach procesu budowy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 1: Przykładowy protokół implantacji urządzenia TD Drive. Procedury i lokalizacje docelowe zostały dostosowane do pytań badawczych autorów oraz polityki instytucjonalnej.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
W artykule przedstawiono adaptowalny implant do dwustronnych, symetrycznych, wieloobszarowych zapisów elektrod drucianych dla swobodnie poruszających się szczurów.
Możliwość łatwej regulacji implantu poprzez zmianę predefiniowanych parametrów była jedną z motywacji do stworzenia TD Drive. Dążąc do maksymalizacji elastyczności przy zmianie parametrów, nieodłączne ograniczenia w relacjach między nimi nieuchronnie nakładają ograniczenia na tę zdolność adaptacji. Domyślnie nie są ustawiane żadne limity dla parametrów przednio-tylnych, przy czym współrzędne te są regulowane przez logiczne interakcje między miejscami i ogólny rozmiar korpusu dysku. Parametry sterujące współrzędnymi środkowo-bocznymi wszystkich miejsc rejestracji podlegają ręcznie narzuconym limitom (zob. tabela 1). U podstaw wielu opcji parametrycznych leżą liczne interakcje między cechami projektu. W pewnych warunkach interakcje te mogą stać się niespójne. W idealnej sytuacji wszystkie możliwe kombinacje wartości parametrów są prawidłowe. Jednak ze względu na bardziej złożoną konstrukcję TD Drive zdecydowano się na ograniczenie współrzędnych środkowo-bocznych do testowanego zakresu. Wybór współrzędnych poza testowanymi granicami jest w zasadzie możliwy. Jednak wprowadzanie takich zmian nie jest zalecane, ponieważ integralność projektu może zostać zagrożona, a przywrócenie jej przy zachowaniu współrzędnych poza limitem może wymagać doświadczenia w modelowaniu CAD. Jest to nieodłączny rezultat kompromisu między łatwością produkcji napędów a elastycznością - większe stopnie swobody sprawiają, że parametryczna definicja napędu jest bardziej złożona i może skutkować zbyt szczegółowymi, niepożądanymi wynikami (na przykład konieczność wytworzenia różnych EIB w przypadku niewielkich zmian w konstrukcji napędu).
Wybory parametrów dokonywane w tej manifestacji TD Drive są kierowane preferencjami obecnych eksperymentatorów. Zdecydowano się na przykład na zwiększenie wysokości cokołów TD Drive, poprawiając łatwość implantacji podczas operacji kosztem nieco wyższego implantu końcowego. Jednak implant jest nadal znacznie mniejszy niż napędy z indywidualnie ruchomymi tetrodami i został dobrze przyjęty przez zwierzęta. Dwa postumenty używane do zakotwiczenia napędu ("c" na rysunku 2E) są celowo umieszczone w płaszczyźnie środkowej, równolegle do szwu środkowego czaszki szczura. Ogranicza to lokalizacje zapisu do współrzędnych środkowo-bocznych > 0,75 mm. Często obecność zatoki strzałkowej poniżej linii środkowej narzuca podobną granicę dla kraniotomii anatomicznie. Obecny projekt TD Drive został stworzony w programie Autodesk Fusion. Chociaż jest to jeden z najbardziej zaawansowanych programów do parametrycznego projektowania wspomaganego komputerowo 3D i w momencie publikacji zapewnia bezpłatną licencję do użytku akademickiego, komercyjny i oparty na chmurze charakter programu stanowi zagrożenie dla bezpłatnej dostępności projektu. W związku z tym przeniesienie projektu do prawdziwego parametrycznego oprogramowania CAD o otwartym kodzie źródłowym21, takiego jak FreeCAD, może być konieczne w przyszłej iteracji.
Zabieg TD Drive można wykonać w ciągu 2-3 godzin. Docelowe lokalizacje drutu są oznaczone stereotaktycznie (PFC +3,5AP obok linii środkowej, HPC -3,8AP -/+ 2,5 ML, RSC -5,8 obok linii środkowej), a elektrody śrubowe, GND i dodatkowe czaszki dla stabilności są umieszczone względem tych lokalizacji. Podczas gdy szablon TD Drive zapewnia lokalizacje stereotaktyczne, nieprecyzyje w umieszczeniu rurki poliimidowej i użycie mniej sztywnego materiału rurki mogą wprowadzać niewielkie zmiany w położeniu elektrod. Dlatego zaleca się wiercenie małych kraniotomii (zamiast otworów w żarnach o średnicy 0,5 mm wielkości rurki prowadzącej), aby uwzględnić tę zmienność. W tej operacji wykonuje się pojedynczą, większą kraniotomię dla celów RSC i HPC. W przypadku PFC i RSC zdecydowano się na wszczepienie wiązek przewodów na ustalonej głębokości. Wiązka PFC zawierała przewody skierowane na dwie różne głębokości do nagrywania z przedlimbicznej i przedniej kory obręczy. Wiązki HPC były ruchome i zbudowane z 3 drutów na różnych wysokościach, aby ułatwić dotarcie do warstwy piramidalnej Ca1, a także warstwy promienistej. Ostatni, krótszy przewód umożliwiał nagrywanie z PPC. Osiągnęliśmy najlepsze wyniki w celowaniu w Ca1 hipokampa, gdy najdłuższy drut elektrody został przeniesiony na docelową głębokość (2 mm brzusznie od powierzchni mózgu) podczas operacji, z niewielkimi korektami w ciągu dwóch tygodni po operacji podczas kontroli sygnału na żywo, aby uwzględnić indywidualne odchylenia i obrzęk mózgu po operacji.
Problem z dużymi implantami, takimi jak hipernapędy tetrodowe, u szczurów polega na ryzyku pogorszenia stabilności implantu i utraty implantu przez zwierzęta. W przypadku TD Drive zaobserwowano pojedyncze awarie spowodowane pogorszeniem stabilności implantu po 2 miesiącach (3 z 16 zwierząt). Dlatego TD Drive jest zalecany do eksperymentów, których planowany maksymalny czas trwania wynosi 8 tygodni. Pokazujemy, że w tym okresie czasu sygnał jest stabilny - nawet dokładne zapisy warstwy piramidalnej hipokampa - i nie ma systematycznego dryfu ani znaczącego chybotania wpływającego na zapisy LFP. Jednym z czynników wpływających na osiągnięcie tej długoterminowej stabilności jest zastosowanie wielu czaszkowych (patrz rysunek 3A). W niektórych sytuacjach ilość zużytych kotwiących czaszkę może zwiększać ryzyko infekcji22. Jest to jednak prawdopodobnie najbardziej istotne u szczurów z mocowaną głową, u których powtarzające się naprężenia związane z mocowaniem głowy na płycie głowicy i podłączonych kotwiących mogą powodować degradację implantu, co ułatwia infekcje. Kolejnym czynnikiem, który zwiększa ryzyko awarii implantu (i może wywoływać dyskomfort u zachowujących się zwierząt) jest waga implantu. Kompletny implant napędowy TD ze kotwiącymi i cementem dentystycznym waży około 7 g, przy czym części drukowane w 3D i EIB stanowią około połowy wagi. Ze względu na niską wagę napędu TD (mniej niż 1/3 innych dużych hipernapędów tetrodowych), jest mało prawdopodobne, aby nadmierna waga implantu była istotnym czynnikiem powodującym awarie napędu TD. Ogólnie rzecz biorąc, głównym czynnikiem stabilnych, wolnych od infekcji implantów jest sterylna procedura chirurgiczna i dobre przyleganie cementu dentystycznego, który pokrywa implant do implantu, kotwiących i czaszki23. Oceniliśmy TD Drive tylko pod kątem rejestrowania lokalnych potencjałów pola i nie próbowaliśmy uzyskać aktywności pojedynczej jednostki. Chociaż oczekujemy, że implant będzie ogólnie wystarczająco stabilny, aby to zrobić, przestrzeganie tych samych jednostek w trakcie i między sesjami może wymagać optymalizacji stabilności wózka, na przykład poprzez optymalizację szyny prowadzącej wahadłowca ("b" na rysunku 2E). Dodanie ruchomych wahadłowców do innych miejsc nagrywania pozwoliłoby na dodatkowe wykorzystanie ruchomych elektrod drucianych, które są preferowanym sposobem zapewnienia lepszej długoterminowej jakości sygnału w nagraniach jednostkowych.
Przy całkowitym czasie montażu wynoszącym około 3 godzin i czasie operacji wynoszącym około 2-3 godzin, TD Drive oferuje kompromis między hipernapędami tetrodowymi a prostszymi, mniej regulowanymi implantami wieloprzewodowymi24. Za pomocą wybranych celów uzyskano nagrania z 10 obszarów mózgu z 6 pęczkami. W porównaniu z innymi implantami do nieruchomych wiązek przewodów, symetryczne rozmieszczenie miejsc rejestracji ma jeszcze jedną zaletę: jeśli lateralizacja nie jest istotna, jednoczesne wszczepienie drutów w obu półkulach podwaja szansę na trafienie we właściwy cel i wydajność danych na zwierzę. W badaniu pilotażowym 4 z 8 zwierząt miały prawidłowo wycelowane obustronnie wszystkie 5 miejsc docelowych (PFC, w tym kora przedlimbiczna (PRL) i przednia kora zakrętu obręczy (ACC), RSC, PPC i piramidalna warstwa Ca1 HPC), ale 7 z 8 miało zarejestrowane co najmniej każdy obszar mózgu po jednej stronie. Dlatego ten napęd jest zalecany dla tych, którzy chcą szybkiego i łatwego w budowie rozwiązania do rejestrowania LFP, które może być stosowane przez mniej doświadczonych badaczy, zwłaszcza gdy potrzebna jest wyższa liczba zwierząt, na przykład w badaniach snu. Przy wielu wysokiej klasy hipernapędach tetrodowych, które pozwoliłyby na rejestrację indywidualnej aktywności neuronalnej, nawet bardzo wykwalifikowani i doświadczeni badacze mogą zbudować i wszczepić tylko 2-6 implantów rocznie, z których wiele nie dotrze z powodzeniem do żadnego obszaru zainteresowania mózgu. Potrzeba wielu lat treningu, aby osiągnąć wyższe wskaźniki sukcesu, a nawet wtedy liczba zwierząt, które można skutecznie rejestrować, pozostaje niska.
Podsumowując, TD Drive to łatwy i szybki w budowie napęd drutowy z 6 wiązkami, które można łatwo dostosować do różnych miejsc nagrywania i innych implantów, takich jak kaniule i włókna.
Oświadczenia
TS i PvH są pracownikami firmy 3Dneuro z siedzibą w Nijmegen w Holandii. Firma 3Dneuro jest współtwórcą i producentem napędu TD Drive.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Angeli Gomez Fonseca za inspirację do stworzenia napędu oraz wszystkim studentom, którzy przeprowadzili pilotażowe eksperymenty na zwierzętach, Milanowi Bogersowi, Floor van Ravenswoud i Evie Severijnen. Prace te były wspierane przez Holenderską Radę ds. Badań Naukowych (NWO; Program zwrotnicy 17619 "INTENSYWNY").
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wiertło 0,5 mm | McMaster | 2951A38 | |
| Gniazdo SIP/DIP o rastrze 1,27 mm (Mill-Max) | Mouser Electronic | 575-003101 | Do montażu i podłączenia EEG i GND |
| 5 minutowe epoksydowe | Bison | Dostępny w handlu | regularny, gotowy do użycia klej epoksydowy |
| cyjanoakrylowy | Loctite | Super Glue-3 | |
| Drut EEG | Science Products GmbH | 7SS-2T | |
| Drut elektrodowy | Science Products GmbH | NC7620F | |
| Etanol | LC | Do standardowej procedury sterylizacji przedoperacyjnej napędu | |
| Kleszcze drobnoziarniste (5) | FST | 91150-20 | Do przygotowania i obsługi wiązki przewodów |
| Forma 3B | Formlabs | Drukarka 3D służąca do drukowania 3D samodzielnie wydrukowanych części napędu TD | |
| Złote szpilki (małe) | Neuralynx, Inc. | 9885 | Mocowanie przewodów elektrycznych do płyty EIB |
| Przewód uziemiający | Science Products GmbH | SS-3T/A Złącze | |
| o dużej gęstości | LabMaker GmbH/Omnetics | A79026-001 | |
| Lister Szczury Hodded | Charles River Laboratories | Crl:LIS | użyliśmy samców szczurów w wieku 9-12 tygodni w momencie przyjazdu |
| Mosiężna wkładka M1 | AliExpress | Dostępny w handlu | |
| https://aliexpress.com/item/33047616164.html kran M1 Śruba | McMaster | 2504A33 | |
| M1x16 | Bossard | 1096613 | |
| ze stali nierdzewnej M1x3 | i nie tylko | 84213_14985 | |
| Wkręty poliamidowe M2,5x5 | i inne | 7985PA25S_50 | |
| olej mineralny | McMaster | 1244K14 | |
| Lakier do paznokci | Etos | Dostępny w handlu | Do kodowania kolorami przewodów EEG i GND |
| malarska | Gamma | Dostępna w handlu | Do przygotowania wiązki przewodów |
| Pin Imadło | McMaster | 8455A16 | |
| papier do plotowania | Canson | Dostępne w handlu | Do przygotowania wiązek drutu |
| rurki poliimidowe | Amazon / Małe części | TWPT-0159-30-50 | AWG, 0.0159" ID, 0.0219" OD, 0.0030" Ściana, 30" Długość |
| RHD 32-kanałowa scena czołowa z akcelerometrem | Intan Technologies, LLC | C3324 | Do nagrań na uwięzi w sleepbox |
| RHD 3-ft (0,9 m) standardowe SPI | Intan Technologies, LLC | C3203 | Od komutatora do stacji czołowej |
| RHD 6-ft (1,8 m) standardowe SPI | Intan Technologies, LLC | C3206 | Od skrzynki OpenEphys do komutatora |
| Pierścień ślizgowy z kołnierzem | Adafruit | 1196 | Komutator: średnica 22 mm, 12 żył |
| Topnik lutowniczy | Griffon S-39 50 ml | Dostępny w handlu | Do EEG i GND |
| pasta lutownicza | Amazon | B08CBZ5HC5 | |
| nakrętka M2 ze stali nierdzewnej | McMaster | 93935A305 | |
| Konfiguracja nagrywania na uwięzi | OpenEphys | Acquisition Board | |
| Bezprzewodowy rejestrator nagrań | SpikeGadgets | miniLogger 32 | Do bezprzewodowych nagrań w zadaniu |
| Konfiguracja nagrywania bezprzewodowego | SpikeGadgets | Main Control Unit (MCU) z płytką rozdzielającą i nadajnikiem-odbiornikiem RF | Do bezprzewodowych nagrań w zadaniu |
Bibliografia
- Deffieux, T., Demené, C., Tanter, M. Functional Ultrasound Imaging: A New Imaging Modality for Neuroscience. Neuroscience. 474, 110-121 (2021).
- Finn, E. S., Poldrack, R. A., Shine, J. M. Functional neuroimaging as a catalyst for integrated neuroscience. Nature. 623 (7986), 263-273 (2023).
- Aharoni, D., Federico Guo, C. Aharoni-Lab/Miniscope-v4: Release for generating. GitHub. , (2023).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
- Buzsáki, G., et al. Tools for probing local circuits: High-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Lacroix, M. M., et al. Improved sleep scoring in mice reveals human-like stages. bioRxi.v. , (2018).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Sci New Ser. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Headley, D. B., DeLucca, M. V., Haufler, D., Paré, D. Incorporating 3D-printing technology in the design of head-caps and electrode drives for recording neurons in multiple brain regions. J Neurophysiol. 113 (7), 2721-2732 (2015).
- Camba, J. D., Contero, M., Company, P. Parametric CAD modeling: An analysis of strategies for design reusability. Comput Aided Des. 74, 18-31 (2016).
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication. J Vis Exp. (26), e1094(2009).
- Voigts, J., Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: An ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Front Syst Neurosci. 7, (2013).
- Voigts, J., Newman, J. P., Wilson, M. A., Harnett, M. T. An easy-to-assemble, robust, and lightweight drive implant for chronic tetrode recordings in freely moving animals. J Neural Eng. 17 (2), 026044(2020).
- Sheng, T., et al. A novel 3D-printed multi-driven system for large-scale neurophysiological recordings in multiple brain regions. J Neurosci Methods. 361, 109286(2021).
- Vöröslakos, M., Petersen, P. C., Vöröslakos, B., Buzsáki, G. Metal microdrive and head cap system for silicon probe recovery in freely moving rodent. eLife. 10, e65859(2021).
- Mishra, A., Marzban, N., Cohen, M. X., Englitz, B. Dynamics of neural microstates in the VTA-striatal-prefrontal loop during novelty exploration in the rat. bioRxiv. , (2020).
- Allen, L. M., et al. RatHat: A self-targeting printable brain implant system. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Slack, I. Soldering Safety. , Available from: https://safety.eng.cam.ac.uk/safe-working/copy_of_soldering-safety (2018).
- Harvard Soldering Safety Guidelines. , Available from: https://www.ehs.harvard.edu/sites/default/files/soldering_safety_guidelines.pdf (2019).
- Samanta, A., et al. CBD lengthens sleep but shortens ripples and leads to intact simple but worse cumulative memory. iScience. 26 (11), 108327(2023).
- Machado, F., Malpica, N., Borromeo, S. Parametric CAD modeling for open source scientific hardware: Comparing OpenSCAD and FreeCAD Python scripts. PLOS One. 14 (12), e0225795(2019).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat: Procedures and pitfalls. Somatosens Mot Res. 27 (4), 131-148 (2010).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic surgery and long-term maintenance of cranial implants in research animals. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (1), 56-63 (1999).
- França, A. S. C., van Hulten, J. A., Cohen, M. X. Low-cost and versatile electrodes for extracellular chronic recordings in rodents. Heliyon. 6 (9), e04867(2020).
Przedruki i uprawnienia
