Ten protokół opisuje zmodyfikowaną procedurę szybkiego izolowania czystych oocytów etapu I u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych, zapewniając tym samym wygodną metodę do badań specyficznych dla oocytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka izolacja oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania nad rozwojem oocytów mają znaczące implikacje w biologii rozwoju. Danio pręgowany (Danio rerio) był szeroko wykorzystywany jako organizm modelowy do badania wczesnych procesów rozwojowych od oocytu do zarodka. U danio pręgowanego oocyty są otoczone pojedynczą warstwą somatycznych komórek ziarnistych. Jednak oddzielenie komórek ziarnistych od oocytów stanowi wyzwanie, ponieważ uzyskanie czystych oocytów ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnej analizy. Chociaż zaproponowano różne metody izolowania oocytów danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju, obecne techniki nie są w stanie całkowicie usunąć komórek ziarnistych, co ogranicza dokładność analizy genomu skoncentrowanej wyłącznie na oocytach. W tym badaniu udało nam się opracować szybki i skuteczny proces izolowania czystych oocytów etapu I u danio pręgowanego przy jednoczesnym wyeliminowaniu zanieczyszczenia komórkami ziarnistymi. Technika ta ułatwia analizę biochemiczną i molekularną, szczególnie w badaniu aspektów epigenetycznych i struktury genomu specyficznych dla oocytów. Warto zauważyć, że metoda jest przyjazna dla użytkownika, minimalizuje uszkodzenia oocytów i zapewnia praktyczne rozwiązanie do późniejszych badań i analiz.
Wprowadzenie
Danio pręgowany jest jednym z najważniejszych systemów modelowych w biologii rozwojowej. W ostatnich latach w licznych badaniach wykorzystano danio pręgowanego jako model do badania ważnych zdarzeń biologicznych i procesów regulacyjnych od oocytu do zarodka. Obejmują one skomplikowane procesy rozwoju i dojrzewania oocytów1, funkcjonalność genów matczynych2, regulację przejść matczyno-jarzygotycznych3, oraz obszerne analizy omiczne4.
Komórki ziarniste, komórki somatyczne otaczające i pielęgnujące rozwijającą się komórkę jajową w pęcherzyku jajnikowym5,6, odgrywają kluczową rolę w tym procesie rozwoju. Gdy pierwotne komórki rozrodcze (PGC) ewoluują w oogonię, są otoczone przez monowarstwę komórek ziarnistych7. Wraz z zewnętrznymi komórkami osłonowymi, oocyt i otaczające go komórki ziarniste tworzą dojrzały pęcherzyk8. Biorąc pod uwagę podstawowe rozróżnienie między komórkami rozrodczymi a komórkami somatycznymi, uzyskanie czystej próbki oocytów jest konieczne, zwłaszcza w przypadku analiz związanych z genomem.
W strukturze pęcherzykowej danio pręgowanego, komórki ziarniste zazwyczaj wykazują średnicę zaledwie kilku mikronów8, podkreślając ścisłe powiązania między komórkami ziarnistymi a oocytami9. To ścisłe powiązanie stanowi wyzwanie w osiągnięciu całkowitej separacji ze względu na znaczną różnicę zarówno w liczbie, jak i objętości komórek ziarnistych w porównaniu z oocytami (setki komórek ziarnistych w porównaniu z pojedynczym oocytem)10,11. Nawet minimalne zanieczyszczenie pojedynczą komórką ziarnistą może utrudnić dalsze analizy ukierunkowane na oocyty. Dlatego w przypadku badań koncentrujących się na cechach genomowych i epigenetycznych niezbędna jest eliminacja komórek ziarnistych.
Korzystając z dobrze scharakteryzowanych kryteriów morfologicznych, oocyty na każdym etapie mogą być rozróżniane na podstawie średnicy11. Proces oogenezy u danio pręgowanego jest podzielony na pięć etapów w zależności od morfologii i kariotypu11. Oocyty stadium I (średnica 7-140 μm) obejmują oocyty od początku mejozy do wczesnego etapu mejozy I. Co najważniejsze, oocyty te są przezroczyste, co pozwala na obserwację jądra centralnego w świetle przechodzącym (Figura 1Ai). Oocyty w stadium II (średnica 140-340 μm) stopniowo stają się pieniste i półprzezroczyste. Wraz z powiększeniem pęcherzyków włosowych i proliferacją pęcherzyków korowych, pęcherzyki rozrodcze w środku stają się trudne do odróżnienia12 (Rysunek 1Aii). Oocyty III stopnia (średnica 340-690 μm) stopniowo gromadzą witellogeninę, a świeże pęcherzyki stają się coraz bardziej nieprzezroczyste (Rysunek 1Aiii). Mejoza trwa w oocytach etapu IV (średnica 690-730 μm), gdy chromosomy wchodzą w środek mejozy II, gdzie ulegają stagnacji (Figura 1Aiv). Oocyty w stadium V (średnica 730-750 μm) dojrzały i są gotowe do owulacji7,11(Rysunek 1Av).
Na podstawie unikalnych cech każdego z wyżej wymienionych etapów, zaproponowano metodę izolowania oocytów od etapów I do III poprzez trawienie jajników danio pręgowanego za pomocą roztworu trawiennego zawierającego kolagenazę I, kolagenazę II i hialuronidazę, a następnie filtrację przez sitko komórkowe o określonej wielkości13. Jednak, chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie oocytów na różnych etapach rozwoju, nie jest w stanie całkowicie oddzielić oocytów i komórek ziarnistych. Inni badacze zasugerowali również metody oddzielania komórek ziarnistych od oocytów. Jednak metody te opierają się przede wszystkim na metodach mechanicznych, które mogą powodować uszkodzenie oocytów, są czasochłonne i niewystarczające do uzyskania znacznej liczby oocytów do analizy14,15.
Biorąc pod uwagę ograniczenia istniejących metod i specyficzne wymagania badawcze, to badanie ma na celu ustalenie procedury dokładnego oddzielania oocytów i komórek ziarnistych oraz uzyskania wystarczającej liczby czystych oocytów I stopnia do analizy. Rozwijając przywołaną metodę13, stosujemy ulepszony bufor trawienny (patrz Tabela materiałów), który jest łagodniejszy i ułatwia dyspersję oocytów i dysocjację komórek ziarnistych. Następnie oocyty są przepuszczane przez sitko komórkowe, po którym następuje mycie i dalsza selekcja mikroskopowa, umożliwiająca pozyskanie dużej liczby czystych oocytów w stadium I.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie danio pręgowane były traktowane zgodnie z rygorystycznymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami, określonymi przez odpowiednie krajowe i/lub lokalne organy ds. dobrostanu zwierząt. Utrzymanie i obchodzenie się z rybami uzyskało zgodę zarówno władz lokalnych, jak i komisji etycznej ds. zwierząt Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Syczuańskiego (zatwierdzenie nr 20220422003). Jajniki danio pręgowanego zawierają mieszaninę wieloetapowych oocytów, z których każdy etap rozwojowy jest obecny w jajnikach dorosłego danio pręgowanego. Jednak młode danio pręgowane zostały wybrane do tego badania ze względu na dominację oocytów w późnym stadium (stadium II-III) w jajnikach dorosłych ryb, które są duże i nieprzezroczyste. Natomiast młode osobniki mają płaskie i wydłużone jajniki składające się głównie z oocytów w stadium I (Ryc. 1B) (Ryc. 1B). Wcześniejsze badania wykazały, że cechy morfologiczne wczesnej oogenezy u dorosłych i młodocianych ryb danio pręgowanego są bardzo spójne, co potwierdza możliwość wykorzystania młodocianych danio pręgowanych13. Procedury opisane poniżej, opisane w Rysunek 2, zawierają szczegółowy opis procesu izolacji, od sekcji do uzyskania czystych oocytów w stadium I. Dla dalszych informacji odczynniki, i sprzęt wykorzystany w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Rozwarstwienie jajników
- Wybierz kilka samic danio pręgowanego o standardowej długości (SL) od 10 mm do 15 mm.
UWAGA: SL, mierzony w milimetrach od pyska do podstawy ogona, służy jako wiarygodne kryterium wyboru odpowiednich ryb. Do tej procedury zaleca się stosowanie młodych ryb między 5 a 7 tygodniem po zapłodnieniu (wpf) z SL w zakresie od 10 mm do 15 mm. Jajniki młodych danio pręgowanego są głównie zajęte przez wczesne oocyty, zapewniając optymalne warunki do łatwego uzyskania oocytów w stadium I (Ryc. 1B). - Poddaj eutanazji młode samice, umieszczając je w lodowatej wodzie (0-4 °C).
UWAGA: Aby zapewnić eutanazję i zminimalizować ból odczuwany przez danio pręgowanego podczas eutanazji, należy przeprowadzić następujące procedury: potwierdzić, że temperatura lodowatej wody mieści się w zakresie 0-4 °C za pomocą termometru, szybko przenieść danio pręgowanego do lodowatej wody i utrzymywać go w lodowatej wodzie przez co najmniej 10 minut po ustaniu ruchu operkularnego16, 17,18. - Osusz nadmiar wody na powierzchni ryby za pomocą chłonnego papieru.
- Przeanalizuj danio pręgowanego pod mikroskopem stereoskopowym, wykonując następujące czynności:
- Odetnij głowę za pomocą mikronożyczek wzdłuż tylnego brzegu pokrywy skrzelowej; odetnij ogon wzdłuż kloaki. Przenieś środkowy pień do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego 2 ml pożywki L-15 (z L-glutaminą).
- Rozetnij środkowy pień w podłożu L-15. Przeciąć wzdłuż środkowej osi brzucha i usunąć wnętrzności oraz pęcherz pławny.
UWAGA: Wnętrzności danio pręgowanego są połączone. Dlatego uszczypnij tylne jelito w pobliżu okolicy odbytu i podnieś je, aby łatwo usunąć całą masę trzewną. - Odłącz obustronne jajniki od brzucha za pomocą pęsety. Usuń tkankę tłuszczową, łuski i inne tkanki ciała przyczepione do jajnika.
UWAGA: Jajniki pokryte są tkanką tłuszczową. Dlatego najlepiej jest usunąć je razem, aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia oocytów.
UWAGA: Z pęsetą należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć obrażeń.
2. Trawienie
- Przenieść jajniki na 6-dołkową płytkę zawierającą 2 ml roztworu do dysocjacji komórek Kingera i inkubować przez 2-3 godziny w temperaturze 28,5 °C. Wstrząsać płytką 6-dołkową co 30 minut, aby przyspieszyć dyspersję.
UWAGA: Użyj pęsety, aby rozdzielić jajniki na małe bloki tkankowe, aby zwiększyć skuteczność trawienia. Czas trawienia jest zmienny; regularnie monitoruj i zakończ proces, gdy znaczna liczba oocytów stadium I zostanie rozproszona pod mikroskopem stereoskopowym. Rozwiązanie dysocjacji komórek Kingera jest roztworem roboczym i może być stosowane bezpośrednio. Po zapakowaniu można go przechowywać stabilnie w temperaturze -20 °C, a przed użyciem rozmrozić w niskiej temperaturze (4 °C). - Dodać pożywkę L-15 podgrzaną w temperaturze 28,5 °C do buforu wytrawiającego w celu zatrzymania trawienia.
3. Filtracja
- Umieść sitko o wielkości 100 μm w innym dołku płytki 6-dołkowej, dodaj pożywkę L-15 i upewnij się, że poziom pożywki jest wyższy niż filtr.
UWAGA: Teoretyczna średnica oocytów w stadium I jest mniejsza niż 140 μm. Jednak oocyty o większych średnicach mogą nadal przechodzić przez sitko komórkowe. Dlatego na tym etapie wybrano sitko do komórek o mniejszej średnicy niż cel. Rozmiary oczek można dostosować w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych. - Przeciągnąć pożywkę trawienną przez sitko do komórek za pomocą pipety. Odczekaj 1-2 minuty, aż wszystkie oocyty etapu I przejdą przez sitko, a następnie wyjmij je. Upewnij się, że oocyty pozostają w płynie przez cały proces przenoszenia.
UWAGA: Utrzymywanie oocytów w pożywce pomaga utrzymać ich integralność i optymalną kondycję. Jeśli oocyty są wystawione na działanie powietrza przez dłuższy czas, mogą wyschnąć i ulec uszkodzeniu, co wpłynie na ostateczną skuteczność separacji. Podczas przenoszenia oocytów przez sitko komórkowe należy trzymać pipetę poniżej powierzchni cieczy, zamiast dodawać je w zawiesinie.
4. Mycie
- Usunąć nadmiar podłoża za pomocą pipety. Dodać 4 ml świeżej pożywki L-15 i delikatnie zawiesić oocyty. Odczekaj 1-2 minuty, a następnie usuń supernatant.
UWAGA: Używaj narzędzi o niskich właściwościach adhezyjnych, aby zapobiec uszkodzeniu oocytów. - Powtórz krok 4.1 5-6 razy, aż nie będzie żadnych innych zanieczyszczeń.
UWAGA: Delikatne obchodzenie się z jajami podczas procesu prania ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia uszkodzenia oocytów. Pomimo uzyskania dużej ilości oocytów w stadium I (około 200-400 oocytów w stadium I od jednego danio pręgowanego) po poprzednich etapach mycia, oocyty mogą być nadal mieszane z fragmentami komórek, oocytami z innych stadiów lub małymi granulkami utworzonymi przez uszkodzone oocyty w późnym stadium. Ponadto niektóre komórki ziarniste mogą nadal przylegać do powierzchni kilku oocytów z powodu niepełnego trawienia enzymatycznego. Dlatego w przypadku zastosowań wymagających wyższego poziomu czystości, takich jak sekwencjonowanie genomu, konieczne są dodatkowe kroki, aby wybrać całkowicie czyste oocyty. Aby rozwiązać ten problem, przejdź do kroków 5 i 6.
5. Wybór do kontroli jakości
- Przenieś umyte oocyty etapu I do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego świeżą pożywkę L-15.
- Pod mikroskopem o powiększeniu równym lub przekraczającym 10x usuń fragmenty komórek, oocyty innego stadium i oocyty w stadium I przylegające do komórek ziarnistych za pomocą narzędzia, którym można manipulować z precyzją, takiego jak igła do wstrzykiwań.
UWAGA: Ten krok wymaga cierpliwości od eksperymentatora, ale zapewnia izolację czystych i nienaruszonych oocytów.
UWAGA: Z igłami do wstrzykiwań należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć obrażeń.
6. Potwierdzenie przez barwienie jądrowe
UWAGA: Dla dalszego udoskonalenia wyizolowanych oocytów, zastosowano barwienie za pomocą Hoechst 33342 w celu identyfikacji i usunięcia pojedynczych oocytów z komórkami ziarnistymi, które mogły zostać pominięte w poprzednim kroku.
- Dodać końcowe stężenie 5 μg/ml Hoechst 33342 do pożywki L-15 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
- Obserwuj fluorescencję Hoechsta przez mikroskop fluorescencyjny pod wzbudzeniem laserem UV.
UWAGA: Hoechst jest zwykle wzbudzany w zakresie ultrafioletu, zwykle na długościach fal od 310 do 360 nm. Podczas tego procesu zaleca się stosowanie powiększenia od 80x do 100x. Zastosuj automatyczny tryb ekspozycji. Długość fali wzbudzenia i czas ekspozycji można dostosować w zależności od konkretnego modelu mikroskopu i indywidualnych wymagań. - Za pomocą igły ostrożnie wybierz oocyty, które nie spełniają pożądanych kryteriów.
UWAGA: Podczas wizualizacji komórek w środku oocytu znajduje się duża chromatyna jądrowa. Gdyby komórki ziarniste przylegały do oocytu, widoczne byłyby małe i jasne jądra, przylegające do krawędzi oocytu (Ryc. 3). Wybierz je pod mikroskopem. - Dokładnie i wielokrotnie umyj oocyty L-15 w celu usunięcia nadmiaru Hoechst.
- Zidentyfikowane oocyty w stadium I należy wykorzystać bezpośrednio do późniejszej ekstrakcji lub przechowywać je w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym azocie.
UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem i zamrażarkami o bardzo niskiej temperaturze należy nosić maskę ochronną i rękawice kriogeniczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1 ilustruje morfologię jajników obserwowaną u dorosłych i młodocianych danio pręgowanych, przedstawiając oocyty na różnych etapach rozwoju w celu służyć jako materiał referencyjny. Rycina 1A przedstawia graficzną reprezentację morfologii i wielkości oocytu na każdym etapie rozwoju, począwszy od etapu pierwotnego wzrostu (stadium I), a kończąc na owulowanej komórce jajowej (stadium V). Ryciny 1Ai-v przedstaw średnice odpowiadające stadium ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu opracowaliśmy metodę izolowania czystych i czystych oocytów I stopnia, z wyłączeniem komórek ziarnistych, do dalszej analizy (w szczególności analiz genomowych). Porównując tę zmodyfikowaną metodę z przywołaną metodą13, oocyty I stopnia uzyskane tą metodą są morfologicznie nienaruszone, w wystarczającej liczbie i wolne od zanieczyszczenia innymi komórkami somatycznymi, co czyni je odpowiednimi do różnych późniejszych badań i analiz. Ponadto, w porównaniu z innymi metodami separacji m...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32170813 i 31871449) oraz Departament Nauki i Technologii Sychuanu (2024NSFSC0651), a także projekt 1·3·5 dla dyscyplin doskonałości - Fundusz Badań Klinicznych, Szpital Zachodniochiński, Uniwersytet Sichuan (2024HXFH035). Autorzy pragną podziękować Zhao Wangowi i Yanqiu Gao z Laboratorium Chirurgii Dziecięcej za hodowlę danio pręgowanego związaną z tą pracą. Autorzy pragną również podziękować wszystkim recenzentom, którzy wzięli udział w recenzji, a także firmie MJEditor (www.mjeditor.com) za zapewnienie usług redakcji w języku angielskim podczas przygotowywania tego manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Roztwór do dysocjacji komórek Kingera | PlantChemMed | PC-33689 | Roztwór dysocjacji komórek Kingera może być stabilnie przechowywany w temperaturze -20 & stopni; C po zapakowaniu i może być stosowany po rozmrożeniu w niskiej temperaturze (4 ° C). Może być stosowany bezpośrednio do dysocjacji jajników danio pręgowanego. Optymalna temperatura to 28,5 ° C, przez około 2-3 godziny. Czas trwania można dostosować do konkretnych warunków dysocjacji, skrócony lub wydłużony (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Sitka do komórek (100 μ m ) | Mikroskop | 352360 | |
| Zeiss | Axio Zoom.V16 | ||
| Kleszcze | Dumont | #5 | |
| Szklana igła kapilarna | / | / | Stępiona przez spalenie zapalniczką |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Końcówki do pipet o niskiej adsorpcji (10 μ l ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz' s L-15 medium medium (z L-glutaminą) | Hyclon | SH30525.01 | |
| Wiadro na lód | / | / | Lodowata woda służy do eutanazji danio pręgowanego |
| Inkubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Młodociane ryby | / | / | 5– 6 tygodni po zapłodnieniu, standardowa długość [SL] 10– |
| Naczynie plastikowe 15 mm (35 mm) Mikroskop | SORFA | ||
| Motic | SMZ-161 | ||
| Płytka do hodowli tkankowych (6-dołkowa) | Nożyczki sprężynowe SORFA | 0110006 | |
| Vannas | Fine Science Toosl | #15000-00 |
Bibliografia
- Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304(2021).
- Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385(2020).
- Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).
- Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014(2022).
- Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
- Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).
- Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
- Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
- Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
- Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
- Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
- Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
- Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
