Ten protokół opisuje, jak generować ludzkie wycinki trzustki od zmarłych dawców narządów w celu badania funkcji komórek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. To innowacyjne podejście umożliwia badanie normalnych i strukturalnie uszkodzonych wysp trzustkowych oraz skomplikowanych interakcji między przedziałami endokrynnymi i zewnątrzwydzielniczymi.
Artykuł metodologiczny
Generowanie wycinków ludzkiej tkanki trzustki w celu badania fizjologii endokrynnej i zewnątrzwydzielniczej trzustki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kluczowe jest badanie ludzkiej trzustki, aby zrozumieć patofizjologiczne mechanizmy związane z cukrzycą typu 1 (T1D) i 2 (T2D), a także hormonalną i zewnątrzwydzielniczą fizjologię trzustki oraz wzajemne jej wzajemne oddziaływanie. Wiele nauczyliśmy się z badań izolowanych wysp trzustkowych, ale uniemożliwia to zbadanie ich funkcji i interakcji w kontekście całej tkanki. Plastry trzustki dają wyjątkową okazję do zbadania fizjologii normalnych, zapalnych i strukturalnie uszkodzonych wysp trzustkowych w ich naturalnym środowisku, co z kolei umożliwia badanie interakcji między przedziałami endokrynnymi i zewnątrzwydzielniczymi w celu lepszego zbadania złożonej dynamiki tkanki trzustki. W związku z tym przyjęcie platformy do cięcia żywej trzustki stanowi znaczący postęp w tej dziedzinie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować żywe wycinki tkanek od zmarłych dawców narządów poprzez osadzanie tkanek w plastrowaniu agarozy i wibratomu, a także ich wykorzystanie do oceny odczytów funkcjonalnych, takich jak dynamiczne wydzielanie i obrazowanie żywych komórek.
Wprowadzenie
Badania nad fizjologią wysp trzustkowych są fundamentalne dla zrozumienia patogenezy cukrzycy i opracowania nowych podejść terapeutycznych. Do tej pory badania koncentrowały się na izolowanych wysepkach, które narażają je na naprężenia mechaniczne i enzymatyczne, prawdopodobnie powodujące zmiany w fizjologii komórki; Co więcej, nie jest możliwa ocena funkcji wysp trzustkowych w kontekście ich naturalnego środowiska tkankowego, na które prawdopodobnie wpływają m.in. komórki zewnątrzwydzielnicze i naczyniowe1. Podczas badania trzustki od dawców z cukrzycą typu 1 istnieje wyzwanie, że ich wyspy trzustkowe są trudne do wyizolowania i mogą ulec fragmentacji podczas izolacji, co może wywołać efekt selekcji na wyspach trzustkowych, które mogą nie reprezentować populacji in vivo2. Co więcej, wyspy trzustkowe zostaną oddzielone od ich złożonego środowiska i połączeń komórkowych, zwłaszcza od naciekających komórek odpornościowych, które znajdują się w wyspach objętych stanem zapalnym i są bardziej obfite na obrzeżach wysp. Tak więc, chociaż izolowane wyspy trzustkowe są podstawowym narzędziem w badaniach nad cukrzycą, istnieją ograniczenia. W odpowiedzi wprowadzamy przełomowy protokół generowania żywych plastrów trzustki, oferując rozwiązanie tych wyzwań.
Niedawny rozwój i przyjęcie technik cięcia tkanki trzustki jest uważane za przełom dla naszej zdolności do badania skomplikowanej biologii i funkcji trzustki. Ta innowacja otworzyła nowe możliwości w dynamicznych badaniach fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami endokrynnymi, zewnątrzwydzielniczymi, nerwowymi, naczyniowymi i odpornościowymi w ich naturalnym kontekście anatomicznym. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, to ustawienie in vitro zachowuje znaczną część cytoarchitektury narządu, co pozwala na bliższe zbliżenie do jego rodzimej biologii. Metoda ta, początkowo opracowana na myszach przez Speiera i Rupnika w 2003 roku3, metoda ta wykazała swoją przydatność do oceny obrazowania wapnia, elektrofizjologii i wydzielania hormonów zarówno dla sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, jak i międzykomórkowej4,5,6,7,8,9. Platforma plasterków trzustki została następnie zastosowana do badania ludzkiej tkanki trzustki uzyskanej za pomocą biopsji chirurgicznej4,10,11,12. Nasza grupa wykazała możliwość pozyskania i wykorzystania wycinków trzustki od zmarłych dawców narządów dzięki działalności Sieci Dawców Narządów Trzustki z Cukrzycą (nPOD)13. nPOD dostarcza tkanki trzustki zatwierdzonym badaczom prowadzącym badania nad cukrzycą typu 1 u ludzi, a od czasu przyjęcia platformy plastrów trzustki nPOD rutynowo generuje i dystrybuuje żywe plastry trzustki14,15,16,17. Od czasu wdrożenia platformy do wycinania trzustki w 2020 r. firma nPOD z powodzeniem rozprowadziła wycinki tkanek od 43 dawców (w tym 12 dawców z cukrzycą typu 1) wśród licznych badaczy. Korzystając z tych wycinków, naukowcy przeprowadzili przełomowe badania nad krytycznymi aspektami funkcji wysp trzustkowych i zbadali wzajemne zależności między wyspami trzustkowymi a układem naczyniowym, układem nerwowym i komórkami odpornościowymi w kontekście T1D13,18,19,20,21,22,23,24. Liczne badania uwypukliły ograniczenia tradycyjnych podejść i podkreśliły znaczenie technik, które mogą uchwycić dynamiczne interakcje w obrębie trzustki25,26,27. Zdolność adaptacyjna technik krojenia trzustki myszy do ludzkiej, w połączeniu z ich integracją z programami takimi jak Sieć Dawców Narządów Trzustkowych z Cukrzycą (nPOD), jest przykładem rosnącego uznania dla potencjału tej metody w zakresie odblokowania cennych informacji na temat chorób, takich jak cukrzyca typu 1.
Protokół
Ludzkie skrawki trzustki od dawców tkanek obu płci zostały uzyskane za pośrednictwem banku tkanek Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD), University of Florida. Tkanki narządów pochodzące od osób zmarłych bez identyfikatorów zostały uznane za badania niebędące udziałem ludzi zgodnie z przepisami i regulacjami dotyczącymi dawstwa narządów i sklasyfikowane jako osoby niebędące ludźmi przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Florydy (IRB; IRB nr 392-2008), zrzekając się konieczności uzyskania zgody. Tkanki nPOD użyte specjalnie w tym projekcie zostały zatwierdzone jako nieludzkie przez University of Florida IRB (IRB20140093).
UWAGA: Dla czytelników zupełnie nowych w technice slice i jej zastosowaniach, takich jak perifuzja i obrazowanie wapnia, może być wskazane zdobycie praktycznego doświadczenia i rozwinięcie podstawowych umiejętności przy użyciu plastrów myszy lub szczura3,28 przed rozpoczęciem pracy z próbkami ludzkimi.
1. Przygotowania
UWAGA: Te przygotowania powinny być wykonane przed przybyciem tkanki.
- Przygotuj bufor HEPES, mieszając 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, 2 mM L-alaniny, L-argininy i L-glutaminy. Dostosuj pH do 7,4 i wysterylizuj filtr.
- Dodaj glukozę i/lub inne bodźce do buforu, aby przygotować roztwory do eksperymentu peryfuzyjnego. Jako bufor wyjściowy dodać 5,5 mM glukozy. Ten bufor będzie używany do procedur krojenia, zbierania plastrów i przygotowań peryfuzyjnych.
- Przygotuj co najmniej dwie potrawy do zbioru plastrów, dodając aprotyninę (10 μg/ml) do buforu podstawowego.
- Przygotować 3,8 % roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze HEPES bez BSA i aminokwasów (125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES) i utrzymywać w temperaturze 37 °C.
- Zmontuj wibratom, umieszczając świeże ostrze w uchwycie. W razie potrzeby ustaw kąt ostrza na 15° (jeśli używasz Leica VT1200S). W razie potrzeby skalibruj wibratom.
- Włącz maszynę peryfuzyjną, wybierz liczbę komór i protokół programu.
- Umieść wszystkie niezbędne roztwory w maszynie peryfuzyjnej, zalej system i utrzymuj roztwory w cieple. Maszyna oblicza niezbędne objętości każdego roztworu użytego w protokole.
2. Przetwarzanie tkanek
UWAGA: Plasterki powinny być generowane natychmiast po otrzymaniu. Każde opóźnienie może spowodować trudności w zabiegu i doprowadzić do degradacji tkanek.
- Umieść tkankę trzustki w naczyniu z buforem linii bazowej pod mikroskopem stereoskopowym (Ryc. 1A). Delikatnie usuń tkankę łączną, zwłóknieniową i tłuszczową za pomocą kleszczy i nożyczek.
- Pokrój tkankę na wiele małych kawałków o długości około 0,5cm3 (Rysunek 1B) za pomocą nożyczek lub skalpela. Osuszone kawałki trzustki osuszyć na bibułce.
- Przenieś 4 kawałki na szalkę Petriego o średnicy 35 mm i napełnij naczynie roztworem agarozy, aż wszystkie kawałki zostaną całkowicie zanurzone. Pozwól agarozie w pełni zastygnąć.
- Ostrożnie wyciąć kawałki z agarozy. Przesuń skalpel wzdłuż krawędzi naczynia, aby usunąć agarozę i ostrożnie oddziel bloki tkanki. Upewnij się, że kawałki są otoczone cienką warstwą agarozy.
3. Krojenie
- Przyklej kawałki tkanki do metalowej płytki wibratomu, umieszczając je do góry nogami.
- Zamontuj płytkę w tacce i napełnij tackę buforem podstawowym (HEPES zawierający 5,5 mM podstawowej glukozy).
- Ustaw wibratomat na automatyczne krojenie na 120 μm i dostosuj pozycję początkową i końcową.
- Przesuń ostrze krótko nad tkankę i rozpocznij krojenie z małą prędkością (0,1 mm/s) i amplitudą 0,8 mm. Prędkość można zwiększyć, jeśli pozwala na to tkanka (Rysunek 1C).
- Zbieraj plastry za pomocą zakrzywionych kleszczy lub małej szczotki. Zgromadź wycinki w buforze bazowym zawierającym aprotyninę ( Rysunek 1D).
- Pozostawić plastry na spoczynek przez co najmniej 1 godzinę w buforze podstawowym z aprotyniną. Umieść plastry na powolnej wytrząsarce orbitalnej, aby umożliwić wypłukanie enzymów uwolnionych podczas procedury krojenia.
4. Test żywy/martwy
UWAGA: To jest opcjonalny test, który pokaże żywotność wycinków tkanki po zabiegu. Jednak plastry nie mogą być ponownie użyte po zabarwieniu.
- Przenieś pojedynczy plasterek do studzienki wypełnionej buforem podstawowym.
- Dodać dioctan fluoresceiny (FDA, 50 μg/ml), inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
- Dodać jodek propidyny (PI,50 μg/ml), inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
- Przenieś plasterek do innego dołka wypełnionego PBS w celu mycia przez 1 minutę.
- Przenieś plastry na szalkę Petriego lub zamontuj na szkiełku podstawowym z szkiełkiem nakrywkowym do obrazowania (Rysunek 2A,B).
5. Peryfuzja
UWAGA: Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić dynamiczną peryfuzję dla wycinków tkanek, jednak nadaje się również dla izolowanych wysepek. Komory wysepek będą wymagały przygotowania bibułą filtracyjną i roztworem kulek przed załadowaniem wysepek zgodnie z opisem w instrukcji obsługi maszyny. Jednak wysepka i komora plastrowa mogą być używane razem w tym samym eksperymencie.
- Wybierz 3 plastry i przytnij agarozę do minimum pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą pędzla i skalpela.
- Dodaj kroplę buforu podstawowego (HEPES zawierający 5,5 mM podstawowej glukozy) na siatkę komory na plastry i delikatnie umieść jedną porcję na siatce. Powtórz te czynności dla każdego z 3 plasterków (Rysunek 3A). Jeśli plastry są bardzo małe, ułóż więcej niż 3 komory, aby zwiększyć liczbę wysepek. Nie umieszczaj więcej niż jednego plasterka w komorze.
UWAGA: Liczba wysepek na plasterek różni się znacznie w zależności od dawcy i zależy od wielkości wycinka (10-100 wysepek / plasterek). Udowodniono, że w sumie 3 plastry wystarczają do pomiaru zarówno wydzielania insuliny, jak i glukagonu. - W przypadku izolowanych wysp trzustkowych należy użyć co najmniej 30 wysp trzustkowych na kolumnę do wydzielania insuliny. Zaleca się użycie 100 wysepek do wykrywania glukagonu. Zmontuj poszczególne części komory plastrów od góry do dołu.
- Podłącz komorę plastra do przewodów doprowadzających i odpływowych w maszynie i uruchom protokół ( Rysunek 3C).
- Podczas protokołu należy używać pompy grzewczej i chłodzącej tacę. Zmienić płytki zbiorcze podczas trwania protokołu i przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli oznaczanie ilościowe jest przeprowadzane tego samego dnia, lub przechowywać w temperaturze -80 °C do tego czasu.
- Po wykonaniu protokołu wyjmij komory, zdemontuj i zbierz plastry do lizy (3% HCl w absolutnym etanolu) lub utrwalenia (w 4% paraformaldehydu).
- Wyczyść maszynę, przepłukując ją wodą, 10% wybielaczem, wodą i powietrzem.
- Określ ilościowo wydzielanie hormonów, korzystając z dostępnych na rynku zestawów do wykrywania.
UWAGA: Rysunek 4 pokazuje bezwzględne poziomy wydzielania insuliny i glukagonu w 3 warstwach w celu oszacowania zakresów stężeń.
6. Obrazowanie wapnia
- Przygotuj roztwór barwnika wapniowego (np. Fluo4-AM, Calbryte) zgodnie z instrukcją producenta.
- Rozcieńczyć barwnik w podstawowym roztworze buforowym HEPES i dodać aprotyninę (10 μg/ml).
- Przenieś pojedynczą plasterkę i inkubuj przez 30-60 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
- W czasie inkubacji przygotuj zestaw do obrazowania warstwowego, napełniając strzykawki perfuzyjne i zalewając rurki (Rysunek 5A, B).
- Podłącz wszystkie urządzenia, włącz grzałkę i uruchom przepływ pompy. Zalecane do stosowania zarówno ogrzewania przepływowego, jak i grzałki platformowej o natężeniu przepływu 0,5 ml/min.
- Delikatnie umieść pojedynczą kromkę w komorze obrazowania i zabezpiecz za pomocą harfy.
- Użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby zidentyfikować obszar obrazowania. Użycie odbicia pomaga zidentyfikować obszar wysepek (Rysunek 5C).
- Przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu (np. 20x lub 40x) i dostosuj pozycję zgodnie z konfiguracją eksperymentalną.
UWAGA: Aby zapewnić optymalną żywotność komórek i integralność wysepek, zaleca się, aby sekcje optyczne znajdowały się 1-2 warstwy komórek poniżej powierzchni cięcia. - Ustaw pozycję skanowania stosu z lub kafelka. Ustaw interwał obrazowania i czas nagrywania. W tym przypadku zastosowano rozdzielczość co najmniej 256 x 256, aby umożliwić dyskryminację poszczególnych komórek, interwał obrazowania 5-10 s i zakres z-stack (jeśli dotyczy) 30-60 μm z odstępem 10 μm między płaszczyznami (jedna warstwa komórki). Zobacz Rysunek 6, aby zapoznać się ze szczegółowymi ustawieniami obrazowania.
UWAGA: Ustaw parametr obrazowania, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość i maksymalny obszar, ale unikaj wybielania próbki. - Rozpocznij obrazowanie i przełącz dopływ roztworu zgodnie z eksperymentem. Po zakończeniu zbierz plasterki i przymocuj je do immunohistochemii.
Wyniki
Przy prawidłowym wykonaniu protokołu, 1 g tkanki trzustki pozwala uzyskać około 100-200 plastrów. Następnie plastry te powinny zostać poddane ocenie pod stereomikroskopem w celu zidentyfikowania tych, które są bogate w wyspy trzustkowe, przed przystąpieniem do oceny funkcjonalnej. Przewiduje się, że żywotność, określona za pomocą znakowania fluoresceiną diacetatem (FDA) i jodkiem propidium (PI), wyniesie 80%-90% (Rysunek 2A). Żywotność może być znacznie niższa na powierzchni cięcia ze względu na uszkodzenia komórek podczas procesu krojenia. W żywych plastrach obserwuje się dynamiczną sekrecję hormonów (Rysunek 2B>), co skutkuje intensywnym uwalnianiem insuliny po ekspozycji na wysoką koncentrację glukozy oraz depolaryzacji błony za pomocą chlorku potasu (KCl).
I przeciwnie, w przypadku opóźnień podczas procedury krojenia lub gdy jakość tkanki jest suboptimalna, wyniki różnią się znacząco. Liczba uzyskanych przekrojów może ulec zmniejszeniu, a ocena żywotności może wykazać wyższy odsetek komórek nieżywotnych znakowanych PI (Rysunek 2C). W takich przypadkach ocena funkcjonalna wskazuje na osłabioną lub nawet całkowicie brakującą odpowiedź na wysoką glukozę i depolaryzację błony (Rysunek 2D). Dane z suboptimalnych eksperymentów ilustrują znaczenie precyzyjnego i terminowego wykonania procedury oraz jakości tkanki, ponieważ czynniki te mogą prowadzić do zmniejszonej żywotności tkanki i upośledzenia jej funkcjonalności. Te negatywne wyniki służą jako cenna przypomnienie o krytycznych czynnikach, które należy wziąć pod uwagę dla sukcesu tej metody.
Typowe wyniki obrazowania wapniowego są wizualizowane w formie mapy ciepła, jak przedstawiono na Rysunku 5D, lub jako oddzielne ślady dla poszczególnych komórek, jak pokazano na Rysunku 5E. Należy podkreślić, że barwnik znakuje wszystkie typy komórek w sposób niewybiórczy, dlatego kluczowe jest zastosowanie specyficznych bodźców w celu rozróżnienia komórek na podstawie ich odpowiedzi. Aby zidentyfikować żywe komórki, stosujemy KCl i sortujemy komórki na podstawie odpowiedzi, które przekraczają średnią odpowiedź bazową o więcej niż dwa błędy standardowe. Ponadto skrawki można utrwalić i zabarwić, co umożliwia identyfikację typów komórek.
Rycina 1: Obróbka i krojenie tkanek. (A) 1 g nieobrobionej tkanki trzustki. (B) Oczyszczone fragmenty trzustki przygotowane do zatapiania w agarozie. (C) Procedura krojenia przy użyciu wibratomu. (D) Świeżo wycięte plastry ludzkiej trzustki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Dane dotyczące żywotności tkanki i wydzielania insuliny. (A) Reprezentatywne obrazy dla żywotnych przekrojów tkanki. Maksymalna projekcja intensywności odbitego światła laserowego (szary, góra po lewej), PI dla martwych komórek (czerwony, dół po lewej), FDA dla żywych komórek (zielony, dół po prawej) oraz nałożone obrazy komórek żywych i martwych (góra po prawej). Linia przerywana wskazuje wysepkę. Pasek skali 50 µm. (B) Dynamiczne wydzielanie insuliny z ludzkich przekrojów tkanki trzustkowej od jednego dawcy bez cukrzycy. Kinetyka insuliny wykazuje szczytową odpowiedź pierwszej fazy po 6 min stymulacji wysokim stężeniem glukozy, po której następuje plateau drugiej fazy. Dane zostały znormalizowane do średniego podstawowego wydzielania przy 5,5 mM glukozy (indeks stymulacji, krotność zmiany). Wydzielanie przeprowadzono na przekrojach od tego samego dawcy, co przedstawiono w (A). (C) Reprezentatywne obrazy dla nieżywotnych przekrojów tkanki. Maksymalna projekcja intensywności odbitego światła laserowego (szary, góra po lewej), PI dla martwych komórek (czerwony, dół po lewej), FDA dla żywych komórek (zielony, dół po prawej) oraz nałożone obrazy komórek żywych i martwych (góra po prawej). Linia przerywana wskazuje wysepkę. Pasek skali 50 µm. (D) Dynamiczne wydzielanie insuliny z ludzkich przekrojów tkanki trzustkowej od jednego dawcy bez cukrzycy. Kinetyka insuliny wykazuje wyraźny brak zarówno stymulowanego glukozą wydzielania insuliny, jak i depolaryzacji błony za pomocą KCl. Dane zostały znormalizowane do średniego podstawowego wydzielania przy 5,5 mM glukozy (indeks stymulacji, krotność zmiany). Wydzielanie przeprowadzono na przekrojach od tego samego dawcy, co przedstawiono w (C). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Ładowanie tkanki do dynamicznej perifuzji. (A) Piętrowe komory do skrawków tkankowych. Poszczególne skrawki są umieszczane na metalowej kratce, jak pokazano na wstawce. (B) Ładowanie izolowanych wysepek do komór do wysepek. Komory do skrawków i wysepek podłączone do urządzenia do perifuzji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4Wydzielanie hormonów w skrawkach i izolowanych wysepek. Dane przedstawione na panelach (A) oraz (B) pochodzą od innego dawcy niż panele (C) i (D). (A) Bezwzględna sekrecja hormonów z 3 skrawków tkanki trzustki od jednego dawcy niediabetycznego. Sekrecję insuliny przedstawiono w kolorze zielonym, a sekrecję glukagonu w kolorze purpurowym. (B) wydzielanie hormonów przedstawione w (A) znormalizowane do całkowitej zawartości hormonu (% zawartości). Zawartość mierzy się we wszystkich 3 plastrach wykorzystanych w eksperymencie. (C) Dynamiczna sekrecja insuliny w wyizolowanych wysepkach (100 wysepek) i skrawkach tkanki trzustki (3 skrawki) od tego samego dawcy bez cukrzycy. Dane przedstawiono w wartościach bezwzględnych (mU/L). (D) wydzielanie insuliny przedstawione w (C) znormalizowane do całkowitej zawartości insuliny (% zawartości). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Układ obrazowania i oczekiwane wyniki. (A) Układ do obrazowania funkcjonalnego z wykorzystaniem pionowego mikroskopu konfokalnego i systemu perifuzji. (B) Komora obrazowania połączona z dopływem i odpływem. (C) Stos obrazów konfokalnych wysepki w plastrze tkanki od zdrowego dawcy człowieka, przedstawiający światło odbite (góra) oraz sygnał Fluo4 (dół). Odbicie służy do identyfikacji wysepek w plastrze (linia przerywana). (D) Mapa ciepła przedstawiająca dynamikę Ca2+ komórek wysepek in vitro, wyrażoną jako intensywność fluorescencji Fluo4 znormalizowana do podstawowej intensywności sygnału przy 5,5 mM glukozy i stymulacji wysokim stężeniem glukozy (16,7 mM). Każdy wiersz reprezentuje pojedynczą komórkę śledzoną w czasie na osi x, a ich odpowiedź w postaci zmiany wielkości (%) intensywności fluorescencji względem poziomu podstawowego (dF/F) jest przedstawiona w skali kolorystycznej od niebieskiego (niska intensywność) do czerwonego (wysoka intensywność). (E) Reprezentatywne przebiegi dla 4 pojedynczych komórek wykazujące odpowiedź na wysoką dawkę glukozy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Ustawienia obrazowania wapnia. Zrzut ekranu oprogramowania z reprezentatywnymi ustawieniami wybranymi do rejestracji time-lapse w skali 40 µm (obrazowanie XYZT). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania żywotnych wycinków tkanki trzustki i ich wykorzystania do odczytów funkcjonalnych, takich jak dynamiczne wydzielanie hormonów i obrazowanie funkcjonalne. Podobnie jak w przypadku izolacji ludzkich wysp trzustkowych, na powodzenie procedury plastrowania mają wpływ różne czynniki, w tym charakterystyka dawcy, czas transportu tkanek i jakość tkanek25,29. Dlatego tak ważne jest, aby starannie dobrać próbki tkanek do eksperymentu i ograniczyć czas niedokrwienia do minimum. W tym kontekście należy dokładnie rozważyć inne potencjalne źródła tkanki ludzkiej poza dawcami zwłok. Uwzględnienie dawców chirurgicznych daje możliwość połączenia funkcjonalnych danych dotyczących wycinków z istotnymi informacjami in vivo od tego samego pacjenta, co zwiększa znaczenie translacyjne11. Jednak to źródło tkanki wiąże się z innymi czynnikami, ponieważ biopsje są zwykle wykonywane przez starszych pacjentów poddawanych pankreatektomii, głównie z powodu zlokalizowanego guza. Warto zauważyć, że biopsje trzustki nie są wykonywane w kontekście cukrzycy.
Podczas wykonywania właściwej procedury krojenia kluczowe znaczenie ma terminowe przetwarzanie tkanek. Plastry mogą być przechowywane przez kilka godzin, jak opisano w tym protokole, lub hodowane przez dłuższy czas, jak opisano przez Qadira i wsp.19. Obecnie protokół ten jest jedyną metodą utrzymania żywotności plastrów przez dłuższy czas, jednak przyszłe wysiłki powinny ocenić zmiany funkcjonalne w różnych czasach kulturowych i dokonać porównań z izolowanymi wysepkami od tego samego dawcy.
Najważniejszym krokiem w tym procesie jest staranne przygotowanie tkanek przed zatopieniem w agarozie. Duże przewody i tkanka zwłóknieniowa mogą komplikować proces krojenia i potencjalnie prowadzić do wyrwania się bloków tkankowych z agarozy. Jeśli tak się stanie, a kawałki pozostaną odpowiedniej wielkości, można je ponownie przetworzyć i zatopić w celu pokrojenia. Utrzymanie dobrej jakości tkanek i staranne przetwarzanie znacznie zwiększa wydajność procedury krojenia i pozwala uzyskać maksymalną ilość i jakość plastrów. Czas, jaki upłynął od przygotowania tkanki do wytworzenia plastra, nie powinien przekraczać 2-3 godzin, ponieważ dłuższe odstępy mają znaczący wpływ na żywotność tkanek.
Podczas perfuzji plastra prostym, ale krytycznym krokiem jest precyzyjne przycinanie plastra, aby zapewnić idealne dopasowanie do komory. Pozwala to na prawidłową kąpiel tkanki i nieprzerwany przepływ. Po zainicjowaniu protokołu ważne jest, aby unikać dalszej manipulacji komorami, aby zapobiec niepożądanym skokom uwalniania hormonów. Należy przygotować wystarczający bufor, a rurki powinny sięgać dna roztworu, aby zapobiec zasysaniu powietrza i wysuszaniu komór.
W przypadku obrazowania wapnia ważne jest, aby starannie wybrać obszar zainteresowania, w zależności od potrzeb eksperymentalnych i projektu. Ważne jest, aby zminimalizować fotowybielanie, wybierając parametry obrazowania, które zmniejszają ekspozycję na światło lub skracają całkowity czas protokołu. Podobnie jak w przypadku dynamicznego wydzielania hormonów, utrzymanie prawidłowego przepływu roztworu i podgrzewania ma kluczowe znaczenie, ponieważ plastry wymagają warunków zbliżonych do fizjologicznych dla optymalnego funkcjonowania (np. 37 °C).
Plastry tkanki trzustki skutecznie utrzymują integralność strukturalną trzustki, zachowując połączenia komórka-komórka między różnymi typami komórek. W związku z tym stanowią alternatywę dla pracy z izolowanymi wysepkami, ułatwiając jednoczesną eksplorację funkcji zarówno endokrynnych, jak i zewnątrzwydzielniczych oraz ich wzajemnych oddziaływań. Aby ocenić wzajemne oddziaływanie poszczególnych typów komórek, kluczowe jest ich rozróżnienie. Późniejsze barwienie jest jedną z opcji, ale ma ograniczenia w zakresie dostępnych sond fluorescencyjnych i wyzwania związanego z lokalizacją dokładnych warstw komórek. Dlatego wskazane jest włączenie do protokołu bodźców specyficznych dla komórki, aby umożliwić dyskryminację komórek na podstawie odpowiedzi. Do rozróżniania typów komórek w plastrach myszy lub ludzi skutecznymi bodźcami są adrenalina dla komórek alfa21,30, grelina dla komórek delta31, ceruleina dla komórek groniastych 5,32, kwasy żółciowe dla komórek przewodowych33 i noradrenalina dla komórek naczyniowych22. Podobne bodźce można wykorzystać do pomiaru reakcji wydzielniczych. Podczas gdy badania obrazowe koncentrują się na pojedynczych komórkach, badania wydzielania analizują odpowiedź zbiorową. Dlatego ważne jest, aby uwzględnić wystarczającą liczbę wycinków, aby wykryć pożądane wyniki. Optymalna ilość może się różnić w zależności od typu komórek, przy czym trzy plasterki okazują się wystarczające dla komórek endokrynnych; Zaleca się jednak użycie większej liczby wycinków, aby zapewnić wykrywalność, a nie ryzykować utraty cennych informacji.
Jak każda inna metoda, wycinki tkanek mają ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę podczas interpretacji wyników. Zastosowanie bodźca ukierunkowanego na określone typy komórek może prowadzić do wpływu na inne typy komórek w wycinku, potencjalnie wywołując pętle sprzężenia zwrotnego. Są one jednak również ważne do zbadania, a zatem mierzone odpowiedzi mogą być bardziej reprezentatywne dla odpowiedzi fizjologicznej. Do selektywnego celowania w komórki można stosować tradycyjne protokoły in vitro . Co ważne, komórki groniaste zawierają enzymy trzustkowe, które mogą rozkładać białka i trawić wycinek tkanki, powodując degradację komórkową w ciągu kilku godzin. Aby utrzymać żywotność, konsekwentne stosowanie inhibitorów trypsyny jest niezbędne, gdy plastry są w stanie statycznym, nawet jeśli ich zastosowanie może zakłócać pomyślne przenoszenie wirusów wykorzystywanych do znakowania.
W porównaniu z izolacją wysepek, zmienność dawcy i jakość tkanek mogą mieć wpływ zarówno na ilość, jak i żywotność otrzymanych wycinków. Niewystarczająca żywotność po krojeniu może skutkować krótką żywotnością i utrudniać hodowlę plastrów. Co więcej, liczba wysepek może się znacznie różnić w zależności od dawcy, co utrudnia oszacowanie zawartości wysepek przed przeprowadzeniem eksperymentów. W związku z tym kluczowe znaczenie ma staranny dobór kryteriów akceptacji dawcy i wdrożenie odpowiednich metod normalizacji, takich jak procentowa zawartość hormonu do wydzielania lub zmiana fałdowania w stosunku do wartości wyjściowej. Aby uzyskać spójne wyniki, zaleca się ocenę żywotności wycinków tkanek przed eksperymentem. Ponadto zaleca się włączenie do eksperymentu odpowiednich bodźców kontrolnych (np. KCl). W przypadku analizy pojedynczych komórek, takich jak obrazowanie, można wdrożyć wstępne sortowanie komórek na podstawie ich odpowiedzi na te stymulacje kontrolne. Pomimo wspomnianych wyzwań, plastry stanowią cenne uzupełnienie obecnych metod badawczych.
Opisany protokół może być wykorzystany jako punkt wyjścia dla kilku zastosowań, a wycinki trzustki mogą być manipulowane, a reakcje badane po różnych bodźcach. Kierujemy również czytelników do licznych badań naukowych z wykorzystaniem mysich lub ludzkich wycinków trzustki, dostarczając cennych spostrzeżeń dla osób planujących swoje eksperymenty. Możliwe, że w przyszłości możliwe jest, że potencjalne terapie będą badane przy użyciu plastrów trzustki lub że będzie można modelować mechanizmy choroby.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie zostało przeprowadzone przy wsparciu Sieci Dawców Narządów Trzustki z Cukrzycą (nPOD; RRID:SCR_014641), wspólny projekt badawczy dotyczący cukrzycy typu 1 wspierany przez JDRF (nPOD: 5--2018-557-Q-R) oraz The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793). Odpowiedzialność za wyrażone treści i poglądy spoczywa na autorach i niekoniecznie odzwierciedlają one oficjalne stanowisko nPOD. Organizacje pobierające narządy (OPO) współpracujące z nPOD w celu zapewnienia zasobów badawczych są wymienione na stronie http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Autorzy są wdzięczni darczyńcom i ich rodzinom za ich nieoceniony wkład. Praca ta była wspierana przez Amerykańskie Towarzystwo Diabetologiczne 4-22-PDFPM (J.K.P.) oraz Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust (grant 2015-PG-T1D-052).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alanina | Sigma | A7627 | aminokwas |
| AlexaFluor 488 koza anty-świnka | morska Invitrogen | A11073 | przeciwciało drugorzędowe |
| AlexaFluor 546 kozie przeciwciało przeciw szczurom | Thermo Fisher | A11077 | drugorzędowe |
| AlexaFluor 647 kozie przeciwciało anty-mysie | Thermo Fisher | A21235 | przeciwciało drugorzędowe |
| Aprotynina | Sigma | Inhibitor A1153 | |
| Arginina | Sigma | A5006 | aminokwas |
| Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Barwnik wapniowy |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Barwnik wapniowy |
| Fluoresceina diacetat | Sigma | F7378 | marker żywotności |
| Glukagon | Sigma | G2654 | przeciwciało |
| pierwszorzędoweELISA glukagonu (zestaw dla ludzi) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA do wykrywania hormonów |
| Glutamina | Sigma | G3126 | aminokwas |
| Insulina | Dako | A-0546 | przeciwciało pierwszorzędowe |
| Insulina ELISA (ludzka) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA do wykrywania hormonów |
| Agaroza o niskiej temperaturze topnienia | Sigma | A9414 | |
| LSM 900 | Mikroskop konfokalny | Zeiss | |
| Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | komora na plastry do peryfucyjnego | |
| plastra trzustki Zestaw przedłużacza komory | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | komora na plastry |
| trzustki na perforowaną płytkę | Biorep Technologies | Komora na plastry | PERI-PSC-PP |
| System peryfuzyjny z automatyczną obsługą tacek | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
| Jodek propidium | Life Technologie | P1304MP martwy marker | |
| Półautomatyczny wibratom VT1200S | Leica | 14048142066 | |
| Somatostatyna | Milipore | Przeciwciało pierwszorzędowe | MAB354 |
Bibliografia
- Abdelli, S., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Lyon, J., et al. Research-focused isolation of human islets from donors with and without diabetes at the alberta diabetes institute isletcore. Endocrinology. 157 (2), 560-569 (2016).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446 (5), 553-558 (2003).
- Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
- Marolt, U., et al. Calcium imaging in intact mouse acinar cells in acute pancreas tissue slices. PLoS One. 17 (6), 0268644(2022).
- Stozer, A., et al. Confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices. J Vis Exp. (170), e62293(2021).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS One. 8 (1), e54638(2013).
- Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released atp to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
- Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. Katp-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar atp. Mol Cell Endocrinol. 230 (1-2), 51-58 (2005).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Mol Metab. 6 (9), 943-957 (2017).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Rep. 31 (1), 107469(2020).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525(2020).
- Campbell-Thompson, M., et al. Network for pancreatic organ donors with diabetes (npod): Developing a tissue biobank for type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 28 (7), 608-617 (2012).
- Kaddis, J. S., Pugliese, A., Atkinson, M. A. A run on the biobank: What have we learned about type 1 diabetes from the npod tissue repository. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 22 (4), 290-295 (2015).
- Pugliese, A., et al. New insight on human type 1 diabetes biology: Npod and npod-transplantation. Curr Diab Rep. 14 (10), 530(2014).
- Pugliese, A., et al. The juvenile diabetes research foundation network for pancreatic organ donors with diabetes (npod) program: Goals, operational model and emerging findings. Pediatr Diabetes. 15 (1), 1-9 (2014).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. J Biol Chem. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nat Commun. 11 (1), 3265(2020).
- Huber, M. K., et al. Observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices. J Vis Exp. (170), e62207(2021).
- Panzer, J. K., Tamayo, A., Caicedo, A. Restoring glutamate receptor signaling in pancreatic alpha cells rescues glucagon responses in type 1 diabetes. Cell Rep. 41 (11), 111792(2022).
- Mateus Goncalves, L., Almaca, J. Functional characterization of the human islet microvasculature using living pancreas slices. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 602519(2020).
- Doke, M., et al. Dynamic scrna-seq of live human pancreatic slices reveals functional endocrine cell neogenesis through an intermediate ducto-acinar stage. Cell Metab. 35 (11), 1944-1960 (2023).
- Mateus Goncalves, L., et al. Pericyte dysfunction and impaired vasomotion are hallmarks of islets during the pathogenesis of type 1 diabetes. Cell Rep. 42 (8), 112913(2023).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85 (7), 950-955 (2008).
- Hart, N. J., Powers, A. C. Use of human islets to understand islet biology and diabetes: Progress, challenges and suggestions. Diabetologia. 62 (2), 212-222 (2019).
- Henquin, J. C. The challenge of correctly reporting hormones content and secretion in isolated human islets. Mol Metab. 30, 230-239 (2019).
- Panzer, J. K., Caicedo, A. Protocol to generate and utilize pancreatic tissue slices to study endocrine and exocrine physiology in situ from mouse and human tissue. STAR Protoc. 4 (3), 102399(2023).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34 (3), 826-827 (2002).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by tpc2-dependent ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic alpha-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), e78706(2013).
- Gal, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Front Physiol. 10, 938(2019).
Przedruki i uprawnienia
