Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

Summary

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Abstract

Acinetobacter baumannii jest uznawany za trudny patogen Gram-ujemny ze względu na jego powszechną oporność na antybiotyki. Kluczowe jest zrozumienie mechanizmów stojących za tą opornością, aby zaprojektować nowe i skuteczne opcje terapeutyczne. Niestety, nasza zdolność do zbadania tych mechanizmów u A. baumannii jest utrudniona przez niedostatek odpowiednich narzędzi manipulacji genetycznej. W tym miejscu opisujemy metody wykorzystania chromosomalnego systemu opartego na mini-Tn7 w celu osiągnięcia ekspresji genu w pojedynczej kopii w szczepie A. baumannii, który nie ma funkcjonalnych mechanizmów wypływu typu RND. Insercja pojedynczej kopii i indukowalna ekspresja pompy wypływowej są dość korzystne, ponieważ obecność operonów wypływu RND na plazmidach o dużej liczbie kopii jest często słabo tolerowana przez komórki bakteryjne. Co więcej, włączenie rekombinowanych wektorów ekspresyjnych mini-Tn7 do chromosomu zastępczego gospodarza A. baumannii o zwiększonej wrażliwości na wypływ pomaga uniknąć zakłóceń powodowanych przez inne pompy wypływu. System ten jest cenny nie tylko do badania niescharakteryzowanych bakteryjnych pomp wypływowych, ale także do oceny skuteczności potencjalnych inhibitorów ukierunkowanych na te pompy.

Introduction

Acinetobacter baumannii jest patogenem o najwyższym priorytecie Światowej Organizacji Zdrowia ze względu na jego odporność na wszystkie klasy antybiotyków¹. Jest to patogen oportunistyczny atakujący głównie osoby hospitalizowane, ranne lub z obniżoną odpornością. A. baumannii w dużej mierze unika antybiotyków za pomocą pomp wypływowych, z których najistotniejszą jest rodzina eksporterów Resistance-Nodulation-Division (RND)². Zrozumienie, w jaki sposób te pompy wypływowe działają mechanicznie, pozwoli na opracowanie ukierunkowanych opcji terapeutycznych.

Jednym z powszechnych sposobów na rozróżnienie procesów komórkowych jest manipulacja genetyczna. Jednak narzędzia dostępne do badań genetycznych A. baumannii są ograniczone, a aby jeszcze bardziej zagmatwać projekt eksperymentalny, izolaty kliniczne często są oporne na antybiotyki rutynowo stosowane do selekcji w manipulacjach genetycznych³. Drugą przeszkodą napotkaną podczas badania pomp wypływowych jest to, że są one ściśle regulowane - często przez nieznane czynniki - co utrudnia dokładne wyizolowanie i przypisanie funkcji do jednej pompy⁴. Widząc tę potrzebę rozszerzenia zestawu narzędzi badawczych, opracowaliśmy oparty na mini-Tn7, indukowany system ekspresji z pojedynczą kopią, który zawiera kasetę celu rekombinazy Flp (FRT), która pozwala na usunięcie znacznika wyboru5^,6,7 (Rysunek 1). Po raz pierwszy stworzony dla Pseudomonas^8,9,10, ten elegancki system klonowania i wyrażania został użyty do wygenerowania jednokopijnych uzupełnień pompy wypływu do szczepu A. baumannii z niedoborem pompy odpływowej RND (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: dalej określane jako A. baumannii AB258), które wygenerowaliśmy¹¹. Będąc w stanie badać jedną pompę wypływową na raz i nie przytłaczać komórek bakteryjnych ekspresją o wysokiej liczbie kopii (jak to zwykle obserwuje się w przypadku systemów ekspresyjnych opartych na plazmidach), można lepiej poznać krytyczne, fizjologiczne aspekty każdej pompy wypływowej przy minimalnej ingerencji i zmniejszonych powikłaniach.

Ten artykuł opisuje, jak za pomocą systemu mini-Tn7 uzupełnić usunięty gen będący przedmiotem zainteresowania, RND efflux pump adeIJK, do chromosomu A. baumannii AB258 poprzez serię nieskomplikowanych kroków wykonywanych w ciągu 9 dni⁷. Pierwszy zestaw kroków ponownie wprowadza usunięte geny pompy wypływowej sklonowane do plazmidu insercyjnego opartego na mini-Tn7 (Figura 2A) w miejscu insercji pojedynczego attTn7 za dobrze zachowanym genem glmS (Figura 3A). Proces ten jest ułatwiony przez niereplikacyjny plazmid pomocniczy (Figura 2B), który koduje geny transpozazy potrzebne do insercji sterowanej Tn7. Drugi zestaw kroków wykorzystuje plazmid wycinający (Figura 2C) do usuwania genu gentamycyny za pośrednictwem rekombinazy Flp otoczonego miejscami FRT (Figura 3B) w celu stworzenia nieoznaczonego szczepu. Chociaż system ten jest używany do wyjaśnienia podstawowych ról i możliwych inhibitorów pomp odpływowych RND w odniesieniu do oporności na antybiotyki, może być wykorzystany do zbadania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Protocol

1. Przygotowanie eksperymentalne

1. Oczyść plazmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (plazmid insercyjny, Rysunek 2A) za pomocą interesującego genu.
   UWAGA: W tym przypadku interesującym genem jest adeIJK. Końcowe stężenie plazmidu powinno wynosić ≥100 ng/μL.
2. Oczyść plazmid pomocniczy (pTNS2)⁹ i plazmid wycinający (pFLP2^ab)⁶ (Rysunek 2B,C, odpowiednio), najlepiej do końcowego stężenia plazmidowego DNA wynoszącego ≥100 ng / μL.
3. Przygotuj 50 ml sterylnej ultraczystej wody i 25 ml sterylnego bulionu LB (Lennox) (patrz tabela materiałów).
4. Przygotuj co najmniej 10 funtów płytek agarowych, każda z następującymi dodatkami: zwykła (bez dodatków), gentamycyna (Gm) w stężeniu 50 μg/ml, karbenicylina (Cb) w stężeniu 200 μg/ml (do wyboru za pomocą genu oporności na ampicylinę) i 5% sacharozy (patrz tabela materiałów).
5. Szczep przeznaczony do wprowadzenia należy rozprowadzić na agarze LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin. W tym przypadku stosuje się A. baumannii AB258.
   UWAGA: Ten protokół musi być wykonywany w jak największym stopniu w sterylnym środowisku przy użyciu palnika Bunsena na stole lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie materiały eksploatacyjne (końcówki do pipet, pętle do zaszczepiania, probówki do mikrofug itp.) muszą być sterylne.

2. Przygotowanie kultury

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię A. baumannii AB258 w 4 ml bulionu LB w sterylnej probówce hodowlanej o pojemności 13 ml za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania lub sterylnego drewnianego patyczka do zaszczepiania.
   UWAGA: Pojedyncza hodowla o pojemności 4 ml jest używana do jednej próbki i jednej kontroli. Zwiększ liczbę kultur w zależności od liczby potrzebnych próbek.
2. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (250 obr./min).
3. Umieść butelkę sterylnej wody destylowanej (25-50 ml) w temperaturze 4 °C na noc do użycia w kroku 3.

3. Przygotowanie ogniw elektrokompetentnych

1. Umieść wszystkie sterylne probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml (po dwie na kulturę) i sterylne kuwety do elektroporacji (dwie na kulturę) na lodzie (patrz tabela materiałów). Próbki należy utrzymywać na lodzie tak długo, jak to możliwe przez cały czas trwania procedury.
2. Butelkę ze sterylną wodą, która była przechowywana w temperaturze 4 °C, umieścić na lodzie.
3. Przenieś 1,5 ml nocnej kultury bakteryjnej do jednej z probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
4. Wirować przy 13 000 x g przez 2 minuty w celu osadzenia komórek.
   UWAGA: Najlepiej byłoby odwirować w temperaturze 4 °C, ale wirowanie w temperaturze otoczenia jest dopuszczalne i nie jest szkodliwe.
5. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml usunąć cały supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
6. Dodaj kolejne 1,5 ml kultury bakteryjnej do tej samej probówki do mikrofuge. Wirować przy 13 000 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć cały supernatant.
7. Powtórzyć krok 3.6 po raz ostatni z pozostałym 1 ml hodowli.
8. Dodaj 1 ml lodowatej sterylnej wody do osadu komórkowego i zawieś go ponownie, delikatnie pipetując, aż osad przestanie znajdować się na dnie probówki do mikrofuge.
9. Odwirować zawieszone komórki przy 13 000 x g przez 2 minuty.
10. Ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Nie wylewać supernatantu, zwłaszcza w kolejnych etapach mycia, gdy komórki mają tendencję do tworzenia mniej zwartych granulek.
11. Powtórz ten krok mycia lodowatą sterylną wodą, kroki od 3.8 do kroku 3.10, jeszcze dwa razy.
12. Delikatnie zawieś ostatnią osadkę komórkową w 200 μl lodowatej sterylnej wody.
13. Przenieś 100 μl końcowej zawiesiny komórek do drugiej lodowatej probówki o pojemności 1,5 ml. Ta druga podwielokrotność stanie się kontrolą ujemną dla elektroporacji. Próbki komórek należy przechowywać na lodzie.

4. Elektroporacja

1. Wstępnie podgrzać 1 ml bulionu LB i jedną płytkę agarową LB + Gm⁵⁰ (przygotowaną w kroku 1.4) dla każdej próbki i kontroli w inkubatorze statycznym ustawionym na 37 °C.
2. W łącznej objętości 5 μl lub mniejszej dodać 100-200 ng każdego z plazmidów pomocniczych pTNS2 i plazmidu insercyjnego pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK do podwielokrotności komórek elektrokompetentnych.
3. Wymieszaj delikatnym stukaniem opuszkami palców, aby zapewnić całkowite wymieszanie plazmidów z komórkami elektrokompetentnymi bez wprowadzania pęcherzyków.
4. Dodać równoważną objętość sterylnej wody destylowanej do podwielokrotności komórek kontroli ujemnej i delikatnie wymieszać, jak powyżej.
5. Próbki należy inkubować na lodzie przez 20 minut.
6. Przenieś całą próbkę ogniw do lodowatej kuwety do elektroporacji, a następnie umieść kuwetę z powrotem na lodzie. Powtórzyć te czynności dla próbki z komórki kontroli ujemnej.
7. Elektroporować próbkę ogniwa.
   1. Włącz elektroporator i ustaw go na 2,0 kV (25 μF, 200 Ω) (patrz tabela materiałów).
   2. Przetrzyj powierzchnię kuwety miękką chusteczką, aby usunąć przylegający lód lub wilgoć.
   3. Włóż kuwetę do elektroporatora i dostarcz porażenie prądem.
   4. Natychmiast dodaj 0,9 ml wstępnie podgrzanego bulionu LB do komórek w kuwecie i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać komórki z podłożem.
   5. Przenieś całą zawiesinę komórek do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml (temperatura pokojowa).
   6. Sprawdź wartość stałej czasowej na elektroporatorze; aby uzyskać najlepsze wyniki, wartość ta powinna mieścić się w przedziale od 4 do 6.
8. Powtórzyć procedurę elektroporacji (etapy od 4.7.1 do 4.7.6) dla próbki ogniwa kontroli ujemnej.
9. Próbki poddane elektroporacji należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy prędkości 250 obr./min, aby umożliwić regenerację komórek.
10. Za pomocą rozsiewacza do zaszczepiania rozprowadź 100 μl każdej elektroporowanej próbki komórek na wstępnie podgrzanej płytce agarowej LB + Gm⁵⁰.
    1. Pozostałe próbki należy odwirować przy 13 000 x g przez 2 minuty w celu osadzenia komórek.
    2. Po usunięciu całego supernatantu za pomocą pipety, ponownie zawiesić komórki w 100 μl bulionu LB.
    3. Rozłóż każdą całą próbkę na pojedynczych, wstępnie ogrzanych płytkach agarowych LB + Gm⁵⁰.
       UWAGA: Wydajność elektroporacji może być zależna od odkształcenia. Podczas elektroporowania szczepu po raz pierwszy, pouczające może być nałożenie różnych objętości, a nawet rozcieńczeń próbki do elektroporacji, aby upewnić się, że powstałe płytki mają izolowane kolonie.
11. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.

5. Wybór przekształconych kolonii do badań przesiewowych opartych na PCR

1. Sprawdź płytki elektroporacyjne. Kontrola ujemna nie powinna mieć żadnych kolonii; Próbka powinna mieć odrębne kolonie.
   UWAGA: Płytki z koloniami, na tym etapie i na wszystkich kolejnych etapach, na których produkowane są płytki agarowe z koloniami lub łatami, mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni przed kontynuacją.
2. Za pomocą sterylnych wykałaczek zbierz do 10 pojedynczych kolonii z płytek agarowych LB + Gm⁵⁰ i nałóż je na świeżą płytkę agarową LB + Gm⁵⁰.
3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.

6. Weryfikacja insercji chromosomów metodą PCR kolonii

1. Wyjmij z inkubatora płytki agarowe LB + Gm⁵⁰ zawierające załatane kolonie.
2. Za pomocą sterylnej wykałaczki lub sterylnej końcówki do pipet usuń niewielką porcję (mniej więcej wielkości dużej kolonii) z plastra do 20 μl sterylnej wody destylowanej w probówce PCR o pojemności 0,2 ml; dobrze wymieszaj. Próbka wody powinna stać się widocznie mętna, gdy komórki zostaną uwolnione z wykałaczki. Należy przygotować dowolną liczbę próbek, które należy poddać badaniom przesiewowym, ale 6 powinno wystarczyć.
3. Probówkę do PCR zawierającą zawiesinę bakteryjną inkubować w temperaturze 100 °C przez 5-10 minut.
4. Za pomocą miniwirówki (patrz tabela materiałów) wirować próbkę z ustaloną maksymalną prędkością przez 2 minuty, aby osadzać resztki komórkowe.
5. Przenieść supernatant do nowej probówki do PCR o pojemności 0,2 ml i umieścić ją na lodzie. Ta próbka zawiera matrycę DNA do reakcji PCR.
   UWAGA: Ta matryca DNA może być przechowywana w temperaturze -20 °C przed przystąpieniem do PCR.
6. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR zawierającą 1x bufor polimerazy, 200 μM dNTP, 0,18 μM ABglmS2_F_New startera do przodu, 0,18 μM startera odwrotnego Tn7R (Tabela 1), 1 U polimerazy DNA Taq i 1 μL przygotowanego DNA matrycy w całkowitej objętości 25 μL. Przygotować kontrolę bez matrycy (NTC), w tym wszystkie z wyjątkiem matrycowego DNA (zob. tabela materiałów).
7. Wprowadzić warunki reakcji do termocyklera: 95 °C przez 2 minuty, 95 °C przez 30 s, 49 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, co daje łącznie 35 cykli; 72 °C przez 10 minut; 12 °C trzymanie. Uruchom przykłady.
8. Po dodaniu barwnika ładującego DNA do końcowego stężenia 1x, załaduj 10 μl każdej reakcji PCR na 2% żel agarozowy i uruchom pod napięciem 80 V przez 40 minut. Oczekiwany rozmiar amplikonu dla tej pary starterów wynosi 382 pz. NTC nie powinien mieć żadnych pasm.
9. Zidentyfikuj próbki, z których wytworzył się oczekiwany produkt PCR. Przygotować płytkę smugową na płytkach agarowych LB + Gm⁵⁰ z dowolnego plastra PCR-dodatniego; inkubować w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin. Celem jest wygenerowanie płytki z pojedynczymi koloniami w celu przygotowania materiału glicerolowego w celu zachowania tego oznaczonego szczepu i jako punkt wyjścia do stworzenia nieoznaczonego szczepu (opisanego poniżej).

7. Usunięcie znacznika Gm^R za pomocą pFLP2^ab

1. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2: Przygotowanie kultury. Próbka użyta do przygotowania kultury przez noc to pojedyncza kolonia z płytek agarowych LB + Gm⁵⁰ przygotowanych w celu wytworzenia dyskretnych kolonii w kroku 6.9.
2. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3: Przygotowanie ogniw elektrokompetentnych. Przygotuj komórki z hodowli przez noc do elektroporacji.
3. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4: Elektroporacja. W tym przypadku plazmidem, który należy wprowadzić do komórek, jest pFLP2^ab (100-200 ng), który usunie gen oporności na gentamycynę, otaczając interesujący nas gen wstawiony chromosomalnie.
4. Po odzyskaniu komórek przez 1 godzinę (krok 4.9), rozprowadź 100 μl elektroporowanej próbki ogniwa na wstępnie podgrzanej płytce agarowej LB + Cb²⁰⁰ (przygotowanej w kroku 1.4). To selektywne ciśnienie zapewnia, że tylko komórki zawierające plazmid wycinający pFLP2^ab będą rosły.
5. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.
6. Sprawdź, czy na płytce nie ma kolonii. Na płytce kontroli ujemnej nie powinno znajdować się żadne kolonie; Płytka z próbką agaru LB + Cb²⁰⁰ powinna mieć odrębne kolonie.
7. Za pomocą sterylnych wykałaczek nałóż krzyżowo do 20 izolowanych kolonii na płytkę agarową LB + Cb²⁰⁰ i płytkę agarową LB + Gm⁵⁰.
8. Inkubować płytki przez 16-18 godzin w temperaturze 37 °C.
9. Sprawdź, czy na tabliczkach nie ma poprawek. Klony, które rosną na płytce agarowej LB + Cb²⁰⁰, ale nie na płytce agarowej LB + Gm⁵⁰, mają usunięty gen oporności na gentamycynę z oryginalnej wkładki.
10. Wybierz plastry, które są odporne na karbenicylinę i gentamycynę podatną na smugi na poszczególnych płytkach agarowych LB uzupełnionych 5% (w/v) sacharozy, co wymusza wydalenie plazmidu pFLP2^ab z bakterii. Wybierz do 10 kolonii.
11. Inkubować płytki przez 16-18 godzin w temperaturze 37 °C.
12. Sprawdź płytki pod kątem kolonii.
13. Jako ostateczne potwierdzenie utraty plazmidu pFLP2^ab, należy nakroć krzyżowo 4-6 izolowanych kolonii z 5% płytek sacharozy na płytkę agarową LB + Cb²⁰⁰ i płytkę agarową LB
.
14. Inkubować płytki przez 16-18 godzin w temperaturze 37 °C.
15. Wybierz klon, który rośnie na płytce agarowej LB i który jest wrażliwy na karbenicylinę, aby przygotować bulion glicerolowy, aby zachować ten nieoznaczony szczep.
    1. Weryfikację genetyczną nieoznakowanego szczepu można przeprowadzić za pomocą PCR kolonii (krok 6: Weryfikacja insercji chromosomów przez PCR kolonii) przy użyciu starterów, które są ukierunkowane na gen oporności na gentamycynę.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR zawierającą 1x bufor polimerazy, 200 μM dNTP, 0,18 μM Gm_F startera do przodu, 0,18 μM Gm_R startera odwrotnego (Tabela 1), 1 U polimerazy DNA Taq i 1 μL przygotowanej matrycy DNA w całkowitej objętości 25 μL. Przygotować kontrolę bez matrycy (NTC) zawierającą wszystkie oprócz matrycowego DNA, oraz kontrolę pozytywną z wykorzystaniem DNA ze znakowanego szczepu.
    3. Wprowadzić warunki reakcji do termocyklera: 95 °C przez 2 minuty, 95 °C przez 30 s, 50 °C przez 30 s i 72 °C przez 40 s, co daje łącznie 35 cykli; 72 °C przez 10 min; 12 °C trzymanie. Uruchom przykłady.
    4. Po dodaniu barwnika ładującego DNA do końcowego stężenia 1x, załaduj 10 μl każdej reakcji PCR na 1% żel agarozowy i pracuj pod napięciem 80 V przez 40 minut. Oczekiwany rozmiar amplikonu dla tej pary starterów wynosi 525 pz. Kontrola dodatnia powinna mieć pojedynczy pasek; próbki i NTC nie powinny mieć pasm.

Results

Procedura wprowadzania chromosomów trwa tylko 2 godziny w ciągu 3 dni, aby zobaczyć wynik - kolonie rosnące na selektywnej płytce agarowej (Rysunek 1A-C). Oczekiwana liczba kolonii na płytce transformacyjnej jest zależna od szczepu: można zobaczyć 20-30, a nawet setki kolonii, ponieważ wprowadzenie Tn7 w miejscach attTn7 jest specyficzne i wydajne⁹. Łatanie kolonii płytek transformacyjnych na selektywnych pożywkach (Rysunek 4A) zachowuje przekształcony szczep i dostarcza materiału wyjściowego do badania przesiewowego PCR kolonii (Rysunek 1E i Rysunek 4B). Badania przesiewowe kolonii metodą PCR można ograniczyć do minimum - nie powinno być konieczne przetworzenie więcej niż 10 kolonii, a większość z nich powinna dać pozytywny wynik do insercji. Iloczyn PCR dla starterów przesiewowych, ABglmS2_F_New i Tn7R (Tabela 1), wynosi 382 pz (Rysunek 4B linia 4); Kontrole ujemne reakcji obejmują A. baumannii typu dzikiego ATCC 17978 (Rysunek 4B linia 2), AB258 (Figura 4B linia 3) i brak szablonu (Rysunek 4B pas 5). Kolonie, które są dodatnie pod względem PCR, reprezentują uzupełnione, oznaczone szczepy.

Usunięcie genu odporności na gentamycynę (odznaczenie) zajmuje mniej niż 3 godziny, trwające 6 dni, ponieważ komórki przekształcone za pomocą plazmidu wycinającego muszą zostać wybrane przez selektywne posiewanie, a następnie plazmid wycinający musi zostać wyleczony z bakterii (Rysunek 1F). Wycięcie oparte na rekombinacji Flp-FRT jest precyzyjne i skuteczne, a jego wynikiem powinno być ≥20 kolonii na płytce transformacyjnej. Kolonie, które są naklejane krzyżowo na karbenicylinę (selekcja pod kątem oporności na β-laktamy wynikającej z plazmidu wycinającego) i gentamycyny (w poszukiwaniu utraty oporności na gentamycynę) powinny być odpowiednio oporne na karbenicylinę i wrażliwe na gentamycynę. Plazmid wycinający jest wypychany z bakterii przez wzrost na 5% płytkach agarowych sacharozy. Wzrost na sacharozie zmusza komórki do eliminacji pFLP2^ab, ponieważ gen sacB na plazmidzie sprzyja konwersji sacharozy do lewansu, polisacharydu toksycznego dla bakterii^12,13. Wszystkie kolonie, które rosną na 5% pożywce sacharozy, powinny wtedy rosnąć tylko na zwykłych płytkach agarowych LB; Na płytkach agarowych z karbenicyliną nie powinno być żadnych narośli. Kolonie rosnące na gładkich płytkach agarowych LB reprezentują nieoznaczone szczepy. Potwierdzenie utraty markera gentamycyny można osiągnąć za pomocą PCR kolonii przy użyciu starterów Gm_F i Gm_R (Tabela 1 i Rysunek 5). Ta para starterów daje amplikon 525 pz tylko w kontroli pozytywnej (początkowo utworzony szczep oznaczony, Rysunek 5 linia 4); ATCC 17978 typu dzikiego ( Rysunek 5 linia 2), AB258 (Figura 5 linia 3), dowolna testowana kolonia (Rysunek 5 linia 5) oraz kontrola bez szablonu (Rysunek 5 linia 6) nie powinny pokazywać wzmocnienia.

Gdy nieoznaczony szczep zostanie potwierdzony, można rozpocząć testy funkcjonalne z testami fenotypowymi. W tym przypadku oczywistym pierwszym wyborem jest określenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) szeregu antybiotyków: cyprofloksacyna jest znanym substratem AdeIJK, tetracyklina może być usunięta przez AdeIJK (główną pompą wypływową jest AdeAB), a kanamycyna ma stosunkowo niewielki wpływ na A. baumannii ATCC 17978^2,14. Stosując metodę mikrorozcieńczania bulionu zgodnie z wytycznymi CLSI¹⁵, uzupełniony nieoznaczony szczep AB258::adeIJK poddano prowokacji każdemu antybiotykowi pod nieobecność i w obecności 50 μM IPTG; szczep typu dzikiego ATCC 17978 i szczep AB258 z niedoborem odpływu RND zostały włączone jako kontrole (Tabela 2). Ogólnie rzecz biorąc, trend obserwowany w wartościach MIC mówi o oczekiwanej zmniejszonej podatności AB258::adeIJK na cyprofloksacynę i tetracyklinę z indukowaną ekspresją pompy wypływowej, co potwierdza, że wprowadzenie adeIJK zakończyło się sukcesem.

Rysunek 1: Przegląd procedury. (A) Przygotowuje się nocną hodowlę szczepu A. baumannii, która ma być uzupełniona. (B) Komórki z hodowli nocnej przemywa się wodą 3 razy przez odwirowanie i utrzymuje na lodzie. (C) Plazmidy dostarczające i pomocnicze dodaje się do komórek i inkubuje na lodzie przez 20 minut. Próbkę poddaje się elektroporacji, dodaje się pożywkę LB i pozostawia się ogniwa do odzyskania przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Podwielokrotność komórek o objętości 100 μl rozprowadza się na płytkach agarowych LB + Gm⁵⁰ i inkubuje w temperaturze 37 °C przez noc. (D) Kolonie z płytki transformacyjnej są łatane na płytkę agarową LB + Gm⁵⁰ i hodowane przez noc w temperaturze 37 °C. (E) Łatane kolonie przygotowuje się do PCR w celu przeprowadzenia badań przesiewowych na obecność produktu amplifikacji obejmującego miejsce insercji chromosomów. Amplifikacja PCR jest wizualizowana za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Próbki dodatnie PCR reprezentują pomyślne wprowadzenie genu będącego przedmiotem zainteresowania do chromosomu i utworzenie oznaczonego szczepu. (F) Kolonię dodatnią dla gentamycyny przygotowuje się jak w krokach (AC), z elektroporacją plazmidu ab pLFP2^w celu usunięcia kasety gentamycyny z insercji chromosomowej. Selektywne posiewanie na agarze LB + Cb²⁰⁰ potwierdza wychwyt plazmidu. Zduplikowane łatanie na płytkach agarowych LB + Cb²⁰⁰ i LB + Gm⁵⁰ ujawnia kolonie, które są Cb^R i Gm^S, potwierdzając utratę kasety gentamycyny po włożeniu. Wzrost wybranych kolonii Cb^R na 5% sacharozie leczy plazmid pLFP2^ab z komórek. Kolonie z 5% płytki sacharozy są łatane na agarze LB + Cb²⁰⁰ i agarze LB, aby odsłonić pożądane kolonie Cb^S i Gm^S i potwierdzić utworzenie nieoznaczonego szczepu. Gm⁵⁰, gentamycyna w stężeniu 50 μg/ml; Cb²⁰⁰, karbenicylina w stężeniu 200 μg/ml; ^R, odporny; ^S, wrażliwy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Plazmidy używane w tym protokole. Ogólne mapy plazmidowe (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (plazmid insercyjny), (B) pTNS2 (plazmid pomocniczy) i (C) pFLP2^ab (plazmid wycinający). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat wstawiania i odznaczania. (a) Umieszczenie. Pojedyncze miejsce insercji Tn7 w chromosomie A. baumannii znajduje się 24 pz od końca genu glmS2. Koelektroporacja plazmidu insercyjnego i plazmidu pomocniczego pozwala na uzupełnienie interesującego genu (gen wstawiony, fioletowy) wraz z resztą kasety insercyjnej (miejsca FRT do wycięcia markera, żółte; gen accC1 odpowiedzialny za oporność na gentamycynę, zielony; lacIq do indukowalnej ekspresji, niebieski) do chromosomu. (b) Odznaczanie. Elektroporacja uzupełnionego, oznaczonego szczepu insercyjnego plazmidem wycinającym pFLP2^ab ułatwia usunięcie genu oporności na gentamycynę (accC1, zielony) poprzez rekombinację Flp-FRT (miejsca FRT, żółty), tworząc nieoznaczony szczep. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Transformacja, łatanie i potwierdzanie insercji za pomocą PCR kolonii. Reprezentatywny wynik (A) wzrostu kolonii transformacyjnych po łataniu i (B) amplifikacji PCR kolonii za pomocą starterów ABglmS_F_New (szary) i Tn7R (pomarańczowy) w celu potwierdzenia insercji chromosomowej. Tor 1: Drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowej; Tor 2: ATCC 179798; Pas 3: AB258; Tor 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Tor 5: kontrola bez szablonu. Oczekiwane pasmo 382 pz jest oznaczone. Należy zauważyć, że startery specyficzne dla gentamycyny (Gm_F i Gm_R, zielony) mogą być również używane do potwierdzania insercji chromosomowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Potwierdzenie utraty markera przez PCR kolonii. Reprezentatywny wynik amplifikacji PCR kolonii starterami specyficznymi dla gentamycyny (Gm_F i Gm_R) w celu potwierdzenia utraty markera antybiotykowego poprzez wycięcie pFLP^{na podstawie ab}. Tor 1: drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowej; Tor 2: ATCC 179798; Pas 3: AB258; Tor 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Pas 5: AB258::adeIJK; Tor 6: kontrola bez szablonu. Oczekiwane pasmo 525 pz jest oznaczone. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:

Szczepy, plazmidy i startery	Istotne cechy	odniesienie
plama
A. baumannii ATCC 17978	Typ odkształcenia	Kontroler ATCC (Kontroler T
A. baumannii ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
plazmidy
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	GmR, AmpR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, AmpR, adeIJK	W ramach tego badania
pTNS2	WzmacniaczR	9
pFLP2ab	pWH1266 pochodzenie lub replikacja, sacB, AmpR	7
Podkłady	Sekwencja (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC powiedział:	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	W ramach tego badania
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	W ramach tego badania

Tabela 1: Szczepy bakteryjne, plazmidy i startery używane w tym protokole. Gm, gentamycyna; Amp, ampicylina; ^R, odporny.

) pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

	Ciprofloksacyna		Tetracyklina		Kanamycyna
Protokół IPTG	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978 (wersja angielska	0,250	Nd	0,500	Nd	1,5	Nd
Zobacz materiał AB258	0,031	Nd	0,063	Nd	4	Nd
AB258::adeIJK	0,016	0,063	0,031	0,125	8	cyfra arabska
Zmiana składania		Norma 4.01		Rozdział 4.03		0,25

Tabela 2: Testowanie funkcjonalności wstawionych genów poprzez wrażliwość na antybiotyki. Porównanie wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla A. baumannii ATCC 17978, AB258, nieindukowanego AB258::adeIJK i AB258::adeIJK indukowanego przez IPTG przeciwko cyprofloksacynie, tetracyklinie i kanamycynie. Zmiana krotności = indukowana (+ IPTG)/nieindukowana (− IPTG); nd = nie określono.

Discussion

Mimo że ta procedura chromosomalnej insercji indukowalnego systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią u A. baumannii jest technicznie prosta i nie jest pracochłonna, istnieje kilka ważnych kroków, które należy podkreślić. Po pierwsze, przygotowanie właściwych komórek musi odbywać się w jak największym stopniu na lodzie, ponieważ komórki stają się kruche podczas wymiany pożywki na lodowatą wodę. Idealnie byłoby, gdyby etapy wirowania odbywały się w temperaturze 4 °C, ale dopuszczalne jest wirowanie w temperaturze pokojowej. Biorąc pod uwagę rosnącą kruchość komórek podczas mycia wodą, kluczowe znaczenie ma również delikatne pipetowanie. Po drugie, elektroporacja jest wrażliwa na obecność jonów. Mycie komórek za pomocą wielu rund granulowania i ponownego zaparcia w wodzie zapewnia całkowite usunięcie nośnika. Ponadto plazmidy powinny być świeżo oczyszczone i mogą być eluowane w standardowych elucyjnych zestawu (zwykle bufor TE), o ile stężenie plazmidowego DNA jest wystarczająco wysokie. Naszym celem jest dodanie <5 μl plazmidu do 100 μl zawiesiny komórek, aby utrzymać bardzo niską siłę jonową próbki, chociaż należy tolerować do 10 μl. Po trzecie, w razie potrzeby należy przygotować selektywne płytki agarowe, aby zapewnić skuteczność dodanego antybiotyku. Należy zauważyć, że karbenicylina została użyta zamiast zwykłej ampicyliny do selekcji podczas transformacji plazmidu wycinającego, pFLP2^ab. A. baumannii jest wewnętrznie oporny na aminonicyliny (ampicylinę)¹⁶; Podstawienie karboksypenicyliny (karbenicyliny) pozwala na ciągłą selekcję kodowaną przez plazmid β-laktamazy.

Optymalizacja protokołu eksperymentalnego jest bardziej zniuansowana i będzie się różnić w zależności od różnych gatunków Acinetobacter (lub nawet genetycznie zmodyfikowanych szczepów tego samego gatunku) i ewentualnie konkretnych odczynników używanych w laboratorium. Na przykład napięcie używane do elektroporacji może wahać się od 1,8 do 2,5 kV, a warunki termocyklingu mogą wymagać nieznacznej zmiany w zależności od polimerazy DNA używanej do PCR. Pomocne wskazówki, które należy rozważyć, jeśli komórki słabo rosną po elektroporacji, obejmują zmniejszenie stężenia gentamycyny w płytkach agarowych z 50 μg/ml do 30 μg/ml i/lub wydłużenie czasu inkubacji płytek agarowych do ≥24 godzin. Jeśli chodzi o etapy usuwania kasety z gentamycyną, większy sukces można osiągnąć przy użyciu płytek agarowych LB z 10% sacharozą i/lub inkubacji w temperaturze 30 °C przez ≥24 godziny, jeśli utrzymuje się oporność na karbenicylinę.

W literaturze można znaleźć wiele metod przygotowania komórek A. baumannii do stosowania z elektroporacją, ale często obejmują one etap subkulturacji po początkowej hodowli przez noc, a następnie długą fazę wzrostu do zalecanej gęstości optycznej. Odkryliśmy, że prosta hodowla przez noc może być stosowana równie skutecznie. Elektroporacja A. baumannii została dobrze opisana, a czytelnicy mogą uzyskać więcej informacji na temat tego specyficznego aspektu protokołu tutaj^17,18. Kluczowymi zaletami tego systemu komplementacji genów chromosomu mini-Tn7 w porównaniu z systemem komplementacji opartym na plazmidzie są zdolność do regulowania poziomu ekspresji komplementowanego genu za pomocą kontrolowanego przez IPTG systemu represorowego lacI^q oraz wybór usunięcia markera gentamycyny (genu aacC1) za pomocą flankujące tereny FRT. Zaobserwowano, że tolerancja komórek na ekspresję pomp wypływowych może się różnić w zależności od włożonej pompy. Na przykład komórki są bardziej wrażliwe na ekspresję AdeIJK w porównaniu z AdeABC lub AdeFGH; Można temu zaradzić, modyfikując stężenie IPTG w warunkach hodowli. Usunięcie markera antybiotykowego zmniejsza ryzyko mutacji szczepu ze względu na ciągłą presję selekcyjną, a także pozwala na nieograniczone badania wrażliwości na antybiotyki³.

Ten system mini-Tn7 był z powodzeniem stosowany z gatunkami Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ i Acinetobacter ^5,6,21,22, jednak istnieją pewne ograniczenia. Na przykład u A. baumannii w genomie⁵ znajduje się tylko jedno funkcjonalne miejsce insercji attTn7, więc szczep może zostać utworzony z wieloma delecjami, ale tylko jeden gen na raz może być uzupełniony. Ponadto system ten nie został jeszcze udowodniony jako skuteczny w przypadku bakterii Gram-dodatnich¹⁰.

Pompy wypływowe RND są ważnymi czynnikami ułatwiającymi oporność na antybiotyki u A. baumannii. To, co czyni je tak potężnymi, to ich trzyczęściowa struktura, która rozciąga się na błonę wewnętrzną i zewnętrzną, umożliwiając usuwanie antybiotyków z peryplazmy na zewnątrz komórki. Wykazano, że najbardziej przebadane i wszechobecne pompy RND - oznaczone jako AdeABC, AdeFGH i AdeIJK - eliminują antybiotyki obejmujące wszystkie klasy. Szczegółowe wyjaśnienie funkcji pompy wypływowej będzie stanowić dobry punkt wyjścia do zaprojektowania nowych opcji terapeutycznych przeciwko szczepom wielolekoopornym. Użycie potrójnego szczepu delecyjnego pompy RND AB258 i uzupełnianie jednej pompy na raz pozwala na badanie każdej pompy niezależnie od pozostałych, rozróżniając dla każdej z nich unikalne profile substratów i najskuteczniejsze inhibitory. Oczywiście pompy wypływowe odgrywają również "codzienną" rolę w normalnym funkcjonowaniu bakterii. Zrozumienie tych ról może doprowadzić do pośredniego uszkodzenia pomp, co z kolei przerwałoby wypływ antybiotyków, co prawdopodobnie sprawiłoby, że bakterie wielolekooporne ponownie stałyby się podatne na powszechnie stosowane antybiotyki. Ogólnie rzecz biorąc, system mini-Tn7 może być używany do wprowadzania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania w celu szczegółowych badań lub pomocnych markerów, na przykład białek fluorescencyjnych do obrazowania mikroskopowego⁶.

Rosnące rozpowszechnienie bakterii wielolekoopornych jest problemem dla nas wszystkich. Zrozumienie mechanizmów ochronnych zapewnianych przez pompy wypływowe w patogenach takich jak A. baumannii ma kluczowe znaczenie dla zwalczania poważnych infekcji. Ten chromosomalny system ekspresji genów z pojedynczą kopią jest potężnym narzędziem do badań mechanistycznych, a także do identyfikacji inhibitorów udaremniających działanie pompy wypływowej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka do PCR 0,2 ml	VWR	20170-012	Do preparatów do gotowania kolonii i reakcji PCR
1,5 ml probówki do mikrofuge	Sarstedt	72-690-301	Probówki do hodowli ogólnego zastosowania
13 mL, Pyrex	Fisher	14-957K	Płynne naczynia hodowlane
6x bufor ładujący DNA	Froggabio	LD010	Żel agarozowy elektroforeza do ładowania próbki barwnik
octowy kwas, lodowiec	Fisher	351271-212	Składnik buforowy w żelu agarozowym
Agar	Bioshop	AGR003	Stałe podłoże wzrostowe
Agaroza	BioBasic	D0012	Separacja elektroforetyczna produktów reakcji PCR; stosowany w stężeniu 0,8– 2%
Jednostka do elektroforezy w żelu agarozowym	Fisher	29-237-54	Elektroforeza w żelu agarozowym; rozdzielanie produktów reakcji PCR
Karbenicylina	Fisher	50841231	Pożywki selektywne
Zamknięcia probówek hodowlanych	Fisher	13-684-138	Nakrętka ze stali nierdzewnej do probówek hodowlanych 13 ml
Zestaw trifosforanu deoksynukleotydu (dNTP)	Biobasic	DD0058	składnik reakcji PCR; dostarczane jako 100 mM każdy dATP, dCTP, dGTP, dTTP; zmieszane i rozcieńczone przez 10 mM każdy dNTP
Sucha kąpiel/grzałka blokowa	Fisher	88860023	Cyfrowa sucha łaźnia Isotemp do przygotowania wrzenia
Kuwety do elektroporacji	VWR	89047-208	Kuwety do elektroporacji 2 mm z okrągłą nasadką
Elektroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz Elektroporator
Bromek etydyny	Fisher	BP102-1	Wizualizacja produktów reakcji PCR i markera DNA w żelu agarozowym
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Składnik buforowy w żelu agarozowym
Gentamycyna	Biobasic	GB0217	Do przygotowania pożywek selektywnych
Glicerol	Fisher	G33	Przygotowanie zapasów bakterii do długotrwałego przechowywania w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze
Inkubator (wytrząsanie)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Wytrząsarka do wzrostu płynnych kultur
Inkubator (statyczny)	Fisher	11-690-550D	Piec do inkubatora izotemperaturowego Model 550D do wzrostu kultur stałych (agar LB)
Pętla inokulacyjna	Sarstedt	86.1562.050	Smugi kolonii na płytkach agarowych
Rozsiewacz inokulacji	Sarstedt	86.1569.005	Rozprzestrzenianie hodowla na płytkach agarowych
Rosół lizogeniczny (LB), Lennox	Fisher	BP1427	Płynna pożywka wzrostowa (20 g/l: 5 g/l chlorku sodu, 10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 do wirowania próbek
Miniwirówka	Fisher	S67601B	Wirowanie 0,2 ml probówek PCR
Szalki Petriego	SPL Nauki przyrodnicze	10090	Do stałych pożywek wzrostowych (płytki agarowe): 90 x 15 mm
Pipety	Mandel	Różne	pipety jednokanałowe Gilson (P10, P20, P200, P1000)
Zasilanie	Biorad	1645050	PowerPac Podstawowy zasilacz do elektroforezy
Startery Składnik	IDT	NA	PCR; specyficzny dla genu będącego przedmiotem zainteresowania; przygotowany w temperaturze 100 μ M zgodnie z zaleceniami w karcie specyfikacji produktu
Sacharoza	BioBasic	SB0498	Do przygotowania pożywek przeciwselektywnych do usuwania plazmidu pFLP2ab z transformowanego A. baumannii
Taq DNA polimeraza	FroggaBio	T-500	Składnik reakcji PCR; polimeraza dostarczana z 10x buforem
Termocykler	Biorad	1861096	Model T100 do PCR
Wykałaczki	Fisher	S24559	Do łatania kolonii na płytkach agarowych
Baza Trizma	Sigma	T1503	Składnik buforowy w żelu agarozowym
Woda ultraczysta	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ: ultra czysta woda do przygotowania pożywek i roztworów oraz mycia komórek
Szeroki zakres markerów DNA	Biobasic	M103R-2	Oznaczanie wielkości produktów PCR na żelu agarozowym
Drewniane patyczki do zaszczepiania	Fisher	29-801-02	Zaszczepianie kultur koloniami z płytek agarowych