Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Acinetobacter baumannii jest uznawany za trudny patogen Gram-ujemny ze względu na jego powszechną oporność na antybiotyki. Kluczowe jest zrozumienie mechanizmów stojących za tą opornością, aby zaprojektować nowe i skuteczne opcje terapeutyczne. Niestety, nasza zdolność do zbadania tych mechanizmów u A. baumannii jest utrudniona przez niedostatek odpowiednich narzędzi manipulacji genetycznej. W tym miejscu opisujemy metody wykorzystania chromosomalnego systemu opartego na mini-Tn7 w celu osiągnięcia ekspresji genu w pojedynczej kopii w szczepie A. baumannii, który nie ma funkcjonalnych mechanizmów wypływu typu RND. Insercja pojedynczej kopii i indukowalna ekspresja pompy wypływowej są dość korzystne, ponieważ obecność operonów wypływu RND na plazmidach o dużej liczbie kopii jest często słabo tolerowana przez komórki bakteryjne. Co więcej, włączenie rekombinowanych wektorów ekspresyjnych mini-Tn7 do chromosomu zastępczego gospodarza A. baumannii o zwiększonej wrażliwości na wypływ pomaga uniknąć zakłóceń powodowanych przez inne pompy wypływu. System ten jest cenny nie tylko do badania niescharakteryzowanych bakteryjnych pomp wypływowych, ale także do oceny skuteczności potencjalnych inhibitorów ukierunkowanych na te pompy.
Wprowadzenie
Acinetobacter baumannii jest patogenem o najwyższym priorytecie Światowej Organizacji Zdrowia ze względu na jego odporność na wszystkie klasy antybiotyków1. Jest to patogen oportunistyczny atakujący głównie osoby hospitalizowane, ranne lub z obniżoną odpornością. A. baumannii w dużej mierze unika antybiotyków za pomocą pomp wypływowych, z których najistotniejszą jest rodzina eksporterów Resistance-Nodulation-Division (RND)2. Zrozumienie, w jaki sposób te pompy wypływowe działają mechanicznie, pozwoli na opracowanie ukierunkowanych opcji terapeutycznych.
Jednym z pows....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie eksperymentalne
- Oczyść plazmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (plazmid insercyjny, Rysunek 2A) za pomocą interesującego genu.
UWAGA: W tym przypadku interesującym genem jest adeIJK. Końcowe stężenie plazmidu powinno wynosić ≥100 ng/μL. - Oczyść plazmid pomocniczy (pTNS2)9 i plazmid wycinający (pFLP2ab)6 (Rysunek 2B,C, odpowiednio), najlepiej do końcowego stężenia plazmidowego DNA wynoszącego ≥100 ng / μL.
- Przygotuj 50 ml sterylnej ultraczys....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Procedura insercji chromosomalnej trwa łącznie tylko 2 h w ciągu 3 dni do momentu uzyskania wyniku – kolonii rosnących na selektywnym podłożu agarowym (Rysunek 1A-C). Oczekiwana liczba kolonii na płytce po transformacji zależy od szczepu: można zaobserwować od 20-30 do nawet setek kolonii, ponieważ insercja Tn7 w miejscach attTn7 jest specyficzna i wydajna9. Przenoszenie kolonii z płytki po transformacji na podłoża selektywne.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mimo że ta procedura chromosomalnej insercji indukowalnego systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią u A. baumannii jest technicznie prosta i nie jest pracochłonna, istnieje kilka ważnych kroków, które należy podkreślić. Po pierwsze, przygotowanie właściwych komórek musi odbywać się w jak największym stopniu na lodzie, ponieważ komórki stają się kruche podczas wymiany pożywki na lodowatą wodę. Idealnie byłoby, gdyby etapy wirowania odbywały się w temperaturze 4 °C, ale dopuszczalne jest wirowanie w temperaturze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Grant Odkrywczy od Kanadyjskiej Rady Nauk Przyrodniczych i Inżynierii dla AK. Schematy użyte na rysunkach są tworzone za pomocą BioRender.com.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka do PCR 0,2 ml | VWR | 20170-012 | Do preparatów do gotowania kolonii i reakcji PCR |
| 1,5 ml probówki do mikrofuge | Sarstedt | 72-690-301 | Probówki do hodowli ogólnego zastosowania |
| 13 mL, Pyrex | Fisher | 14-957K | Płynne naczynia hodowlane |
| 6x bufor ładujący DNA | Froggabio | LD010 | Żel agarozowy elektroforeza do ładowania próbki barwnik |
| octowy kwas, lodowiec | Fisher | 351271-212 | Składnik buforowy w żelu agarozowym |
| Agar | Bioshop | AGR003 | Stałe podłoże wzrostowe |
| Agaroza | BioBasic | D0012 | Separacja elektroforetyczna produktów reakcji PCR; stosowany w stężeniu 0,8– 2% |
| Jednostka do elektroforezy w żelu agarozowym | Fisher | 29-237-54 | Elektroforeza w żelu agarozowym; rozdzielanie produktów reakcji PCR |
| Karbenicylina | Fisher | 50841231 | Pożywki selektywne |
| Zamknięcia probówek hodowlanych | Fisher | 13-684-138 | Nakrętka ze stali nierdzewnej do probówek hodowlanych 13 ml |
| Zestaw trifosforanu deoksynukleotydu (dNTP) | Biobasic | DD0058 | składnik reakcji PCR; dostarczane jako 100 mM każdy dATP, dCTP, dGTP, dTTP; zmieszane i rozcieńczone przez 10 mM każdy dNTP |
| Sucha kąpiel/grzałka blokowa | Fisher | 88860023 | Cyfrowa sucha łaźnia Isotemp do przygotowania wrzenia |
| Kuwety do elektroporacji | VWR | 89047-208 | Kuwety do elektroporacji 2 mm z okrągłą nasadką |
| Elektroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz Elektroporator |
| Bromek etydyny | Fisher | BP102-1 | Wizualizacja produktów reakcji PCR i markera DNA w żelu agarozowym |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Składnik buforowy w żelu agarozowym |
| Gentamycyna | Biobasic | GB0217 | Do przygotowania pożywek selektywnych |
| Glicerol | Fisher | G33 | Przygotowanie zapasów bakterii do długotrwałego przechowywania w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze |
| Inkubator (wytrząsanie) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Wytrząsarka do wzrostu płynnych kultur |
| Inkubator (statyczny) | Fisher | 11-690-550D | Piec do inkubatora izotemperaturowego Model 550D do wzrostu kultur stałych (agar LB) |
| Pętla inokulacyjna | Sarstedt | 86.1562.050 | Smugi kolonii na płytkach agarowych |
| Rozsiewacz inokulacji | Sarstedt | 86.1569.005 | Rozprzestrzenianie hodowla na płytkach agarowych |
| Rosół lizogeniczny (LB), Lennox | Fisher | BP1427 | Płynna pożywka wzrostowa (20 g/l: 5 g/l chlorku sodu, 10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego) |
| Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 do wirowania próbek |
| Miniwirówka | Fisher | S67601B | Wirowanie 0,2 ml probówek PCR |
| Szalki Petriego | SPL Nauki przyrodnicze | 10090 | Do stałych pożywek wzrostowych (płytki agarowe): 90 x 15 mm |
| Pipety | Mandel | Różne | pipety jednokanałowe Gilson (P10, P20, P200, P1000) |
| Zasilanie | Biorad | 1645050 | PowerPac Podstawowy zasilacz do elektroforezy |
| Startery Składnik | IDT | NA | PCR; specyficzny dla genu będącego przedmiotem zainteresowania; przygotowany w temperaturze 100 μ M zgodnie z zaleceniami w karcie specyfikacji produktu |
| Sacharoza | BioBasic | SB0498 | Do przygotowania pożywek przeciwselektywnych do usuwania plazmidu pFLP2ab z transformowanego A. baumannii |
| Taq DNA polimeraza | FroggaBio | T-500 | Składnik reakcji PCR; polimeraza dostarczana z 10x buforem |
| Termocykler | Biorad | 1861096 | Model T100 do PCR |
| Wykałaczki | Fisher | S24559 | Do łatania kolonii na płytkach agarowych |
| Baza Trizma | Sigma | T1503 | Składnik buforowy w żelu agarozowym |
| Woda ultraczysta | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ: ultra czysta woda do przygotowania pożywek i roztworów oraz mycia komórek |
| Szeroki zakres markerów DNA | Biobasic | M103R-2 | Oznaczanie wielkości produktów PCR na żelu agarozowym |
| Drewniane patyczki do zaszczepiania | Fisher | 29-801-02 | Zaszczepianie kultur koloniami z płytek agarowych |
Bibliografia
- Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
- Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acineto....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
