TD Drive: parametryczny implant o otwartym kodzie źródłowym do wieloobszarowych zapisów elektrofizjologicznych u zachowujących się i śpiących szczurów

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy unikalny, drukowalny w 3D implant dla szczurów, nazwany TD Drive, zdolny do symetrycznych, obustronnych zapisów elektrod drucianych, obecnie w maksymalnie dziesięciu rozproszonych obszarach mózgu jednocześnie.

Streszczenie

Skomplikowane interakcje między wieloma obszarami mózgu leżą u podstaw większości funkcji przypisywanych mózgowi. Proces uczenia się, a także tworzenie i konsolidacja wspomnień to dwa przykłady, które w dużym stopniu opierają się na funkcjonalnej łączności w mózgu. Ponadto badanie podobieństw i/lub różnic na półkulach idzie w parze z tymi wieloobszarowymi interakcjami. Badania elektrofizjologiczne mające na celu dokładniejsze wyjaśnienie tych złożonych procesów polegają zatem na rejestrowaniu aktywności mózgu w wielu miejscach jednocześnie, często w sposób dwustronny. Prezentowany jest implant do druku 3D dla szczurów, nazwany TD Drive, zdolny do symetrycznych, obustronnych zapisów elektrod drucianych, obecnie w maksymalnie dziesięciu rozproszonych obszarach mózgu jednocześnie. Projekt typu open source został stworzony przy użyciu zasad projektowania parametrycznego, co pozwala potencjalnym użytkownikom łatwo dostosować projekt napędu do swoich potrzeb, po prostu dostosowując parametry wysokiego poziomu, takie jak współrzędne przednie-tylne i przyśrodkowe lokalizacji elektrod rejestrujących. Projekt implantu został zweryfikowany na n = 20 szczurach z kapturem Listera, które wykonywały różne zadania. Implant był kompatybilny z nagraniami snu na uwięzi i nagraniami w otwartym terenie (Object Exploration), a także z nagrywaniem bezprzewodowym w dużym labiryncie przy użyciu dwóch różnych komercyjnych systemów nagrywania i scen czołowych. W związku z tym przedstawiono adaptowalny projekt i montaż nowego implantu elektrofizjologicznego, ułatwiający szybkie przygotowanie i wszczepienie.

Wprowadzenie

Wieloobszarowy charakter interakcji mózgu podczas czuwania i snu utrudnia dokładne badanie zachodzących procesów fizjologicznych. Podczas gdy podejścia takie jak funkcjonalny rezonans magnetyczny (fMRI) i funkcjonalne ultradźwięki (fUS) umożliwiają pobieranie próbek aktywności mózgu z całych mózgów^1,2, wykorzystują one sprzężenie nerwowo-naczyniowe do wnioskowania o aktywności mózgu na podstawie aktywności hemodynamicznej, ograniczając ich rozdzielczość czasową². Ponadto fMRI wymaga umieszczenia osoby badanej w skanerze MRI, co zabrania eksperymentów na swobodnie poruszających się zwierzętach. Optyczne obrazowanie dynamiki wapnia z obrazowaniem jedno- lub wielofotonowym umożliwia jednoczesne rejestrowanie setek neuronów w zależności od typu komórki³. Jednak mikroskopy montowane na głowie, takie jak Miniscope³, które pozwalają na swobodne poruszanie się, są zwykle ograniczone do obrazowania powierzchownych obszarów kory mózgowej w nienaruszonych mózgach⁴. Podczas gdy średnica ich pola widzenia na korze mózgowej może być rzędu 1 mm, wymagania przestrzenne tych mikroskopów montowanych na głowie mogą utrudniać celowanie w kilka, zwłaszcza sąsiednich, obszarów. Dlatego, aby dokładnie uchwycić wieloobszarową dynamikę mózgu podczas czuwania i snu, elektrofizjologia zewnątrzkomórkowa, rejestrowana za pomocą elektrod wszczepionych w obszary mózgu będące przedmiotem zainteresowania, jest jedną z metod z wyboru ze względu na wysoką rozdzielczość czasową i precyzję przestrzenną⁵. Ponadto pozwala na scharakteryzowanie dynamiki snu u zwierząt zgodnie z analizami uzyskanymi z ludzkiego EEG, zwiększając wartość translacyjną tej metody⁶.

Klasycznie, badania rejestrujące aktywność mózgu za pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych wykorzystywały pojedyncze druty elektrodowe lub wiązki elektrod, takie jak tetrodes⁷. Najnowocześniejsze sondy, takie jak Neuropixels probe⁸, umożliwiają celowanie w kilka obszarów jednocześnie, pod warunkiem, że są one ustawione na osi, która umożliwia wszczepienie sondy wzdłuż tej osi bez uszczerbku dla zwierzęcia. Jednak dokładne jednoczesne rejestrowanie wielu, oddzielonych od siebie przestrzennie obszarów nadal stanowi wyzwanie, a istniejące metody są albo kosztowne, albo czasochłonne.

W ostatnich latach metody wytwarzania przyrostowego, takie jak stereolitografia, stały się powszechnie dostępne. Umożliwiło to naukowcom opracowanie nowatorskich implantów elektrod, które można było dostosować do ich wymagań eksperymentalnych⁹, na przykład, uprościło powtarzalne celowanie w wiele obszarów mózgu. Często te projekty implantów są również udostępniane społeczności akademickiej jako sprzęt typu open source, co pozwala innym badaczom dostosować je do własnych celów. Stopień adaptacji poszczególnych implantów różni się zarówno w zależności od tego, jak implant jest zaprojektowany, jak i od sposobu jego udostępniania. Modelowanie parametryczne¹⁰ to popularne podejście w projektowaniu wspomaganym komputerowo, w którym różne elementy projektu są połączone współzależnymi parametrami i zdefiniowaną historią projektu. Wdrożenie parametrycznego podejścia do projektowania implantów zwiększa ich zdolność do ponownego użycia i adaptacji¹⁰, ponieważ zmiana poszczególnych parametrów automatycznie aktualizuje kompletne projekty bez konieczności skomplikowanego przemodelowania projektu. Konsekwencją jest to, że sam projekt jest udostępniany w edytowalnym formacie, który zachowuje relacje parametryczne i historię projektu. Formaty plików, które reprezentują tylko prymitywy geometryczne, takie jak STL lub STEP, sprawiają, że późniejsze modyfikacje parametryczne opublikowanych modeli są niewykonalne.

Podczas gdy hipernapędy tetrody^11,12,13 umożliwiają nagrywanie z dziesiątek tetrod, ich montaż i implantacja są czasochłonne, a ich jakość zależy w dużej mierze od umiejętności i doświadczenia indywidualnego badacza. Ponadto zwykle łączą rurki prowadzące, które kierują elektrody rejestrujące do ich miejsca docelowego, w jedną lub dwie większe wiązki, ograniczając w ten sposób liczbę i rozproszenie obszarów, w które można skutecznie celować.

Inne implanty^14,15 odsłaniają całą czaszkę i pozwalają na swobodne umieszczanie wielu indywidualnych mikronapędów, które przenoszą elektrody rejestrujące. Podczas gdy umieszczenie niezależnych mikronapędów¹⁶ podczas operacji maksymalizuje elastyczność, wydłuża czas operacji i może utrudniać celowanie w wiele sąsiednich obszarów ze względu na wymagania przestrzenne poszczególnych mikronapędów. Ponadto, chociaż implanty są open source, są publikowane tylko jako pliki STL, co utrudnia modyfikację.

Przykładem napędu z bardziej wrodzoną filozofią parametryczną jest RatHat¹⁷. Zapewniając szablon chirurgiczny, który obejmuje całą grzbietową powierzchnię czaszki, umożliwia precyzyjne celowanie w wiele celów mózgowych bez użycia ramy stereotaktycznej podczas operacji. Dostępnych jest wiele wariantów implantów dla kaniul, optrod lub tetrod. Jednak, chociaż dysk jest darmowy do celów akademickich, nie jest publikowany jako open source, co stanowi przeszkodę dla naukowców w ocenie i użytkowaniu implantu.

W tym artykule prezentowany jest TD Drive (zobacz Rysunek 1), nowatorski implant do druku 3D do pozakomórkowych zapisów elektrod u szczurów. TD Drive ma na celu przezwyciężenie niektórych wad istniejących rozwiązań: pozwala na jednoczesne celowanie w wiele obszarów mózgu, odzwierciedlonych w obu półkulach, za pomocą niezależnych drutów elektrodowych. Ze względu na prostą konstrukcję może być zmontowany w ciągu kilku godzin przy stosunkowo niskich kosztach przez mniej doświadczonych badaczy. TD Drive jest publikowany jako open source, w łatwo modyfikowalnych formatach plików, aby umożliwić naukowcom dostosowanie go do ich konkretnych potrzeb. Zastosowanie parametrycznego modelowania 3D od początku procesu projektowania TD Drive pozwala na abstrahowanie parametrów niezbędnych do zmiany: aby zmienić lokalizacje docelowe, badacze mogą po prostu edytować parametry reprezentujące ich współrzędne grzbietowo-brzuszne i przednio-tylne, bez konieczności samodzielnego przeprojektowywania napędu. Pliki do modyfikacji i produkcji TD Drive można znaleźć pod adresem https://github.com/3Dneuro/TD_Drive.

Rysunek 1: Przegląd napędu TD. (A) Renderowanie napędu TD z nasadką ochronną. (B) Renderowanie z pokazanymi częściami wewnętrznymi. Napęd TD Drive posiada (a) wiele parametrycznie regulowanych miejsc nagrywania dla stałych i ruchomych przewodów elektrodowych, EIB z (b) złączem Omnetics o dużej gęstości kompatybilnym z popularnymi przewodowymi i bezprzewodowymi systemami akwizycji danych oraz (c) intuicyjnym mapowaniem kanałów zoptymalizowanym pod kątem nagrań z systemami Intan/Open Ephys (patrz rysunek uzupełniający 1) oraz (d) nasadka chroniąca implant podczas nagrań na uwięzi oraz gdy nie jest podłączona scena czołowa. (C) Szablon prowadzący na spodzie TD Drive ułatwia umieszczanie kaniul prowadzących i służy jako nadmiarowa weryfikacja lokalizacji implantów podczas operacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Projekt implantu został przetestowany w n = 4, zatwierdzony w n = 8 i potwierdzony u n= 8 szczurów z kapturem Listera, które wykonywały różne zadania. Pierwsze 4 zwierzęta wykorzystano do opracowania napędu i dostosowania parametrów. Następnie przeprowadzono pełny pilotaż z udziałem 8 zwierząt (pokazanych w wynikach). Przeprowadzono drugą kohortę składającą się z 8 zwierząt, która została włączona do analizy przeżycia implantu. Implant był kompatybilny z nagraniami snu na uwięzi i nagraniami w otwartym terenie (Object Exploration), a także z nagrywaniem bezprzewodowym w dużym labiryncie (HexMaze 9 m x 5 m) przy użyciu dwóch różnych komercyjnych systemów nagrywania i scen czołowych. Dwie kohorty po 8 osób zostały nagrane za pomocą dwóch różnych systemów akwizycji - na uwięzi do dłuższych nagrań snu i bezprzewodowo do nagrań eksploracji dużych labiryntów. Możemy wywnioskować, że ten prosty napęd drutowy pozwala na długotrwałe eksperymenty z większymi kohortami przez mniej doświadczonych badaczy, aby umożliwić analizę faz snu, a także analizę oscylacji w wielu obszarach mózgu. Jest to przeciwieństwo większości dotychczasowych implantów elektrofizjologicznych, które ze względu na trudność i czasochłonność pozwalają na mniejsze kohorty zwierząt i zwykle wymagają bardzo doświadczonych eksperymentatorów. Jednak przy tym napędzie nie można zarejestrować żadnej indywidualnej aktywności neuronów; w związku z tym zastosowanie jest ograniczone do badań lokalnego potencjału pola (LFP) i aktywności sumacyjnej.

Protokół

Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez Holenderski Centralny Komitet Śledczy Dierproeven (CCD) i przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Eksperymentach na Zwierzętach (kody protokołu: 2020-0020-006 i 2020-0020-010). Użyto samców szczurów kapturowych Lister w wieku 9-12 tygodni po przybyciu. Odczynniki i sprzęt użyty w protokole są wymienione w Tabeli Materiałów. Patrz Rysunek Uzupełniający 1 i Rysunek Uzupełniający 2, aby zapoznać się z etapami procesu budowy napędu.

1. Dostosowywanie i tworzenie modeli 3D oraz danych z karty interfejsu elektrody (EIB)

1. Otwórz projekt korpusu napędu w programie Autodesk Fusion. Kliknij Zmień parametry na karcie Modyfikuj. Dostosuj współrzędne dla pierwszego miejsca zapisu, wprowadzając współrzędną przednio-tylną w anteroPosteriorSite1 i współrzędną przyśrodkowo-boczną w medioLateralSite1. Można dostosować średnicę otworu na rurkę prowadzącą lub elektrody, regulując średnicęSite1. Powtórz te czynności dla lokalizacji nagrywania 2 i 3, a projekt modelu zostanie automatycznie dostosowany.
   UWAGA: Trzy lokalizacje używane w obecnym protokole to hipokamp (HPC), zawierający ruchome wiązki przewodów, oraz kora przedczołowa (PFC) i retrosplenialna (RSC), obie ze stałymi wiązkami przewodów (wiązka przewodów PFC celuje zarówno w korę przedlimbiczną (PRL), jak i przednią korę obręczy (ACC)). W tabeli 1 przedstawiono ręcznie narzucone limity parametrów sterujących współrzędnymi środkowobocznymi miejsc rejestracji.
2. Wyeksportuj zaktualizowaną treść dysku, klikając ją prawym przyciskiem myszy w przeglądarce i wybierając opcję Zapisz jako siatkę. Wybierz typ STL (binarny), jednostki mm i wysokie zagęszczenie.
3. Wybierz albo przygotowane pliki STL dla zwykłej czapeczki lub, w razie potrzeby (na przykład, gdy cele są bardzo boczne), przygotowane pliki STL dla dużych kapitalików.
4. W zależności od tego, którą nasadkę wybierzesz, wybierz do produkcji zwykłą lub dużą EBI. Pliki produkcyjne Gerber dla obu EIB są dostarczane jako archiwa zip, które można wysłać bezpośrednio do usługi produkcyjnej.

2. Drukowanie modeli 3D i produkcja EIB

UWAGA: W niniejszym badaniu, do produkcji części użyto dostępnej na rynku drukarki 3D (zobacz Tabelę Materiałów). W przypadku korzystania z różnych drukarek lub outsourcingu produkcji może być konieczne użycie różnych, porównywalnych żywic do produkcji części.

1. Wydrukuj korpus napędu i czółenka za pomocą stereolitografii⁹ z wysoką rozdzielczością w zwykłej lub biokompatybilnej żywicy (np. żywicy bezbarwnej, czarnej lub białej) o wysokości warstwy 25 μm. Wydrukuj części do nasadki z mocnej i wytrzymałej żywicy (np. Tough 2000).
2. Produkcja EBI we własnym zakresie lub zlecenie jej wykonania zewnętrznemu usługodawcy. złącze o dużej gęstości do EIB za pomocą technik SMD (Surface Mounted Device).
   UWAGA: Jeśli nie masz doświadczenia w drobnych elementów elektronicznych, zaleca się wykonanie na zewnątrz, na przykład w uniwersyteckim warsztacie elektronicznym lub u komercyjnego dostawcy. Wzmocnij lutowane złącze o dużej gęstości, nakładając mocną żywicę epoksydową wokół złącza. Uważaj, aby nie zakryć otworów na elektrody żywicą epoksydową.

3. Obróbka końcowa korpusu wydrukowanego w 3D

UWAGA: Czapki i czółenka nie powinny wymagać obróbki końcowej. W zależności od jakości wydruków 3D, może być konieczne ich lekkie przeszlifowanie lub usunięcie resztek śladów podporowych. Podczas szlifowania i wiercenia należy uważać, aby nie uszkodzić ścianek korpusu napędu. W razie potrzeby wyczyść części poddane obróbce izopropanolem i/lub miękką szmatką i/lub sprężonym powietrzem.

1. Wywierć otwory na rurki prowadzące na górze i na dole korpusu napędu za pomocą wiertła 0.5 mm zamontowanego w imadle kołkowym. Dzięki temu wymiary są poprawne i spójne we wszystkich witrynach.
2. Wywierć dwa otwory na pogłębiacz stożkowy (jak w Rysunek 2E) w korpusie napędu dla mosiężnej wkładki wahadłowej za pomocą wiertła 2 mm w imadle kołkowym.
3. Oczyść otwory pogłębiacza z resztek wiertniczych za pomocą sprężonego powietrza. Następnie nagwintuj otwory prowadzące na wahadłowe, które są przedłużeniem otworów pogłębiacza, za pomocą kranu M1. Wykonaj gwintowanie w dwóch lub więcej iteracjach, usuwając zanieczyszczenia z kranu i otworu między iteracjami. Opcjonalnie nasmaruj kran kroplą oleju mineralnego.
4. Oczyść korpus napędu z zanieczyszczeń po wierceniu i stukaniu sprężonym powietrzem.

Rysunek 2: Renderowanie napędu TD. (A,B) Napęd TD (A) bez i (B) z osłoną ochronną na modelu czaszki szczura. (C) Rurki prowadzące z poliimidu prawidłowo umieszczone w każdym z sześciu miejsc nagrywania. (D) Izolowany, kompletny zespół wahadłowy składający się ze prowadzącej, drukowanego w 3D czółenka i lutowanej mosiężnej wkładki. (E) Korpus napędu TD z włożonymi dwoma czółenkami. Oznaczone na czerwono: (a) otwory z pogłębiaczem stożkowym dla wahadłowca, (b) prowadnica wahadłowca, (c) środkowe cokoły korpusu napędu, (d) szablon prowadnicy. (F,G) Ważne miejsca na górze (F) i na dole (G) korpusu dysku, które mogą wymagać obróbki końcowej po wydrukowaniu 3D, są oznaczone czerwoną strzałką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Zestawy wahadłowców

1. Wsuń wydrukowane w 3D czółenko na M1x16. Użyj mosiężnej wkładki M1, aby przytrzymać wydrukowane w 3D czółenko na miejscu. Czółenko musi mieć możliwość swobodnego obracania się bez przesuwania się w górę lub w dół po umieszczeniu wkładki.
   UWAGA: Poniższe kroki wiążą się z ryzykiem poparzenia (). W zależności od użytego lutu i topnika lutowniczego mogą one obejmować narażenie na substancje drażniące drogi oddechowe i ołów. Podczas należy zawsze nosić okulary ochronne (ponieważ lut może się rozpryskiwać) i postępować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpiecznego obchodzenia się z potencjalnie szkodliwymi substancjami, w tym odpowiednią wentylacją miejsca pracy w celu odprowadzania oparów lutowniczych. Postępuj zgodnie z lokalnymi przepisami i procedurami operacyjnymi lub zapoznaj się z dostępnymi materiałami online^18,19.
2. Za pomocą niewielkiej ilości pasty lutowniczej mosiężną wkładkę do. Uważaj, aby nie przegrzać wkładki i, aby nie stopić wydrukowanego w 3D czółenka. W zależności od żywicy użytej do drukowania 3D czółenka, trudno jest uniknąć niewielkiej ilości stopienia (a następnie przyklejenia się czółenka do wkładki).
   UWAGA: W przypadku stosowania ze stali nierdzewnej może być wymagany topnik lutowniczy. Zaleca się stosowanie mosiężnych lub ze stali maszynowej, ponieważ są one łatwiejsze do.
3. Po schłodzeniu zespołu czółenka delikatnie obróć wydrukowane w 3D czółenko kilka razy wokół. Jeśli czółenko połączyło się z wkładką podczas, powinno to ją zwolnić.
   UWAGA: Upewnij się, że wahadłowiec może się swobodnie obracać i nie chwieje. Jeśli tak się stanie, wyrzuć zespół wahadłowca i rozpocznij nowy. Ostrożnie spróbuj obrócić mosiężną wkładkę. Jeśli obraca się względem, powtórz proces.

5. Montaż napędu

1. Przytnij dostępne w handlu rurki poliimidowe do około 25 mm długości, ale przynajmniej wystarczająco długie, aby wystawały przez cały korpus napędu.
2. Włóż poliimidowe rurki prowadzące do korpusu napędu. Każda rurka powinna być wprowadzona przez jeden otwór na górze napędu i odpowiadający mu otwór w szablonie prowadzącym na spodzie napędu ("d" w Rysunek 2E). Rurki należy wkładać, aż zrównają się z górną częścią korpusu napędu.
3. Za pomocą cienkiej igły lub wykałaczki nałóż niewielką ilość płynnego kleju cyjanoakrylowego na otwory w górnej części korpusu napędu, aby zamocować rurki prowadzące na miejscu. Nałóż klej od spodu korpusu, aby uniknąć spływania kleju do rurek prowadzących. Klej zostanie wciągnięty do przestrzeni między korpusem napędu a rurą prowadzącą przez siły kapilarne i w ten sposób połączy te dwa.
4. Nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na interfejs między rurkami prowadzącymi a szablonem prowadzącym w dolnej części korpusu napędu. Ponownie należy uważać, aby nie zatkać rurek prowadzących klejem. Pozostaw klej do wyschnięcia na kilka minut.
   UWAGA: Dokładny czas potrzebny na wykonanie zależy od materiału napędu i odstępu między korpusem napędu a rurami prowadzącymi. Generalnie 5-10 minut powinno wystarczyć.
5. Odwróć korpus napędu do góry nogami i odetnij poliimidowe rurki prowadzące na spodzie tak, aby wystawały około 1 mm poza środkowe cokoły korpusu napędu ("c" w Rysunek 2E i Rysunek uzupełniający 2). W tej konfiguracji koniec rurek prowadzących będzie zlicowany z powierzchnią mózgu podczas implantacji.
   UWAGA: Napęd został opracowany w celu celowania w głębsze obszary mózgu. Jeśli celem są powierzchowne obszary kory mózgowej, mogą być konieczne krótsze rurki prowadzące z poliimidu, aby nie uszkodzić powierzchni mózgu w przypadku początkowego obrzęku mózgu.
6. Włóż dwa zespoły wahadłowe do korpusu napędu. Wkręcając je w gwintowane otwory prowadzące, upewnij się, że są równoległe do prowadnic wahadłowych ("b" w Rysunek 2E). Palcami delikatnie wyrównaj czółenka z prowadnicami czółenka.
7. Całkowicie przykręć czółenka do otworów pogłębiacza, aby sprawdzić, czy mosiężne wkładki zespołu wahadłowca nie utknęły w korpusie napędu lub nie kolidują z poliamidowymi rurkami prowadzącymi. W przypadku tego protokołu wymagana jest minimalna odległość 16 pełnych obrotów. Jeśli nie zostanie to osiągnięte, przytnij rurkę poliimidową na górze korpusu napędu, aby uzyskać więcej miejsca. Nie dokręcaj zbyt mocno czółenka w korpusie napędu - może to zniszczyć uwięzione gwinty na korpusie napędu i połączenie lutowane zespołu wahadłowego.
   UWAGA: Jeśli zespół wahadłowca utknie, usuń go całkowicie i sprawdź, czy połączenie lutowane się poluzowało. W takim przypadku należy użyć nowego zestawu wahadłowca. Jeśli zespół wahadłowca koliduje z rurą prowadzącą, skróć rurę prowadzącą tak, aby nie wystawała poza korpus napędu.
8. Przykręć EIB do korpusu napędu za pomocą poliimidowych M2.5x5. Nałóż kilka kropel kleju cyjanoakrylowego między korpus dysku a EIB. Upewnij się, że nie zatkałeś otworów przelotowych do podłączenia elektrody.

6. Przygotowanie osłony ochronnej

1. Włóż nakrętkę M2 ze stali nierdzewnej do profilu na lewej połowie nasadki i przymocuj ją klejem cyjanoakrylowym.
2. W razie potrzeby wywierć otwór z przodu lewej nasadki za pomocą wiodła M1 w imadle kołkowym. Stuknij w otwór z przodu prawej połowy nasadki za pomocą kranu M1.

7. Przygotowanie drutu elektrodowego

1. Przygotuj dwie metalowe płytki jako powierzchnię do tworzenia wiązek drutów elektrodowych. Płyty służą jako płaska, stabilna, ale ruchoma powierzchnia, na której nastąpi montaż, sklejenie i cięcie wiązki drutu. Przymocuj papier do plotowania do pierwszej płyty i zawiąż dwie lepkie taśmy malarskie na drugiej płycie, lepką powierzchnią skierowaną do góry.
2. Trzy z czterech drutów w wiązkach HPC zostaną przecięte pod kątem 60 stopni, aby utworzyć przesunięcie w kierunku grzbietowo-brzusznym. Pozwoli to na umieszczenie drutu odpowiednio nad, wewnątrz i poniżej warstwy piramidy hipokampa. Aby ułatwić cięcie, narysuj wyraźną linię o kącie 60 stopni na papierze kreślarskim (linia 60 stopni).
3. Dla każdej wiązki elektrod HPC wytnij 4 kawałki drutu elektrodowego o długości 4,5 cm każdy. Dla każdej wiązki elektrod PFC i RSC wytnij 4 kawałki drutu elektrodowego o długości 3.5 cm każdy.
4. Delikatnie podnieś 4 przewody, dotykając ich opuszkiem palca (przykleją się do niego) i umieść je jak najbliżej siebie obok siebie na taśmie malarskiej. Upewnij się, że nie kładziesz ich jeden na drugim.
5. Pod mikroskopem użyj kleszczy, aby umieścić druty jak najbliżej siebie. Nałóż cienką warstwę płynnego kleju cyjanoakrylowego na pierwsze 2 cm górnej części wiązki. W przypadku wiązki HPC przyklej > 2 cm i < 3,5 cm drutu. Poczekaj, aż klej wyschnie.
6. Delikatnie dotknij drutów kleszczami pod mikroskopem. Jeśli się nie rozdzielą, są prawidłowo sklejone. W ramach kontroli poczytalności upewnij się, że warstwa kleju świeci pod oświetleniem mikroskopu.
7. Po całkowitym wyschnięciu usuń wiązkę drutu z taśmy i przenieś ją na płytę z papierem do kreślenia. Pod mikroskopem sprawdź wiązkę drutu pod kątem nadmiaru kleju na górze lub po bokach i ostrożnie usuń ją ostrzem skalpela.
8. W przypadku wiązek RSC wykonaj proste cięcie u dołu tablicy, prostopadle do kierunku przewodów.
9. W przypadku wiązek HPC umieść tablicę na papierze do kreślenia tak, aby przecinała linię 60 stopni, a następnie użyj linii jako prowadnicy, aby wykonać cięcie pod kątem 60 stopni w kierunku przewodów.
   1. Następnie za pomocą ostrza skalpela ostrożnie odetnij najkrótszy z 4 przewodów z wiązki. Przetnij drut prostopadle do kierunku drutu, skracając go do około 0.75 mm w porównaniu z drugim najdłuższym drutem w wiązce.
10. W przypadku wiązek PFC podziel dolną część macierzy na dwie wiązki 2-przewodowe. Upewnij się, że oba przewody są dobrze sklejone ze sobą. Skróć jedną z wiązek 2-żyłowych o 1 mm, przecinając ją prostopadle do kierunku drutu. Patrz Rysunek Uzupełniający 1 (na dole) i Rysunek Uzupełniający 2b dla obrazów przeciętych wiązek przewodów.

8. Przygotowanie przewodu uziemiającego i przewodów EEG

1. Wypchnij co najmniej 10 pinów SIP/DIP z połączonej listwy gniazd SIP/DIP o rozstawie 1.27 mm.
2. Wytnij 2 kawałki o długości 6 cm na przewód uziemiający (GND). Wytnij 8 kawałków o długości 6 cm na drut EEG. Użyj ostrza skalpela, aby ostrożnie usunąć część izolacji z obu końców wszystkich przewodów.
3. Umieść ze stali nierdzewnej M1x3 w trzeciej ręce, pozostawiając jak najwięcej miejsca pod. Owiń odizolowaną stronę przewodu GND lub EEG wokół trzpienia, tuż pod.
4. Nałóż niewielką ilość topnika lutowniczego za pomocą małej igły lub wykałaczki. drut do. Upewnij się, że przypadkowo nie zatkasz szczeliny łba.
5. Umieść pin SIP/DIP w trzeciej ręce, tak aby strona żeńska była dostępna. Włóż odizolowaną część po przeciwnej stronie przewodu do pinu SIP/DIP. Nałóż niewielką ilość topnika lutowniczego i drut do kołka.
6. Wyjmij przylutowany zespół z drutu z uchwytu. Zespół ten zostanie wszczepiony w czaszkę podczas operacji implantacji.
7. Umieść kolejny pin SIP/DIP w uchwycie, obrócony o 180 stopni (tj. dostępny po stronie męskiej). Nałóż niewielką ilość topnika lutowniczego i odizolowaną stronę drugiego przewodu do męskiej strony kołka.
8. Wyjmij przylutowany zespół kołków drucianych z uchwytu. Zespół ten zostanie później podłączony do EIB, a zespół śruba-drut oraz zespół przewód-sworzeń zostaną połączone ze sobą podczas operacji implantacji za pomocą swoich dwóch kołków.
9. Aby wzmocnić lutowane połączenia, nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na połączenie między przewodami a pinami.
10. Po wyschnięciu kleju sprawdź, czy styki SIP/DIP obu zespołów można płynnie połączyć. Użyj opcji sprawdzania ciągłości multimetru, aby sprawdzić, czy istnieje ciągłe połączenie między śrubą a odizolowanym końcem przewodu zespołu przewoda-kołek, gdy oba zespoły są połączone. Opcjonalnie oznacz kolorami każdy zestaw przewodów lakierem do paznokci (patrz Tabela materiałów), aby uprościć prawidłowe połączenie podczas operacji implantologicznej.

9. Ładowanie wiązek przewodów do napędu

1. Przymocuj dysk do uchwytu. Na tym etapie należy uważać, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku na EIB ani nie uszkodzić złącza o dużej gęstości.
2. Gdy korpus napędu znajdzie się w stabilnej pozycji, weź jedną z wiązek drutu i ostrożnie wsuń ją do odpowiedniej rurki poliimidowej, ręcznie lub za pomocą cienkich kleszczyków. Upewnij się, że układ przewodów jest umieszczony we właściwej orientacji (np. w przypadku układu PFC dwa dłuższe przewody układu powinny być skierowane w stronę środka) i należy uważać, aby nie zgiąć układu przewodów.
3. Powtórz ostatni krok dla wszystkich innych wiązek przewodów.
4. Użyj cienkich kleszczyków, aby chwycić jeden z drutów i ostrożnie zegnij go w kierunku otworu, w który chcesz go włożyć. Po włożeniu użyj złotej szpilki, aby przypiąć ją do otworu EIB. Powtórz to dla wszystkich przewodów wiązki i dla wszystkich wiązek.
   1. Upewnij się, że na tym etapie przewody tworzą ładną pętlę nad EIB (w ten sposób nadal jest miejsce na przesuwanie wiązki w górę iw dół rurki poliimidowej w celu regulacji długości na dole rurki) i że matryca wystająca z dna rurki poliimidowej nie zostanie przypadkowo wygięta. Upewnij się, że zanotowałeś, który przewód z każdej wiązki przewodów łączy się z każdym kanałem w EIB. Patrz rysunek uzupełniający 1, aby zapoznać się z opracowaniem mapowania kanałów TD Drive.
      UWAGA: Alternatywnie, po załadowaniu każdej wiązki przewodów (krok 9.2), można bezpośrednio podłączyć przewody do EIB (krok 9.4), a następnie przejść do kroku 9.2 + 9.4 dla pozostałych wiązek przewodów. Można to zmieniać w zależności od osobistych preferencji eksperymentatorów. Patrz rysunek uzupełniający 2b, aby zapoznać się z przykładem załadowanego napędu TD.
5. Dostosuj długość wiązek przewodów, aby prawidłowo wycelować w miejsca nagrywania, delikatnie wciskając lub wyciągając wiązki przewodów do lub z rurki prowadzącej (patrz rysunek uzupełniający 2d).
   UWAGA: Ponieważ rurki prowadzące są cięte tak, aby zlicowały z powierzchnią mózgu, odległość, na jaką wiązka drutu wystaje poza rurkę prowadzącą, odpowiada grzbietowo-brzusznemu położeniu obszaru docelowego. Ruchome wiązki przewodów HPC powinny być zlicowane z dolną częścią rury prowadzącej, stałe wiązki RSC powinny wystawać 1.5 mm, a stałe wiązki PFC powinny wystawać 3.5 mm poza rury prowadzące. Podczas pchania lub ciągnięcia wiązek przewodów należy uważać, aby nie wyciągnąć pojedynczych przewodów z EIB na górze ani nie zgiąć dolnej części wiązki przewodów.
6. Gdy stałe układy przewodów (RSC i PFC) są wyrównane, nałóż niewielką ilość mocnego kleju epoksydowego na górną część rur prowadzących, przyklejając wiązki na miejscu. Podczas utwardzania żywicy epoksydowej upewnij się, że wiązki drutu są nadal prawidłowo wyrównane na dole.
7. Aby zamocować ruchome układy przewodów HPC, najpierw przesuń wahadłowiec do najwyższej wymaganej pozycji (w eksperymentach opisanych w tym artykule co najmniej 16 pełnych obrotów/4 mm powyżej najniższej pozycji). Następnie wepchnij wiązki drutu do otworu w kształcie litery U czółenka i przyklej je niewielką ilością mocnego kleju epoksydowego.
   UWAGA: Upewnij się, że żywica epoksydowa nie spływa po wiązce do rurki poliimidowej. Po utwardzeniu żywicy epoksydowej nałóż drugą warstwę żywicy epoksydowej w tym samym miejscu, aby wzmocnić połączenie i zmniejszyć prawdopodobieństwo zerwania połączenia podczas przesuwania wahadłowca.
8. Ostrożnie włóż otwarty koniec zespołu drut-kołek przewodu GND przez jeden z otworów przelotowych oznaczonych GND. Zamocuj go za pomocą złotego kołka.
   UWAGA: W przypadku korzystania ze sceny czołowej, w której kanały GND i referencyjne (REF) są zwarte, można również użyć kanału REF, jeśli jest to wygodniejsze.
9. Wyjmij napęd z uchwytu; uważaj, aby nie zgiąć żadnego z przewodów. Ponownie przymocuj przednią część napędu do tego samego uchwytu i włóż 4 zespoły przewodów EEG do otworów przelotowych kanałów EEG (oznaczonych 2,4, 29, 31) i przymocuj je za pomocą złotego kołka.
10. W przypadku wszystkich przewodów GND i EEG użyj multimetru na ustawieniu ciągłości, aby sprawdzić ciągłe połączenie między złotym pinem na EIB a pinem podłączonego zespołu przewód-pin.
11. Przechowuj dysk. Można to zrobić na przykład poprzez przymocowanie nasadki do korpusu napędu i przechowywanie jej do góry nogami.
    UWAGA: Przed wszczepieniem implantu chirurgicznego należy wysterylizować spód dysku za pomocą etanolu. Wszystkie kostne i zespoły drutów GND/EEG powinny być sterylizowane w etanolu. Narzędzia chirurgiczne należy sterylizować w autoklawie.

10. Operacja wszczepienia implantu dysku

UWAGA: Ten krok krótko opisuje procedury chirurgiczne związane z wszczepieniem TD Drive. Bardziej obszerny protokół implantacji, w tym opis narzędzi, a także dawek i stężeń leków, można znaleźć w pliku uzupełniającym 1.

1. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne oraz oczyść i zdezynfekuj obszar operacyjny zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi. Aby wysterylizować implanty, umieść części drutów elektrod, które będą miały kontakt z mózgiem, w etanolu przez co najmniej jedną minutę.
   UWAGA: Długa ekspozycja na etanol lub jego opary może osłabić klej cyjanoakrylowy. Jeśli opary nie są uwięzione, przedłuż czas zanurzenia drutów w etanolu. W celu sprawdzenia integralności kleju zaleca się znalezienie optymalnego czasu z implantem testowym, który nie jest używany w rzeczywistym eksperymencie.
2. Zapewnij niezbędną prewencyjną analgezję, antybiotyki i znieczulenie gazowe (izofluran) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i lokalnymi.
3. Umieść szczura w aparacie stereotaktycznym. Ogolić czubek głowy i zdezynfekować skórę jodonem powidonu. Podskórnie zastosuj znieczulenie miejscowe (lidokaina) i wykonaj małe nacięcie na czaszce na górze linii środkowej.
4. Odsłoń czaszkę, pociągając skórę na bok. Usuń tkankę łączną z czaszki, osusz i oczyść powierzchnię czaszki. Delikatnie odłącz mięśnie z boku czaszki, aby umożliwić umieszczenie kotwiących.
5. Zmierz współrzędne bregma i lambda. W celu precyzyjnego celowania upewnij się, że powierzchnia czaszki jest równoległa do przednio-tylno-bocznej płaszczyzny stereotaktu, mierząc różnicę w grzbietowo-brzusznym położeniu bregmy i lambdy. Jeśli współrzędne się różnią, dostosuj pozycję szczura w stereotaksie, podnosząc lub opuszczając ustnik.
6. Zaznacz kraniotomię wokół miejsc docelowych (kora przedlimbiczna (AP +3,5 mm i ML + -1 mm), retrosplenialna (AP+5,8 mm i ML +-1mm oraz hipokamp (AP -3,8 mm i ML + - 2,5 mm)).
7. Wywierć otwory na GND/EEG i kotwiące. Włóż i przykryj je płynnym akrylem dentystycznym. Wywierć kraniotomię i ostrożnie usuń oponę twardą. Zapobiegaj wysychaniu kraniotomii, stosując sterylną sól fizjologiczną.
8. Ostrożnie umieść TD Drive na szczycie kraniotomii, upewniając się, że rurki prowadzące są równo z czaszką. Zabezpiecz rurki prowadzące wazeliną i przymocuj TD Drive do czaszki za pomocą akrylu dentystycznego.
9. Powoli opuść układy przewodów ukierunkowane na HPC od ich początkowej lokalizacji (~1,5 mm DV od powierzchni mózgu) w kierunku piramidalnej warstwy hipokampa CA1. Do warstwy piramidalnej docierano stopniowo w kolejnych dniach podczas sprawdzania sygnału w okresie rekonwalescencji szczurów.
10. Umieść nasadkę ochronną wokół dysku.
11. Wyłącz znieczulenie gazowe i usuń szczura z ramy stereotaktycznej. Umieść szczura w czystej klatce w ogrzewanej komorze i zapewnij mokrą karmę i wodę do regeneracji. Monitoruj szczura, aż będzie ponownie aktywny, poruszając się w klatce, jedząc i pijąc.
12. Przyprowadź szczura z powrotem do pomieszczenia mieszkalnego. Zapewnij znieczulenie pooperacyjne i opiekę zgodnie z wytycznymi instytucji. Na przykład zobacz przykład protokołu chirurgicznego w pliku uzupełniającym 1.

11. Odzyskiwanie EBI

1. Pod koniec eksperymentu odzyskaj dysk i zdejmij pokrywę ochronną.
2. Usuń złote szpilki i ostrożnie podłącz przewody elektrod. Odkręć EIB od korpusu napędu. Delikatnie wciskając miękką pęsetę między EIB a korpus napędu lub ostrożnie podnosząc EIB ręcznie, zwolnij pozostałe wiązanie cyjanoakrylowe, które utrzymuje EIB przy korpusie.
3. Oczyść EIB i złote piny do ponownego użycia na kolejnych implantach TD Drive. Przed ponownym użyciem EIB sprawdź złote przelotki i złącze o dużej gęstości pod kątem zużycia. Ponownie użyj EIB tylko wtedy, gdy przelotki są wystarczająco nienaruszone, aby umożliwić dobre połączenie między złotymi pinami, drutami elektrody i EIB oraz jeśli połączenie złącza o dużej gęstości ze sceną czołową jest nadal wystarczająco stabilne.

Wyniki

Korzystając z instrukcji zawartych w protokole, napęd TD może być łatwo zbudowany przez wielu eksperymentatorów. Po opracowaniu napędu (n = 4) przeprowadzono pełny pilotaż z ośmioma zwierzętami. Wszczepiono dodatkową partię ośmiu zwierząt i przeprowadzono zbieranie danych eksperymentalnych. Ponieważ analiza danych dotyczących tych zwierząt nie została zakończona, zostały one włączone do analizy przeżywalności, ale nie do innych analiz (np. celowania lub histologii). Operacja wszczepienia implantu została wykonana 2 tygodnie po przylocie (patrz Rysunek 3A dla docelowych lokalizacji użytych w pilotażu). Implant został wykonany przy użyciu zwykłych zabiegów chirurgicznych i trwał ~3 godziny. Doświadczony chirurg wykonywał pierwsze implanty i mógł nauczyć samodzielności zarówno doświadczonych, jak i początkujących eksperymentatorów z 2-3 operacjami.

Rysunek 3: Operacja wszczepienia implantu, dane dotyczące snu i aktywność szerokopasmowa. (A) Schematyczny przegląd pokazujący docelowe lokalizacje kraniotomii (niebieskie kółka) i czaszki (zielony: EEG, niebieski: GND, szary: kotwiące, zauważ, że dwie kotwiące znajdują się z boku czaszki). (B) Fotografia wszczepionych zwierząt z uwiązaną głową podczas snu i czuwania. (C) Przykładowe dane dotyczące snu z PFC (prelimbicznego) i HPC (Ca1) zwierzęcia na uwięzi, podzielone na sen REM z theta i sen NonREM z deltą, wrzecionami i tętnieniami. Oś Y: mikrowolt, oś x: sekundy. Dane te można wykorzystać na przykład do oceny snu lub wykrywania i analizy zdarzeń oscylacyjnych (D) Przykład: aktywność szerokopasmowa zarejestrowana bezprzewodowo u obudzonego zwierzęcia (hałaśliwe kanały po lewej stronie nie były połączone). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Trwałość implantu, wykrywanie delta i histologia. (A) Wykres przeżycia implantu dla dwóch rund dłuższych eksperymentów. Warto zauważyć, że w 85 dniu n = 8 zakończyło eksperyment i zaplanowano perfuzję. (B) Przykład danych dla stabilności. Pokazano liczbę wykryć delta w kanale hipokampa w ciągu dni nagrywania (~3 dni w tygodniu). Każde zwierzę wykazywało normalną zmienność w zależności od ilości snu, ale nie było ogólnego dryfu w czasie w sygnale, a tym samym wykryć. (C) Reprezentatywna histologia wskazująca obustronne celowanie u jednego szczura. Lewa kolumna: lewa półkula, prawa kolumna: prawa półkula. Współrzędne AP wskazują współrzędne przednio-tylne przedstawionego wycinka, a strzałki wskazują zmiany chorobowe w docelowych obszarach. Powiększenie: 1,6x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wszystkie zwierzęta dobrze wyzdrowiały i tolerowały implant (Rysunek 3B). Elektrody czołowe i zaśledzinowe były zamocowane, ale pęczki hipokampa były ruchome. Wiązki hipokampa wszczepiono na głębokości grzbietowo-brzusznej 2 mm i dostosowano w celu maksymalizacji pokrycia HPC podczas 2 tygodni rekonwalescencji po operacji, gdzie sygnał był sprawdzany na żywo w okresach przyzwyczajenia do snu. U 7 z 8 zwierząt wszystkie miejsca docelowe zostały osiągnięte na co najmniej jednej półkuli (Tabela 2 dla wskaźników trafień, patrz Rysunek 4C dla reprezentatywnej histologii). Nagrania czuwania i snu zostały z powodzeniem wykonane na uwięzi w pudełku do nagrywania, a także nagrania bezprzewodowe w większym labiryncie (przykładowe dane Rysunek 3C,D). Zwierzęta trzymały implanty przez 2 miesiące, po czym poszczególne zwierzęta zaczynały je tracić; jednak większość zwierząt utrzymywała implanty do dnia zakończenia eksperymentu 85-100 po implantacji (Ryc. 4A). W tym czasie LFP pozostał stabilny, co widać w przykładowej analizie, w której wykryto oscylacje delta (Rysunek 4B). Obserwowano normalną zmienność w czasie, ale nie stwierdzono systematycznego dryfu sygnału w żadnym z zarejestrowanych obszarów mózgu (w tym w warstwie piramidalnej CA1). Zaleca się zakończenie eksperymentów w ciągu 10-15 tygodni po zabiegu. Wszystkie EBI mogłyby zostać odzyskane.

Użyliśmy tego implantu głównie do pomiaru faz snu i oscylacji snu w odpowiedzi na naukę i inne interwencje. Na przykład, jak doustne przyjmowanie CBD wpływa na występowanie oscylacji i spójność w różnych obszarach mózgu (patrz Samanta et al.²⁰).

pkt. powiedział: powiedział: pkt.

parametr	Wartość minimalna (mm)	Wartość maksymalna (mm)
medioLateralSite1	0,75	cyfra arabska
medioLateralSite2	1,5	5
medioLateralSite3	0,75	cyfra arabska

Tabela 1: Przegląd ręcznie nałożonych limitów parametrów kontrolujących współrzędne środkowo-boczne miejsc rejestracji.

półkula	Pfc	Rsc	CA1 pyr.
Prawy	8 z 8	5 z 8	6 z 8
Lewy	8 z 8	7 z 8	7 z 8

Tabela 2: Współczynnik trafień dla pilota 8 zwierząt. U 4 z 8 zwierząt wszystkie elektrody zostały umieszczone prawidłowo. Jednak u 7 z 8 zwierząt wszystkie obszary mózgu były prawidłowo ukierunkowane w co najmniej jednej półkuli (z wyjątkiem 1 szczura, u którego brakowało warstwy piramidalnej CA1).

Rysunek uzupełniający 1: Architektura TD Drive. (Góra) Przegląd mapowania kanałów dla TD Drive w przypadku użycia ze stacją czołową Intan RHD32. (Na dole) Dodatkowa ilustracja konfiguracji wiązek przewodów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Dodatkowe zdjęcia napędu TD na kilku etapach procesu budowy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Przykładowy protokół implantacji napędu TD. Procedury i lokalizacje docelowe są dostosowane do pytań badawczych autorów i polityki instytucjonalnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W artykule przedstawiono adaptowalny implant do dwustronnych, symetrycznych, wieloobszarowych zapisów elektrod drucianych dla swobodnie poruszających się szczurów.

Możliwość łatwej regulacji implantu poprzez zmianę predefiniowanych parametrów była jedną z motywacji do stworzenia TD Drive. Dążąc do maksymalizacji elastyczności przy zmianie parametrów, nieodłączne ograniczenia w relacjach między nimi nieuchronnie nakładają ograniczenia na tę zdolność adaptacji. Domyślnie nie są ustawiane żadne limity dla parametrów przednio-tylnych, przy czym współrzędne te są regulowane przez logiczne interakcje między miejscami i ogólny rozmiar korpusu dysku. Parametry sterujące współrzędnymi środkowo-bocznymi wszystkich miejsc rejestracji podlegają ręcznie narzuconym limitom (zob. tabela 1). U podstaw wielu opcji parametrycznych leżą liczne interakcje między cechami projektu. W pewnych warunkach interakcje te mogą stać się niespójne. W idealnej sytuacji wszystkie możliwe kombinacje wartości parametrów są prawidłowe. Jednak ze względu na bardziej złożoną konstrukcję TD Drive zdecydowano się na ograniczenie współrzędnych środkowo-bocznych do testowanego zakresu. Wybór współrzędnych poza testowanymi granicami jest w zasadzie możliwy. Jednak wprowadzanie takich zmian nie jest zalecane, ponieważ integralność projektu może zostać zagrożona, a przywrócenie jej przy zachowaniu współrzędnych poza limitem może wymagać doświadczenia w modelowaniu CAD. Jest to nieodłączny rezultat kompromisu między łatwością produkcji napędów a elastycznością - większe stopnie swobody sprawiają, że parametryczna definicja napędu jest bardziej złożona i może skutkować zbyt szczegółowymi, niepożądanymi wynikami (na przykład konieczność wytworzenia różnych EIB w przypadku niewielkich zmian w konstrukcji napędu).

Wybory parametrów dokonywane w tej manifestacji TD Drive są kierowane preferencjami obecnych eksperymentatorów. Zdecydowano się na przykład na zwiększenie wysokości cokołów TD Drive, poprawiając łatwość implantacji podczas operacji kosztem nieco wyższego implantu końcowego. Jednak implant jest nadal znacznie mniejszy niż napędy z indywidualnie ruchomymi tetrodami i został dobrze przyjęty przez zwierzęta. Dwa postumenty używane do zakotwiczenia napędu ("c" na rysunku 2E) są celowo umieszczone w płaszczyźnie środkowej, równolegle do szwu środkowego czaszki szczura. Ogranicza to lokalizacje zapisu do współrzędnych środkowo-bocznych > 0,75 mm. Często obecność zatoki strzałkowej poniżej linii środkowej narzuca podobną granicę dla kraniotomii anatomicznie. Obecny projekt TD Drive został stworzony w programie Autodesk Fusion. Chociaż jest to jeden z najbardziej zaawansowanych programów do parametrycznego projektowania wspomaganego komputerowo 3D i w momencie publikacji zapewnia bezpłatną licencję do użytku akademickiego, komercyjny i oparty na chmurze charakter programu stanowi zagrożenie dla bezpłatnej dostępności projektu. W związku z tym przeniesienie projektu do prawdziwego parametrycznego oprogramowania CAD o otwartym kodzie źródłowym²¹, takiego jak FreeCAD, może być konieczne w przyszłej iteracji.

Zabieg TD Drive można wykonać w ciągu 2-3 godzin. Docelowe lokalizacje drutu są oznaczone stereotaktycznie (PFC +3,5AP obok linii środkowej, HPC -3,8AP -/+ 2,5 ML, RSC -5,8 obok linii środkowej), a elektrody śrubowe, GND i dodatkowe czaszki dla stabilności są umieszczone względem tych lokalizacji. Podczas gdy szablon TD Drive zapewnia lokalizacje stereotaktyczne, nieprecyzyje w umieszczeniu rurki poliimidowej i użycie mniej sztywnego materiału rurki mogą wprowadzać niewielkie zmiany w położeniu elektrod. Dlatego zaleca się wiercenie małych kraniotomii (zamiast otworów w żarnach o średnicy 0,5 mm wielkości rurki prowadzącej), aby uwzględnić tę zmienność. W tej operacji wykonuje się pojedynczą, większą kraniotomię dla celów RSC i HPC. W przypadku PFC i RSC zdecydowano się na wszczepienie wiązek przewodów na ustalonej głębokości. Wiązka PFC zawierała przewody skierowane na dwie różne głębokości do nagrywania z przedlimbicznej i przedniej kory obręczy. Wiązki HPC były ruchome i zbudowane z 3 drutów na różnych wysokościach, aby ułatwić dotarcie do warstwy piramidalnej Ca1, a także warstwy promienistej. Ostatni, krótszy przewód umożliwiał nagrywanie z PPC. Osiągnęliśmy najlepsze wyniki w celowaniu w Ca1 hipokampa, gdy najdłuższy drut elektrody został przeniesiony na docelową głębokość (2 mm brzusznie od powierzchni mózgu) podczas operacji, z niewielkimi korektami w ciągu dwóch tygodni po operacji podczas kontroli sygnału na żywo, aby uwzględnić indywidualne odchylenia i obrzęk mózgu po operacji.

Problem z dużymi implantami, takimi jak hipernapędy tetrodowe, u szczurów polega na ryzyku pogorszenia stabilności implantu i utraty implantu przez zwierzęta. W przypadku TD Drive zaobserwowano pojedyncze awarie spowodowane pogorszeniem stabilności implantu po 2 miesiącach (3 z 16 zwierząt). Dlatego TD Drive jest zalecany do eksperymentów, których planowany maksymalny czas trwania wynosi 8 tygodni. Pokazujemy, że w tym okresie czasu sygnał jest stabilny - nawet dokładne zapisy warstwy piramidalnej hipokampa - i nie ma systematycznego dryfu ani znaczącego chybotania wpływającego na zapisy LFP. Jednym z czynników wpływających na osiągnięcie tej długoterminowej stabilności jest zastosowanie wielu czaszkowych (patrz rysunek 3A). W niektórych sytuacjach ilość zużytych kotwiących czaszkę może zwiększać ryzyko infekcji²². Jest to jednak prawdopodobnie najbardziej istotne u szczurów z mocowaną głową, u których powtarzające się naprężenia związane z mocowaniem głowy na płycie głowicy i podłączonych kotwiących mogą powodować degradację implantu, co ułatwia infekcje. Kolejnym czynnikiem, który zwiększa ryzyko awarii implantu (i może wywoływać dyskomfort u zachowujących się zwierząt) jest waga implantu. Kompletny implant napędowy TD ze kotwiącymi i cementem dentystycznym waży około 7 g, przy czym części drukowane w 3D i EIB stanowią około połowy wagi. Ze względu na niską wagę napędu TD (mniej niż 1/3 innych dużych hipernapędów tetrodowych), jest mało prawdopodobne, aby nadmierna waga implantu była istotnym czynnikiem powodującym awarie napędu TD. Ogólnie rzecz biorąc, głównym czynnikiem stabilnych, wolnych od infekcji implantów jest sterylna procedura chirurgiczna i dobre przyleganie cementu dentystycznego, który pokrywa implant do implantu, kotwiących i czaszki²³. Oceniliśmy TD Drive tylko pod kątem rejestrowania lokalnych potencjałów pola i nie próbowaliśmy uzyskać aktywności pojedynczej jednostki. Chociaż oczekujemy, że implant będzie ogólnie wystarczająco stabilny, aby to zrobić, przestrzeganie tych samych jednostek w trakcie i między sesjami może wymagać optymalizacji stabilności wózka, na przykład poprzez optymalizację szyny prowadzącej wahadłowca ("b" na rysunku 2E). Dodanie ruchomych wahadłowców do innych miejsc nagrywania pozwoliłoby na dodatkowe wykorzystanie ruchomych elektrod drucianych, które są preferowanym sposobem zapewnienia lepszej długoterminowej jakości sygnału w nagraniach jednostkowych.

Przy całkowitym czasie montażu wynoszącym około 3 godzin i czasie operacji wynoszącym około 2-3 godzin, TD Drive oferuje kompromis między hipernapędami tetrodowymi a prostszymi, mniej regulowanymi implantami wieloprzewodowymi²⁴. Za pomocą wybranych celów uzyskano nagrania z 10 obszarów mózgu z 6 pęczkami. W porównaniu z innymi implantami do nieruchomych wiązek przewodów, symetryczne rozmieszczenie miejsc rejestracji ma jeszcze jedną zaletę: jeśli lateralizacja nie jest istotna, jednoczesne wszczepienie drutów w obu półkulach podwaja szansę na trafienie we właściwy cel i wydajność danych na zwierzę. W badaniu pilotażowym 4 z 8 zwierząt miały prawidłowo wycelowane obustronnie wszystkie 5 miejsc docelowych (PFC, w tym kora przedlimbiczna (PRL) i przednia kora zakrętu obręczy (ACC), RSC, PPC i piramidalna warstwa Ca1 HPC), ale 7 z 8 miało zarejestrowane co najmniej każdy obszar mózgu po jednej stronie. Dlatego ten napęd jest zalecany dla tych, którzy chcą szybkiego i łatwego w budowie rozwiązania do rejestrowania LFP, które może być stosowane przez mniej doświadczonych badaczy, zwłaszcza gdy potrzebna jest wyższa liczba zwierząt, na przykład w badaniach snu. Przy wielu wysokiej klasy hipernapędach tetrodowych, które pozwoliłyby na rejestrację indywidualnej aktywności neuronalnej, nawet bardzo wykwalifikowani i doświadczeni badacze mogą zbudować i wszczepić tylko 2-6 implantów rocznie, z których wiele nie dotrze z powodzeniem do żadnego obszaru zainteresowania mózgu. Potrzeba wielu lat treningu, aby osiągnąć wyższe wskaźniki sukcesu, a nawet wtedy liczba zwierząt, które można skutecznie rejestrować, pozostaje niska.

Podsumowując, TD Drive to łatwy i szybki w budowie napęd drutowy z 6 wiązkami, które można łatwo dostosować do różnych miejsc nagrywania i innych implantów, takich jak kaniule i włókna.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wiertło 0,5 mm	McMaster	2951A38
Gniazdo SIP/DIP o rastrze 1,27 mm (Mill-Max)	Mouser Electronic	575-003101	Do montażu i podłączenia EEG i GND
5 minutowe epoksydowe	Bison	Dostępny w handlu	regularny, gotowy do użycia klej epoksydowy
cyjanoakrylowy	Loctite		Super Glue-3
Drut EEG	Science Products GmbH	7SS-2T
Drut elektrodowy	Science Products GmbH	NC7620F
Etanol	LC		Do standardowej procedury sterylizacji przedoperacyjnej napędu
Kleszcze drobnoziarniste (5)	FST	91150-20	Do przygotowania i obsługi wiązki przewodów
Forma 3B	Formlabs		Drukarka 3D służąca do drukowania 3D samodzielnie wydrukowanych części napędu TD
Złote szpilki (małe)	Neuralynx, Inc.	9885	Mocowanie przewodów elektrycznych do płyty EIB
Przewód uziemiający	Science Products GmbH	SS-3T/A Złącze
o dużej gęstości	LabMaker GmbH/Omnetics	A79026-001
Lister Szczury Hodded	Charles River Laboratories	Crl:LIS	użyliśmy samców szczurów w wieku 9-12 tygodni w momencie przyjazdu
Mosiężna wkładka M1	AliExpress	Dostępny w handlu
https://aliexpress.com/item/33047616164.html kran M1 Śruba	McMaster	2504A33
M1x16	Bossard	1096613
ze stali nierdzewnej M1x3	i nie tylko	84213_14985
Wkręty poliamidowe M2,5x5	i inne	7985PA25S_50
olej mineralny	McMaster	1244K14
Lakier do paznokci	Etos	Dostępny w handlu	Do kodowania kolorami przewodów EEG i GND
malarska	Gamma	Dostępna w handlu	Do przygotowania wiązki przewodów
Pin Imadło	McMaster	8455A16
papier do plotowania	Canson	Dostępne w handlu	Do przygotowania wiązek drutu
rurki poliimidowe	Amazon / Małe części	TWPT-0159-30-50	AWG, 0.0159" ID, 0.0219" OD, 0.0030" Ściana, 30" Długość
RHD 32-kanałowa scena czołowa z akcelerometrem	Intan Technologies, LLC	C3324	Do nagrań na uwięzi w sleepbox
RHD 3-ft (0,9 m) standardowe SPI	Intan Technologies, LLC	C3203	Od komutatora do stacji czołowej
RHD 6-ft (1,8 m) standardowe SPI	Intan Technologies, LLC	C3206	Od skrzynki OpenEphys do komutatora
Pierścień ślizgowy z kołnierzem	Adafruit	1196	Komutator: średnica 22 mm, 12 żył
Topnik lutowniczy	Griffon S-39 50 ml	Dostępny w handlu	Do EEG i GND
pasta lutownicza	Amazon	B08CBZ5HC5
nakrętka M2 ze stali nierdzewnej	McMaster	93935A305
Konfiguracja nagrywania na uwięzi	OpenEphys	Acquisition Board
Bezprzewodowy rejestrator nagrań	SpikeGadgets	miniLogger 32	Do bezprzewodowych nagrań w zadaniu
Konfiguracja nagrywania bezprzewodowego	SpikeGadgets	Main Control Unit (MCU) z płytką rozdzielającą i nadajnikiem-odbiornikiem RF	Do bezprzewodowych nagrań w zadaniu