Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66470

⸱

22 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne, 2Programmable Biomaterials Laboratory, Institute of Materials, School of Engineering, Ecole Poly-technique Fédérale Lausanne

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj pokazujemy protokół obrazowania do obserwacji oddziaływań biomolekularnych za pomocą fototermicznego odsłuchu off-rezonansowego (PORT), gdzie zoptymalizowaliśmy parametry obrazowania, zidentyfikowaliśmy ograniczenia systemu i zbadaliśmy potencjalne ulepszenia w obrazowaniu montażu motywu DNA gwiazdy trzypunktowej.

Streszczenie

Szybka mikroskopia sił atomowych (HS-AFM) jest popularną techniką obrazowania molekularnego do wizualizacji procesów biologicznych pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym ze względu na jej zdolność do obrazowania w warunkach fizjologicznych w środowisku płynnym. Tryb gwintowania fototermicznego z rezonansem off-resonansowym (PORT) wykorzystuje laser napędowy do oscylacji wspornika w kontrolowany sposób. To bezpośrednie uruchamianie wspornikowe jest skuteczne w zakresie MHz. W połączeniu z działaniem pętli sprzężenia zwrotnego na krzywej siły w dziedzinie czasu, a nie na amplitudzie rezonansowej, PORT umożliwia szybkie obrazowanie z prędkością do dziesięciu klatek na sekundę z bezpośrednią kontrolą sił między końcówką a próbką. Wykazano, że PORT umożliwia obrazowanie delikatnej dynamiki składania i precyzyjne monitorowanie wzorów tworzonych przez biomolekuły. Do tej pory technika ta była wykorzystywana w różnych dynamicznych badaniach in vitro, w tym we wzorcach składania motywu 3-punktowej gwiazdy DNA pokazanych w tej pracy. Poprzez serię eksperymentów, protokół ten systematycznie identyfikuje optymalne ustawienia parametrów obrazowania i granice ostateczności systemu obrazowania HS-PORT AFM oraz ich wpływ na procesy składania biomolekularnego. Dodatkowo bada potencjalne niepożądane efekty termiczne wywołane przez laser napędowy na próbkę i otaczającą ją ciecz, szczególnie gdy skanowanie jest ograniczone do małych obszarów. Odkrycia te dostarczają cennych informacji, które przyczynią się do rozwoju zastosowania trybu PORT w badaniu złożonych systemów biologicznych.

Wprowadzenie

Mikroskopia sił atomowych o dużej szybkości (HS-AFM) to szybko rozwijająca się technika obrazowania1,2,3,4. Działa z prędkością, która pozwala naukowcom na wizualizację interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym5,6,7,8,9. Fototermiczne stukanie w rezonans off-resonancyjny (PORT) to tryb obrazowania off-rezonansowego podobny do tap z siłą szczytową10,11, tryb siły pulsacyjnej12,13, lub tryb skakania14. Jednak zamiast oscylować skaner w pionie, PORT oscyluje pionowo tylko wspornik za pomocą lasera wzbudzającego skupionego na wsporniku (zwykle blisko punktu mocowania). Wspornik odkształca się z powodu efektu bimorficznego: laser wzbudzający z modulacją mocy okresowo podgrzewa powlekany wspornik, który wygina się z powodu różnych współczynników rozszerzalności cieplnej wspornika i materiałów powłokowych15. Nagrzewanie się kantylantów i próbek można zminimalizować za pomocą lasera sterującego, który jest okresowo wyłączany i ponownie włączany podczas każdego cyklu oscylacji, zamiast stosowania pełnego napędu sinusoidalnego5.

DNA jest używane do tworzenia biologicznie istotnych, strukturalnie interesujących i biochemicznie użytecznych motywów od wielu lat16,17,18,19,20. Ponadto udowodniono, że struktury DNA idealnie nadają się do charakteryzowania jakości obrazowania AFM21 oraz do oceny efektu końcówki szybkiego AFM22. Trzypunktowe gwiazdy o końcu DNA (3PS) stały się praktyczne jako programowalny system modelowy do badania supramolekularnej organizacji cząsteczek o podobnej strukturze w złożonych systemach biologicznych19. Wcześniej samoorganizacja sieci utworzonych przez tępo zakończone trimeryczne monomery DNA była śledzona za pomocą HS-AFM23. W końcu organizują się one w duże sieci w porządku sześciokątnym. W tym przypadku samoorganizacja DNA 3-punktowych gwiazd19 jest obrazowana techniką PORT z prędkościami wystarczająco szybkimi, aby śledzić samoorganizację i jej mechanizmy korekcyjne24, zapewniając jednocześnie minimalne zakłócenie procesu lub uszkodzenie próbki. Podobnie jak w przypadku każdego trybu HS-AFM, istnieje kompromis między osiągalną jakością obrazowania, szybkością obrazowania i niepożądanymi zakłóceniami próbki. Wybierając odpowiedni kompromis, można lepiej zrozumieć wzorce samoorganizacji zespołów supramolekularnych. Protokół ten będzie zatem wykorzystywał podobną konfigurację z DNA 3PS jako system modelowy do optymalizacji parametrów specyficznych dla PORT. Umożliwi to pracę z dużą szybkością obrazowania przy wystarczająco dużych rozmiarach skanów przy jednoczesnej minimalizacji uszkodzeń próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Próbka i

UWAGA: Płytka DNA użyta w tym badaniu to motyw 3-ramiennej gwiazdy opracowany w laboratorium Mao na Uniwersytecie Purdue19,25. Wszystkie oligonukleotydy użyte w tym badaniu zostały zakupione od Integrated DNA Technologies, Inc. Zbierz niezbędne materiały i odczynniki.

  1. Wymieszaj jednoniciowe DNA (ssDNA) w stosunku molowym 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM dla S2 i 1,8 μM dla S3) w buforze do wyżarzania (5 mM TRIS, 1 mM EDTA i 10 mM MgAc2). Końcowe stężenie motywu DNA musi wynosić 0,6 μM (49 ng/μl przy masie cząsteczkowej 3PS wynoszącej 82020,3 g/mol).
  2. Umieścić roztwór DNA w żaroodpornym pojemniku i podgrzać go do temperatury 80 °C. Powoli schładzać roztwór DNA z temperatury 80 °C do 20 °C przez okres 4 godzin. Ten proces wyżarzania pomaga oligonukleotydom ssDNA w tworzeniu pożądanego dwuniciowego motywu DNA.
  3. W celu oczyszczenia załaduj wyżarzony roztwór DNA na 3% żel agarozowy, aby usunąć nadmiar ssDNA i wszelkie niepożądane produkty uboczne. Uruchom 3% żel pod napięciem 60 V przez ok. 2,5 godziny w buforze roboczym zawierającym 0,5x Tris-Borate-EDTA (TBE) i 10 mM Mg(CH3COO)2.
  4. Zidentyfikuj i zlokalizuj opaskę na żelu, która zawiera motyw DNA. Upewnij się, że pasmo zostało przeniesione do określonej pozycji na podstawie jego rozmiaru.
  5. Ostrożnie wyciąć pasmo zawierające motyw DNA z żelu. Ekstrahować motyw DNA z wyciętego fragmentu żelu, umieszczając go w kolumnie wirowej do ekstrakcji żelu i odwirowując w temperaturze 3 000 x g i 4 °C przez 10 minut.
  6. Zastąp bufor w wyekstrahowanym motywie DNA buforem do wyżarzania za pomocą koncentratora odśrodkowego. Odwirować przy 3000 x g w temperaturze pokojowej (lub niższej) do momentu, gdy stężony roztwór będzie mniejszy niż 100 μl. Następnie dodaj 300 μl buforu do wyżarzania i powtórz ten krok dwukrotnie, aby upewnić się, że bufor został wymieniony.
  7. Rozcieńczyć motyw DNA do 6 nM do celów obrazowania. Użyj spektrofotometru lub innych odpowiednich metod, aby dokładnie określić i dostosować stężenie. Motyw DNA jest teraz gotowy do obrazowania.
    UWAGA: Wszystkie w protokole mają pH 8,0. Informacje o sekwencji dla trzech odpowiednich pasm są następujące:
    S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
    AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
    S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
    CGGTAACG
    S3: CGTTACCGTGTGGGGGGCATGCATAGT

2. Wzrost końcówki wspornika

  1. Montaż wspornika na uchwycie wspornikowym SEM: Upewnij się, że wsporniki są czyste i wolne od wszelkich zanieczyszczeń. Zamontuj wsporniki na odpowiednim uchwycie kompatybilnym z systemem SEM. Niestandardowy projekt uchwytu wspornikowego może zostać udostępniony na żądanie.
  2. Wtrysk gazu: Podgrzej gaz prekursorowy (np. prekursor fenantrenu C14H10 do końcówek z węgla amorficznego), który ma być użyty w układzie wtrysku gazu w celu wyhodowania nowej końcówki. Gdy tylko podciśnienie spadnie poniżej 10-5 mbar, przepłucz przewód wtrysku gazu 10 razy przez 2 sekundy, aby upewnić się, że w przewodzie dyszy nie ma niepożądanych resztek powietrza (należy to zrobić przy zamkniętym zaworze do komory pistoletu).
  3. Regulacja położenia końcówki: Użyj skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), aby zlokalizować koniec wspornika. Przechylić uchwyt wspornika pod kątem (np. 11° w tym przypadku) odpowiadającym kątowi, jaki wykaźnik przedstawi po umieszczeniu na uchwycie wspornika AFM w stosunku do powierzchni, tak aby wyrosła końcówka była prostopadła do powierzchni podczas obrazowania. Dostosuj położenie i ostrość SEM, aby uzyskać wyraźny widok na końcówkę wspornika, gdzie będzie rosła ostra nanokońcówka z włókna węglowego.
  4. Zogniskowane osadzanie indukowane wiązką elektronów (FEBID):
    1. Ustaw parametry osadzania w wybranym oprogramowaniu (w tym przypadku SmartFIB), takie jak prąd wiązki (I) i napięcie przyspieszenia (V), odległość robocza (WD), powiększenie, naświetlony kształt, dawka/czas osadzania i czas przebywania. Następujące parametry wykorzystano do wyhodowania amorficznych końcówek węglowych, które wykazują dobre właściwości mechaniczne do obrazowania AFM, prowadząc do długości około 130 nm i promieni w zakresie 2-4 nm:
      Wybierz punktowy/kropkę jako kształt naświetlony
      WD = 5 mm
      I = 78 pA, a V = 5 kV
      Czas przebywania = 1 μs
      Dawka = 0,05 nC, a czas osadzania = 0,64 s
      Powiększenie = 20000x
    2. Rozpocznij proces osadzania w celu wyhodowania końcówki, napromieniowując wiązkę elektronów w miejscu na końcówkę wspornika, jednocześnie wstrzykując gaz prekursorowy, zamykając gaz po zakończeniu osadzania. W takim przypadku oprogramowanie SmartFIB robi to automatycznie po skonfigurowaniu wspomnianej receptury
      3. .
  5. Analiza po wzroście: Wykonaj obrazowanie SEM po wzroście, aby zbadać nowo wyrosłą końcówkę i upewnić się, że jest ona jakościowa i charakterystyczna (promień i długość końcówki). Odczekaj 1-2 minuty po wzroście końcówki, aby upewnić się, że cały gaz prekursorowy został wypompowany, aby uniknąć ponownego osadzania się podczas obrazowania SEM. Wyjąć uchwyt próbki z komory SEM.
  6. Recykling wsporników: W przypadku, gdy system SEM ma również zainstalowaną kombinowaną skupioną wiązkę jonów (FIB), usuń uszkodzoną lub brudną, wcześniej wyhodowaną końcówkę, frezując ją za pomocą systemu FIB przy użyciu niskich prądów FIB (np. 1 pA, aby uniknąć uszkodzenia wspornika). Usuń końcówkę przez frezowanie w kształcie przekroju, od końca końcówki do podstawy, aby uniknąć zapadania się końcówki. Pozwoli to na odhodowanie nowego.

3. Sprzęt HS-AFM

  1. Konfiguracja obrazowania składa się z niestandardowego głowicy PORT5, 26 (Rysunek 1A), szybkiego skanera26 z płytą z próbkami z miką na górze, kompatybilnego kontrolera27, wzmacniacza wysokiego napięcia o dużej przepustowości wymaganej do szybkiego obrazowania, bazy AFM i komputera PC z wymaganym oprogramowaniem do sterowania wyżej wymienionym sprzętem27.
    UWAGA: W tym przypadku są to komponenty typu open source, dla których plany można uzyskać w Laboratorium Bio- i Nano- Instrumentacji pod adresem EPFL27, 28. Możliwe jest również wzięcie udziału w warsztatach na temat budowy głowicy i kontrolera PORT29, a także pobranie i korzystanie z oprogramowania opartego na LabView.
  2. Ostrożnie umieść ultrakrótki wspornik (np. AC10DS lub odpowiednik) pod zaciskiem sprężynowym na uchwycie wspornika za pomocą pęsety. Upewnij się, że wiór wspornikowy jest stały i stabilny.
  3. Dodać 50 μl płynu za pomocą strzykawki przez lewy port dostępu do płynu, jak pokazano na Rysunek 1B. Gdy laser wzbudzający jest nadal wyłączony, ustaw laser odczytu na wsporniku za pomocą trzech dedykowanych pokręteł na głowicy AFM pokazanych na Rysunek 1A. Zrób to, obserwując cień wspornika na białym papierze, maksymalizując sumę (metoda cienia). Następnie wyśrodkuj plamkę lasera na fotodiodzie za pomocą dwóch dedykowanych pokręteł.
  4. Włącz i wyrównaj laser napędowy, zaznaczając pole Włącz wzbudzenie w wzbudzeniu VI, aby uruchamiał i oscylował wspornik. Pokaż sygnał wzbudzenia wspornika i sygnał ugięcia wspornika na podłączonym oscyloskopie. Jeśli oscylacja ugięcia jest zbyt niska (lub nie występuje), może to oznaczać, że laser napędowy jest bardzo daleko od wspornika. W takim przypadku użyj metody cienia i wyłącz laser odchylający, aby ułatwić wyrównanie. Zmaksymalizuj amplitudę oscylacji za pomocą pokręteł regulacji lasera napędowego pokazanych na Rysunek 1A.
  5. Aby wyregulować amplitudę oscylacji wspornika w PORT, wprowadź do odpowiedniego sterowania oprogramowania napięcie międzyszczytowe wysyłane do obwodu sterującego diody laserowej (od teraz wejście AC między szczytami) w wzbudzeniu VI. Aby utrzymać diodę laserową w reżimie przewodzenia, a tym samym laserowania, dodaj napięcie stałe do obwodu sterującego diody laserowej (od teraz wejście offsetu DC), co również odbywa się z pudełka konfiguracyjnego w wzbudzeniu VI. Oba będą miały również wpływ na moc lasera, którą można zmierzyć za pomocą miernika mocy lasera i służy do dostrajania amplitudy oscylacji wspornika.
  6. Określ maksymalną częstotliwość wzbudzenia fototermicznego, którą można przyłożyć do wspornika, która musi być poniżej częstotliwości rezonansowej wspornika. Określ częstotliwość rezonansową za pomocą strojenia termicznego lub przemiatania częstotliwości. Wsporniki użyte w tym badaniu (AC10DS), których częstotliwość rezonansowa w cieczach wynosi około 400 kHz (1 MHz w powietrzu)30, mają quasistatyczny obszar zgięcia poniżej 300 kHz5. W związku z tym należy stosować częstotliwości PORT poniżej tej granicy (około 100-200 kHz).
  7. Dostosuj parametry obrazowania i ustawienia szybkości PORT i szybkości skanowania do wymaganych wartości odpowiednio w Excitation i Scan Vis (parametry użyte w tym artykule są podane w opisach na rysunku). Po skonfigurowaniu ustawień i parametrów obrazowania wykonaj wymagane eksperymenty obrazowania, aby obserwować i śledzić interakcje molekularne.
    UWAGA: Ponieważ wsporniki AC10DS nie są już sprzedawane, może być konieczne użycie alternatywy, takiej jak Fastscan D lub BioLever31, dopóki nie będzie dostępny ich odpowiednik.

4. Uzyskiwanie prawidłowych krzywych interakcji

  1. Początkowo zbliż się do powierzchni próbki w trybie kontaktowym, klikając Start na kontrolerze Z VI ustawionym na Tryb kontaktowy.
    1. W tym trybie końcówka AFM wchodzi w bezpośredni kontakt z próbką. Po osiągnięciu powierzchni wykonaj krzywą siły w funkcji odległości w Rampie VI, aby uzyskać kalibrację czułości ugięcia wspornika.
    2. Należy również oszacować stałą sprężystości wspornika, albo na podstawie specyfikacji dostawcy wspornika (mniej dokładnie), uzyskanej za pomocą interferometru, albo za pomocą kalibracji opartej na dostrojeniu termicznym po kalibracji czułości ugięcia. Precyzyjna kalibracja wspornika jest niezbędna do dokładnej kontroli siły końcówka-próbka.
  2. Po całkowitym schowaniu Z-piezo z powierzchni, do której końcówka nie może dosięgnąć powierzchni, klikając Up w kontrolerze Z VI, przełącz się w tryb PORT w sterowniku Z VI i włącz laser wzbudzenia w polu wyboru Wzbudzenie VI. Aby rozpocząć, ustaw tryb PORT tak, aby działał z żądaną częstotliwością w wzbudzeniu VI, która w tym eksperymentalnym przypadku wynosi 100 kHz, za pomocą wspornika AC10DS.
  3. Nagraj drgania bez wspornika blisko, ale nie dotykając powierzchni. Następnie włącz sprzężenie zwrotne w kontrolerze Z w kontakcie z powierzchnią, aby nagrywać, i kliknij Popraw, aby uzyskać oscylację wspornika, gdy wspornik styka się z powierzchnią, w obu nanometrach. Odejmij krzywą drgań swobodnych od krzywej kontaktu przerywanego, aby uzyskać rzeczywistą krzywą oddziaływania, przekształcając je na pN przy użyciu stałej sprężystości wspornikowej (w tym przypadku 0,1 N/m).

5. Obrazowanie HS-AFM

  1. Przygotować roztwór Mg(CH3COO)2 o stężeniu 10 mM. Za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzyknąć 50 μl przygotowanego roztworu 10 mM Mg(CH3COO)2 do kanału płynnego uchwytu wspornika, tworząc kroplę płynu, która otacza wspornik
    2. .
  2. Stopniowo zbliżaj wspornik do powierzchni, klikając Start na sterowniku Z VI. Po wykryciu powierzchni włącz sprzężenie zwrotne i znajdź szczyt krzywej interakcji w krzywych siły ORT VI. Znajdź najniższą nastawę siły, która umożliwia prawidłowe śledzenie (poniżej 300 pN, aby uniknąć uszkodzenia delikatnych próbek biologicznych).
  3. Ustaw rozmiar skanowania w skanerze Scan VI na 800 nm na 800 nm, a częstotliwość linii na 100 Hz. Zeskanuj powierzchnię, klikając strzałkę Ramka (w dół) w Skanowaniu VI, aby sprawdzić jakość powierzchni. Jeśli zostaną wykryte jakiekolwiek zanieczyszczenia, rozwiąż problem, czyszcząc powierzchnię, wspornik i/lub uchwyt wspornikowy przed kontynuowaniem.
  4. Po zeskanowaniu wycofaj wspornik z powierzchni, klikając przycisk Wycofaj w sterowniku Z VI. Usuń roztwór buforowy z otworu w uchwycie wspornika za pomocą strzykawki Hamiltona, aby zapobiec problemom z martwą objętością.
  5. Przygotuj rozcieńczony roztwór DNA 3PS z części 1 protokołu. Wstrzyknąć 50 μl rozcieńczonego roztworu DNA 3PS do dedykowanego kanału uchwytu wspornikowego.
  6. Rozpocznij proces obrazowania, powtarzając kroki 5.2-5.3, skanując obszar o wymiarach 800 nm na 800 nm z domyślną częstotliwością linii 100 Hz (256 linii × 256 pikseli). Po wstępnym skanowaniu dostosuj rozmiar i szybkość obrazowania w programie Scan VI do określonych wartości w celu dalszego pozyskiwania danych.
  7. Utrzymuj nastawę siły wejściowej interakcji końcówka-próbka w polu nastawy Z Controller VI na najniższym poziomie wymaganym do prawidłowego śledzenia (poniżej 300 pN) przez cały proces obrazowania, aby zminimalizować uszkodzenie/zakłócenie próbki, chyba że określono inaczej. Powtórz ten proces dla wszystkich wymaganych obszarów próbki.

6. Przetwarzanie obrazu

  1. Skonfiguruj środowisko do uruchamiania dostosowanego kodu przetwarzania wsadowego Pygwy (Python for Gwyddion), upewniając się, że Python i wszystkie niezbędne biblioteki. Więcej informacji można znaleźć na stronie Gwyddion32 są poprawnie zainstalowane w systemie. Dzięki temu kod działa płynnie i ma dostęp do wymaganych funkcjonalności.
  2. Otwórz niestandardowy kod przetwarzania wsadowego Pygwy (dostarczony na żądanie). Zapewni to dostęp do narzędzi i funkcjonalności potrzebnych do przetwarzania i analizy obrazu.
  3. Rozpocznij przetwarzanie obrazu, wykonując korekcję poziomej linii mediany na obrazach. Ten krok ma na celu usunięcie wszelkich nieprawidłowości lub artefaktów obecnych w liniach skanowania, zapewniając, że kolejne kroki przetwarzania są oparte na dokładnych danych. Po usunięciu tła płaszczyzny zastosuj korekcję linii. Użyj usuwania blizn, aby jeszcze bardziej uwydatnić obrazy, eliminując wszelkie niechciane ślady lub niedoskonałości spowodowane czynnikami zewnętrznymi. Ten krok poprawia ogólny wygląd wizualny obrazów.
  4. Zwiększ widoczność i kontrast obrazów, dostosowując kolorową mapę wysokości. Dzięki temu interesujące nas cechy są wyraźnie wizualizowane i wyróżniają się na obrazach.
  5. Wybierz przetworzone obrazy, które mają zostać połączone w wideo. Określ żądaną liczbę klatek na sekundę dla wideo. W takim przypadku ustaw go na 7 klatek na sekundę (fps).
  6. Oblicz czas trwania każdej klatki. Użyj Fiji (ImageJ), aby połączyć przetworzone obrazy w wideo. Upewnij się, że liczba klatek na sekundę i czas trwania klatek są prawidłowo ustawione.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu, dzięki możliwościom HS-PORT AFM, pomyślnie zaobserwowano dynamiczny proces składania motywów DNA w formie trójramiennych gwiazd w stabilne wyspy. Technika ta pozwoliła nam uchwycić proces formowania się tych struktur w czasie rzeczywistym. Na Rysunku 2A,B otrzymano wyraźne obrazy przy częstotliwości skanowania linii wynoszącej odpowiednio 100 Hz i 200 Hz, dla częstotliwości PORT 100 kHz (rozmiar skanu 800 nm na 800 nm). Odpowiada to odpowiednio 3,9 i 1,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas obrazowania delikatnych próbek biologicznych tryby obrazowania z opukaniem poza rezonansem w AFM są szczególnie przydatne, ponieważ mogą bezpośrednio kontrolować siły interakcji końcówka-próbka10. Wśród nich tryb PORT wyróżnia się wyższymi szybkościami oscylacji, jakie może osiągnąć, co umożliwia wyższe szybkości skanowania. Ponieważ PORT uruchamia wspornik bezpośrednio i tylko za pomocą lasera, umożliwia wzbudzenie przy znacznie wyższych częstotliwościach niż konwencjonalne tryby gwintowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Autorzy dziękują Raphaelowi Zinggowi za pomoc w programowaniu skryptu Pythona do przetwarzania serii obrazów. GEF potwierdza finansowanie z programu ramowego UE w zakresie badań naukowych i innowacji H2020 (2014-2020); ERC-2017-CoG; InCell; Numer projektu 773091. VC przyjmuje do wiadomości, że projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy grantowej nr 754354 działania "Maria Skłodowska-Curie". Badania te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki w ramach grantu 200021_182562.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AC10DSOlympusBL-AC10FS-A2Wycofane z produkcji 
Biometra Compact XS/SBiometra GmbH846-025-199 Jednostka elektroforezy 
Biometra TRIOBiometra GmbH207072Xtermocykler do wyżarzania
Niestandardowa konfiguracja AFMLaboratorium oprzyrządowania Bio-Nano, Międzywydziałowy Instytut Bioinżynierii, Szkoła Inżynierii, Ecole Polytechnique Fé dé rale LozannaDo uzyskania w Laboratorium Oprzyrządowania Bio-Nano Odczynniki
EDTAITWA5097W buforze do wyżarzania
Laserowy miernik mocyThorlabsPM100DCyfrowy ręczny optyczny  Konsola miernika mocy i energii
Lively 3AP Zasilacz, MP-310Major ScienceMP-310Zasilacz do elektroforezy
MgAc2ABCR GmbHAB544692W buforze do wyżarzania
TBEThermo Scientific327330010Bufor do elektroforezy
TRISBio-Rad1610719W buforze do wyżarzania

Bibliografia

  1. Ando, T. High-speed atomic force microscopy and its future prospects. Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).
  2. Uchihashi, T., Scheuring, S. Applications of high-speed atomic force microscopy to real-time visualization of dynamic biomolecular processes. Biochimica Et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 229-240 (2018).
  3. Eghiaian, F., Rico, F., Colom, A., Casuso, I., Scheuring, S. High-speed atomic force microscopy: Imaging and force spectroscopy. FEBS Letters. 588 (19), 3631-3638 (2014).
  4. Umeda, K., McArthur, S. J., Kodera, N. Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action. Microscopy. 72 (2), 151-161 (2023).
  5. Nievergelt, A. P., Banterle, N., Andany, S. H., Gönczy, P., Fantner, G. E. High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6. Nature Nanotechnology. 13 (8), 696-701 (2018).
  6. Heath, G. R., Scheuring, S. High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules. Nature Communications. 9, 4983(2018).
  7. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy in Biology. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2022).
  8. Fukuda, S., Ando, T. Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes. Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).
  9. Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM. Nature Communications. 11 (1), 5062(2020).
  10. PeakForce Tapping. , Available from: https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html (2023).
  11. Wang, S., Hao, C. Principle and application of peak force tapping mode atomic force microscope. International Conference on Cognitive-based Information Processing and Applications (CIPA 2021). , Springer. Singapore. 671-679 (2022).
  12. Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties. Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).
  13. Rosa-Zeiser, A., Weilandt, E., Hild, S., Marti, O. The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation. Measurement Science and Technology. 8 (11), 1333(1997).
  14. De Pablo, P. J., Colchero, J., Gómez-Herrero, J., Baró, A. M. Jumping mode scanning force microscopy. Applied Physics Letters. 73 (22), 3300-3302 (1998).
  15. Umeda, N., Ishizaki, S., Uwai, H. Scanning attractive force microscope using photothermal vibration. Journal of Vacuum Science & Technology B. 9 (2), 1318-1322 (1991).
  16. Avakyan, N., Conway, J. W., Sleiman, H. F. Long-range ordering of blunt-ended DNA tiles on supported lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 139 (34), 12027-12034 (2017).
  17. Wang, R., Kuzuya, A., Liu, W., Seeman, N. Blunt-ended DNA stacking interactions in a 3-helix motif. Chemical Communications. 46 (27), 4905-4907 (2010).
  18. Parikka, J. M., Sokołowska, K., Markešević, N., Toppari, J. J. Constructing large 2D lattices out of DNA-tiles. Molecules. 26 (6), 1502(2021).
  19. He, Y., Chen, Y., Liu, H., Ribbe, A. E., Mao, C. Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays. Journal of the American Chemical Society. 127 (35), 12202-12203 (2005).
  20. Lipid-DNA Method. , Available from: http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm (2023).
  21. Pyne, A. L. B., et al. Base-pair resolution analysis of the effect of supercoiling on DNA flexibility and major groove recognition by triplex-forming oligonucleotides. Nature Communications. 12 (1), 1053(2021).
  22. Kielar, C., Zhu, S., Grundmeier, G., Keller, A. Quantitative assessment of tip effects in single-molecule high-speed atomic force microscopy using DNA origami substrates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (34), 14336-14341 (2020).
  23. Nievergelt, A. P., et al. Large-range HS-AFM imaging of DNA self-assembly through in situ data-driven control. Small Methods. 3 (7), 1900031(2019).
  24. Caroprese, V., et al. Structural flexibility dominates over binding strength for supramolecular crystallinity. bioRxiv. , (2023).
  25. Welcome to Mao Group. , Available from: https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html (2023).
  26. Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag. 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).
  27. SPM Controller/Software. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/ (2023).
  28. Open Hardware. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/ (2023).
  29. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/ (2023).
  30. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. BioLever. , Available from: https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW (2023).
  31. BioLever. AppNano. , Available from: https://www.appnano.com/product-page/biolever (2023).
  32. Python Scripting. , Available from: http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html (2023).
  33. Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).
  34. Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling. arXiv. , (2023).
  35. Giessibl, F. J. Advances in atomic force microscopy. Reviews of Modern Physics. 75 (3), 949-983 (2003).
  36. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy (AFM). Encyclopedia of Biophysics. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Szybki AFMtryb PORTobrazowanie samoorganizacjiwzbudzanie wspornikaassemblage biomolekularneobrazowanie w czasie rzeczywistymanaliza krzywych siły
Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.