Artykuł metodologiczny

Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66471

⸱

5 stycznia 2024

 , 
1Department of Microbiology, University of Manitoba

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Streszczenie

Acinetobacter baumannii jest uznawany za trudny patogen Gram-ujemny ze względu na jego powszechną oporność na antybiotyki. Kluczowe jest zrozumienie mechanizmów stojących za tą opornością, aby zaprojektować nowe i skuteczne opcje terapeutyczne. Niestety, nasza zdolność do zbadania tych mechanizmów u A. baumannii jest utrudniona przez niedostatek odpowiednich narzędzi manipulacji genetycznej. W tym miejscu opisujemy metody wykorzystania chromosomalnego systemu opartego na mini-Tn7 w celu osiągnięcia ekspresji genu w pojedynczej kopii w szczepie A. baumannii, który nie ma funkcjonalnych mechanizmów wypływu typu RND. Insercja pojedynczej kopii i indukowalna ekspresja pompy wypływowej są dość korzystne, ponieważ obecność operonów wypływu RND na plazmidach o dużej liczbie kopii jest często słabo tolerowana przez komórki bakteryjne. Co więcej, włączenie rekombinowanych wektorów ekspresyjnych mini-Tn7 do chromosomu zastępczego gospodarza A. baumannii o zwiększonej wrażliwości na wypływ pomaga uniknąć zakłóceń powodowanych przez inne pompy wypływu. System ten jest cenny nie tylko do badania niescharakteryzowanych bakteryjnych pomp wypływowych, ale także do oceny skuteczności potencjalnych inhibitorów ukierunkowanych na te pompy.

Wprowadzenie

Acinetobacter baumannii jest patogenem o najwyższym priorytecie Światowej Organizacji Zdrowia ze względu na jego odporność na wszystkie klasy antybiotyków1. Jest to patogen oportunistyczny atakujący głównie osoby hospitalizowane, ranne lub z obniżoną odpornością. A. baumannii w dużej mierze unika antybiotyków za pomocą pomp wypływowych, z których najistotniejszą jest rodzina eksporterów Resistance-Nodulation-Division (RND)2. Zrozumienie, w jaki sposób te pompy wypływowe działają mechanicznie, pozwoli na opracowanie ukierunkowanych opcji terapeutycznych.

Jednym z powszechnych sposobów na rozróżnienie procesów komórkowych jest manipulacja genetyczna. Jednak narzędzia dostępne do badań genetycznych A. baumannii są ograniczone, a aby jeszcze bardziej zagmatwać projekt eksperymentalny, izolaty kliniczne często są oporne na antybiotyki rutynowo stosowane do selekcji w manipulacjach genetycznych3. Drugą przeszkodą napotkaną podczas badania pomp wypływowych jest to, że są one ściśle regulowane - często przez nieznane czynniki - co utrudnia dokładne wyizolowanie i przypisanie funkcji do jednej pompy4. Widząc tę potrzebę rozszerzenia zestawu narzędzi badawczych, opracowaliśmy oparty na mini-Tn7, indukowany system ekspresji z pojedynczą kopią, który zawiera kasetę celu rekombinazy Flp (FRT), która pozwala na usunięcie znacznika wyboru5,6,7 (Rysunek 1). Po raz pierwszy stworzony dla Pseudomonas8,9,10, ten elegancki system klonowania i wyrażania został użyty do wygenerowania jednokopijnych uzupełnień pompy wypływu do szczepu A. baumannii z niedoborem pompy odpływowej RND (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: dalej określane jako A. baumannii AB258), które wygenerowaliśmy11. Będąc w stanie badać jedną pompę wypływową na raz i nie przytłaczać komórek bakteryjnych ekspresją o wysokiej liczbie kopii (jak to zwykle obserwuje się w przypadku systemów ekspresyjnych opartych na plazmidach), można lepiej poznać krytyczne, fizjologiczne aspekty każdej pompy wypływowej przy minimalnej ingerencji i zmniejszonych powikłaniach.

Ten artykuł opisuje, jak za pomocą systemu mini-Tn7 uzupełnić usunięty gen będący przedmiotem zainteresowania, RND efflux pump adeIJK, do chromosomu A. baumannii AB258 poprzez serię nieskomplikowanych kroków wykonywanych w ciągu 9 dni7. Pierwszy zestaw kroków ponownie wprowadza usunięte geny pompy wypływowej sklonowane do plazmidu insercyjnego opartego na mini-Tn7 (Figura 2A) w miejscu insercji pojedynczego attTn7 za dobrze zachowanym genem glmS (Figura 3A). Proces ten jest ułatwiony przez niereplikacyjny plazmid pomocniczy (Figura 2B), który koduje geny transpozazy potrzebne do insercji sterowanej Tn7. Drugi zestaw kroków wykorzystuje plazmid wycinający (Figura 2C) do usuwania genu gentamycyny za pośrednictwem rekombinazy Flp otoczonego miejscami FRT (Figura 3B) w celu stworzenia nieoznaczonego szczepu. Chociaż system ten jest używany do wyjaśnienia podstawowych ról i możliwych inhibitorów pomp odpływowych RND w odniesieniu do oporności na antybiotyki, może być wykorzystany do zbadania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Protokół

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Oczyść plazmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (plazmid insercyjny, Rysunek 2A) za pomocą interesującego genu.
    UWAGA: W tym przypadku interesującym genem jest adeIJK. Końcowe stężenie plazmidu powinno wynosić ≥100 ng/μL.
  2. Oczyść plazmid pomocniczy (pTNS2)9 i plazmid wycinający (pFLP2ab)6 (Rysunek 2B,C, odpowiednio), najlepiej do końcowego stężenia plazmidowego DNA wynoszącego ≥100 ng / μL.
  3. Przygotuj 50 ml sterylnej ultraczystej wody i 25 ml sterylnego bulionu LB (Lennox) (patrz tabela materiałów).
  4. Przygotuj co najmniej 10 funtów płytek agarowych, każda z następującymi dodatkami: zwykła (bez dodatków), gentamycyna (Gm) w stężeniu 50 μg/ml, karbenicylina (Cb) w stężeniu 200 μg/ml (do wyboru za pomocą genu oporności na ampicylinę) i 5% sacharozy (patrz tabela materiałów).
  5. Szczep przeznaczony do wprowadzenia należy rozprowadzić na agarze LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin. W tym przypadku stosuje się A. baumannii AB258.
    UWAGA: Ten protokół musi być wykonywany w jak największym stopniu w sterylnym środowisku przy użyciu palnika Bunsena na stole lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie materiały eksploatacyjne (końcówki do pipet, pętle do zaszczepiania, probówki do mikrofug itp.) muszą być sterylne.

2. Przygotowanie kultury

  1. Zaszczepić pojedynczą kolonię A. baumannii AB258 w 4 ml bulionu LB w sterylnej probówce hodowlanej o pojemności 13 ml za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania lub sterylnego drewnianego patyczka do zaszczepiania.
    UWAGA: Pojedyncza hodowla o pojemności 4 ml jest używana do jednej próbki i jednej kontroli. Zwiększ liczbę kultur w zależności od liczby potrzebnych próbek.
  2. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (250 obr./min).
  3. Umieść butelkę sterylnej wody destylowanej (25-50 ml) w temperaturze 4 °C na noc do użycia w kroku 3.

3. Przygotowanie ogniw elektrokompetentnych

  1. Umieść wszystkie sterylne probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml (po dwie na kulturę) i sterylne kuwety do elektroporacji (dwie na kulturę) na lodzie (patrz tabela materiałów). Próbki należy utrzymywać na lodzie tak długo, jak to możliwe przez cały czas trwania procedury.
  2. Butelkę ze sterylną wodą, która była przechowywana w temperaturze 4 °C, umieścić na lodzie.
  3. Przenieś 1,5 ml nocnej kultury bakteryjnej do jednej z probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
  4. Wirować przy 13 000 x g przez 2 minuty w celu osadzenia komórek.
    UWAGA: Najlepiej byłoby odwirować w temperaturze 4 °C, ale wirowanie w temperaturze otoczenia jest dopuszczalne i nie jest szkodliwe.
  5. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml usunąć cały supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  6. Dodaj kolejne 1,5 ml kultury bakteryjnej do tej samej probówki do mikrofuge. Wirować przy 13 000 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć cały supernatant.
  7. Powtórzyć krok 3.6 po raz ostatni z pozostałym 1 ml hodowli.
  8. Dodaj 1 ml lodowatej sterylnej wody do osadu komórkowego i zawieś go ponownie, delikatnie pipetując, aż osad przestanie znajdować się na dnie probówki do mikrofuge.
  9. Odwirować zawieszone komórki przy 13 000 x g przez 2 minuty.
  10. Ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Nie wylewać supernatantu, zwłaszcza w kolejnych etapach mycia, gdy komórki mają tendencję do tworzenia mniej zwartych granulek.
  11. Powtórz ten krok mycia lodowatą sterylną wodą, kroki od 3.8 do kroku 3.10, jeszcze dwa razy.
  12. Delikatnie zawieś ostatnią osadkę komórkową w 200 μl lodowatej sterylnej wody.
  13. Przenieś 100 μl końcowej zawiesiny komórek do drugiej lodowatej probówki o pojemności 1,5 ml. Ta druga podwielokrotność stanie się kontrolą ujemną dla elektroporacji. Próbki komórek należy przechowywać na lodzie.

4. Elektroporacja

  1. Wstępnie podgrzać 1 ml bulionu LB i jedną płytkę agarową LB + Gm50 (przygotowaną w kroku 1.4) dla każdej próbki i kontroli w inkubatorze statycznym ustawionym na 37 °C.
  2. W łącznej objętości 5 μl lub mniejszej dodać 100-200 ng każdego z plazmidów pomocniczych pTNS2 i plazmidu insercyjnego pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK do podwielokrotności komórek elektrokompetentnych.
  3. Wymieszaj delikatnym stukaniem opuszkami palców, aby zapewnić całkowite wymieszanie plazmidów z komórkami elektrokompetentnymi bez wprowadzania pęcherzyków.
  4. Dodać równoważną objętość sterylnej wody destylowanej do podwielokrotności komórek kontroli ujemnej i delikatnie wymieszać, jak powyżej.
  5. Próbki należy inkubować na lodzie przez 20 minut.
  6. Przenieś całą próbkę ogniw do lodowatej kuwety do elektroporacji, a następnie umieść kuwetę z powrotem na lodzie. Powtórzyć te czynności dla próbki z komórki kontroli ujemnej.
  7. Elektroporować próbkę ogniwa.
    1. Włącz elektroporator i ustaw go na 2,0 kV (25 μF, 200 Ω) (patrz tabela materiałów).
    2. Przetrzyj powierzchnię kuwety miękką chusteczką, aby usunąć przylegający lód lub wilgoć.
    3. Włóż kuwetę do elektroporatora i dostarcz porażenie prądem.
    4. Natychmiast dodaj 0,9 ml wstępnie podgrzanego bulionu LB do komórek w kuwecie i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać komórki z podłożem.
    5. Przenieś całą zawiesinę komórek do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml (temperatura pokojowa).
    6. Sprawdź wartość stałej czasowej na elektroporatorze; aby uzyskać najlepsze wyniki, wartość ta powinna mieścić się w przedziale od 4 do 6.
  8. Powtórzyć procedurę elektroporacji (etapy od 4.7.1 do 4.7.6) dla próbki ogniwa kontroli ujemnej.
  9. Próbki poddane elektroporacji należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy prędkości 250 obr./min, aby umożliwić regenerację komórek.
  10. Za pomocą rozsiewacza do zaszczepiania rozprowadź 100 μl każdej elektroporowanej próbki komórek na wstępnie podgrzanej płytce agarowej LB + Gm50.
    1. Pozostałe próbki należy odwirować przy 13 000 x g przez 2 minuty w celu osadzenia komórek.
    2. Po usunięciu całego supernatantu za pomocą pipety, ponownie zawiesić komórki w 100 μl bulionu LB.
    3. Rozłóż każdą całą próbkę na pojedynczych, wstępnie ogrzanych płytkach agarowych LB + Gm50.
      UWAGA: Wydajność elektroporacji może być zależna od odkształcenia. Podczas elektroporowania szczepu po raz pierwszy, pouczające może być nałożenie różnych objętości, a nawet rozcieńczeń próbki do elektroporacji, aby upewnić się, że powstałe płytki mają izolowane kolonie.
  11. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.

5. Wybór przekształconych kolonii do badań przesiewowych opartych na PCR

  1. Sprawdź płytki elektroporacyjne. Kontrola ujemna nie powinna mieć żadnych kolonii; Próbka powinna mieć odrębne kolonie.
    UWAGA: Płytki z koloniami, na tym etapie i na wszystkich kolejnych etapach, na których produkowane są płytki agarowe z koloniami lub łatami, mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni przed kontynuacją.
  2. Za pomocą sterylnych wykałaczek zbierz do 10 pojedynczych kolonii z płytek agarowych LB + Gm50 i nałóż je na świeżą płytkę agarową LB + Gm50.
  3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.

6. Weryfikacja insercji chromosomów metodą PCR kolonii

  1. Wyjmij z inkubatora płytki agarowe LB + Gm50 zawierające załatane kolonie.
  2. Za pomocą sterylnej wykałaczki lub sterylnej końcówki do pipet usuń niewielką porcję (mniej więcej wielkości dużej kolonii) z plastra do 20 μl sterylnej wody destylowanej w probówce PCR o pojemności 0,2 ml; dobrze wymieszaj. Próbka wody powinna stać się widocznie mętna, gdy komórki zostaną uwolnione z wykałaczki. Należy przygotować dowolną liczbę próbek, które należy poddać badaniom przesiewowym, ale 6 powinno wystarczyć.
  3. Probówkę do PCR zawierającą zawiesinę bakteryjną inkubować w temperaturze 100 °C przez 5-10 minut.
  4. Za pomocą miniwirówki (patrz tabela materiałów) wirować próbkę z ustaloną maksymalną prędkością przez 2 minuty, aby osadzać resztki komórkowe.
  5. Przenieść supernatant do nowej probówki do PCR o pojemności 0,2 ml i umieścić ją na lodzie. Ta próbka zawiera matrycę DNA do reakcji PCR.
    UWAGA: Ta matryca DNA może być przechowywana w temperaturze -20 °C przed przystąpieniem do PCR.
  6. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR zawierającą 1x bufor polimerazy, 200 μM dNTP, 0,18 μM ABglmS2_F_New startera do przodu, 0,18 μM startera odwrotnego Tn7R (Tabela 1), 1 U polimerazy DNA Taq i 1 μL przygotowanego DNA matrycy w całkowitej objętości 25 μL. Przygotować kontrolę bez matrycy (NTC), w tym wszystkie z wyjątkiem matrycowego DNA (zob. tabela materiałów).
  7. Wprowadzić warunki reakcji do termocyklera: 95 °C przez 2 minuty, 95 °C przez 30 s, 49 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, co daje łącznie 35 cykli; 72 °C przez 10 minut; 12 °C trzymanie. Uruchom przykłady.
  8. Po dodaniu barwnika ładującego DNA do końcowego stężenia 1x, załaduj 10 μl każdej reakcji PCR na 2% żel agarozowy i uruchom pod napięciem 80 V przez 40 minut. Oczekiwany rozmiar amplikonu dla tej pary starterów wynosi 382 pz. NTC nie powinien mieć żadnych pasm.
  9. Zidentyfikuj próbki, z których wytworzył się oczekiwany produkt PCR. Przygotować płytkę smugową na płytkach agarowych LB + Gm50 z dowolnego plastra PCR-dodatniego; inkubować w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin. Celem jest wygenerowanie płytki z pojedynczymi koloniami w celu przygotowania materiału glicerolowego w celu zachowania tego oznaczonego szczepu i jako punkt wyjścia do stworzenia nieoznaczonego szczepu (opisanego poniżej).

7. Usunięcie znacznika GmR za pomocą pFLP2ab

  1. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2: Przygotowanie kultury. Próbka użyta do przygotowania kultury przez noc to pojedyncza kolonia z płytek agarowych LB + Gm50 przygotowanych w celu wytworzenia dyskretnych kolonii w kroku 6.9.
  2. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3: Przygotowanie ogniw elektrokompetentnych. Przygotuj komórki z hodowli przez noc do elektroporacji.
  3. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4: Elektroporacja. W tym przypadku plazmidem, który należy wprowadzić do komórek, jest pFLP2ab (100-200 ng), który usunie gen oporności na gentamycynę, otaczając interesujący nas gen wstawiony chromosomalnie.
  4. Po odzyskaniu komórek przez 1 godzinę (krok 4.9), rozprowadź 100 μl elektroporowanej próbki ogniwa na wstępnie podgrzanej płytce agarowej LB + Cb200 (przygotowanej w kroku 1.4). To selektywne ciśnienie zapewnia, że tylko komórki zawierające plazmid wycinający pFLP2ab będą rosły.
  5. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.
  6. Sprawdź, czy na płytce nie ma kolonii. Na płytce kontroli ujemnej nie powinno znajdować się żadne kolonie; Płytka z próbką agaru LB + Cb200 powinna mieć odrębne kolonie.
  7. Za pomocą sterylnych wykałaczek nałóż krzyżowo do 20 izolowanych kolonii na płytkę agarową LB + Cb200 i płytkę agarową LB + Gm50.
  8. Inkubować płytki przez 16-18 godzin w temperaturze 37 °C.
  9. Sprawdź, czy na tabliczkach nie ma poprawek. Klony, które rosną na płytce agarowej LB + Cb200, ale nie na płytce agarowej LB + Gm50, mają usunięty gen oporności na gentamycynę z oryginalnej wkładki.
  10. Wybierz plastry, które są odporne na karbenicylinę i gentamycynę podatną na smugi na poszczególnych płytkach agarowych LB uzupełnionych 5% (w/v) sacharozy, co wymusza wydalenie plazmidu pFLP2ab z bakterii. Wybierz do 10 kolonii.
  11. Inkubować płytki przez 16-18 godzin w temperaturze 37 °C.
  12. Sprawdź płytki pod kątem kolonii.
  13. Jako ostateczne potwierdzenie utraty plazmidu pFLP2ab, należy nakroć krzyżowo 4-6 izolowanych kolonii z 5% płytek sacharozy na płytkę agarową LB + Cb200 i płytkę agarową LB
    14. .
  14. Inkubować płytki przez 16-18 godzin w temperaturze 37 °C.
  15. Wybierz klon, który rośnie na płytce agarowej LB i który jest wrażliwy na karbenicylinę, aby przygotować bulion glicerolowy, aby zachować ten nieoznaczony szczep.
    1. Weryfikację genetyczną nieoznakowanego szczepu można przeprowadzić za pomocą PCR kolonii (krok 6: Weryfikacja insercji chromosomów przez PCR kolonii) przy użyciu starterów, które są ukierunkowane na gen oporności na gentamycynę.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR zawierającą 1x bufor polimerazy, 200 μM dNTP, 0,18 μM Gm_F startera do przodu, 0,18 μM Gm_R startera odwrotnego (Tabela 1), 1 U polimerazy DNA Taq i 1 μL przygotowanej matrycy DNA w całkowitej objętości 25 μL. Przygotować kontrolę bez matrycy (NTC) zawierającą wszystkie oprócz matrycowego DNA, oraz kontrolę pozytywną z wykorzystaniem DNA ze znakowanego szczepu.
    3. Wprowadzić warunki reakcji do termocyklera: 95 °C przez 2 minuty, 95 °C przez 30 s, 50 °C przez 30 s i 72 °C przez 40 s, co daje łącznie 35 cykli; 72 °C przez 10 min; 12 °C trzymanie. Uruchom przykłady.
    4. Po dodaniu barwnika ładującego DNA do końcowego stężenia 1x, załaduj 10 μl każdej reakcji PCR na 1% żel agarozowy i pracuj pod napięciem 80 V przez 40 minut. Oczekiwany rozmiar amplikonu dla tej pary starterów wynosi 525 pz. Kontrola dodatnia powinna mieć pojedynczy pasek; próbki i NTC nie powinny mieć pasm.

Wyniki

Procedura insercji chromosomalnej trwa łącznie tylko 2 h w ciągu 3 dni do momentu uzyskania wyniku – kolonii rosnących na selektywnym podłożu agarowym (Rysunek 1A-C). Oczekiwana liczba kolonii na płytce po transformacji zależy od szczepu: można zaobserwować od 20-30 do nawet setek kolonii, ponieważ insercja Tn7 w miejscach attTn7 jest specyficzna i wydajna9. Przenoszenie kolonii z płytki po transformacji na podłoża selektywne (Rysunek 4A) pozwala na zachowanie przekształconego szczepu i dostarcza materiału wyjściowego do przesiewania kolonii metodą PCR (Rysunek 1E oraz Rysunek 4B). Przesiewanie kolonii za pomocą PCR można ograniczyć do minimum – nie więcej niż 10 kolonii wymaga obróbki, a większość z nich powinna dać pozytywny wynik insercji. Produkt PCR dla starterów przesiewowych, ABglmS2_F_New i Tn7R (Tabela 1), ma wielkość 382 bp (Rysunek 4B ścieżka 4); kontrole negatywne dla reakcji obejmują szczep dziki A. baumannii ATCC 17978 (Rysunek 4B ścieżka 2), AB258 (Rysunek 4B ścieżka 3) oraz brak matrycy (Rysunek 4B ścieżka 5). Kolonie PCR-pozytywne reprezentują komplementowane, znakowane szczepy.

Usunięcie genu oporności na gentamicin (usuwanie markera) trwa mniej niż 3 h, jednak cały proces zajmuje 6 dni, ponieważ komórki transformowane plazmidem wycinającym muszą zostać wyselekcjonowane poprzez wysiew na podłoża selekcyjne, a następnie plazmid wycinający musi zostać usunięty z bakterii (Rysunek 1F). Wycinanie oparte na rekombinacji Flp-FRT jest precyzyjne i skuteczne i powinno skutkować powstaniem ≥20 kolonii na płytce po transformacji. Kolonie przeniesione metodą cross-patching na podłoża z karbenicyliną (selekcja oporności na β-laktamy nadawanej przez plazmid wycinający) oraz z gentamicinem (poszukiwanie utraty oporności na gentamicin) powinny być odpowiednio wszystkie oporne na karbenicylinę i wrażliwe na gentamicin. Plazmid wycinający jest usuwany z bakterii poprzez wzrost na płytkach agarowych z 5% sacharozą. Wzrost na sacharozie wymusza eliminację pFLP2ab, ponieważ gen sacB na plazmidzie sprzyja przekształcaniu sacharozy w lewany, polisacharydy toksyczne dla bakterii12,13. Wszystkie kolonie rosnące na podłożu z 5% sacharozą powinny następnie rosnąć wyłącznie na zwykłych płytkach agar LB; na płytkach z agarem z karbenicyliną nie powinno być wzrostu. Kolonie rosnące na zwykłych płytkach agar LB reprezentują szczepy pozbawione markera. Potwierdzenie utraty markera gentamicin można przeprowadzić za pomocą colony PCR z użyciem starterów Gm_F i Gm_R (Tabela 1 oraz Rysunek 5). Ta para starterów generuje amplikon o długości 525 bp tylko w kontroli pozytywnej (początkowo stworzony szczep z markerem, Rysunek 5 ścieżka 4); szczep dziki ATCC 17978 (Rysunek 5 ścieżka 2), AB258 (Rysunek 5 ścieżka 3), każda przetestowana kolonia (Rysunek 5 ścieżka 5) oraz kontrola bez matrycy (Rysunek 5 ścieżka 6) nie powinny wykazywać amplifikacji.

Po potwierdzeniu uzyskania szczepu nieoznakowanego można rozpocząć testy funkcjonalne za pomocą analizy fenotypowej. W tym przypadku oczywistym pierwszym krokiem jest oznaczenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla szeregu antybiotyków: cyprofloksacyna jest znanym substratem AdeIJK, tetracyklina może być usuwana przez AdeIJK (główną pompą efflux jest AdeAB), a kanamycyna wykazuje stosunkowo niewielki wpływ na A. baumannii ATCC 179782,14. Stosując metodę mikrorozcieńczeń w bulionie zgodnie z wytycznymi CLSI15, poddano uzupełniony nieoznakowany szczep AB258::adeIJK działaniu każdego antybiotyku w obecności i przy braku 50 µM IPTG; jako kontrole uwzględniono szczep typu dzikiego ATCC 17978 oraz szczep AB258 z defektem pompy efflux RND (Tabela 2). Ogólnie rzecz biorąc, trend widoczny w wartościach MIC potwierdza oczekiwany rezultat – zmniejszoną wrażliwość szczepu AB258::adeIJK na cyprofloksacynę i tetracyklinę przy indukowanej ekspresji pompy efflux, co weryfikuje pomyślność insercji adeIJK.

Schemat edycji genomu bakteryjnego z metodą PCR, kontrolą temperatury i wynikami znakowania szczepu.
Rysunek 1: Przegląd procedury. (A) Przygotowanie nocnej hodowli szczepu A. baumannii do komplementacji. (B) Komórki z nocnej hodowli są płukane wodą 3 razy via wirowanie i przechowywane w lodzie. (C) Do komórek dodaje się plazmidy dostarczające i pomocnicze, a następnie inkubuje w lodzie przez 20 min. Próbkę poddaje się elektroporacji, dodaje pożywkę LB i pozwala komórkom na regenerację przez 1 h w 37 °C. Alikwot 100 µL komórek wysiewa się na płytki agarowe LB + Gm50 i inkubuje w 37 °C przez noc. (D) Kolonie z płytki po transformacji przenosi się na płytkę agarową LB + Gm50 i hoduje przez noc w 37 °C. (E) Przeniesione kolonie przygotowuje się do PCR w celu przesiewowego wykrycia produktu amplifikacji obejmującego miejsce insercji chromosomowej. Amplifikację PCR wizualizuje się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Próbki PCR-dodatnie świadczą o pomyślnej insercji interesującego genu do chromosomu i utworzeniu szczepu znakowanego. (F) Kolonię dodatnią pod kątem gentamycyny przygotowuje się zgodnie z krokami (A-C), przeprowadzając elektroporację plazmidem pLFP2ab w celu usunięcia kasety gentamycynowej z insercji chromosomowej. Selektywne wysiewanie na agar LB + Cb200 potwierdza pobranie plazmidu. Podwójne przeniesienie na płytki agarowe LB + Cb200 i LB + Gm50 ujawnia kolonie CbR i GmS, co potwierdza utratę kasety gentamycynowej z insercji. Wzrost wybranych kolonii CbR na 5% sacharozy powoduje utratę plazmidu pLFP2ab z komórek. Kolonie z płytki z 5% sacharozą przenosi się na agar LB + Cb200 i agar LB, aby zidentyfikować pożądane kolonie CbS i GmS oraz potwierdzić utworzenie szczepu nieznakowanego. Gm50, gentamycyna 50 µg/mL; Cb200, karbenycylina 200 µg/mL; R, oporny; S, wrażliwy. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat plazmidów przedstawiający plazmidy insercyjne, pomocnicze i ekscyzyjne do modyfikacji genetycznych.
Rysunek 2: Plazmidy użyte w tym protokole. Ogólne mapy plazmidów (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (plazmid insercyjny), (B) pTNS2 (plazmid pomocniczy) i (C) pFLP2ab (plazmid ekscyzyjny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Edycja genów za pomocą plazmidów; schemat przedstawia procesy insercji i ekscyzji w Acinetobacter baumannii.
Rysunek 3: Schemat insercji i usuwania markera. (A) Insercja. Pojedyncza witryna insercyjna Tn7 w chromosomie A. baumannii znajduje się 24 bp od końca genu glmS2. Współelektroporacja plazmidu insercyjnego i plazmidu pomocniczego umożliwia komplementację genu zainteresowania (gen wstawiony, fioletowy) wraz z resztą kasety insercyjnej (witryny FRT do ekscyzji markera, żółte; gen accC1 odpowiedzialny za oporność na gentamicinę, zielony; gen lacIq odpowiedzialny za ekspresję indukowalną, niebieski) do chromosomu. (B) Usuwanie markera. Elektroporacja komplementowanego, znakowanego szczepu insercyjnego za pomocą plazmidu ekscyzyjnego pFLP2ab umożliwia usunięcie genu oporności na gentamicinę (accC1, zielony) via rekombinację Flp-FRT (witryny FRT, żółte), co prowadzi do powstania szczepu nieznakowanego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Transformacja bakteryjna: szalka Petri z koloniami; elektroforeza żelowa z drabiną DNA; schemat mapowania genów.
Rysunek 4: Transformacja, przenoszenie kolonii i potwierdzenie insercji za pomocą PCR kolonii. Reprezentatywny wynik (A) wzrostu kolonii po transformacji i przeniesieniu oraz (B) amplifikacji PCR kolonii z użyciem starterów ABglmS_F_New (szary) i Tn7R (pomarańczowy) w celu potwierdzenia insercji chromosomalnej. Ścieżka 1: drabina DNA o niskiej masie cząsteczkowej; ścieżka 2: ATCC 179798; ścieżka 3: AB258; ścieżka 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; ścieżka 5: kontrola bez matrycy. Oznaczono oczekiwany prążek o wielkości 382 bp. Należy zauważyć, że do potwierdzenia insercji chromosomalnej można było również użyć starterów specyficznych dla gentamycyny (Gm_F i Gm_R, zielone). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat edycji genów z elektroforezą żelu DNA, przedstawiający weryfikację wstawionego genu przy 525 bp.
Rysunek 5Potwierdzenie utraty markera za pomocą PCR kolonii. Reprezentatywny wynik amplifikacji metodą colony PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla gentamycyny (Gm_F i Gm_R) w celu potwierdzenia utraty markera antybiotykowego poprzez pFLPab-wycinanie. Ścieżka 1: drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowej; Ścieżka 2: ATCC 179798; Ścieżka 3: AB258; Ścieżka 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; ścieżka 5: AB258::adeIJK; Ścieżka 6: kontrola bez matrycy. Oznaczono oczekiwany prążek o wielkości 525 bp. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Szczepy, plazmidy i primeryIstotne charakterystykiBibliografia
Barwienie
*A. baumannii* ATCC 17978Szczep typowyATCC
*A. baumannii* ATCC 17978 AB258ΔadeAB,ΔadeFGH,ΔadeIJK11
Plazmidy
pUC18T-miniTn7T-Gm-LACGmR, AmpR9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJKGmR, AmpR, adeIJKNiniejsze badanie
pTNS2AmpR9
pFLP2abreplikacyjna sekwencja startowa pWH1266, sacB, AmpR7
StarterySekwencja (5′–3′)
ABglmS_F_NowyCACAGCATAACTGGACTGATTTC7
Tn7RTATGGAAGAAGTTCAGGCTC7
Gm_FTGGAGCAGCAACGATGTTACNiniejsze badanie
Gm_RTGTTAGGTGGCGGTACTTGGNiniejsze badanie

Tabela 1: Szczepy bakteryjne, plazmidy i primery użyte w tym protokole. Gm, gentamicyna; Amp, ampicylina; R, oporność.

CyprofloksacynaTetracyklinaKanamycyna
IPTG−+−+−+
ATCC 179780.250nd0.500nd1.5nd
AB2580.031nd0.063nd4nd
AB258::adeIJK0.0160.0630.0310.12582
Krotność zmiany4.014.030.25

Tabela 2: Testowanie funkcjonalności wprowadzonych genów poprzez podatność na antybiotyki. Porównanie wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla A. baumannii ATCC 17978, AB258, nieindukowanego AB258::adeIJK oraz indukowanego IPTG AB258::adeIJK przeciwko cyprofloksacynie, tetracyklinie i kanamycynie. Krotność zmiany = indukowany (+ IPTG)/nieindukowany (− IPTG); nd = nieoznaczone.

Dyskusja

Mimo że ta procedura chromosomalnej insercji indukowalnego systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią u A. baumannii jest technicznie prosta i nie jest pracochłonna, istnieje kilka ważnych kroków, które należy podkreślić. Po pierwsze, przygotowanie właściwych komórek musi odbywać się w jak największym stopniu na lodzie, ponieważ komórki stają się kruche podczas wymiany pożywki na lodowatą wodę. Idealnie byłoby, gdyby etapy wirowania odbywały się w temperaturze 4 °C, ale dopuszczalne jest wirowanie w temperaturze pokojowej. Biorąc pod uwagę rosnącą kruchość komórek podczas mycia wodą, kluczowe znaczenie ma również delikatne pipetowanie. Po drugie, elektroporacja jest wrażliwa na obecność jonów. Mycie komórek za pomocą wielu rund granulowania i ponownego zaparcia w wodzie zapewnia całkowite usunięcie nośnika. Ponadto plazmidy powinny być świeżo oczyszczone i mogą być eluowane w standardowych elucyjnych zestawu (zwykle bufor TE), o ile stężenie plazmidowego DNA jest wystarczająco wysokie. Naszym celem jest dodanie <5 μl plazmidu do 100 μl zawiesiny komórek, aby utrzymać bardzo niską siłę jonową próbki, chociaż należy tolerować do 10 μl. Po trzecie, w razie potrzeby należy przygotować selektywne płytki agarowe, aby zapewnić skuteczność dodanego antybiotyku. Należy zauważyć, że karbenicylina została użyta zamiast zwykłej ampicyliny do selekcji podczas transformacji plazmidu wycinającego, pFLP2ab. A. baumannii jest wewnętrznie oporny na aminonicyliny (ampicylinę)16; Podstawienie karboksypenicyliny (karbenicyliny) pozwala na ciągłą selekcję kodowaną przez plazmid β-laktamazy.

Optymalizacja protokołu eksperymentalnego jest bardziej zniuansowana i będzie się różnić w zależności od różnych gatunków Acinetobacter (lub nawet genetycznie zmodyfikowanych szczepów tego samego gatunku) i ewentualnie konkretnych odczynników używanych w laboratorium. Na przykład napięcie używane do elektroporacji może wahać się od 1,8 do 2,5 kV, a warunki termocyklingu mogą wymagać nieznacznej zmiany w zależności od polimerazy DNA używanej do PCR. Pomocne wskazówki, które należy rozważyć, jeśli komórki słabo rosną po elektroporacji, obejmują zmniejszenie stężenia gentamycyny w płytkach agarowych z 50 μg/ml do 30 μg/ml i/lub wydłużenie czasu inkubacji płytek agarowych do ≥24 godzin. Jeśli chodzi o etapy usuwania kasety z gentamycyną, większy sukces można osiągnąć przy użyciu płytek agarowych LB z 10% sacharozą i/lub inkubacji w temperaturze 30 °C przez ≥24 godziny, jeśli utrzymuje się oporność na karbenicylinę.

W literaturze można znaleźć wiele metod przygotowania komórek A. baumannii do stosowania z elektroporacją, ale często obejmują one etap subkulturacji po początkowej hodowli przez noc, a następnie długą fazę wzrostu do zalecanej gęstości optycznej. Odkryliśmy, że prosta hodowla przez noc może być stosowana równie skutecznie. Elektroporacja A. baumannii została dobrze opisana, a czytelnicy mogą uzyskać więcej informacji na temat tego specyficznego aspektu protokołu tutaj17,18. Kluczowymi zaletami tego systemu komplementacji genów chromosomu mini-Tn7 w porównaniu z systemem komplementacji opartym na plazmidzie są zdolność do regulowania poziomu ekspresji komplementowanego genu za pomocą kontrolowanego przez IPTG systemu represorowego lacIq oraz wybór usunięcia markera gentamycyny (genu aacC1) za pomocą flankujące tereny FRT. Zaobserwowano, że tolerancja komórek na ekspresję pomp wypływowych może się różnić w zależności od włożonej pompy. Na przykład komórki są bardziej wrażliwe na ekspresję AdeIJK w porównaniu z AdeABC lub AdeFGH; Można temu zaradzić, modyfikując stężenie IPTG w warunkach hodowli. Usunięcie markera antybiotykowego zmniejsza ryzyko mutacji szczepu ze względu na ciągłą presję selekcyjną, a także pozwala na nieograniczone badania wrażliwości na antybiotyki3.

Ten system mini-Tn7 był z powodzeniem stosowany z gatunkami Pseudomonas 9,10, Yersinia9, Burkholderia19, Xanthomonas20 i Acinetobacter 5,6,21,22, jednak istnieją pewne ograniczenia. Na przykład u A. baumannii w genomie5 znajduje się tylko jedno funkcjonalne miejsce insercji attTn7, więc szczep może zostać utworzony z wieloma delecjami, ale tylko jeden gen na raz może być uzupełniony. Ponadto system ten nie został jeszcze udowodniony jako skuteczny w przypadku bakterii Gram-dodatnich10.

Pompy wypływowe RND są ważnymi czynnikami ułatwiającymi oporność na antybiotyki u A. baumannii. To, co czyni je tak potężnymi, to ich trzyczęściowa struktura, która rozciąga się na błonę wewnętrzną i zewnętrzną, umożliwiając usuwanie antybiotyków z peryplazmy na zewnątrz komórki. Wykazano, że najbardziej przebadane i wszechobecne pompy RND - oznaczone jako AdeABC, AdeFGH i AdeIJK - eliminują antybiotyki obejmujące wszystkie klasy. Szczegółowe wyjaśnienie funkcji pompy wypływowej będzie stanowić dobry punkt wyjścia do zaprojektowania nowych opcji terapeutycznych przeciwko szczepom wielolekoopornym. Użycie potrójnego szczepu delecyjnego pompy RND AB258 i uzupełnianie jednej pompy na raz pozwala na badanie każdej pompy niezależnie od pozostałych, rozróżniając dla każdej z nich unikalne profile substratów i najskuteczniejsze inhibitory. Oczywiście pompy wypływowe odgrywają również "codzienną" rolę w normalnym funkcjonowaniu bakterii. Zrozumienie tych ról może doprowadzić do pośredniego uszkodzenia pomp, co z kolei przerwałoby wypływ antybiotyków, co prawdopodobnie sprawiłoby, że bakterie wielolekooporne ponownie stałyby się podatne na powszechnie stosowane antybiotyki. Ogólnie rzecz biorąc, system mini-Tn7 może być używany do wprowadzania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania w celu szczegółowych badań lub pomocnych markerów, na przykład białek fluorescencyjnych do obrazowania mikroskopowego6.

Rosnące rozpowszechnienie bakterii wielolekoopornych jest problemem dla nas wszystkich. Zrozumienie mechanizmów ochronnych zapewnianych przez pompy wypływowe w patogenach takich jak A. baumannii ma kluczowe znaczenie dla zwalczania poważnych infekcji. Ten chromosomalny system ekspresji genów z pojedynczą kopią jest potężnym narzędziem do badań mechanistycznych, a także do identyfikacji inhibitorów udaremniających działanie pompy wypływowej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Grant Odkrywczy od Kanadyjskiej Rady Nauk Przyrodniczych i Inżynierii dla AK. Schematy użyte na rysunkach są tworzone za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do PCR 0,2 mlVWR20170-012Do preparatów do gotowania kolonii i reakcji PCR
1,5 ml probówki do mikrofugeSarstedt72-690-301Probówki do hodowli ogólnego zastosowania
13 mL, PyrexFisher14-957KPłynne naczynia hodowlane
6x bufor ładujący DNAFroggabioLD010Żel agarozowy elektroforeza do ładowania próbki barwnik
octowy kwas, lodowiecFisher351271-212Składnik buforowy w żelu agarozowym
AgarBioshopAGR003Stałe podłoże wzrostowe
AgarozaBioBasicD0012Separacja elektroforetyczna produktów reakcji PCR; stosowany w stężeniu 0,8– 2%
Jednostka do elektroforezy w żelu agarozowymFisher29-237-54Elektroforeza w żelu agarozowym; rozdzielanie produktów reakcji PCR
KarbenicylinaFisher50841231Pożywki selektywne
Zamknięcia probówek hodowlanychFisher13-684-138Nakrętka ze stali nierdzewnej do probówek hodowlanych 13 ml
Zestaw trifosforanu deoksynukleotydu (dNTP)BiobasicDD0058składnik reakcji PCR; dostarczane jako 100 mM każdy dATP, dCTP, dGTP, dTTP; zmieszane i rozcieńczone przez 10 mM każdy dNTP
Sucha kąpiel/grzałka blokowaFisher88860023Cyfrowa sucha łaźnia Isotemp do przygotowania wrzenia
Kuwety do elektroporacjiVWR89047-208Kuwety do elektroporacji 2 mm z okrągłą nasadką
ElektroporatorCole Parmer940000009110 VAC, 60 Hz Elektroporator
Bromek etydynyFisherBP102-1Wizualizacja produktów reakcji PCR i markera DNA w żelu agarozowym
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)VWRCA-EM4050Składnik buforowy w żelu agarozowym
GentamycynaBiobasicGB0217Do przygotowania pożywek selektywnych
GlicerolFisherG33Przygotowanie zapasów bakterii do długotrwałego przechowywania w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze
Inkubator (wytrząsanie)New Brunswick ScientificM1352-0000Excella E24 Wytrząsarka do wzrostu płynnych kultur
Inkubator (statyczny)Fisher11-690-550DPiec do inkubatora izotemperaturowego Model 550D do wzrostu kultur stałych (agar LB)
Pętla inokulacyjnaSarstedt86.1562.050Smugi kolonii na płytkach agarowych
Rozsiewacz inokulacjiSarstedt86.1569.005Rozprzestrzenianie hodowla na płytkach agarowych
Rosół lizogeniczny (LB), LennoxFisherBP1427Płynna pożywka wzrostowa (20 g/l: 5 g/l chlorku sodu, 10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego)
MicrofugeFisher75002431Sorvall Legend Micro 17 do wirowania próbek
MiniwirówkaFisherS67601BWirowanie 0,2 ml probówek PCR
Szalki PetriegoSPL Nauki przyrodnicze10090Do stałych pożywek wzrostowych (płytki agarowe): 90 x 15 mm
Pipety MandelRóżnepipety jednokanałowe Gilson (P10, P20, P200, P1000)
ZasilanieBiorad1645050PowerPac Podstawowy zasilacz do elektroforezy
Startery SkładnikIDTNAPCR; specyficzny dla genu będącego przedmiotem zainteresowania; przygotowany w temperaturze 100 μ M zgodnie z zaleceniami w karcie specyfikacji produktu
SacharozaBioBasicSB0498Do przygotowania pożywek przeciwselektywnych do usuwania plazmidu pFLP2ab z transformowanego A. baumannii
Taq DNA polimerazaFroggaBioT-500Składnik reakcji PCR; polimeraza dostarczana z 10x buforem
TermocyklerBiorad1861096Model T100 do PCR
WykałaczkiFisherS24559Do łatania kolonii na płytkach agarowych
Baza TrizmaSigmaT1503Składnik buforowy w żelu agarozowym
Woda ultraczystaMillipore SigmaZLXLSD51040MilliQ: ultra czysta woda do przygotowania pożywek i roztworów oraz mycia komórek
Szeroki zakres markerów DNABiobasicM103R-2Oznaczanie wielkości produktów PCR na żelu agarozowym
Drewniane patyczki do zaszczepianiaFisher29-801-02Zaszczepianie kultur koloniami z płytek agarowych
reakcji System oczyszczania wody

Bibliografia

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380(2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
  6. Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288(2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
  13. Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
  14. Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373(2021).
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , Clinical and Laboratory Standards Institute. (2021).
  16. Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
  17. Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110(2016).
  18. Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
  19. Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
  20. Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
  21. Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045(2020).
  22. Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja pomp effluxchromosomowy system Mini Tn7mechanizmy efflux RNDkom rki elektrokompetentneprzesiewowa metoda colony PCRoporno na antybiotykiinsercja gen w
Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.