Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66475

⸱

29 marca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of BioSciences, Rice University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj oferujemy praktyczną procedurę preparowania i przeprowadzania analiz histologicznych oraz analiz ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej.

Streszczenie

Termogeneza za pośrednictwem brązowej tkanki tłuszczowej (BAT) odgrywa ważną rolę w regulacji metabolizmu, a bodźce środowiskowe u myszy i ludzi mogą mieć duży wpływ na jej morfologię i funkcję. Obecnie mysi BAT międzyłopatkowy (iBAT), który znajduje się między dwiema łopatkami w górnej części grzbietowej boku myszy, jest głównym magazynem BAT wykorzystywanym przez laboratoria badawcze do badania funkcji BAT. Ostatnio u myszy zidentyfikowano kilka nieznanych wcześniej składów BAT, w tym jeden analogiczny do ludzkiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej. W przeciwieństwie do iBAT, mysia brunatna tkanka tłuszczowa nadobojczykowa (scBAT) znajduje się w warstwie pośredniej szyi i dlatego nie jest tak łatwo dostępna.

Aby ułatwić badanie nowo zidentyfikowanych myszy scBAT, poniżej przedstawiono protokół szczegółowo opisujący kroki do wypreparowania nienaruszonego scBAT od myszy po urodzeniu i dorosłych. Ze względu na niewielkie rozmiary scBAT w porównaniu z innymi magazynami tłuszczu, procedury zostały zmodyfikowane i zoptymalizowane specjalnie pod kątem przetwarzania scBAT. Wśród tych modyfikacji jest zastosowanie mikroskopu preparacyjnego podczas pobierania tkanek w celu zwiększenia precyzji i homogenizacji zamrożonych próbek scBAT w celu zwiększenia wydajności późniejszej analizy qPCR. Dzięki tym optymalizacjom można określić identyfikację, wygląd morfologiczny i charakterystykę molekularną scBAT u myszy.

Wprowadzenie

Rosnące rozpowszechnienie otyłości w Stanach Zjednoczonych i na całym świecie wzbudziło duże zainteresowanie zrozumieniem jej etiologii i identyfikacją potencjalnych metod leczenia1,2. Tkanka tłuszczowa odgrywa istotną rolę w metabolizmie, a rozregulowanie tkanki tłuszczowej może prowadzić do rozwoju otyłości. Generalnie wyróżnia się dwa rodzaje tkanki tłuszczowej, białą i brunatną tkankę tłuszczową. Podczas gdy biała tkanka tłuszczowa (WAT) może magazynować energię chemiczną i wydzielać czynniki endokrynne, brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) może wykorzystywać energię chemiczną do generowania ciepła i utrzymywania temperatury ciała w niskich temperaturach3,4. Ze względu na tę unikalną zdolność, aktywacja BAT może również zwiększyć wydatek energetyczny i poprawić wrażliwość na insulinę5.

BAT pełni swoją funkcję poprzez termogenezę bez dreszczy, proces, w którym pośredniczy rozprzęganie białka 1 (UCP1)6. Ssaki, w tym myszy i ludzie, posiadają różne ilości BAT. Klasyczny pogląd BAT jest taki, że te tkanki tłuszczowe występują w większej obfitości u myszy i niemowląt niż u dorosłych ludzi. iBAT, zlokalizowany w górnej części grzbietu między łopatkami, jest najlepiej zbadanym magazynem BAT u myszy. Stosując obrazowanie radioizotopowe i biopsje, ostatnie badania pozwoliły zidentyfikować kilka składów BAT u dorosłych ludzi. Niektóre z nich, w tym magazyny znalezione w głębokiej okolicy szyi i nadobojczykowej, nie zostały wcześniej zidentyfikowane u myszy lub innych zwierząt modelowych7,8,9,10,11. Spośród tych składów BAT, scBAT jest najczęściej spotykanym składowiskiem u dorosłych ludzi. Aby lepiej zrozumieć pochodzenie i molekularny wkład tych nowo odkrytych magazynów BAT u ludzi, konieczne jest zidentyfikowanie równoważnych magazynów u myszy, które umożliwiają manipulacje genetyczne i molekularne w celu prześledzenia i przetestowania funkcjonalnej roli tych magazynów. W ten sposób my i inni zidentyfikowaliśmy kilka wcześniej nieznanych magazynów BAT w różnych lokalizacjach anatomicznych u myszy, w tym scBAT12,13, piersiowy okołonaczyniowy BAT14,15, perineral BAT16 i periaorttic BAT17. Mysz scBAT anatomicznie przypomina ludzki scBAT i morfologicznie przypomina klasyczny iBAT, wyrażając wysoki poziom UCP112.

W przeciwieństwie do mysiego iBAT, który można łatwo rozciąć, scBAT znajduje się w warstwie pośredniej szyi myszy, poniżej gruczołów ślinowych i wzdłuż żyły szyjnej zewnętrznej. Odizolowanie tego magazynu do analiz histologicznych i molekularnych może być wyzwaniem. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę preparowania scBAT od myszy postnatalnych i dorosłych oraz przetwarzania tego magazynu do analizy histologicznej i ekspresji genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Baylor College of Medicine. Wszystkie zabiegi wykonano na samcach myszy C57BL/6J w wieku 3 tygodni i 3 miesięcy. Przed sekcją wszystkie myszy zostały poddane eutanazji przy użyciu zatwierdzonej procedury eutanazji dwutlenku węgla u gryzoni. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Analiza scBAT

  1. Umieść tuszę myszy na stole warsztatowym i wyczyść nożyczki chirurgiczne i bardzo drobne kleszcze punktowe 70% etanolem.
  2. Spryskaj brzuszną szyję myszy 70% etanolem, aby zwilżyć futro i zminimalizować zanieczyszczenie sierści.
  3. Wykonaj obustronne nacięcie, około 1,5 cm, wzdłuż obojczyków.
  4. Od końców poprzedniego nacięcia odetnij wzdłużnie w kierunku uszu, o długości około 1 cm. Spowoduje to utworzenie kwadratowego nacięcia w kształcie litery U wokół szyi (Rysunek 1A,B).
    UWAGA: scBAT leży w warstwie pośredniej szyjki. Na tym etapie odsłaniana jest warstwa powierzchowna, składająca się ze skóry, podskórnej tkanki tłuszczowej i gruczołów ślinowych. Warstwa pośrednia, wraz z scBAT, zawiera żyły szyjne i mięśnie szyi. Głęboka warstwa szyi, zawierająca głębokie BAT szyi oraz żyły tętnicze i szyjne, jest odsłaniana poprzez usunięcie mięśni szkieletowych.
  5. Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym i ustaw ostrość na odsłoniętej szyjce (Rysunek 1C).
    UWAGA: Ten dodatkowy krok znacznie zwiększa precyzję pobierania tkanek, co jest konieczne, biorąc pod uwagę niewielki rozmiar scBAT.
  6. Całkowicie odsłoń gruczoły ślinowe, odsuwając nacięte odcinki skóry kleszczami.
  7. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy odłącz tkankę łączącą gruczoły ślinowe z tkanką wokół obojczyków i ze sobą.
  8. Odsłoń magazyny scBAT, podnosząc gruczoły ślinowe. Poszukaj BAT wzdłuż zewnętrznej żyły szyjnej i ewentualnie połączonej ze spodem gruczołów ślinowych. Rozpoznaj go po pomarańczowym kolorze, który wyróżnia się na tle otaczającej tkanki.
  9. Przytrzymuj docelową tkankę tłuszczową kleszczami i delikatnie oderwij ją od gruczołów ślinowych.
  10. Po odłączeniu od gruczołów ślinowych należy kontynuować odłączanie scBAT od zewnętrznej żyły szyjnej i mięśni szyi, aż do momentu, gdy zajezdni po obu stronach szyi będą mogły zostać usunięte w całości.
  11. Sprawdź każdą wypreparowaną próbkę scBAT pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 1D, E), używając kleszczy do usunięcia pozostałej tkanki łącznej.
  12. Umieścić każdą próbkę w szklanej fiolce scyntylacyjnej zawierającej 10 ml buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS) i wyjąć mysz spod mikroskopu.

2. Przetwarzanie i barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) scBAT (zilustrowane w Rysunek 2A)

  1. Zastąp PBS (krok 1.12) 10 ml zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) i umieść fiolkę na nutatorze, kołysząc się w temperaturze 4 °C przez noc, aby zamocować scBAT.
    UWAGA: Utrwalanie perfuzji może być stosowane u myszy po urodzeniu, zwłaszcza dorosłych, gdy potrzebne jest dalsze przetwarzanie do analizy immunohistochemicznej.
  2. Następnego dnia usuń roztwór PFA z fiolki za pomocą sterylnej pipety transferowej i zastąp go 10-15 ml PBS. Umieścić fiolkę na nutatorze i rozdrabniać przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp PBS 0,85% roztworem soli fizjologicznej i kontynuuj kołysanie przez kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Roztwór soli zawiera 0,85% soli fizjologicznej (NaCl) w/v w wodzie uzdatnionej DEPC (bez RNaz). PBS można zastąpić roztworem soli w tym i następnym kroku.
  3. Usunąć 0,85% soli fizjologicznej za pomocą pipety transferowej i dodać 10 ml 70% roztworu etanolu/0,85% soli fizjologicznej do fiolki. Przechowywać fiolkę w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc lub do momentu, gdy będzie gotowa do zatopienia w parafinie.
    UWAGA: PBS można stosować, jeśli 0,85% soli fizjologicznej nie jest dostępne. scBAT powinien być przetwarzany tak szybko, jak to możliwe, aby ułatwić cięcie i lepiej zachowaną morfologię tkanki.
  4. Przed zatopieniem parafiny należy odwodnić scBAT poprzez serię wymian etanolu w celu usunięcia wody z tkanki.
    1. Na początek usuń 70% etanolu/0,85% soli fizjologicznej z fiolki za pomocą pipety transferowej i dodaj 10-15 ml 95% alkoholu odwadniającego, kołysząc fiolkę na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Powtórz ten krok jeden raz.
      UWAGA: Etanol może być stosowany zamiast roztworów alkoholu odwadniającego.
    2. Następnie zastąp 95% Dehydrant Alcohol 10-15 ml 100% Dehydrant Alcohol i kontynuuj kołysanie na nutatorze przez 1 godzinę. Napełnij nowym 100% Dehydrant Alcohol i kontynuuj kołysanie przez kilka godzin lub przez noc, w zależności od ilości scBAT w fiolce.
  5. Aby usunąć scBAT do zatopienia, dodaj 10 ml toluenu do fiolki i kontynuuj kołysanie na nutatorze, aż scBAT stanie się przezroczysty, około 6-8 godz.
    UWAGA: Czas niezbędny do uzyskania zadowalającego oczyszczenia zależy od wielkości scBAT. Zaleca się rozpoczęcie oczyszczania natychmiast rano, aby infiltracja i osadzanie mogły nastąpić po południu.
  6. Aby zatopić scBAT w wosku parafinowym, usuń toluen i dodaj 10 ml stopionego naciekającego wosku parafinowego do fiolki. Umieścić fiolkę w suszarce nagrzanej do 65 °C na 1 godzinę. Powtórz ten krok z nowym woskiem.
    UWAGA: Rozpocznij topienie granulek wosku w piekarniku przez noc przed rozpoczęciem osadzania, aby upewnić się, że wosk jest w pełni płynny.
  7. Zastąp naciekający wosk parafinowy zatopionym woskiem parafinowym i umieść fiolkę w tej samej temperaturze na 1 godzinę. Powtórz ten krok raz.
    UWAGA: Etap infiltracji może zostać przerwany i kontynuowany później. Wyjąć fiolkę z piekarnika i przechowywać ją w temperaturze pokojowej do momentu, gdy będzie gotowa do kontynuowania.
  8. Osadź tkankę, umieszczając ją najpierw w formie do zatapiania tkanek, dodaj stopiony wosk do zatapiania do formy i zmień orientację tkanki pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie umieść kasetę do osadzania na wosku i kontynuuj wylewanie wosku na wierzch, aż będzie pełna, a nasadka do osadzania zostanie przymocowana do bloku wosku. Przenieś blok do lodówki o temperaturze 4 °C na noc, aby wosk sztywniał i skurczył się przed wyjęciem metalowej formy.
  9. Pokrój scBAT za pomocą mikrotomu na grubość 5-6 μm18, trzy do czterech sekcji na szkiełko mikroskopowe i umieść w ciepłej kąpieli flotacyjnej sekcji parafinowej w temperaturze ~42 °C, aby umożliwić wygładzenie skrawków tkanki.
  10. Przenieś sekcje na szkiełka i umieść je pionowo na kąpieli pływackiej, aby woda mogła spływać po szkiełkach.
  11. Przenieś szkiełka na stojak do barwienia ze stali nierdzewnej i umieść ruszt na stole do suszenia szkiełek do wyschnięcia przez noc.
    UWAGA: Szkiełka parafinowe mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze pokojowej przed dalszą obróbką.
  12. Wykonaj barwienie H&E 19. Na początek umieść szkiełka w stojaku do barwienia, a następnie umieść stojak w słoiku do barwienia z ksylenem na 40 s. Powtórz ten krok raz.
    UWAGA: Jeśli po dwóch etapach parafina jest nadal widoczna, poczekaj, aż całkowicie się rozpuści, zanim przejdziesz dalej.
  13. Aby ponownie nawodnić tkankę, umieść stojak na szkiełka w słoiku do barwienia wypełnionym 100% alkoholem odwadniającym przez dwa 20 s etapy, następnie 15 s etap w 95% odwadniaczu i końcowe 15 s płukanie w ddH2O.
  14. Umieść szkiełka w naczyniu barwiącym wypełnionym roztworem hematoksyliny na 75 s, aby uzyskać barwienie jądrowe, a następnie przepłucz szkiełka w naczyniu barwiącym z ddH2O przez 45 s.
    UWAGA: Czas można dostosować w zależności od pożądanego koloru bejcy.
  15. Różnicować barwienie, zanurzając szkiełka w naczyniu barwiącym wypełnionym roztworem HCl-etanolu na 15 s, a następnie przenieść szkiełka do innego płukania ddH2O przez 15 s.
    UWAGA: Roztwór HCl-etanolu jest przygotowywany zgodnie z opublikowaną metodą19.
  16. W przypadku barwienia cytoplazmatycznego umieść szkiełko w roztworze przeciwbarwnikowym Eozyny Y na 15 sekund.
  17. Odwodnić tkankę, zanurzając szkiełka na 15 s każdy w trzech sekwencyjnych etapach roztworu 95% dehydratantu, a następnie dwóch sekwencyjnych kąpieli w 100% odwadniającym alkoholu - pierwsza przez 15 s, a druga przez 45 s - aby zakończyć odwodnienie.
  18. Na koniec przenieś szkiełka do kąpieli ksylenowej na 45 sekund, aby ponownie zaaklimatyzować tkankę do rozpuszczalników organicznych. Po tym kroku barwienie jest zakończone; Usuń tkankę z roztworu.
  19. Nałóż medium montażowe na każde szkiełko i nakryj je w dygestoriach chemicznych. Suszyć przez noc przed obrazowaniem. Wyniki obrazowania są pokazane w Rysunek 2B.

3. Analiza ekspresji genów scBAT

  1. Pobieranie tkanek (mielenie)
    1. Po wypreparowaniu scBAT, natychmiast umieść tkankę w probówce do mikrowirówki, przebij otwór w górnej części probówki sterylną igłą i zamroź w ciekłym azocie.
      UWAGA: Główne kroki opisanego tutaj protokołu są zilustrowane na Rysunek 3A. Zrobienie otworu w górnej części rurki przed wrzuceniem jej do ciekłego azotu zapobiega pękaniu rurki z powodu nagłej zmiany ciśnienia.
    2. Napełnij plastikową zlewkę ciekłym azotem i pozostaw tłuczek i cienką szpatułkę do namoczenia.
      UWAGA: Ważne jest, aby podczas całego zabiegu utrzymywać temperaturę wszystkich narzędzi i próbek tkanek tak niską, jak to możliwe, zbliżoną do temperatury ciekłego azotu, aby zapobiec rozmrażaniu tkanki. Rozmrożona tkanka tłuszczowa jest bardzo przylegająca i sprawia, że pudrowanie jest trudniejsze. Narzędzia i sample należy usuwać wyłącznie z kąpieli ciekłego azotu bezpośrednio przed użyciem.
    3. Pobieraj po jednej zamrożonej próbce tkanki na raz i wlewaj ją z probówki mikrowirówkowej do moździerza.
    4. Dodaj niewielką ilość ciekłego azotu do moździerza, a następnie za pomocą tłuczka zmielić zamrożoną tkankę, aż zostanie całkowicie sproszkowana.
      UWAGA: Jeśli w dowolnym momencie tkanka zacznie stawać się miękka lub lepka, oznacza to, że topi się; Wlej więcej ciekłego azotu do zaprawy.
    5. Za pomocą cienkiej szpatułki ostrożnie zeskrob i przenieś sproszkowaną tkankę z powrotem do probówki mikrowirówkowej. Wlej ciekły azot do moździerza podczas skrobania, aby zebrać resztki tkanki przed przeniesieniem szpatułką. Powtarzaj etapy przenoszenia, aż cała tkanka zostanie usunięta z moździerza.
    6. Oczyść moździerz za pomocą lekkiej wycieraczki do tkanek i 70% etanolu przed wrzuceniem następnej próbki do zmielenia. Sproszkowaną chusteczkę należy przechowywać przez długi czas w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
  2. Całkowita izolacja RNA
    1. preparat
      1. Wyczyść stół warsztatowy, pipety, uchwyty końcówek i stojaki na probówki zarówno 70% etanolem, jak i odkażaniem powierzchni, aby usunąć RNazę.
      2. Uruchomić wirówkę, aby osiągnąć temperaturę 4 °C.
      3. Podgrzać roztwór elucji do temperatury 70 °C.
      4. Rozcieńczyć DNazę I, mieszając 5 μl odtworzonej DNazy I z 75 μl roztworu rozcieńczającego DNazę na próbkę. Umieścić roztwór DNazy I na lodzie do czasu użycia.
    2. procedura
      1. Dla każdej próbki oznaczyć dwie probówki do mikrowirówek, dwie probówki przytrzymujące kolumnę (dwie probówki do mikrowirówek z podziałką bez nasadki) i jedną mini kolumnę wiążącą.
      2. Dodać 500 μl roztworu izolacyjnego RNA do każdej próbki i sonikować za pomocą silnika do peletów przez 30 s.
      3. Weź strzykawkę do każdej próbki i pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby dalej lizować tkankę. Upewnić się, że po wstrzyknięciu nie są widoczne żadne ciała stałe.
      4. Od czasu do czasu dodawać 250 μl chloroformu i wirować, czekając 5 minut na inkubację próbek w temperaturze pokojowej.
      5. Wirować przy 21 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      6. Przenieś górną część wody do nowej probówki do mikrowirówki i dodaj równoważną ilość 70% etanolu (~500 μL).
        UWAGA: Górna część wodna powinna być przezroczysta, dolna powinna być czerwonym roztworem izolacyjnym RNA, a pomiędzy dwiema warstwami powinny znajdować się niepożądane ciała stałe.
      7. Przenieść 500 μl nowego lizatu do kolumny wiążącej. Wirować przy 18 000 × g przez 60 s, a następnie wyrzucić filtrat.
      8. Powtórz poprzedni krok z pozostałym lizatem, aby wprowadzić cały RNA do kolumny wiążącej.
      9. Dodać 700 μl przemywania o niskiej rygorystyczności do kolumny wiążącej, odwirować przez 30 s i wyrzucić filtrat.
      10. Dodać 80 μl rozcieńczonej DNazy I do każdej kolumny wiążącej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      11. Dodać 700 μl płukania o wysokiej rygorystyczności, odwirować przez 30 s i wyrzucić filtrat.
      12. Dodać 700 μl płukania o niskiej rygorystyczności, odwirować przez 60 s i wyrzucić filtrat.
      13. Przenieś kolumny wiążące do drugiej nowej rurki przytrzymującej kolumnę bez nasadki i wiruj przez 2 minuty, aby upewnić się, że wszystkie płyny zostały usunięte z kolumny wiążącej.
      14. Przenieść kolumny wiążące do nowej probówki do mikrowirówki i dodać 30 μl podgrzanego roztworu elucyjnego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
      15. Wirować przez 2 minuty, aby zebrać eluowany RNA na dnie probówki do mikrowirówki.
      16. Zmierz całkowite stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
        UWAGA: Jeżeli całkowita czystość RNA jest niska, na co wskazuje wartość 260/280 poniżej 2,0 lub wartość 260/230 poniżej 1,8, to po kroku 3.2.2.12 próbki można ponownie przemyć myciem o niskiej rygorystyczności, a następnie przemyć 80% etanolem przed kontynuowaniem kroku 3.2.2.13.
      17. Przechowywać RNA w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    3. Odwrotna transkrypcja (RT)
      1. W pasku probówki do PCR dodaj 0,5-1 μg całkowitego RNA rozcieńczonego w wodzie uzdatnionej DEPC, co daje łącznie 8 μl dla każdej próbki RNA do innego dołka.
        UWAGA: Ilość RNA używanego do odwrotnej transkrypcji może być skalowana w górę lub w dół zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Dodać 1 μl oligo dT i 1 μl dNTP do każdej próbki w probówce PCR. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 10 μl na próbkę.
      3. Umieść pasek probówki PCR w termocyklerze i ustaw go na 65 °C na 5 minut, a następnie 4 °C na czas nieokreślony.
      4. Po 5 minutach w temperaturze 65 °C wyjąć pasek probówki do PCR i umieścić probówkę na lodzie na co najmniej 2 minuty. Po inkubacji na lodzie dodać pięć odczynników: 4 μL 5x buforu pierwszej nici, 2 μL 25 mM MgCl2, 2 μL 0,1 M DTT, 1 μL inhibitora RNazy i 1 μL odwrotnej transkryptazy do każdej próbki. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi teraz 20 μl na próbkę.
      5. Umieść pasek probówki PCR z powrotem w termocyklerze i ustaw program na 50 °C na 50 minut, następnie 85 °C na 5 minut, a następnie 4 °C w nieskończoność.
      6. Gdy program osiągnie temperaturę 4 °C, wyjąć pasek i dodać 1 μl rybonukleazy H (RNazy H).
        UWAGA: RNaza H służy do usuwania pozostałej matrycy RNA w reakcji RT; na tym etapie pożądane RNA powinno być już przekształcone w cDNA.
      7. Umieść pasek z powrotem w termocyklerze i uruchom w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie 4 °C w nieskończoność.
      8. Odwrotna transkrypcja jest zakończona; zmierz stężenie cDNA za pomocą spektrofotometru.
      9. Rozcieńczyć cDNA do 250 ng/μl; przechowywać cDNA w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub -20 °C.
    4. Ilościowy PCR (qPCR)
      1. Sporządź arkusz kalkulacyjny, aby uporządkować położenie każdego startera i próbki na 96-dołkowej płytce qPCR.
        UWAGA: Jeden ze starterów musi być genem referencyjnym, aby znormalizować ekspresję wszystkich innych interesujących genów, takich jak 36B4.
      2. Przygotuj główną mieszankę podkładu dla każdej kombinacji "podkład + próbka". Do każdej studzienki reakcji qPCR dodaj 3 μl wody klasy biologii molekularnej, 5 μl mieszaniny głównej enzymu qPCR, 0,5 μl startera do przodu i 0,5 μl startera odwrotnego, co daje 9 μl na reakcję. Dodaj 1 μl cDNA na reakcję, aby uzyskać w sumie 10 μl na dołek reakcji.
        UWAGA: Standardem jest posiadanie trzech kontrprób technicznych dla każdej kombinacji "starter + próbka", więc każda mieszanka wzorcowa powinna być 4 razy większa od powyższych ilości.
      3. Dodać 1 μl cDNA dla każdej kontrpróby do każdej głównej mieszaniny starterów. Jeśli każda mieszanka główna ma wielkość 4x, odpipetuj 4 μl każdej próbki cDNA do ich własnej znakowanej probówki.
      4. Na koniec odpipetować 10 μl każdej mieszaniny reakcyjnej do 96-dołkowej płytki qPCR w pozycjach określonych przez arkusz kalkulacyjny.
      5. Uszczelnić płytkę grubym klejem, a następnie odwirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 450 × g w temperaturze 20 °C przez 2 min.
        UWAGA: Bardzo ważne jest, aby płyta była w pełni uszczelniona, aby uniknąć parowania próbek podczas termocyklingu. Użyj lekkich wycieraczek do chusteczek, aby docisnąć uszczelkę do płytki, zwłaszcza do krawędzi.
      6. Uruchom płytkę w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym. Zaprogramuj reakcję PCR zgodnie z instrukcjami producenta: 2 minuty w 50 °C, następnie kolejne 2 minuty w 95 °C, a na końcu 40 cykli po 15 s w 95 °C i 30 s w 60 °C. Wyniki analizy ekspresji genów qPCR przedstawiono w Rysunek 3B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przeciwieństwie do iBAT, który znajduje się w warstwie podskórnej pleców pomiędzy łopatkami, scBAT zlokalizowany jest w warstwie pośredniej szyi, rozciągając się głęboko pomiędzy warstwami mięśni szkieletowych a gruczołem ślinowym w miarę wzrostu wzdłuż żyły szyjnej zewnętrznej (Rysunek 1A). Disekcja scBAT nie jest tak prosta jak w przypadku iBAT. Przedstawiamy tutaj szczegółową procedurę, zawierającą kluczowe etapy wyizolowania nienaruszonego scBAT od mysz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym protokole szczegółowo przedstawiamy procedury preparacji i przetwarzania scBAT do analiz H&E i ekspresji genów. Ponieważ scBAT znajduje się w warstwie pośredniej szyjki i leży wzdłuż dużych żył, izolacja tego magazynu wymaga precyzyjnej techniki. W szczególności, aby uzyskać wyraźny widok na magazyn, zalecamy umieszczenie myszy pod mikroskopem preparacyjnym po otwarciu szyi. Używając pary bardzo cienkich kleszczyków punktowych do odklejania scBAT z gruczołu ślinowego i otaczających żył, należy zachować ostro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez NIDDK NIH pod numerem nagrody R01DK116899, USDA/ARS pod numerem nagrody 3092-51000-064-000D, oraz nagrodę pilotażową od Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. Schematy blokowe zostały wykonane przy użyciu BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
95% Alkohol do odwadniania (Flex 95)Epredia8201
100% Alkohol do odwadniania (Flex 100)Epredia8101
96-dołkowa płytka do PCRBio-RadMLL9601
Aurum Wiążąca mini kolumnaBio-Rad7326826
Aurum Mycie o wysokiej rygorystycznościBio-Rad7326803
Aurum Mycie o niskiej rygorystycznościBio-Rad7326804
(do zatapiania)Tissue-Tek4122
BD Igła PrecisionGlide 21g x 1 1/2"Becton Dickinson305167
C1000 Touch TermocyklerBio-Rad1840148
Probówki do mikrowirówek bez nakrętki 2 mlFisherbrand02-681-453
Wirówka Eppendorf5430R
CFX Opus 96 Instrument do PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad12011319
ChloroformThermo Scientific Chemicals383760010
Cytoseal 60 Medium montażowe o niskiej lepkościEpredia83104
DEPC-Uzdatniona wodaAmbionAM 9906
Mikroskop preparacyjnyNikon
Roztwór do rozcieńczania DNazyBio-Rad7326805
DNase IBio-Rad7326828
dNTPsInvitrogen18427013
roztwór elucyjnyBio-Rad7326801
EM 400 zatapianie pożywki parafinowejLeica Biosystems3801320
Eozyna Y (0,5% w/v)RICCA2858-16
Formula R Medium infiltracyjne parafinaLeica Biosystems3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349Bio ExpressS-3200-2
Gill #3 HematoxylinSigma-AldrichGHS332-1L
HCl (do HCL-etanolu)Fisher ChemicalA142212
IP VI Kasety do zatapianiaLeica Biosystems39LC-550-L
Czysty etanol firmy Koptec - 200 Proof (dla 70% etanolu)Decon LabsV1001
MgCl2 (25 mM)ProbówkiScientific R0971
1,7 mlAvantor87003-294
Uszczelki mikrouszczelniające "B" (uszczelki adhseive)Bio-RadMSB1001
MikrotomLeica BiosystemsRM2245
Biologia molekularna Klasa wodyCorning46-000-CM
Moździerz Coors TekThomas Scientific60310
NaCl (dla 0,85% soli fizjologicznej)Fisher BioreagentsBP358-212
SpektrofotometrNanoDrop TechnologieND-1000 UV/Vis
Oligo dTInvitrogen18418020
Sekcja parafinowa Kąpiel flotacyjnaBoekel Scientific14792V
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-AldrichP6148-500G
Pasek rurki PCRAvantor76318-802
Tłuczek firmy Coors TekThomas Scientific60311
Silnik do peletu TłuczekKimble749540-0000
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
Piec próżniowy Precision Model 19 do 51221162Thermo Fisher Scientific
: 36B4  (do przodu) 10 μ M
5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'		Chen lab Oligo database
Elementarz: 36B4 (odwrócony) 10 μ M
5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'		Chen lab Oligo database
Elementarz: Fabp4 (do przodu) 10 μ M
5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'		Chen lab Oligo database
Elementarz: Fabp4 (odwrócony) 10 μ M
5' CCA, TCT, AGG, GTT, ATG, ATG, CTC, TTC, A, TC, A, 3'		Chen lab Oligo database
Elementarz: Glut 4 (starter do przodu) 10 μ M
5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT CCT 3'		Chen lab Oligo database
Elementarz: Glut 4 (odwrócony) 10 μ M
5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'		Chen lab Oligo database
Elementarz: PPARg (do przodu) 10 μ M
5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'		Chen lab Baza danych oligo
Elementarz: PPARg (rezerwa) 10 μ M
5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'		Chen lab Oligo database
Elementarz: Ppargc1a (odwrócony) 10 μ M
5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'		Chen lab Oligo database
Elementarz: Ppargc1a(naprzód) 10 μ M
5' ACG TCC CTG CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'		Chen lab Oligo database
Elementarz: Ucp1 (do przodu) 10 μ M
5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'		Chen lab Oligo
database Primer: Ucp1 (odwrócony) 10 μ M
5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'		Chen lab Baza danych Oligo
Roztwór do izolacji RNA (PureZol)Bio-Rad7326880
RNase Away (odkażanie powierzchni)Thermo Scientific1437535
RNaza HNEBM0297S
Inhibitor rnazy (RNaza na zewnątrz)Invitrogen10777019
Fiolka scyntylacyjna (szkło)Mikroskopia elektronowa Sciences72632
Ławka do suszenia szkiełek Elektrotermiczny (Cole-Parmer)MH6616
Stojak do barwienia ze stali nierdzewnejMikroskopia elektronowa Sciences70312-54
Mikroskop stereoskopowy (do zabudowy)NożyczkiSZ51
McKesson43-1-104
Kleszcze preparacyjne proste Superfine pointAvantor82027-402
Superfrost Plus Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-550-15
Indeks górny III Odwrotna transkryptaza (zawiera 5x bufor pierwszej nici i 0,1 M DTT) Invitrogen18080044
Strzykawka SUR-VET z igłą 25 G x 5/8", 1 mlTerumo100281
SYBR Green (główna mieszanina enzymów qPCR)Applied BiosystemsA25778
Manualny zestaw do barwienia szkiełek Tissue-Tek (słoiki)Nauki o mikroskopii elektronowejSKU: 62540-01
ToluenFisher ChemicalT324-1
Pipeta transferowaAvantor414004-005
XyleneFisher ChemicalX3P-1GAL
Formy bazowe SMZ1500 do mikrowirówek Thermo Fisher Podkład CAT# sugiczne Olympus

Bibliografia

  1. Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217(2022).
  2. Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
  3. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  4. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
  5. Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530(2021).
  6. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  7. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  8. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  9. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  10. Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
  11. Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
  12. Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166(2017).
  13. Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370(2021).
  14. Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
  15. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
  16. de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
  17. Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
  18. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796(2017).
  19. Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Disekcja tkanekbarwienie hematoksyliną i eozynąizolacja RNAilościowa PCRmikroskop dyssekcyjnytkanka tłuszczowa myszy
Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.