Artykuł metodologiczny

Szybka izolacja oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych

DOI:

10.3791/66458

⸱

26 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery and Laboratory of Pediatric Surgery, West China Hospital / West China School of Medicine, Sichuan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje zmodyfikowaną procedurę szybkiego izolowania czystych oocytów etapu I u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych, zapewniając tym samym wygodną metodę do badań specyficznych dla oocytów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad rozwojem oocytów mają znaczące implikacje w biologii rozwoju. Danio pręgowany (Danio rerio) był szeroko wykorzystywany jako organizm modelowy do badania wczesnych procesów rozwojowych od oocytu do zarodka. U danio pręgowanego oocyty są otoczone pojedynczą warstwą somatycznych komórek ziarnistych. Jednak oddzielenie komórek ziarnistych od oocytów stanowi wyzwanie, ponieważ uzyskanie czystych oocytów ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnej analizy. Chociaż zaproponowano różne metody izolowania oocytów danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju, obecne techniki nie są w stanie całkowicie usunąć komórek ziarnistych, co ogranicza dokładność analizy genomu skoncentrowanej wyłącznie na oocytach. W tym badaniu udało nam się opracować szybki i skuteczny proces izolowania czystych oocytów etapu I u danio pręgowanego przy jednoczesnym wyeliminowaniu zanieczyszczenia komórkami ziarnistymi. Technika ta ułatwia analizę biochemiczną i molekularną, szczególnie w badaniu aspektów epigenetycznych i struktury genomu specyficznych dla oocytów. Warto zauważyć, że metoda jest przyjazna dla użytkownika, minimalizuje uszkodzenia oocytów i zapewnia praktyczne rozwiązanie do późniejszych badań i analiz.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany jest jednym z najważniejszych systemów modelowych w biologii rozwojowej. W ostatnich latach w licznych badaniach wykorzystano danio pręgowanego jako model do badania ważnych zdarzeń biologicznych i procesów regulacyjnych od oocytu do zarodka. Obejmują one skomplikowane procesy rozwoju i dojrzewania oocytów1, funkcjonalność genów matczynych2, regulację przejść matczyno-jarzygotycznych3, oraz obszerne analizy omiczne4.

Komórki ziarniste, komórki somatyczne otaczające i pielęgnujące rozwijającą się komórkę jajową w pęcherzyku jajnikowym5,6, odgrywają kluczową rolę w tym procesie rozwoju. Gdy pierwotne komórki rozrodcze (PGC) ewoluują w oogonię, są otoczone przez monowarstwę komórek ziarnistych7. Wraz z zewnętrznymi komórkami osłonowymi, oocyt i otaczające go komórki ziarniste tworzą dojrzały pęcherzyk8. Biorąc pod uwagę podstawowe rozróżnienie między komórkami rozrodczymi a komórkami somatycznymi, uzyskanie czystej próbki oocytów jest konieczne, zwłaszcza w przypadku analiz związanych z genomem.

W strukturze pęcherzykowej danio pręgowanego, komórki ziarniste zazwyczaj wykazują średnicę zaledwie kilku mikronów8, podkreślając ścisłe powiązania między komórkami ziarnistymi a oocytami9. To ścisłe powiązanie stanowi wyzwanie w osiągnięciu całkowitej separacji ze względu na znaczną różnicę zarówno w liczbie, jak i objętości komórek ziarnistych w porównaniu z oocytami (setki komórek ziarnistych w porównaniu z pojedynczym oocytem)10,11. Nawet minimalne zanieczyszczenie pojedynczą komórką ziarnistą może utrudnić dalsze analizy ukierunkowane na oocyty. Dlatego w przypadku badań koncentrujących się na cechach genomowych i epigenetycznych niezbędna jest eliminacja komórek ziarnistych.

Korzystając z dobrze scharakteryzowanych kryteriów morfologicznych, oocyty na każdym etapie mogą być rozróżniane na podstawie średnicy11. Proces oogenezy u danio pręgowanego jest podzielony na pięć etapów w zależności od morfologii i kariotypu11. Oocyty stadium I (średnica 7-140 μm) obejmują oocyty od początku mejozy do wczesnego etapu mejozy I. Co najważniejsze, oocyty te są przezroczyste, co pozwala na obserwację jądra centralnego w świetle przechodzącym (Figura 1Ai). Oocyty w stadium II (średnica 140-340 μm) stopniowo stają się pieniste i półprzezroczyste. Wraz z powiększeniem pęcherzyków włosowych i proliferacją pęcherzyków korowych, pęcherzyki rozrodcze w środku stają się trudne do odróżnienia12 (Rysunek 1Aii). Oocyty III stopnia (średnica 340-690 μm) stopniowo gromadzą witellogeninę, a świeże pęcherzyki stają się coraz bardziej nieprzezroczyste (Rysunek 1Aiii). Mejoza trwa w oocytach etapu IV (średnica 690-730 μm), gdy chromosomy wchodzą w środek mejozy II, gdzie ulegają stagnacji (Figura 1Aiv). Oocyty w stadium V (średnica 730-750 μm) dojrzały i są gotowe do owulacji7,11(Rysunek 1Av).

Na podstawie unikalnych cech każdego z wyżej wymienionych etapów, zaproponowano metodę izolowania oocytów od etapów I do III poprzez trawienie jajników danio pręgowanego za pomocą roztworu trawiennego zawierającego kolagenazę I, kolagenazę II i hialuronidazę, a następnie filtrację przez sitko komórkowe o określonej wielkości13. Jednak, chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie oocytów na różnych etapach rozwoju, nie jest w stanie całkowicie oddzielić oocytów i komórek ziarnistych. Inni badacze zasugerowali również metody oddzielania komórek ziarnistych od oocytów. Jednak metody te opierają się przede wszystkim na metodach mechanicznych, które mogą powodować uszkodzenie oocytów, są czasochłonne i niewystarczające do uzyskania znacznej liczby oocytów do analizy14,15.

Biorąc pod uwagę ograniczenia istniejących metod i specyficzne wymagania badawcze, to badanie ma na celu ustalenie procedury dokładnego oddzielania oocytów i komórek ziarnistych oraz uzyskania wystarczającej liczby czystych oocytów I stopnia do analizy. Rozwijając przywołaną metodę13, stosujemy ulepszony bufor trawienny (patrz Tabela materiałów), który jest łagodniejszy i ułatwia dyspersję oocytów i dysocjację komórek ziarnistych. Następnie oocyty są przepuszczane przez sitko komórkowe, po którym następuje mycie i dalsza selekcja mikroskopowa, umożliwiająca pozyskanie dużej liczby czystych oocytów w stadium I.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie danio pręgowane były traktowane zgodnie z rygorystycznymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami, określonymi przez odpowiednie krajowe i/lub lokalne organy ds. dobrostanu zwierząt. Utrzymanie i obchodzenie się z rybami uzyskało zgodę zarówno władz lokalnych, jak i komisji etycznej ds. zwierząt Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Syczuańskiego (zatwierdzenie nr 20220422003). Jajniki danio pręgowanego zawierają mieszaninę wieloetapowych oocytów, z których każdy etap rozwojowy jest obecny w jajnikach dorosłego danio pręgowanego. Jednak młode danio pręgowane zostały wybrane do tego badania ze względu na dominację oocytów w późnym stadium (stadium II-III) w jajnikach dorosłych ryb, które są duże i nieprzezroczyste. Natomiast młode osobniki mają płaskie i wydłużone jajniki składające się głównie z oocytów w stadium I (Ryc. 1B) (Ryc. 1B). Wcześniejsze badania wykazały, że cechy morfologiczne wczesnej oogenezy u dorosłych i młodocianych ryb danio pręgowanego są bardzo spójne, co potwierdza możliwość wykorzystania młodocianych danio pręgowanych13. Procedury opisane poniżej, opisane w Rysunek 2, zawierają szczegółowy opis procesu izolacji, od sekcji do uzyskania czystych oocytów w stadium I. Dla dalszych informacji odczynniki, i sprzęt wykorzystany w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Rozwarstwienie jajników

  1. Wybierz kilka samic danio pręgowanego o standardowej długości (SL) od 10 mm do 15 mm.
    UWAGA: SL, mierzony w milimetrach od pyska do podstawy ogona, służy jako wiarygodne kryterium wyboru odpowiednich ryb. Do tej procedury zaleca się stosowanie młodych ryb między 5 a 7 tygodniem po zapłodnieniu (wpf) z SL w zakresie od 10 mm do 15 mm. Jajniki młodych danio pręgowanego są głównie zajęte przez wczesne oocyty, zapewniając optymalne warunki do łatwego uzyskania oocytów w stadium I (Ryc. 1B).
  2. Poddaj eutanazji młode samice, umieszczając je w lodowatej wodzie (0-4 °C).
    UWAGA: Aby zapewnić eutanazję i zminimalizować ból odczuwany przez danio pręgowanego podczas eutanazji, należy przeprowadzić następujące procedury: potwierdzić, że temperatura lodowatej wody mieści się w zakresie 0-4 °C za pomocą termometru, szybko przenieść danio pręgowanego do lodowatej wody i utrzymywać go w lodowatej wodzie przez co najmniej 10 minut po ustaniu ruchu operkularnego16, 17,18.
  3. Osusz nadmiar wody na powierzchni ryby za pomocą chłonnego papieru.
  4. Przeanalizuj danio pręgowanego pod mikroskopem stereoskopowym, wykonując następujące czynności:
    1. Odetnij głowę za pomocą mikronożyczek wzdłuż tylnego brzegu pokrywy skrzelowej; odetnij ogon wzdłuż kloaki. Przenieś środkowy pień do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego 2 ml pożywki L-15 (z L-glutaminą).
    2. Rozetnij środkowy pień w podłożu L-15. Przeciąć wzdłuż środkowej osi brzucha i usunąć wnętrzności oraz pęcherz pławny.
      UWAGA: Wnętrzności danio pręgowanego są połączone. Dlatego uszczypnij tylne jelito w pobliżu okolicy odbytu i podnieś je, aby łatwo usunąć całą masę trzewną.
    3. Odłącz obustronne jajniki od brzucha za pomocą pęsety. Usuń tkankę tłuszczową, łuski i inne tkanki ciała przyczepione do jajnika.
      UWAGA: Jajniki pokryte są tkanką tłuszczową. Dlatego najlepiej jest usunąć je razem, aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia oocytów.
      UWAGA: Z pęsetą należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć obrażeń.

2. Trawienie

  1. Przenieść jajniki na 6-dołkową płytkę zawierającą 2 ml roztworu do dysocjacji komórek Kingera i inkubować przez 2-3 godziny w temperaturze 28,5 °C. Wstrząsać płytką 6-dołkową co 30 minut, aby przyspieszyć dyspersję.
    UWAGA: Użyj pęsety, aby rozdzielić jajniki na małe bloki tkankowe, aby zwiększyć skuteczność trawienia. Czas trawienia jest zmienny; regularnie monitoruj i zakończ proces, gdy znaczna liczba oocytów stadium I zostanie rozproszona pod mikroskopem stereoskopowym. Rozwiązanie dysocjacji komórek Kingera jest roztworem roboczym i może być stosowane bezpośrednio. Po zapakowaniu można go przechowywać stabilnie w temperaturze -20 °C, a przed użyciem rozmrozić w niskiej temperaturze (4 °C).
  2. Dodać pożywkę L-15 podgrzaną w temperaturze 28,5 °C do buforu wytrawiającego w celu zatrzymania trawienia.

3. Filtracja

  1. Umieść sitko o wielkości 100 μm w innym dołku płytki 6-dołkowej, dodaj pożywkę L-15 i upewnij się, że poziom pożywki jest wyższy niż filtr.
    UWAGA: Teoretyczna średnica oocytów w stadium I jest mniejsza niż 140 μm. Jednak oocyty o większych średnicach mogą nadal przechodzić przez sitko komórkowe. Dlatego na tym etapie wybrano sitko do komórek o mniejszej średnicy niż cel. Rozmiary oczek można dostosować w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.
  2. Przeciągnąć pożywkę trawienną przez sitko do komórek za pomocą pipety. Odczekaj 1-2 minuty, aż wszystkie oocyty etapu I przejdą przez sitko, a następnie wyjmij je. Upewnij się, że oocyty pozostają w płynie przez cały proces przenoszenia.
    UWAGA: Utrzymywanie oocytów w pożywce pomaga utrzymać ich integralność i optymalną kondycję. Jeśli oocyty są wystawione na działanie powietrza przez dłuższy czas, mogą wyschnąć i ulec uszkodzeniu, co wpłynie na ostateczną skuteczność separacji. Podczas przenoszenia oocytów przez sitko komórkowe należy trzymać pipetę poniżej powierzchni cieczy, zamiast dodawać je w zawiesinie.

4. Mycie

  1. Usunąć nadmiar podłoża za pomocą pipety. Dodać 4 ml świeżej pożywki L-15 i delikatnie zawiesić oocyty. Odczekaj 1-2 minuty, a następnie usuń supernatant.
    UWAGA: Używaj narzędzi o niskich właściwościach adhezyjnych, aby zapobiec uszkodzeniu oocytów.
  2. Powtórz krok 4.1 5-6 razy, aż nie będzie żadnych innych zanieczyszczeń.
    UWAGA: Delikatne obchodzenie się z jajami podczas procesu prania ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia uszkodzenia oocytów. Pomimo uzyskania dużej ilości oocytów w stadium I (około 200-400 oocytów w stadium I od jednego danio pręgowanego) po poprzednich etapach mycia, oocyty mogą być nadal mieszane z fragmentami komórek, oocytami z innych stadiów lub małymi granulkami utworzonymi przez uszkodzone oocyty w późnym stadium. Ponadto niektóre komórki ziarniste mogą nadal przylegać do powierzchni kilku oocytów z powodu niepełnego trawienia enzymatycznego. Dlatego w przypadku zastosowań wymagających wyższego poziomu czystości, takich jak sekwencjonowanie genomu, konieczne są dodatkowe kroki, aby wybrać całkowicie czyste oocyty. Aby rozwiązać ten problem, przejdź do kroków 5 i 6.

5. Wybór do kontroli jakości

  1. Przenieś umyte oocyty etapu I do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego świeżą pożywkę L-15.
  2. Pod mikroskopem o powiększeniu równym lub przekraczającym 10x usuń fragmenty komórek, oocyty innego stadium i oocyty w stadium I przylegające do komórek ziarnistych za pomocą narzędzia, którym można manipulować z precyzją, takiego jak igła do wstrzykiwań.
    UWAGA: Ten krok wymaga cierpliwości od eksperymentatora, ale zapewnia izolację czystych i nienaruszonych oocytów.
    UWAGA: Z igłami do wstrzykiwań należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć obrażeń.

6. Potwierdzenie przez barwienie jądrowe

UWAGA: Dla dalszego udoskonalenia wyizolowanych oocytów, zastosowano barwienie za pomocą Hoechst 33342 w celu identyfikacji i usunięcia pojedynczych oocytów z komórkami ziarnistymi, które mogły zostać pominięte w poprzednim kroku.

  1. Dodać końcowe stężenie 5 μg/ml Hoechst 33342 do pożywki L-15 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  2. Obserwuj fluorescencję Hoechsta przez mikroskop fluorescencyjny pod wzbudzeniem laserem UV.
    UWAGA: Hoechst jest zwykle wzbudzany w zakresie ultrafioletu, zwykle na długościach fal od 310 do 360 nm. Podczas tego procesu zaleca się stosowanie powiększenia od 80x do 100x. Zastosuj automatyczny tryb ekspozycji. Długość fali wzbudzenia i czas ekspozycji można dostosować w zależności od konkretnego modelu mikroskopu i indywidualnych wymagań.
  3. Za pomocą igły ostrożnie wybierz oocyty, które nie spełniają pożądanych kryteriów.
    UWAGA: Podczas wizualizacji komórek w środku oocytu znajduje się duża chromatyna jądrowa. Gdyby komórki ziarniste przylegały do oocytu, widoczne byłyby małe i jasne jądra, przylegające do krawędzi oocytu (Ryc. 3). Wybierz je pod mikroskopem.
  4. Dokładnie i wielokrotnie umyj oocyty L-15 w celu usunięcia nadmiaru Hoechst.
  5. Zidentyfikowane oocyty w stadium I należy wykorzystać bezpośrednio do późniejszej ekstrakcji lub przechowywać je w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym azocie.
    UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem i zamrażarkami o bardzo niskiej temperaturze należy nosić maskę ochronną i rękawice kriogeniczne.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje morfologię jajników obserwowaną zarówno u dorosłych, jak i młodych danio pręgowanych, prezentując oocyty w różnych stadiach rozwoju, aby służyć jako punkt odniesienia. Rysunek 1A przedstawia graficzne przedstawienie morfologii i wielkości oocytów na każdym etapie rozwoju, zaczynając od pierwotnego etapu wzrostu (etap I), a kończąc na owulacji komórki jajowej (etap V). Ryciny 1Ai-v ilustrują średnice odpowiadające etapom od I do V oocytów. Rysunek 1B (lewy panel) wyświetla obrazy jajników u młodych ryb (6 wpf z SL = 1,5 cm). Warto zauważyć, że młodzieńczy jajnik wykazuje wyraźny wygląd zrazikowy, charakteryzujący się przede wszystkim dużą ilością przezroczystych oocytów w stadium I, którym towarzyszy mniejsza populacja oocytów w stadium II. To rozpowszechnienie oocytów w stadium I znacznie ułatwia ich obserwację i pobieranie. Prawy panel przedstawia morfologię jajnika dorosłej ryby (6 miesięcy), w którym można zaobserwować oocyty w różnych stadiach rozwoju. Jednak w jajniku dominują nieprzezroczyste oocyty w późnym stadium (stadium II-III).

Rysunek 2 ilustruje reprezentatywne procesy od rozbioru do uzyskania czystych komórek jajowych I stopnia. Rysunek 3 przedstawia oocyty I stopnia uzyskane zarówno metodą referencyjną, jak i metodą zmodyfikowaną. Po barwieniu metodą Hoechst jądra komórek oocytu i ziarnistości wykazywały niebieską fluorescencję w świetle UV. Na obrazach uzyskanych metodą referencyjną (Ryc. 3A) powierzchnia oocytów była gęsto otoczona licznymi barwionymi jądrami komórek ziarnistych. W przeciwieństwie do tego, oocyty w stadium I oddzielone zmodyfikowaną metodą (Ryc. 3B) wykazują pełną ekspozycję i czystość, bez obecności zabarwienia jąder komórek ziarnistych.

Nasze odkrycia wykazały skuteczność proponowanej metody izolowania oocytów pierwszego stopnia. Proces rozwoju oocytów u ryb teleost wykazuje kilka wspólnych cech7. Aby ocenić możliwość zastosowania tego zjawiska między gatunkami, przeprowadzono dalsze analizy na innych gatunkach ryb. Samice bocji stawowych pozyskano z lokalnego targu, a oocyty we wczesnym stadium (średnica <100 μm) wyizolowano zgodnie z tą samą procedurą. Skład jajnikowy bocji stawowej wykazywał również mieszaninę oocytów w wielu stadiach rozwojowych, charakteryzujących się uderzającym podobieństwem pod względem morfologii i wielkości oocytów do jaj danio pręgowanego w tym samym stadium. Jak pokazano w Rysunek 4A, jajniki dorosłej samicy bocji stawowej były zdominowane przez nieprzezroczyste późne oocyty przeplatane przezroczystymi wczesnymi oocytami. Na powierzchni oocytów zaobserwowano przezroczystą monowarstwę komórek ziarnistych. Zgodnie z naszymi obserwacjami u danio pręgowanego, oocyty bocji o średnicy mniejszej niż 100 μm odpowiadały etapowi poprzedzającemu stadium diplotenu. Rysunek 4B przedstawia oocyty czystej loachy (Misgurnus anguillicaudatus) uzyskane zmodyfikowaną metodą. W porównaniu z jajnikami danio pręgowanego, jajniki bocji stawowej są trudniejsze do dysocjacji. Po 6-7 godzinach trawienia dochodzi do dysocjacji komórek jajowych we wczesnym stadium. Niemniej jednak, to zmodyfikowane podejście dało pożądane czyste i nagie oocyty. Danio pręgowany należy do rodziny karpiowatych, podczas gdy bocje stawowe zaliczane są do rodziny zespolonych (Cobitidae). Te dwie rodziny wykazują odległe pokrewieństwo taksonomiczne, ale ich etap rozwoju jajników i morfologia są niezwykle podobne, co wskazuje, że metoda ta może być ogólnie wykorzystywana do analizy oocytów różnych gatunków ryb.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy jajników i oocytów danio pręgowanego na różnych etapach. (A) Morfologia i wielkość oocytów na każdym etapie rozwoju (St). i-v reprezentuje obrazy i średnicę oocytów od stadium I do V. Podziałka = 200 μm. (B) Morfologia jajników dorosłego i młodocianego danio pręgowanego. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy procedury izolacji, od sekcji do pobrania czystych oocytów etapu I. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Oocyty I stopnia uzyskane dwiema metodami. (A) Oocyty etapu (St) I wyizolowane za pomocą wspomnianej metody. (B) Oocyty stadium I wyizolowane metodą zmodyfikowaną. Jądra komórek oocytu i ziarnistości wybarwiono preparatem Hoechst i wzbudzono światłem UV. Podziałka = 100 μm. BF = jasne pole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Oocyty we wczesnym stadium z bocji stawowej uzyskane zmodyfikowaną metodą. (A) Reprezentatywne obrazy jajnika i oocytów bocjusza stawowego. I, II reprezentują jajniki bocji stawowych pod różnymi powiększeniami, a III-IV reprezentują oocyty bocji stawowych we wczesnym stadium. Podziałka liniowa: i (500 μm); ii (200 μm); III, IV (100 μm). (B) Oocyty we wczesnym stadium wyizolowane z bocji stawowej. Oocyty i jądra komórek ziarnistych barwiono preparatem Hoechst i wzbudzano światłem UV. Podziałka = 100 μm. BF = jasne pole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opracowaliśmy metodę izolowania czystych i czystych oocytów I stopnia, z wyłączeniem komórek ziarnistych, do dalszej analizy (w szczególności analiz genomowych). Porównując tę zmodyfikowaną metodę z przywołaną metodą13, oocyty I stopnia uzyskane tą metodą są morfologicznie nienaruszone, w wystarczającej liczbie i wolne od zanieczyszczenia innymi komórkami somatycznymi, co czyni je odpowiednimi do różnych późniejszych badań i analiz. Ponadto, w porównaniu z innymi metodami separacji mechanicznej14,15, ulepszona metoda jest prostsza w obsłudze, ułatwia pozyskanie większej liczby oocytów i zapobiega uszkodzeniom oocytów.

Co więcej, oprócz skutecznego izolowania oocytów danio pręgowanego w stadium I, metoda ta może być również stosowana do bocji stawowych, co wskazuje na jej szerokie zastosowanie wśród różnych gatunków ryb. W celu zbadania wpływu zanieczyszczenia komórek ziarnistych na ekspresję genów i analizę epigenetyczną przeprowadziliśmy sekwencjonowanie RNA (RNA-seq) oraz analizę CUT&Tag na oocytach uzyskanych metodą referencyjną i zmodyfikowaną. Chociaż kilka genów o zróżnicowanej ekspresji zostało zidentyfikowanych za pomocą sekwencji RNA, niektóre geny, które były specyficznie wyrażane w komórkach ziarnistych, zostały nadal zidentyfikowane (dane nie pokazane). Analiza wykazała również istotne różnice w modyfikacjach histonów między oocytami izolowanymi różnymi metodami (dane nie pokazane). Wyniki te podkreślają znaczenie tej metody w całkowitym oddzieleniu oocytów i komórek ziarnistych w celu dokładnej ekspresji genów i analizy epigenetycznej.

Podczas wdrażania proponowanej metody należy zwrócić uwagę na kilka aspektów: (1) Wybór odpowiedniej wielkości danio pręgowanego ma kluczowe znaczenie. Zapewnia to uzyskanie wystarczającej ilości oocytów i ogranicza kolejne etapy mycia. Jajniki danio pręgowanego o średnicy SL <10 mm nie zapewniają wystarczającej liczby oocytów, co wymaga większej liczby ryb, aby spełnić wymagania dotyczące pobierania próbek i zwiększa presję hodowlaną. I odwrotnie, danio pręgowany z SL większym niż 15 mm wykazuje stopniowe tworzenie oocytów w stadium II-III, których błony łatwo pękają podczas reakcji trawienia. (2) W przypadku wykorzystywania większych ryb wyciek zawartości komórek wynikający z uszkodzonych oocytów może prowadzić do zanieczyszczenia, a tym samym do pewnego stopnia zahamować reakcję trawienia. W takich przypadkach zaleca się usunięcie starego buforu trawiennego, przemycie go L-15, a następnie dodanie nowego roztworu dysocjacji komórek Kingera w celu dalszego trawienia. (3) Jeśli dostępny jest odpowiedni sprzęt, potrząsanie podczas trawienia może zwiększyć separację.

W kroku 3.1 mniejsze komórki ziarniste mogą towarzyszyć oocytom przez sitko komórkowe. Obserwacje praktyczne wskazują jednak, że końcowa próbka pobranej oocytów nie zawiera komórek ziarnistych. Z wyjątkiem przypadków, w których niepełne trawienie skutkowało obecnością resztkowych komórek ziarnistych w niektórych oocytach, w systemie nie wykryto żadnych innych komórek ziarnistych znakowanych Hoechstem. W tym przypadku postawiliśmy hipotezę, że komórki ziarniste, będąc mniejsze i lżejsze, mogą pozostać zawieszone w pożywce hodowlanej, a następnie zostały usunięte podczas wielu etapów mycia. Skuteczność izolacji określono również ilościowo, obliczając proporcję oocytów z przyłączonymi komórkami ziarnistymi i czystych oocytów po barwieniu metodą Hoechst. Odsetek czystych oocytów do 98% zaobserwowano w próbkach zawierających 1000 oocytów.

Pomimo wielu zalet, proponowane podejście miało również pewne godne uwagi ograniczenia. Po pierwsze, metoda ta została zwalidowana pod kątem ekstrakcji DNA lub RNA, sekwencjonowania i natychmiastowego wykrywania nienaruszonych żywych komórek, ale wykonalność i niezawodność rozszerzenia na inne obszary testowe nie zostały jeszcze potwierdzone. Kolejnym ograniczeniem jest to, że proponowana metoda może być stosowana tylko do izolacji oocytów pierwszego stopnia, ponieważ skuteczność izolacji dla innych etapów jest niezadowalająca. W związku z tym konieczne są dodatkowe wysiłki w celu poprawy skuteczności i możliwości zastosowania proponowanej metody. Ponadto przyszłe badania powinny koncentrować się na ustaleniu, czy proponowaną metodę można zastosować do skutecznego izolowania oocytów od innych etapów, rozszerzając tym samym jej zastosowanie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32170813 i 31871449) oraz Departament Nauki i Technologii Sychuanu (2024NSFSC0651), a także projekt 1·3·5 dla dyscyplin doskonałości - Fundusz Badań Klinicznych, Szpital Zachodniochiński, Uniwersytet Sichuan (2024HXFH035). Autorzy pragną podziękować Zhao Wangowi i Yanqiu Gao z Laboratorium Chirurgii Dziecięcej za hodowlę danio pręgowanego związaną z tą pracą. Autorzy pragną również podziękować wszystkim recenzentom, którzy wzięli udział w recenzji, a także firmie MJEditor (www.mjeditor.com) za zapewnienie usług redakcji w języku angielskim podczas przygotowywania tego manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór do dysocjacji komórek KingeraPlantChemMedPC-33689Roztwór dysocjacji komórek Kingera może być stabilnie przechowywany w temperaturze -20 & stopni; C po zapakowaniu i może być stosowany po rozmrożeniu w niskiej temperaturze (4 ° C). Może być stosowany bezpośrednio do dysocjacji jajników danio pręgowanego. Optymalna temperatura to 28,5 ° C, przez około 2-3 godziny. Czas trwania można dostosować do konkretnych warunków dysocjacji, skrócony lub wydłużony (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Sitka do komórek (100 μ m )Mikroskop352360
ZeissAxio Zoom.V16
KleszczeDumont#5
Szklana igła kapilarna//Stępiona przez spalenie zapalniczką
HoechstYesen40732ES03
Końcówki do pipet o niskiej adsorpcji (10 μ l )LabsellectT-0010-LR-R-S
Leibovitz' s L-15 medium medium (z L-glutaminą)HyclonSH30525.01
Wiadro na lód//Lodowata woda służy do eutanazji danio pręgowanego
InkubatorWIGGENSWH-01
Młodociane ryby//5– 6 tygodni po zapłodnieniu, standardowa długość [SL] 10–
Naczynie plastikowe 15 mm (35 mm) MikroskopSORFA
MoticSMZ-161
Płytka do hodowli tkankowych (6-dołkowa)Nożyczki sprężynowe SORFA0110006
VannasFine Science Toosl#15000-00
fluorescencyjny Falcon stereoskopowy 230101

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304(2021).">Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304(2021).
  2. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385(2020).">Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385(2020).
  3. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).">Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).
  4. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014(2022).">Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014(2022).
  5. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).">Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
  6. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).">Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
  7. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).">Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
  8. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).">Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).
  9. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).">Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
  10. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).">Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
  11. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).">Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
  12. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).">Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
  13. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).">Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
  14. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).">Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
  15. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).">Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
  16. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).">Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  17. https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015).">Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015).
  18. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).">Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja oocyt w rybki zebrausuwanie kom rek granulacyjnychoczyszczanie oocyt wdysocjacja kom rekmedium L 15mikroskopia fluorescencyjnaanaliza genomubadania epigenetycznerozw j oocyt w

Powiązane artykuły