Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego

Podsumowanie

Tutaj pokazujemy protokół obrazowania do obserwacji oddziaływań biomolekularnych za pomocą fototermicznego odsłuchu off-rezonansowego (PORT), gdzie zoptymalizowaliśmy parametry obrazowania, zidentyfikowaliśmy ograniczenia systemu i zbadaliśmy potencjalne ulepszenia w obrazowaniu montażu motywu DNA gwiazdy trzypunktowej.

Streszczenie

Szybka mikroskopia sił atomowych (HS-AFM) jest popularną techniką obrazowania molekularnego do wizualizacji procesów biologicznych pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym ze względu na jej zdolność do obrazowania w warunkach fizjologicznych w środowisku płynnym. Tryb gwintowania fototermicznego z rezonansem off-resonansowym (PORT) wykorzystuje laser napędowy do oscylacji wspornika w kontrolowany sposób. To bezpośrednie uruchamianie wspornikowe jest skuteczne w zakresie MHz. W połączeniu z działaniem pętli sprzężenia zwrotnego na krzywej siły w dziedzinie czasu, a nie na amplitudzie rezonansowej, PORT umożliwia szybkie obrazowanie z prędkością do dziesięciu klatek na sekundę z bezpośrednią kontrolą sił między końcówką a próbką. Wykazano, że PORT umożliwia obrazowanie delikatnej dynamiki składania i precyzyjne monitorowanie wzorów tworzonych przez biomolekuły. Do tej pory technika ta była wykorzystywana w różnych dynamicznych badaniach in vitro, w tym we wzorcach składania motywu 3-punktowej gwiazdy DNA pokazanych w tej pracy. Poprzez serię eksperymentów, protokół ten systematycznie identyfikuje optymalne ustawienia parametrów obrazowania i granice ostateczności systemu obrazowania HS-PORT AFM oraz ich wpływ na procesy składania biomolekularnego. Dodatkowo bada potencjalne niepożądane efekty termiczne wywołane przez laser napędowy na próbkę i otaczającą ją ciecz, szczególnie gdy skanowanie jest ograniczone do małych obszarów. Odkrycia te dostarczają cennych informacji, które przyczynią się do rozwoju zastosowania trybu PORT w badaniu złożonych systemów biologicznych.

Wprowadzenie

Mikroskopia sił atomowych o dużej szybkości (HS-AFM) to szybko rozwijająca się technika obrazowania^1,2,3,4. Działa z prędkością, która pozwala naukowcom na wizualizację interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym^5,6,7,8,9. Fototermiczne stukanie w rezonans off-resonancyjny (PORT) to tryb obrazowania off-rezonansowego podobny do tap z siłą szczytową^10,11, tryb siły pulsacyjnej^12,13, lub tryb skakania¹⁴. Jednak zamiast oscylować skaner w pionie, PORT oscyluje pionowo tylko wspornik za pomocą lasera wzbudzającego skupionego na wsporniku (zwykle blisko punktu mocowania). Wspornik odkształca się z powodu efektu bimorficznego: laser wzbudzający z modulacją mocy okresowo podgrzewa powlekany wspornik, który wygina się z powodu różnych współczynników rozszerzalności cieplnej wspornika i materiałów powłokowych¹⁵. Nagrzewanie się kantylantów i próbek można zminimalizować za pomocą lasera sterującego, który jest okresowo wyłączany i ponownie włączany podczas każdego cyklu oscylacji, zamiast stosowania pełnego napędu sinusoidalnego⁵.

DNA jest używane do tworzenia biologicznie istotnych, strukturalnie interesujących i biochemicznie użytecznych motywów od wielu lat^{16,17,18,19,20}. Ponadto udowodniono, że struktury DNA idealnie nadają się do charakteryzowania jakości obrazowania AFM²¹ oraz do oceny efektu końcówki szybkiego AFM²². Trzypunktowe gwiazdy o końcu DNA (3PS) stały się praktyczne jako programowalny system modelowy do badania supramolekularnej organizacji cząsteczek o podobnej strukturze w złożonych systemach biologicznych¹⁹. Wcześniej samoorganizacja sieci utworzonych przez tępo zakończone trimeryczne monomery DNA była śledzona za pomocą HS-AFM²³. W końcu organizują się one w duże sieci w porządku sześciokątnym. W tym przypadku samoorganizacja DNA 3-punktowych gwiazd¹⁹ jest obrazowana techniką PORT z prędkościami wystarczająco szybkimi, aby śledzić samoorganizację i jej mechanizmy korekcyjne²⁴, zapewniając jednocześnie minimalne zakłócenie procesu lub uszkodzenie próbki. Podobnie jak w przypadku każdego trybu HS-AFM, istnieje kompromis między osiągalną jakością obrazowania, szybkością obrazowania i niepożądanymi zakłóceniami próbki. Wybierając odpowiedni kompromis, można lepiej zrozumieć wzorce samoorganizacji zespołów supramolekularnych. Protokół ten będzie zatem wykorzystywał podobną konfigurację z DNA 3PS jako system modelowy do optymalizacji parametrów specyficznych dla PORT. Umożliwi to pracę z dużą szybkością obrazowania przy wystarczająco dużych rozmiarach skanów przy jednoczesnej minimalizacji uszkodzeń próbki.

Protokół

1. Próbka i

UWAGA: Płytka DNA użyta w tym badaniu to motyw 3-ramiennej gwiazdy opracowany w laboratorium Mao na Uniwersytecie Purdue^19,25. Wszystkie oligonukleotydy użyte w tym badaniu zostały zakupione od Integrated DNA Technologies, Inc. Zbierz niezbędne materiały i odczynniki.

1. Wymieszaj jednoniciowe DNA (ssDNA) w stosunku molowym 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM dla S2 i 1,8 μM dla S3) w buforze do wyżarzania (5 mM TRIS, 1 mM EDTA i 10 mM MgAc₂). Końcowe stężenie motywu DNA musi wynosić 0,6 μM (49 ng/μl przy masie cząsteczkowej 3PS wynoszącej 82020,3 g/mol).
2. Umieścić roztwór DNA w żaroodpornym pojemniku i podgrzać go do temperatury 80 °C. Powoli schładzać roztwór DNA z temperatury 80 °C do 20 °C przez okres 4 godzin. Ten proces wyżarzania pomaga oligonukleotydom ssDNA w tworzeniu pożądanego dwuniciowego motywu DNA.
3. W celu oczyszczenia załaduj wyżarzony roztwór DNA na 3% żel agarozowy, aby usunąć nadmiar ssDNA i wszelkie niepożądane produkty uboczne. Uruchom 3% żel pod napięciem 60 V przez ok. 2,5 godziny w buforze roboczym zawierającym 0,5x Tris-Borate-EDTA (TBE) i 10 mM Mg(_CH3COO)₂.
4. Zidentyfikuj i zlokalizuj opaskę na żelu, która zawiera motyw DNA. Upewnij się, że pasmo zostało przeniesione do określonej pozycji na podstawie jego rozmiaru.
5. Ostrożnie wyciąć pasmo zawierające motyw DNA z żelu. Ekstrahować motyw DNA z wyciętego fragmentu żelu, umieszczając go w kolumnie wirowej do ekstrakcji żelu i odwirowując w temperaturze 3 000 x g i 4 °C przez 10 minut.
6. Zastąp bufor w wyekstrahowanym motywie DNA buforem do wyżarzania za pomocą koncentratora odśrodkowego. Odwirować przy 3000 x g w temperaturze pokojowej (lub niższej) do momentu, gdy stężony roztwór będzie mniejszy niż 100 μl. Następnie dodaj 300 μl buforu do wyżarzania i powtórz ten krok dwukrotnie, aby upewnić się, że bufor został wymieniony.
7. Rozcieńczyć motyw DNA do 6 nM do celów obrazowania. Użyj spektrofotometru lub innych odpowiednich metod, aby dokładnie określić i dostosować stężenie. Motyw DNA jest teraz gotowy do obrazowania.
   UWAGA: Wszystkie w protokole mają pH 8,0. Informacje o sekwencji dla trzech odpowiednich pasm są następujące:
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG
   S3: CGTTACCGTGTGGGGGGCATGCATAGT

2. Wzrost końcówki wspornika

1. Montaż wspornika na uchwycie wspornikowym SEM: Upewnij się, że wsporniki są czyste i wolne od wszelkich zanieczyszczeń. Zamontuj wsporniki na odpowiednim uchwycie kompatybilnym z systemem SEM. Niestandardowy projekt uchwytu wspornikowego może zostać udostępniony na żądanie.
2. Wtrysk gazu: Podgrzej gaz prekursorowy (np. prekursor fenantrenu C₁₄H₁₀ do końcówek z węgla amorficznego), który ma być użyty w układzie wtrysku gazu w celu wyhodowania nowej końcówki. Gdy tylko podciśnienie spadnie poniżej ^10-5 mbar, przepłucz przewód wtrysku gazu 10 razy przez 2 sekundy, aby upewnić się, że w przewodzie dyszy nie ma niepożądanych resztek powietrza (należy to zrobić przy zamkniętym zaworze do komory pistoletu).
3. Regulacja położenia końcówki: Użyj skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), aby zlokalizować koniec wspornika. Przechylić uchwyt wspornika pod kątem (np. 11° w tym przypadku) odpowiadającym kątowi, jaki wykaźnik przedstawi po umieszczeniu na uchwycie wspornika AFM w stosunku do powierzchni, tak aby wyrosła końcówka była prostopadła do powierzchni podczas obrazowania. Dostosuj położenie i ostrość SEM, aby uzyskać wyraźny widok na końcówkę wspornika, gdzie będzie rosła ostra nanokońcówka z włókna węglowego.
4. Zogniskowane osadzanie indukowane wiązką elektronów (FEBID):
   1. Ustaw parametry osadzania w wybranym oprogramowaniu (w tym przypadku SmartFIB), takie jak prąd wiązki (I) i napięcie przyspieszenia (V), odległość robocza (WD), powiększenie, naświetlony kształt, dawka/czas osadzania i czas przebywania. Następujące parametry wykorzystano do wyhodowania amorficznych końcówek węglowych, które wykazują dobre właściwości mechaniczne do obrazowania AFM, prowadząc do długości około 130 nm i promieni w zakresie 2-4 nm:
      Wybierz punktowy/kropkę jako kształt naświetlony
      WD = 5 mm
      I = 78 pA, a V = 5 kV
      Czas przebywania = 1 μs
      Dawka = 0,05 nC, a czas osadzania = 0,64 s
      Powiększenie = 20000x
   2. Rozpocznij proces osadzania w celu wyhodowania końcówki, napromieniowując wiązkę elektronów w miejscu na końcówkę wspornika, jednocześnie wstrzykując gaz prekursorowy, zamykając gaz po zakończeniu osadzania. W takim przypadku oprogramowanie SmartFIB robi to automatycznie po skonfigurowaniu wspomnianej receptury
   .
5. Analiza po wzroście: Wykonaj obrazowanie SEM po wzroście, aby zbadać nowo wyrosłą końcówkę i upewnić się, że jest ona jakościowa i charakterystyczna (promień i długość końcówki). Odczekaj 1-2 minuty po wzroście końcówki, aby upewnić się, że cały gaz prekursorowy został wypompowany, aby uniknąć ponownego osadzania się podczas obrazowania SEM. Wyjąć uchwyt próbki z komory SEM.
6. Recykling wsporników: W przypadku, gdy system SEM ma również zainstalowaną kombinowaną skupioną wiązkę jonów (FIB), usuń uszkodzoną lub brudną, wcześniej wyhodowaną końcówkę, frezując ją za pomocą systemu FIB przy użyciu niskich prądów FIB (np. 1 pA, aby uniknąć uszkodzenia wspornika). Usuń końcówkę przez frezowanie w kształcie przekroju, od końca końcówki do podstawy, aby uniknąć zapadania się końcówki. Pozwoli to na odhodowanie nowego.

3. Sprzęt HS-AFM

1. Konfiguracja obrazowania składa się z niestandardowego głowicy PORT^{5, 26} (Rysunek 1A), szybkiego skanera²⁶ z płytą z próbkami z miką na górze, kompatybilnego kontrolera²⁷, wzmacniacza wysokiego napięcia o dużej przepustowości wymaganej do szybkiego obrazowania, bazy AFM i komputera PC z wymaganym oprogramowaniem do sterowania wyżej wymienionym sprzętem²⁷.
   UWAGA: W tym przypadku są to komponenty typu open source, dla których plany można uzyskać w Laboratorium Bio- i Nano- Instrumentacji pod adresem EPFL^{27, 28}. Możliwe jest również wzięcie udziału w warsztatach na temat budowy głowicy i kontrolera PORT²⁹, a także pobranie i korzystanie z oprogramowania opartego na LabView.
2. Ostrożnie umieść ultrakrótki wspornik (np. AC10DS lub odpowiednik) pod zaciskiem sprężynowym na uchwycie wspornika za pomocą pęsety. Upewnij się, że wiór wspornikowy jest stały i stabilny.
3. Dodać 50 μl płynu za pomocą strzykawki przez lewy port dostępu do płynu, jak pokazano na Rysunek 1B. Gdy laser wzbudzający jest nadal wyłączony, ustaw laser odczytu na wsporniku za pomocą trzech dedykowanych pokręteł na głowicy AFM pokazanych na Rysunek 1A. Zrób to, obserwując cień wspornika na białym papierze, maksymalizując sumę (metoda cienia). Następnie wyśrodkuj plamkę lasera na fotodiodzie za pomocą dwóch dedykowanych pokręteł.
4. Włącz i wyrównaj laser napędowy, zaznaczając pole Włącz wzbudzenie w wzbudzeniu VI, aby uruchamiał i oscylował wspornik. Pokaż sygnał wzbudzenia wspornika i sygnał ugięcia wspornika na podłączonym oscyloskopie. Jeśli oscylacja ugięcia jest zbyt niska (lub nie występuje), może to oznaczać, że laser napędowy jest bardzo daleko od wspornika. W takim przypadku użyj metody cienia i wyłącz laser odchylający, aby ułatwić wyrównanie. Zmaksymalizuj amplitudę oscylacji za pomocą pokręteł regulacji lasera napędowego pokazanych na Rysunek 1A.
5. Aby wyregulować amplitudę oscylacji wspornika w PORT, wprowadź do odpowiedniego sterowania oprogramowania napięcie międzyszczytowe wysyłane do obwodu sterującego diody laserowej (od teraz wejście AC między szczytami) w wzbudzeniu VI. Aby utrzymać diodę laserową w reżimie przewodzenia, a tym samym laserowania, dodaj napięcie stałe do obwodu sterującego diody laserowej (od teraz wejście offsetu DC), co również odbywa się z pudełka konfiguracyjnego w wzbudzeniu VI. Oba będą miały również wpływ na moc lasera, którą można zmierzyć za pomocą miernika mocy lasera i służy do dostrajania amplitudy oscylacji wspornika.
6. Określ maksymalną częstotliwość wzbudzenia fototermicznego, którą można przyłożyć do wspornika, która musi być poniżej częstotliwości rezonansowej wspornika. Określ częstotliwość rezonansową za pomocą strojenia termicznego lub przemiatania częstotliwości. Wsporniki użyte w tym badaniu (AC10DS), których częstotliwość rezonansowa w cieczach wynosi około 400 kHz (1 MHz w powietrzu)³⁰, mają quasistatyczny obszar zgięcia poniżej 300 kHz⁵. W związku z tym należy stosować częstotliwości PORT poniżej tej granicy (około 100-200 kHz).
7. Dostosuj parametry obrazowania i ustawienia szybkości PORT i szybkości skanowania do wymaganych wartości odpowiednio w Excitation i Scan Vis (parametry użyte w tym artykule są podane w opisach na rysunku). Po skonfigurowaniu ustawień i parametrów obrazowania wykonaj wymagane eksperymenty obrazowania, aby obserwować i śledzić interakcje molekularne.
   UWAGA: Ponieważ wsporniki AC10DS nie są już sprzedawane, może być konieczne użycie alternatywy, takiej jak Fastscan D lub BioLever^31, dopóki nie będzie dostępny ich odpowiednik.

4. Uzyskiwanie prawidłowych krzywych interakcji

1. Początkowo zbliż się do powierzchni próbki w trybie kontaktowym, klikając Start na kontrolerze Z VI ustawionym na Tryb kontaktowy.
   1. W tym trybie końcówka AFM wchodzi w bezpośredni kontakt z próbką. Po osiągnięciu powierzchni wykonaj krzywą siły w funkcji odległości w Rampie VI, aby uzyskać kalibrację czułości ugięcia wspornika.
   2. Należy również oszacować stałą sprężystości wspornika, albo na podstawie specyfikacji dostawcy wspornika (mniej dokładnie), uzyskanej za pomocą interferometru, albo za pomocą kalibracji opartej na dostrojeniu termicznym po kalibracji czułości ugięcia. Precyzyjna kalibracja wspornika jest niezbędna do dokładnej kontroli siły końcówka-próbka.
2. Po całkowitym schowaniu Z-piezo z powierzchni, do której końcówka nie może dosięgnąć powierzchni, klikając Up w kontrolerze Z VI, przełącz się w tryb PORT w sterowniku Z VI i włącz laser wzbudzenia w polu wyboru Wzbudzenie VI. Aby rozpocząć, ustaw tryb PORT tak, aby działał z żądaną częstotliwością w wzbudzeniu VI, która w tym eksperymentalnym przypadku wynosi 100 kHz, za pomocą wspornika AC10DS.
3. Nagraj drgania bez wspornika blisko, ale nie dotykając powierzchni. Następnie włącz sprzężenie zwrotne w kontrolerze Z w kontakcie z powierzchnią, aby nagrywać, i kliknij Popraw, aby uzyskać oscylację wspornika, gdy wspornik styka się z powierzchnią, w obu nanometrach. Odejmij krzywą drgań swobodnych od krzywej kontaktu przerywanego, aby uzyskać rzeczywistą krzywą oddziaływania, przekształcając je na pN przy użyciu stałej sprężystości wspornikowej (w tym przypadku 0,1 N/m).

5. Obrazowanie HS-AFM

1. Przygotować roztwór Mg(_CH3COO)₂ o stężeniu 10 mM. Za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzyknąć 50 μl przygotowanego roztworu 10 mM Mg(CH₃COO)₂ do kanału płynnego uchwytu wspornika, tworząc kroplę płynu, która otacza wspornik
.
2. Stopniowo zbliżaj wspornik do powierzchni, klikając Start na sterowniku Z VI. Po wykryciu powierzchni włącz sprzężenie zwrotne i znajdź szczyt krzywej interakcji w krzywych siły ORT VI. Znajdź najniższą nastawę siły, która umożliwia prawidłowe śledzenie (poniżej 300 pN, aby uniknąć uszkodzenia delikatnych próbek biologicznych).
3. Ustaw rozmiar skanowania w skanerze Scan VI na 800 nm na 800 nm, a częstotliwość linii na 100 Hz. Zeskanuj powierzchnię, klikając strzałkę Ramka (w dół) w Skanowaniu VI, aby sprawdzić jakość powierzchni. Jeśli zostaną wykryte jakiekolwiek zanieczyszczenia, rozwiąż problem, czyszcząc powierzchnię, wspornik i/lub uchwyt wspornikowy przed kontynuowaniem.
4. Po zeskanowaniu wycofaj wspornik z powierzchni, klikając przycisk Wycofaj w sterowniku Z VI. Usuń roztwór buforowy z otworu w uchwycie wspornika za pomocą strzykawki Hamiltona, aby zapobiec problemom z martwą objętością.
5. Przygotuj rozcieńczony roztwór DNA 3PS z części 1 protokołu. Wstrzyknąć 50 μl rozcieńczonego roztworu DNA 3PS do dedykowanego kanału uchwytu wspornikowego.
6. Rozpocznij proces obrazowania, powtarzając kroki 5.2-5.3, skanując obszar o wymiarach 800 nm na 800 nm z domyślną częstotliwością linii 100 Hz (256 linii × 256 pikseli). Po wstępnym skanowaniu dostosuj rozmiar i szybkość obrazowania w programie Scan VI do określonych wartości w celu dalszego pozyskiwania danych.
7. Utrzymuj nastawę siły wejściowej interakcji końcówka-próbka w polu nastawy Z Controller VI na najniższym poziomie wymaganym do prawidłowego śledzenia (poniżej 300 pN) przez cały proces obrazowania, aby zminimalizować uszkodzenie/zakłócenie próbki, chyba że określono inaczej. Powtórz ten proces dla wszystkich wymaganych obszarów próbki.

6. Przetwarzanie obrazu

1. Skonfiguruj środowisko do uruchamiania dostosowanego kodu przetwarzania wsadowego Pygwy (Python for Gwyddion), upewniając się, że Python i wszystkie niezbędne biblioteki. Więcej informacji można znaleźć na stronie Gwyddion³² są poprawnie zainstalowane w systemie. Dzięki temu kod działa płynnie i ma dostęp do wymaganych funkcjonalności.
2. Otwórz niestandardowy kod przetwarzania wsadowego Pygwy (dostarczony na żądanie). Zapewni to dostęp do narzędzi i funkcjonalności potrzebnych do przetwarzania i analizy obrazu.
3. Rozpocznij przetwarzanie obrazu, wykonując korekcję poziomej linii mediany na obrazach. Ten krok ma na celu usunięcie wszelkich nieprawidłowości lub artefaktów obecnych w liniach skanowania, zapewniając, że kolejne kroki przetwarzania są oparte na dokładnych danych. Po usunięciu tła płaszczyzny zastosuj korekcję linii. Użyj usuwania blizn, aby jeszcze bardziej uwydatnić obrazy, eliminując wszelkie niechciane ślady lub niedoskonałości spowodowane czynnikami zewnętrznymi. Ten krok poprawia ogólny wygląd wizualny obrazów.
4. Zwiększ widoczność i kontrast obrazów, dostosowując kolorową mapę wysokości. Dzięki temu interesujące nas cechy są wyraźnie wizualizowane i wyróżniają się na obrazach.
5. Wybierz przetworzone obrazy, które mają zostać połączone w wideo. Określ żądaną liczbę klatek na sekundę dla wideo. W takim przypadku ustaw go na 7 klatek na sekundę (fps).
6. Oblicz czas trwania każdej klatki. Użyj Fiji (ImageJ), aby połączyć przetworzone obrazy w wideo. Upewnij się, że liczba klatek na sekundę i czas trwania klatek są prawidłowo ustawione.

Wyniki

W tym badaniu, dynamiczny proces składania motywów DNA z 3-punktową gwiazdą w stabilne wyspy został pomyślnie zaobserwowany przy użyciu możliwości HS-PORT AFM. Technika ta pozwoliła nam uchwycić montaż tych konstrukcji w czasie rzeczywistym. W Rysunek 2A,B, otrzymujemy wyraźny obraz skanujący odpowiednio z częstotliwością linii 100 Hz i 200 Hz dla szybkości 100 kHz PORT (rozmiar skanowania 800 nm na 800 nm). Odpowiada to odpowiednio 3,9 i 1,95 cyklom oscylacji na piksel. Jednak obrazowanie z większą prędkością bez jednoczesnego wzrostu szybkości PORT, która pozwoliłaby na co najmniej jeden cykl oscylacji na piksel, drastycznie obniży jakość obrazu, co można zobaczyć na Rysunek 2C (0,78 cyklu oscylacji na piksel). Szybkość obrazowania jest ograniczona przez szybkość, z jaką wspornik sonduje powierzchnię z odpowiednią kontrolą siły końcówka-próbka, ponieważ szybkość zmian topografii staje się zbyt szybka, aby można było śledzić przy szybkości próbkowania powierzchni.

Oprócz ustawienia wystarczająco wysokiej szybkości PORT, ważne jest, aby krzywe PORT zawierały informacje niezbędne do kontrolowania sił. Szczególnie opór hydrodynamiczny i niska szerokość pasma wykrywania mogą zasłaniać przyłożoną siłę. Rysunek 3 pokazuje ugięcie wspornika w różnych odległościach od powierzchni próbki i częstotliwość wzbudzenia, używając średnio 4096 krzywych w celu zmniejszenia szumu. Niebieskie krzywe w Rysunek 3A (dla szybkości 100 kHz PORT) i Rysunek 3D (dla szybkości PORT 500 Hz) reprezentują ruch wspornika, gdy wspornik znajduje się daleko od powierzchni i oscyluje swobodnie (nie dotykając powierzchni podczas jednego cyklu oscylacji). Czerwone krzywe pokazują ugięcie wspornika, gdy wspornik oscyluje blisko powierzchni i sporadycznie styka się z powierzchnią, sondując próbkę. Aby uzyskać rzeczywistą krzywą interakcji, a tym samym interakcję końcówka-próbka, odejmujemy niebieską krzywą od czerwonej krzywej, aby uzyskać odpowiednio Rysunek 3B,E. Przykład wyraźnej krzywej interakcji wymaganej do nieniszczącego obrazowania próbek biologicznych przedstawiono w Rysunek 3B. Ta konfiguracja prowadzi do dobrej jakości obrazowania pokazanej na Rysunek 3C, gdzie szybkość PORT wynosi 100 kHz. Gdy zwiększamy częstotliwość wzbudzenia w pobliżu rezonansu wspornikowego, w pewnym momencie kontrola sprzężenia zwrotnego pogarsza się, nawet jeśli wspornik wykazuje wystarczającą oscylację amplitudy, aby oderwać się od powierzchni po podniesieniu mocy lasera wzbudzenia (Rysunek 3E). Jeśli częstotliwość PORT jest zbyt zbliżona do częstotliwości rezonansowej wspornika, rezonans wspornika ogranicza reakcję czasową dynamiki wspornika. W związku z tym zginanie wspornika nie odzwierciedla już dokładnie interakcji końcówka-próbka, a uzyskana przez nas krzywa interakcji jest zasłonięta. Prowadzi to do pogorszenia jakości obrazu, co pokazano w Rysunek 3F.

Pogorszenie krzywej interakcji przy wyższych częstotliwościach PORT może również wystąpić z powodu zmniejszonej efektywności aktywacji przy wyższych częstotliwościach³³, co jest obecnie jednym z czynników ograniczających komercyjne szybkie wsporniki AFM. Spadek ten ostatecznie osiąga poziom progowy w roll-off, przy którym prawidłowe obrazowanie jest utrudnione: amplituda oscylacji może być niewystarczająca, aby oderwać się od powierzchni, a końcówka jest zawsze w kontakcie, uszkadzając struktury próbki. Aby przeciwdziałać spadkowi amplitudy spowodowanemu przy wyższych szybkościach PORT, zbadaliśmy wzrost mocy lasera. Użyliśmy głowicy PORT, która może osiągać wyższe moce lasera, aby lepiej obserwować ten efekt. Moc lasera wzbudzającego laser, którą zmierzyliśmy miernikiem mocy, została podzielona na składową DC i AC. Całkowita moc jest kontrolowana poprzez regulację w oprogramowaniu napięcia międzyszczytowego (wejście AC między szczytami) i napięcia DC (wejście offsetowe DC) wysyłanego do obwodu sterującego diody laserowej. Rysunek 4A przedstawia amplitudę oscylacji kantylu między szczytami wynikającą ze zwiększonego sygnału wejściowego AC między szczytami. Zgodnie z oczekiwaniami amplituda oscylacji jest dobrze skorelowana z wartością wejściową prądu przemiennego. Ważne jest, aby pamiętać, że te amplitudy międzyszczytowe są wyższe niż te, które są zwykle używane w obrazowaniu PORT. Podczas obrazowania delikatnych próbek amplituda prądu przemiennego jest rzędu 10-30 nm. Rysunek 4B przedstawia amplitudę oscylacji kantylu między szczytami dla zwiększonych wejść offsetowych DC. Amplituda oscylacji międzyszczytowej pozostaje dość stała w zakresie napięcia niezrównoważenia DC. Niewielkie różnice przypisujemy nieliniowości w wykrywaniu. Rysunek 4C przedstawia wzrost mocy lasera AC i DC wynikający ze wzrostu AC od szczytu do szczytu. Rysunek 4D przedstawia wzrost mocy lasera AC i DC wynikający z rosnącego przesunięcia wejściowego DC.

Efekty zwiększenia międzyszczytowego wejścia AC i wejścia DC offset zostały przetestowane oddzielnie, aby określić odpowiednie efekty na całkowitą moc i amplitudę oscylacji. Wzrost mocy lasera powoduje zakłócenie próbki, prawdopodobnie poprzez wzrost temperatury, podczas gdy wzrost amplitudy oscylacji zwiększy siłę uderzenia w próbkę⁵. Zwiększenie wyłącznie międzyszczytowego sygnału wejściowego prądu przemiennego będzie miało mniejszy wpływ na całkowity wzrost mocy lasera, jak pokazano na Rysunek 4C, i głównie zwiększy amplitudę oscylacji wspornika (a w konsekwencji siłę uderzenia), jak pokazano na Rysunek 4A. Zwiększenie wejścia przesunięcia DC będzie miało większy wpływ na wzrost mocy wyjściowej lasera, jak pokazano na rysunku Rysunek 4D, który podgrzewa próbkę, ale będzie miał znikomy wpływ na amplitudę ugięcia, jak widać na rysunku Rysunek 4B. Wyniki obrazowania są przedstawione w Rysunek 4E,F. Rysunek 4E przedstawia DNA 3PS dla najniższego wejścia AC między szczytami (po lewej stronie, zakreślone na niebiesko) i najwyższego wejścia AC między szczytami (prawy obraz, zakreślony na czerwono), co powoduje uszkodzenie próbki przypuszczalnie przez większe siły. Rysunek 4F przedstawia DNA 3PS dla najniższego wejścia DC offset (lewy obraz, zakreślony na niebiesko) i najwyższego wejścia DC offset (prawy obraz, zakreślony na czerwono), gdzie struktury są uszkodzone.

Rysunek 1: Konfiguracja HS-AFM. (A) Głowica PORT na skanerze i podstawie AFM, pokazująca (i) pokrętło do regulacji ostrości lasera odczytu na wsporniku, (ii) pokrętło do regulacji pozycji lasera odczytu na wsporniku, (iii) pokrętło do regulacji poziomego położenia lasera na fotodiodzie, (iv) pokrętło do regulacji pionowego położenia lasera na fotodiodzie, oraz (v) pokrętła do regulacji położenia lasera z napędem fototermicznym na wsporniku. (B) Zbliżenie wspornika w widoku przekroju poprzecznego głowicy ze stolikiem na próbkę, gdzie (vi) jest zaciskiem sprężynowym przytrzymującym wspornik. Kanał do wtryskiwania cieczy jest zaznaczony na czerwono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Próbka DNA 3PS zobrazowana za pomocą AC10 z częstotliwością 100 kHz PORT przy różnych szybkościach linii. (A) 100 Hz (3,9 cykli oscylacji na piksel), (B) 200 Hz (1,95 cykli oscylacji na piksel) i (C) 500 Hz (0,78 cykli oscylacji na piksel). Zdjęcia zostały wykonane w zadanych wartościach 350 pN lub mniejszych. Podziałka 200 nm. Po obrazowaniu wykonano krzywą siły w celu uzyskania czułości na ugięcie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ugięcie wspornika, krzywa interakcji i jakość obrazu przy szybkościach 100 kHz i 500 kHz PORT. (A) Ugięcie wspornika (swobodna oscylacja wspornika blisko, ale nie dotykająca powierzchni na niebiesko, oraz oscylacja wspornika, gdy wspornik styka się okresowo z powierzchnią na czerwono), (B) krzywa interakcji i (C) odpowiednia jakość obrazu dla szybkości 100 kHz PORT. (D) Ugięcie wspornika (swobodna oscylacja wspornika blisko, ale nie dotykająca powierzchni na niebiesko, a oscylacja wspornika, gdy wspornik styka się z powierzchnią na czerwono), (E) krzywa interakcji i (F) odpowiednia jakość obrazu dla szybkości 500 kHz PORT. Zdjęcia zostały wykonane z częstotliwością liniową 100 Hz. Podziałka liniowa 200 nm. Po obrazowaniu wykonano krzywą siły w celu uzyskania czułości na ugięcie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wpływ międzyszczytowego napięcia wejściowego AC napięcia wejściowego DC offset. Wpływ zwiększenia (A) międzyszczytowego napięcia wejściowego AC i (B) napięcia wejściowego przesunięcia DC na oscylację międzyszczytową wspornika. Wpływ wzrostu napięcia wejściowego AC między szczytami (C) i napięcia wejściowego przesunięcia (D) DC na moc lasera AC i DC. Jakość obrazowania przy minimalnym (zakreślonym na niebiesko) i maksymalnym (zakreślonym na czerwono) (E) międzyszczytowym napięciem wejściowym AC i (F) napięciem wejściowym DC z przesunięciem. Podczas zwiększania międzyszczytowego napięcia wejściowego AC, napięcie wejściowe DC offset było utrzymywane na poziomie 600 mV. Przy zwiększaniu napięcia wejściowego przesunięcia DC, napięcie wejściowe AC między szczytami było utrzymywane na poziomie 200 mV. Integralność próbki jest zagrożona w przypadku konfiguracji o dużej mocy. Częstotliwość PORT została utrzymana na poziomie 100 kHz, a częstotliwość linii na poziomie 100 Hz. Skala 200 nm. Po obrazowaniu wykonano krzywą siły w celu uzyskania czułości na ugięcie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Podczas obrazowania delikatnych próbek biologicznych tryby obrazowania z opukaniem poza rezonansem w AFM są szczególnie przydatne, ponieważ mogą bezpośrednio kontrolować siły interakcji końcówka-próbka¹⁰. Wśród nich tryb PORT wyróżnia się wyższymi szybkościami oscylacji, jakie może osiągnąć, co umożliwia wyższe szybkości skanowania. Ponieważ PORT uruchamia wspornik bezpośrednio i tylko za pomocą lasera, umożliwia wzbudzenie przy znacznie wyższych częstotliwościach niż konwencjonalne tryby gwintowania poza rezonansem, szczególnie w przypadku korzystania z ultrakrótkich wsporników o wysokich częstotliwościach rezonansowych⁵. Jednak w przypadku korzystania z PORT dla HS-AFM należy uważać na parametry obrazowania, aby uzyskać dobrą jakość obrazowania.

Jak pokazano na rysunku 2, zwiększenie szybkości skanowania bez jednoczesnego podniesienia szybkości PORT doprowadzi do złej jakości obrazowania. Po pierwsze, szybkości PORT skutkujące mniej niż jednym cyklem oscylacji na piksel drastycznie obniżą jakość obrazu. Prędkość obrazowania jest z natury ograniczona przez szybkość, z jaką wspornik sonduje powierzchnię przy odpowiedniej kontroli siły końcówki i próbki. W PORT sterowanie sprzężeniem zwrotnym działa dyskretnie na koniec każdego cyklu oscylacji³⁴. Ta ograniczona częstotliwość próbkowania indukuje czyste opóźnienie w pętli sprzężenia zwrotnego, ograniczając w ten sposób osiągalną szerokość pasma sprzężenia zwrotnego. Jeśli szybkość zmian topografii stanie się zbyt szybka, aby można ją było śledzić przy częstotliwości próbkowania PORT, topografia nie może być już dokładnie wykryta ani śledzona przez pętlę sprzężenia zwrotnego. W związku z tym należy zwiększyć szybkość PORT, aby wiernie rozpuścić próbkę przy wyższych prędkościach powierzchniowych. Jednak częstotliwość rezonansowa wspornika z natury ogranicza maksymalną szybkość PORT, jakiej możemy użyć. Jeśli szybkość PORT jest zbliżona do częstotliwości rezonansowej wspornika, ugięcie mierzone metodą dźwigni optycznej nie odzwierciedla już wiernie sił końcówka-próbka. Aby uzyskać właściwą krzywą interakcji końcówka-próbka, zarówno szerokość pasma mechanicznego wspornika, jak i szerokość pasma elektrycznego systemu AFM muszą być wystarczająco duże, aby wykryć składowe Fouriera krzywej ugięcia, które są kilkakrotnie większe niż częstotliwość PORT. Jeśli którekolwiek z tych pasm jest zbyt niskie, krzywa interakcji nie pokazuje już jednostronnego odcięcia (rysunek 3A), ale raczej zachowanie sinusoidalne (rysunek 3D), które zasłania rzeczywistą interakcję próbki końcówki (rysunek 3E). Prowadzi to do słabej kontroli siły w obrazowaniu (ryc. 3F). Nawet mniejsze wsporniki o wysokiej częstotliwości rezonansowej, które mają jednocześnie niskie stałe sprężystości, są zatem wymagane do dalszego zwiększenia szybkości PORT. Tak wysokie szybkości PORT i prędkości skanowania stanowią wyzwanie dla elektroniki AFM, wymagając starannego oprogramowania i konstrukcji elektronicznej, która charakteryzuje się wymaganymi wysokimi przepustowościami i zoptymalizowanymi strategiami cyfrowego przetwarzania sygnału.

Jedną z zalet PORT w porównaniu z szybkim AFM w trybie gwintowania jest to, że można dostroić prędkość próbkowania powierzchni. W trybie gwintowania AFM częstotliwość próbkowania powierzchni jest określona przez częstotliwość rezonansową wspornika. Podczas pracy w PORT znacznie poniżej częstotliwości rezonansu wspornikowego zakładamy, że każde próbkowanie powierzchni dostarcza prawidłowego punktu danych. W związku z tym szerokość pasma wykrywania PORT jest podawana przez częstotliwość Nyquista z połową szybkości PORT. W przypadku trybu podsłuchowego szerokość pasma detekcji jest określona przez f₀/2Q³⁵. Dzięki najnowszym osiągnięciom w PORT możemy stopniowo zwiększać szybkość PORT aż do częstotliwości rezonansowej. W takiej sytuacji PORT i tryb stukania stają się prawie identyczne, ponieważ przy tych częstotliwościach PORT nie jest w stanie dokładnie wykryć interakcji między wspornikiem a końcówką próbki, jak pokazano na rysunku 3E. Podczas pracy z częstotliwością rezonansową wadą staje się większa amplituda oscylacji PORT w porównaniu z trybem stukania. Celem zwiększenia szybkości obrazowania PORT pozostaje zatem zwiększenie częstotliwości rezonansowej wspornika, aby utrzymać działanie z szybkością PORT wystarczająco znacznie poniżej częstotliwości rezonansowej.

Gdy zwiększymy szybkość PORT, aby umożliwić szybsze skanowanie, napotkamy kolejny problem związany z fototermicznym wzbudzeniem wspornikowym: przy wyższych częstotliwościach amplituda oscylacji zmniejsza się z powodu spadku wydajności wzbudzenia fototermicznego, ostatecznie do punktu, w którym musimy zwiększyć moc lasera, co spowoduje wzrost temperatury próbki. Zwiększenie szybkości PORT utrudni zrównoważenie mocy lasera i amplitudy oscylacji, ponieważ wymagana jest wyższa moc wzbudzenia, aby skompensować zmniejszoną wydajność uruchamiania, która prowadzi do uszkodzenia próbki. Przy wyższych poziomach mocy lasera nie mogliśmy już obserwować próbki, pomimo użycia najniższej możliwej wartości zadanej siły (prawe panele na rysunkach 4E,F). Musimy uważać na to, w jaki sposób zwiększymy amplitudę oscylacji wspornika i zwiększymy moc lasera. Istnieją dwa parametry, które możemy dostroić, aby zwiększyć moc lasera. Po pierwsze, wejście AC między szczytami, które steruje sinusoidalnym sygnałem wysyłanym do diody laserowej w celu sinusoidalnej zmiany intensywności dostarczanej mocy lasera. Po drugie, napięcie wejściowe przesunięcia prądu stałego, które utrzymuje diodę laserową w reżimie przewodzenia, a tym samym laserowania. Wzrost pierwszego z nich musi być połączony ze wzrostem drugiego, ponieważ wzrost amplitudy sygnału AC wysyłanego do lasera wymaga wzrostu napięcia DC, aby uniknąć przekroczenia progu lasera. Jednak tylko wejście prądu przemiennego między szczytami wpływa na amplitudę drgań wspornika, jak pokazano na rysunku 4A. Napięcia prądu stałego nie prowadzą do zmian amplitudy drgań (rysunek 4B). Tak więc, jeśli chcemy uruchomić sinusoidalnie, musimy ustawić napięcie DC na minimalne napięcie, które pozwala laserowi diodowemu znajdować się w reżimie laserowym. Alternatywnie możemy zminimalizować nagrzewanie się poprzez okresowe wyłączanie i ponowne włączanie diody laserowej podczas każdego cyklu oscylacji, zamiast korzystania z pełnego napędu sinusoidalnego⁵. Oscylację temperatury wymaganą do uruchomienia wspornika w wzbudzeniu fototermicznym można efektywniej osiągnąć, wyłączając laser podczas części cyklu, co powoduje obniżenie temperatury wspornika, a tym samym prowadzi do wygięcia wspornika. Zminimalizuje to energię dostarczaną do wspornika i próbki, a tym samym obniży całkowitą temperaturę w otoczeniu, łagodząc uszkodzenia cieplne próbki.

W tym badaniu pokazujemy ograniczenia parametrów obrazowania w HS-PORT, które zapobiegają uszkodzeniom próbki ciepła i właściwej kontroli sprzężenia zwrotnego. Zrozumienie tych granic pomoże w jak najlepszym wykorzystaniu obecnego stanu metody PORT AFM, umożliwiając lepszą kontrolę nad interakcją końcówka-próbka i pomagając zachować natywny stan motywów DNA w tych pomiarach. Dzięki osiąganym wysokim wskaźnikom skanowania w połączeniu z dobrą kontrolą sprzężenia zwrotnego, PORT pozwolił nam uzyskać wyraźne i szczegółowe obrazy DNA 3PS i ich interakcji ^7,8,36. Dzięki możliwości zwiększenia prędkości obrazowania i bezpośredniej kontroli siły końcówka-próbka²³ jesteśmy w stanie dokładniej śledzić wzrost i reorganizację zespołów biomolekularnych oraz obserwować szczegółową dynamikę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	Wycofane z produkcji
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	Jednostka elektroforezy
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	termocykler do wyżarzania
Niestandardowa konfiguracja AFM	Laboratorium oprzyrządowania Bio-Nano, Międzywydziałowy Instytut Bioinżynierii, Szkoła Inżynierii, Ecole Polytechnique Fé dé rale Lozanna		Do uzyskania w Laboratorium Oprzyrządowania Bio-Nano Odczynniki
EDTA	ITW	A5097	W buforze do wyżarzania
Laserowy miernik mocy	Thorlabs	PM100D	Cyfrowy ręczny optyczny  Konsola miernika mocy i energii
Lively 3AP Zasilacz, MP-310	Major Science	MP-310	Zasilacz do elektroforezy
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	W buforze do wyżarzania
TBE	Thermo Scientific	327330010	Bufor do elektroforezy
TRIS	Bio-Rad	1610719	W buforze do wyżarzania