Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

Summary

Tutaj oferujemy praktyczną procedurę preparowania i przeprowadzania analiz histologicznych oraz analiz ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej.

Abstract

Termogeneza za pośrednictwem brązowej tkanki tłuszczowej (BAT) odgrywa ważną rolę w regulacji metabolizmu, a bodźce środowiskowe u myszy i ludzi mogą mieć duży wpływ na jej morfologię i funkcję. Obecnie mysi BAT międzyłopatkowy (iBAT), który znajduje się między dwiema łopatkami w górnej części grzbietowej boku myszy, jest głównym magazynem BAT wykorzystywanym przez laboratoria badawcze do badania funkcji BAT. Ostatnio u myszy zidentyfikowano kilka nieznanych wcześniej składów BAT, w tym jeden analogiczny do ludzkiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej. W przeciwieństwie do iBAT, mysia brunatna tkanka tłuszczowa nadobojczykowa (scBAT) znajduje się w warstwie pośredniej szyi i dlatego nie jest tak łatwo dostępna.

Aby ułatwić badanie nowo zidentyfikowanych myszy scBAT, poniżej przedstawiono protokół szczegółowo opisujący kroki do wypreparowania nienaruszonego scBAT od myszy po urodzeniu i dorosłych. Ze względu na niewielkie rozmiary scBAT w porównaniu z innymi magazynami tłuszczu, procedury zostały zmodyfikowane i zoptymalizowane specjalnie pod kątem przetwarzania scBAT. Wśród tych modyfikacji jest zastosowanie mikroskopu preparacyjnego podczas pobierania tkanek w celu zwiększenia precyzji i homogenizacji zamrożonych próbek scBAT w celu zwiększenia wydajności późniejszej analizy qPCR. Dzięki tym optymalizacjom można określić identyfikację, wygląd morfologiczny i charakterystykę molekularną scBAT u myszy.

Introduction

Rosnące rozpowszechnienie otyłości w Stanach Zjednoczonych i na całym świecie wzbudziło duże zainteresowanie zrozumieniem jej etiologii i identyfikacją potencjalnych metod leczenia^1,2. Tkanka tłuszczowa odgrywa istotną rolę w metabolizmie, a rozregulowanie tkanki tłuszczowej może prowadzić do rozwoju otyłości. Generalnie wyróżnia się dwa rodzaje tkanki tłuszczowej, białą i brunatną tkankę tłuszczową. Podczas gdy biała tkanka tłuszczowa (WAT) może magazynować energię chemiczną i wydzielać czynniki endokrynne, brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) może wykorzystywać energię chemiczną do generowania ciepła i utrzymywania temperatury ciała w niskich temperaturach^3,4. Ze względu na tę unikalną zdolność, aktywacja BAT może również zwiększyć wydatek energetyczny i poprawić wrażliwość na insulinę⁵.

BAT pełni swoją funkcję poprzez termogenezę bez dreszczy, proces, w którym pośredniczy rozprzęganie białka 1 (UCP1)⁶. Ssaki, w tym myszy i ludzie, posiadają różne ilości BAT. Klasyczny pogląd BAT jest taki, że te tkanki tłuszczowe występują w większej obfitości u myszy i niemowląt niż u dorosłych ludzi. iBAT, zlokalizowany w górnej części grzbietu między łopatkami, jest najlepiej zbadanym magazynem BAT u myszy. Stosując obrazowanie radioizotopowe i biopsje, ostatnie badania pozwoliły zidentyfikować kilka składów BAT u dorosłych ludzi. Niektóre z nich, w tym magazyny znalezione w głębokiej okolicy szyi i nadobojczykowej, nie zostały wcześniej zidentyfikowane u myszy lub innych zwierząt modelowych^7,8,9,10,11. Spośród tych składów BAT, scBAT jest najczęściej spotykanym składowiskiem u dorosłych ludzi. Aby lepiej zrozumieć pochodzenie i molekularny wkład tych nowo odkrytych magazynów BAT u ludzi, konieczne jest zidentyfikowanie równoważnych magazynów u myszy, które umożliwiają manipulacje genetyczne i molekularne w celu prześledzenia i przetestowania funkcjonalnej roli tych magazynów. W ten sposób my i inni zidentyfikowaliśmy kilka wcześniej nieznanych magazynów BAT w różnych lokalizacjach anatomicznych u myszy, w tym scBAT^12,13, piersiowy okołonaczyniowy BAT^14,15, perineral BAT¹⁶ i periaorttic BAT¹⁷. Mysz scBAT anatomicznie przypomina ludzki scBAT i morfologicznie przypomina klasyczny iBAT, wyrażając wysoki poziom UCP1¹².

W przeciwieństwie do mysiego iBAT, który można łatwo rozciąć, scBAT znajduje się w warstwie pośredniej szyi myszy, poniżej gruczołów ślinowych i wzdłuż żyły szyjnej zewnętrznej. Odizolowanie tego magazynu do analiz histologicznych i molekularnych może być wyzwaniem. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę preparowania scBAT od myszy postnatalnych i dorosłych oraz przetwarzania tego magazynu do analizy histologicznej i ekspresji genów.

Protocol

Procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Baylor College of Medicine. Wszystkie zabiegi wykonano na samcach myszy C57BL/6J w wieku 3 tygodni i 3 miesięcy. Przed sekcją wszystkie myszy zostały poddane eutanazji przy użyciu zatwierdzonej procedury eutanazji dwutlenku węgla u gryzoni. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Analiza scBAT

1. Umieść tuszę myszy na stole warsztatowym i wyczyść nożyczki chirurgiczne i bardzo drobne kleszcze punktowe 70% etanolem.
2. Spryskaj brzuszną szyję myszy 70% etanolem, aby zwilżyć futro i zminimalizować zanieczyszczenie sierści.
3. Wykonaj obustronne nacięcie, około 1,5 cm, wzdłuż obojczyków.
4. Od końców poprzedniego nacięcia odetnij wzdłużnie w kierunku uszu, o długości około 1 cm. Spowoduje to utworzenie kwadratowego nacięcia w kształcie litery U wokół szyi (Rysunek 1A,B).
   UWAGA: scBAT leży w warstwie pośredniej szyjki. Na tym etapie odsłaniana jest warstwa powierzchowna, składająca się ze skóry, podskórnej tkanki tłuszczowej i gruczołów ślinowych. Warstwa pośrednia, wraz z scBAT, zawiera żyły szyjne i mięśnie szyi. Głęboka warstwa szyi, zawierająca głębokie BAT szyi oraz żyły tętnicze i szyjne, jest odsłaniana poprzez usunięcie mięśni szkieletowych.
5. Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym i ustaw ostrość na odsłoniętej szyjce (Rysunek 1C).
   UWAGA: Ten dodatkowy krok znacznie zwiększa precyzję pobierania tkanek, co jest konieczne, biorąc pod uwagę niewielki rozmiar scBAT.
6. Całkowicie odsłoń gruczoły ślinowe, odsuwając nacięte odcinki skóry kleszczami.
7. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy odłącz tkankę łączącą gruczoły ślinowe z tkanką wokół obojczyków i ze sobą.
8. Odsłoń magazyny scBAT, podnosząc gruczoły ślinowe. Poszukaj BAT wzdłuż zewnętrznej żyły szyjnej i ewentualnie połączonej ze spodem gruczołów ślinowych. Rozpoznaj go po pomarańczowym kolorze, który wyróżnia się na tle otaczającej tkanki.
9. Przytrzymuj docelową tkankę tłuszczową kleszczami i delikatnie oderwij ją od gruczołów ślinowych.
10. Po odłączeniu od gruczołów ślinowych należy kontynuować odłączanie scBAT od zewnętrznej żyły szyjnej i mięśni szyi, aż do momentu, gdy zajezdni po obu stronach szyi będą mogły zostać usunięte w całości.
11. Sprawdź każdą wypreparowaną próbkę scBAT pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 1D, E), używając kleszczy do usunięcia pozostałej tkanki łącznej.
12. Umieścić każdą próbkę w szklanej fiolce scyntylacyjnej zawierającej 10 ml buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS) i wyjąć mysz spod mikroskopu.

2. Przetwarzanie i barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) scBAT (zilustrowane w Rysunek 2A)

1. Zastąp PBS (krok 1.12) 10 ml zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) i umieść fiolkę na nutatorze, kołysząc się w temperaturze 4 °C przez noc, aby zamocować scBAT.
   UWAGA: Utrwalanie perfuzji może być stosowane u myszy po urodzeniu, zwłaszcza dorosłych, gdy potrzebne jest dalsze przetwarzanie do analizy immunohistochemicznej.
2. Następnego dnia usuń roztwór PFA z fiolki za pomocą sterylnej pipety transferowej i zastąp go 10-15 ml PBS. Umieścić fiolkę na nutatorze i rozdrabniać przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp PBS 0,85% roztworem soli fizjologicznej i kontynuuj kołysanie przez kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Roztwór soli zawiera 0,85% soli fizjologicznej (NaCl) w/v w wodzie uzdatnionej DEPC (bez RNaz). PBS można zastąpić roztworem soli w tym i następnym kroku.
3. Usunąć 0,85% soli fizjologicznej za pomocą pipety transferowej i dodać 10 ml 70% roztworu etanolu/0,85% soli fizjologicznej do fiolki. Przechowywać fiolkę w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc lub do momentu, gdy będzie gotowa do zatopienia w parafinie.
   UWAGA: PBS można stosować, jeśli 0,85% soli fizjologicznej nie jest dostępne. scBAT powinien być przetwarzany tak szybko, jak to możliwe, aby ułatwić cięcie i lepiej zachowaną morfologię tkanki.
4. Przed zatopieniem parafiny należy odwodnić scBAT poprzez serię wymian etanolu w celu usunięcia wody z tkanki.
   1. Na początek usuń 70% etanolu/0,85% soli fizjologicznej z fiolki za pomocą pipety transferowej i dodaj 10-15 ml 95% alkoholu odwadniającego, kołysząc fiolkę na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Powtórz ten krok jeden raz.
      UWAGA: Etanol może być stosowany zamiast roztworów alkoholu odwadniającego.
   2. Następnie zastąp 95% Dehydrant Alcohol 10-15 ml 100% Dehydrant Alcohol i kontynuuj kołysanie na nutatorze przez 1 godzinę. Napełnij nowym 100% Dehydrant Alcohol i kontynuuj kołysanie przez kilka godzin lub przez noc, w zależności od ilości scBAT w fiolce.
5. Aby usunąć scBAT do zatopienia, dodaj 10 ml toluenu do fiolki i kontynuuj kołysanie na nutatorze, aż scBAT stanie się przezroczysty, około 6-8 godz.
   UWAGA: Czas niezbędny do uzyskania zadowalającego oczyszczenia zależy od wielkości scBAT. Zaleca się rozpoczęcie oczyszczania natychmiast rano, aby infiltracja i osadzanie mogły nastąpić po południu.
6. Aby zatopić scBAT w wosku parafinowym, usuń toluen i dodaj 10 ml stopionego naciekającego wosku parafinowego do fiolki. Umieścić fiolkę w suszarce nagrzanej do 65 °C na 1 godzinę. Powtórz ten krok z nowym woskiem.
   UWAGA: Rozpocznij topienie granulek wosku w piekarniku przez noc przed rozpoczęciem osadzania, aby upewnić się, że wosk jest w pełni płynny.
7. Zastąp naciekający wosk parafinowy zatopionym woskiem parafinowym i umieść fiolkę w tej samej temperaturze na 1 godzinę. Powtórz ten krok raz.
   UWAGA: Etap infiltracji może zostać przerwany i kontynuowany później. Wyjąć fiolkę z piekarnika i przechowywać ją w temperaturze pokojowej do momentu, gdy będzie gotowa do kontynuowania.
8. Osadź tkankę, umieszczając ją najpierw w formie do zatapiania tkanek, dodaj stopiony wosk do zatapiania do formy i zmień orientację tkanki pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie umieść kasetę do osadzania na wosku i kontynuuj wylewanie wosku na wierzch, aż będzie pełna, a nasadka do osadzania zostanie przymocowana do bloku wosku. Przenieś blok do lodówki o temperaturze 4 °C na noc, aby wosk sztywniał i skurczył się przed wyjęciem metalowej formy.
9. Pokrój scBAT za pomocą mikrotomu na grubość 5-6 μm¹⁸, trzy do czterech sekcji na szkiełko mikroskopowe i umieść w ciepłej kąpieli flotacyjnej sekcji parafinowej w temperaturze ~42 °C, aby umożliwić wygładzenie skrawków tkanki.
10. Przenieś sekcje na szkiełka i umieść je pionowo na kąpieli pływackiej, aby woda mogła spływać po szkiełkach.
11. Przenieś szkiełka na stojak do barwienia ze stali nierdzewnej i umieść ruszt na stole do suszenia szkiełek do wyschnięcia przez noc.
    UWAGA: Szkiełka parafinowe mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze pokojowej przed dalszą obróbką.
12. Wykonaj barwienie H&E ¹⁹. Na początek umieść szkiełka w stojaku do barwienia, a następnie umieść stojak w słoiku do barwienia z ksylenem na 40 s. Powtórz ten krok raz.
    UWAGA: Jeśli po dwóch etapach parafina jest nadal widoczna, poczekaj, aż całkowicie się rozpuści, zanim przejdziesz dalej.
13. Aby ponownie nawodnić tkankę, umieść stojak na szkiełka w słoiku do barwienia wypełnionym 100% alkoholem odwadniającym przez dwa 20 s etapy, następnie 15 s etap w 95% odwadniaczu i końcowe 15 s płukanie w ddH₂O.
14. Umieść szkiełka w naczyniu barwiącym wypełnionym roztworem hematoksyliny na 75 s, aby uzyskać barwienie jądrowe, a następnie przepłucz szkiełka w naczyniu barwiącym z ddH₂O przez 45 s.
    UWAGA: Czas można dostosować w zależności od pożądanego koloru bejcy.
15. Różnicować barwienie, zanurzając szkiełka w naczyniu barwiącym wypełnionym roztworem HCl-etanolu na 15 s, a następnie przenieść szkiełka do innego płukania ddH₂O przez 15 s.
    UWAGA: Roztwór HCl-etanolu jest przygotowywany zgodnie z opublikowaną metodą¹⁹.
16. W przypadku barwienia cytoplazmatycznego umieść szkiełko w roztworze przeciwbarwnikowym Eozyny Y na 15 sekund.
17. Odwodnić tkankę, zanurzając szkiełka na 15 s każdy w trzech sekwencyjnych etapach roztworu 95% dehydratantu, a następnie dwóch sekwencyjnych kąpieli w 100% odwadniającym alkoholu - pierwsza przez 15 s, a druga przez 45 s - aby zakończyć odwodnienie.
18. Na koniec przenieś szkiełka do kąpieli ksylenowej na 45 sekund, aby ponownie zaaklimatyzować tkankę do rozpuszczalników organicznych. Po tym kroku barwienie jest zakończone; Usuń tkankę z roztworu.
19. Nałóż medium montażowe na każde szkiełko i nakryj je w dygestoriach chemicznych. Suszyć przez noc przed obrazowaniem. Wyniki obrazowania są pokazane w Rysunek 2B.

3. Analiza ekspresji genów scBAT

1. Pobieranie tkanek (mielenie)
   1. Po wypreparowaniu scBAT, natychmiast umieść tkankę w probówce do mikrowirówki, przebij otwór w górnej części probówki sterylną igłą i zamroź w ciekłym azocie.
      UWAGA: Główne kroki opisanego tutaj protokołu są zilustrowane na Rysunek 3A. Zrobienie otworu w górnej części rurki przed wrzuceniem jej do ciekłego azotu zapobiega pękaniu rurki z powodu nagłej zmiany ciśnienia.
   2. Napełnij plastikową zlewkę ciekłym azotem i pozostaw tłuczek i cienką szpatułkę do namoczenia.
      UWAGA: Ważne jest, aby podczas całego zabiegu utrzymywać temperaturę wszystkich narzędzi i próbek tkanek tak niską, jak to możliwe, zbliżoną do temperatury ciekłego azotu, aby zapobiec rozmrażaniu tkanki. Rozmrożona tkanka tłuszczowa jest bardzo przylegająca i sprawia, że pudrowanie jest trudniejsze. Narzędzia i sample należy usuwać wyłącznie z kąpieli ciekłego azotu bezpośrednio przed użyciem.
   3. Pobieraj po jednej zamrożonej próbce tkanki na raz i wlewaj ją z probówki mikrowirówkowej do moździerza.
   4. Dodaj niewielką ilość ciekłego azotu do moździerza, a następnie za pomocą tłuczka zmielić zamrożoną tkankę, aż zostanie całkowicie sproszkowana.
      UWAGA: Jeśli w dowolnym momencie tkanka zacznie stawać się miękka lub lepka, oznacza to, że topi się; Wlej więcej ciekłego azotu do zaprawy.
   5. Za pomocą cienkiej szpatułki ostrożnie zeskrob i przenieś sproszkowaną tkankę z powrotem do probówki mikrowirówkowej. Wlej ciekły azot do moździerza podczas skrobania, aby zebrać resztki tkanki przed przeniesieniem szpatułką. Powtarzaj etapy przenoszenia, aż cała tkanka zostanie usunięta z moździerza.
   6. Oczyść moździerz za pomocą lekkiej wycieraczki do tkanek i 70% etanolu przed wrzuceniem następnej próbki do zmielenia. Sproszkowaną chusteczkę należy przechowywać przez długi czas w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
2. Całkowita izolacja RNA
   1. preparat
      1. Wyczyść stół warsztatowy, pipety, uchwyty końcówek i stojaki na probówki zarówno 70% etanolem, jak i odkażaniem powierzchni, aby usunąć RNazę.
      2. Uruchomić wirówkę, aby osiągnąć temperaturę 4 °C.
      3. Podgrzać roztwór elucji do temperatury 70 °C.
      4. Rozcieńczyć DNazę I, mieszając 5 μl odtworzonej DNazy I z 75 μl roztworu rozcieńczającego DNazę na próbkę. Umieścić roztwór DNazy I na lodzie do czasu użycia.
   2. procedura
      1. Dla każdej próbki oznaczyć dwie probówki do mikrowirówek, dwie probówki przytrzymujące kolumnę (dwie probówki do mikrowirówek z podziałką bez nasadki) i jedną mini kolumnę wiążącą.
      2. Dodać 500 μl roztworu izolacyjnego RNA do każdej próbki i sonikować za pomocą silnika do peletów przez 30 s.
      3. Weź strzykawkę do każdej próbki i pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby dalej lizować tkankę. Upewnić się, że po wstrzyknięciu nie są widoczne żadne ciała stałe.
      4. Od czasu do czasu dodawać 250 μl chloroformu i wirować, czekając 5 minut na inkubację próbek w temperaturze pokojowej.
      5. Wirować przy 21 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      6. Przenieś górną część wody do nowej probówki do mikrowirówki i dodaj równoważną ilość 70% etanolu (~500 μL).
         UWAGA: Górna część wodna powinna być przezroczysta, dolna powinna być czerwonym roztworem izolacyjnym RNA, a pomiędzy dwiema warstwami powinny znajdować się niepożądane ciała stałe.
      7. Przenieść 500 μl nowego lizatu do kolumny wiążącej. Wirować przy 18 000 × g przez 60 s, a następnie wyrzucić filtrat.
      8. Powtórz poprzedni krok z pozostałym lizatem, aby wprowadzić cały RNA do kolumny wiążącej.
      9. Dodać 700 μl przemywania o niskiej rygorystyczności do kolumny wiążącej, odwirować przez 30 s i wyrzucić filtrat.
      10. Dodać 80 μl rozcieńczonej DNazy I do każdej kolumny wiążącej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      11. Dodać 700 μl płukania o wysokiej rygorystyczności, odwirować przez 30 s i wyrzucić filtrat.
      12. Dodać 700 μl płukania o niskiej rygorystyczności, odwirować przez 60 s i wyrzucić filtrat.
      13. Przenieś kolumny wiążące do drugiej nowej rurki przytrzymującej kolumnę bez nasadki i wiruj przez 2 minuty, aby upewnić się, że wszystkie płyny zostały usunięte z kolumny wiążącej.
      14. Przenieść kolumny wiążące do nowej probówki do mikrowirówki i dodać 30 μl podgrzanego roztworu elucyjnego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
      15. Wirować przez 2 minuty, aby zebrać eluowany RNA na dnie probówki do mikrowirówki.
      16. Zmierz całkowite stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
          UWAGA: Jeżeli całkowita czystość RNA jest niska, na co wskazuje wartość 260/280 poniżej 2,0 lub wartość 260/230 poniżej 1,8, to po kroku 3.2.2.12 próbki można ponownie przemyć myciem o niskiej rygorystyczności, a następnie przemyć 80% etanolem przed kontynuowaniem kroku 3.2.2.13.
      17. Przechowywać RNA w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
   3. Odwrotna transkrypcja (RT)
      1. W pasku probówki do PCR dodaj 0,5-1 μg całkowitego RNA rozcieńczonego w wodzie uzdatnionej DEPC, co daje łącznie 8 μl dla każdej próbki RNA do innego dołka.
         UWAGA: Ilość RNA używanego do odwrotnej transkrypcji może być skalowana w górę lub w dół zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Dodać 1 μl oligo dT i 1 μl dNTP do każdej próbki w probówce PCR. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 10 μl na próbkę.
      3. Umieść pasek probówki PCR w termocyklerze i ustaw go na 65 °C na 5 minut, a następnie 4 °C na czas nieokreślony.
      4. Po 5 minutach w temperaturze 65 °C wyjąć pasek probówki do PCR i umieścić probówkę na lodzie na co najmniej 2 minuty. Po inkubacji na lodzie dodać pięć odczynników: 4 μL 5x buforu pierwszej nici, 2 μL 25 mM MgCl₂, 2 μL 0,1 M DTT, 1 μL inhibitora RNazy i 1 μL odwrotnej transkryptazy do każdej próbki. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi teraz 20 μl na próbkę.
      5. Umieść pasek probówki PCR z powrotem w termocyklerze i ustaw program na 50 °C na 50 minut, następnie 85 °C na 5 minut, a następnie 4 °C w nieskończoność.
      6. Gdy program osiągnie temperaturę 4 °C, wyjąć pasek i dodać 1 μl rybonukleazy H (RNazy H).
         UWAGA: RNaza H służy do usuwania pozostałej matrycy RNA w reakcji RT; na tym etapie pożądane RNA powinno być już przekształcone w cDNA.
      7. Umieść pasek z powrotem w termocyklerze i uruchom w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie 4 °C w nieskończoność.
      8. Odwrotna transkrypcja jest zakończona; zmierz stężenie cDNA za pomocą spektrofotometru.
      9. Rozcieńczyć cDNA do 250 ng/μl; przechowywać cDNA w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub -20 °C.
   4. Ilościowy PCR (qPCR)
      1. Sporządź arkusz kalkulacyjny, aby uporządkować położenie każdego startera i próbki na 96-dołkowej płytce qPCR.
         UWAGA: Jeden ze starterów musi być genem referencyjnym, aby znormalizować ekspresję wszystkich innych interesujących genów, takich jak 36B4.
      2. Przygotuj główną mieszankę podkładu dla każdej kombinacji "podkład + próbka". Do każdej studzienki reakcji qPCR dodaj 3 μl wody klasy biologii molekularnej, 5 μl mieszaniny głównej enzymu qPCR, 0,5 μl startera do przodu i 0,5 μl startera odwrotnego, co daje 9 μl na reakcję. Dodaj 1 μl cDNA na reakcję, aby uzyskać w sumie 10 μl na dołek reakcji.
         UWAGA: Standardem jest posiadanie trzech kontrprób technicznych dla każdej kombinacji "starter + próbka", więc każda mieszanka wzorcowa powinna być 4 razy większa od powyższych ilości.
      3. Dodać 1 μl cDNA dla każdej kontrpróby do każdej głównej mieszaniny starterów. Jeśli każda mieszanka główna ma wielkość 4x, odpipetuj 4 μl każdej próbki cDNA do ich własnej znakowanej probówki.
      4. Na koniec odpipetować 10 μl każdej mieszaniny reakcyjnej do 96-dołkowej płytki qPCR w pozycjach określonych przez arkusz kalkulacyjny.
      5. Uszczelnić płytkę grubym klejem, a następnie odwirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 450 × g w temperaturze 20 °C przez 2 min.
         UWAGA: Bardzo ważne jest, aby płyta była w pełni uszczelniona, aby uniknąć parowania próbek podczas termocyklingu. Użyj lekkich wycieraczek do chusteczek, aby docisnąć uszczelkę do płytki, zwłaszcza do krawędzi.
      6. Uruchom płytkę w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym. Zaprogramuj reakcję PCR zgodnie z instrukcjami producenta: 2 minuty w 50 °C, następnie kolejne 2 minuty w 95 °C, a na końcu 40 cykli po 15 s w 95 °C i 30 s w 60 °C. Wyniki analizy ekspresji genów qPCR przedstawiono w Rysunek 3B.

Results

W przeciwieństwie do iBAT, który znajduje się w podskórnej warstwie grzbietu między dwiema łopatkami, scBAT znajduje się w warstwie pośredniej szyi, rozciągając się głęboko między warstwami mięśni szkieletowych a gruczołem ślinowym, rosnąc wzdłuż zewnętrznej żyły szyjnej (Rysunek 1A). Analiza scBAT nie jest tak prosta jak w przypadku iBAT. Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę, w tym kluczowe kroki do wypreparowania nienaruszonego scBAT od myszy postnatalnych i dorosłych (Rysunek 1B, C). Po otwarciu szyi za pomocą dostarczonego protokołu, cienka warstwa scBAT może zostać zidentyfikowana pod mikroskopem preparacyjnym i oderwana od połączonego gruczołu ślinowego i żyły szyjnej zewnętrznej za pomocą pary kleszczy (Rysunek 1D, E). Aby ocenić morfologię magazynu, świeżo wyizolowany scBAT został przetworzony przy użyciu dostarczonej procedury przetwarzania w połączeniu z wcześniej opublikowaną procedurą barwienia H&E¹⁹ (Rysunek 2A). Jak pokazano w Rysunek 2B, scBAT posiada struktury tkankowe typowe dla magazynów BAT i składa się z wielu małych, wielomiejscowych adipocytów u zdrowych myszy po urodzeniu i dorosłych. Aby ocenić poziom ekspresji genów w scBAT, RNA wyekstrahowano z izolowanych magazynów scBAT przy użyciu dostarczonych procedur (Rysunek 3A). Poziomy ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania można następnie ocenić za pomocą standardowych metod RT-qPCR (Figura 3A). Jak pokazano na Rysunek 3B, zróżnicowane poziomy ekspresji genów zaangażowanych w pośredniczenie w funkcji scBAT, w tym Pparg, głównego regulatora rozwoju BAT; Fabp4 i Glut4, dwa transportery składników odżywczych; oraz Ucp1 i Ppargc1a, dwa geny biorące udział w termogenezie, można łatwo określić. Dla porównania, RNA wyekstrahowano z wyizolowanego iBAT, a ekspresję wyżej wymienionych genów oceniono również przy użyciu dostarczonych procedur (Figura 3A). Poziomy ekspresji tych genów są stosunkowo podobne między tymi dwoma magazynami. (Rysunek 3B).

Rysunek 1: Anatomiczne umiejscowienie scBAT i proces jego rozwarstwienia. (A) umiejscowienie scBAT w warstwie pośredniej szyi. (B) Powierzchowna warstwa szyi przed i po usunięciu skóry. Podziałka = 250 μm. Przerywane żółte linie wyznaczają obszar, który powinien zostać odsłonięty po wykonaniu nacięcia w kształcie litery U. (C) Obraz tuszy myszy umieszczonej pod mikroskopem preparacyjnym w celu zwiększenia przejrzystości wizualnej podczas sekcji. (D,E) Reprezentatywne obrazy warstwy pośredniej szyi przed i po usunięciu scBAT u myszy w wieku 3 tygodni i 3 miesięcy. Podziałka = 250 μm. Przerywane żółte linie obrysowują odsłonięte dwustronne składy scBAT; n = 2. Skróty: scBAT = brunatna tkanka tłuszczowa nadobojczykowa; SFI = warstwa powierzchowna; SG = gruczoł ślinowy; tr = tchawica; jv = żyła szyjna zewnętrzna; SM = Mięsień Szkieletowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przetwarzanie scBAT do barwienia H&E. (A) Schemat blokowy ilustrujący główne etapy przetwarzania scBAT do barwienia H&E. Po wypreparowaniu tkanki jest ona sekwencyjnie utrwalana, odwadniana, osadzana, cięta i barwiona. (B) Reprezentatywne obrazy scBAT wybarwionego H&E od myszy w wieku 3 tygodni i 3 miesięcy; n = 3 dla każdego stadium rozwojowego; podziałka = 250 μm dla obrazów o mniejszym powiększeniu; Podziałka = 50 μm dla obrazów o większym powiększeniu. Skróty: scBAT = brunatna tkanka tłuszczowa nadobojczykowa; PFA = paraformaldehyd; H&E = hematoksylina i eozyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przygotowanie RNA z scBAT do analizy ekspresji genów. (A) Schemat blokowy ilustrujący etapy izolacji RNA i analizy RT-qPCR ekspresji genu scBAT. Ze względu na niewielkie rozmiary i miękką teksturę, błyskawiczne zamrażanie magazynu scBAT i mielenie go w ciekłym azocie ma kluczowe znaczenie dla udanej izolacji RNA. (B) Względna ekspresja genów markerowych, w tym Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 i Ppargc1a, w scBAT i iBAT wyizolowanych od samców myszy w wieku 3 miesięcy, n = 5. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. 36B4 został użyty jako gen porządkowy do normalizacji. Skróty: scBAT = brunatna tkanka tłuszczowa nadobojczykowa; RT-qPCR = PCR z odwrotną transkrypcją ilościową; LN₂ = ciekły azot. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W niniejszym protokole szczegółowo przedstawiamy procedury preparacji i przetwarzania scBAT do analiz H&E i ekspresji genów. Ponieważ scBAT znajduje się w warstwie pośredniej szyjki i leży wzdłuż dużych żył, izolacja tego magazynu wymaga precyzyjnej techniki. W szczególności, aby uzyskać wyraźny widok na magazyn, zalecamy umieszczenie myszy pod mikroskopem preparacyjnym po otwarciu szyi. Używając pary bardzo cienkich kleszczyków punktowych do odklejania scBAT z gruczołu ślinowego i otaczających żył, należy zachować ostrożność, aby uniknąć przebicia żył. Nadmierne krwawienie może utrudnić zlokalizowanie scBAT. Aby przetworzyć scBAT do barwienia H&E, dostosowaliśmy użycie opublikowanego protokołu¹⁹ z niewielkimi modyfikacjami, aby uwzględnić użycie 4% PFA, alkoholi odwadniających i rozpuszczalnika organicznego, toluenu, do przetwarzania tkanek, jak pokazano w sekcji protokołu. Cała procedura trwa ~6 dni, a szkiełka barwione H&E można obrazować następnego dnia po zakończeniu barwienia.

RT-qPCR z wykorzystaniem RNA jako materiału wyjściowego jest najczęściej stosowaną metodą analizy ekspresji genów w dziedzinie biologii tkanki tłuszczowej. Ponieważ scBAT jest stosunkowo małym magazynem BAT w porównaniu z iBAT, uzyskanie wystarczającej ilości RNA do ekspresji genów może być trudne. Aby zwiększyć wydajność RNA, zalecamy stosowanie sekwencyjnych etapów przygotowania lizatu, jak opisano w sekcji protokołu, zaczynając od sproszkowania tkanki za pomocą tłuczka i moździerza podczas zamrażania. Stosując tę metodę przygotowania lizatu, udało nam się uzyskać wysokowydajną i wysokiej jakości próbkę RNA do analizy ekspresji genów scBAT od jednej dorosłej myszy. Ta metoda przygotowania lizatu może być również stosowana do otrzymywania wysokiej jakości lizatów białkowych z scBAT do western blotting z wykorzystaniem buforu do lizy białek.

Korzystając z mysiego iBAT, naukowcy zdobyli istotną wiedzę na temat funkcji BAT w termogenezie i metabolizmie. Niedawna identyfikacja kilku wcześniej nierozpoznanych magazynów BAT u myszy i ludzi, w tym scBAT, ujawniła potrzebę dalszych badań, zanim będziemy mogli w pełni zrozumieć fizjologiczny wkład BAT u myszy i dorosłych ludzi. W szczególności uzasadnione są badania rzucające światło na pochodzenie, funkcje i udział tych nowo odkrytych magazynów BAT w termogenezie i metabolizmie regionalnym lub metabolizmie całego organizmu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% Alkohol do odwadniania (Flex 95)	Epredia	8201
100% Alkohol do odwadniania (Flex 100)	Epredia	8101
96-dołkowa płytka do PCR	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Wiążąca mini kolumna	Bio-Rad	7326826
Aurum Mycie o wysokiej rygorystyczności	Bio-Rad	7326803
Aurum Mycie o niskiej rygorystyczności	Bio-Rad	7326804
(do zatapiania)	Tissue-Tek	4122
BD Igła PrecisionGlide 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Termocykler	Bio-Rad	1840148
Probówki do mikrowirówek bez nakrętki 2 ml	Fisherbrand	02-681-453
Wirówka	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Instrument do PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Medium montażowe o niskiej lepkości	Epredia	83104
DEPC-Uzdatniona woda	Ambion	AM 9906
Mikroskop preparacyjny	Nikon
Roztwór do rozcieńczania DNazy	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
roztwór elucyjny	Bio-Rad	7326801
EM 400 zatapianie pożywki parafinowej	Leica Biosystems	3801320
Eozyna Y (0,5% w/v)	RICCA	2858-16
Formula R Medium infiltracyjne parafina	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (do HCL-etanolu)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Kasety do zatapiania	Leica Biosystems	39LC-550-L
Czysty etanol firmy Koptec - 200 Proof (dla 70% etanolu)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Probówki	Scientific R0971
1,7 ml	Avantor	87003-294
Uszczelki mikrouszczelniające "B" (uszczelki adhseive)	Bio-Rad	MSB1001
Mikrotom	Leica Biosystems	RM2245
Biologia molekularna Klasa wody	Corning	46-000-CM
Moździerz Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (dla 0,85% soli fizjologicznej)	Fisher Bioreagents	BP358-212
Spektrofotometr	NanoDrop Technologie	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Sekcja parafinowa Kąpiel flotacyjna	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
Pasek rurki PCR	Avantor	76318-802
Tłuczek firmy Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Silnik do peletu Tłuczek	Kimble	749540-0000
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Piec próżniowy Precision Model 19	do 51221162		Thermo Fisher Scientific
: 36B4  (do przodu) 10 μ M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'			Chen lab Oligo database
Elementarz: 36B4 (odwrócony) 10 μ M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'			Chen lab Oligo database
Elementarz: Fabp4 (do przodu) 10 μ M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'			Chen lab Oligo database
Elementarz: Fabp4 (odwrócony) 10 μ M 5' CCA, TCT, AGG, GTT, ATG, ATG, CTC, TTC, A, TC, A, 3'			Chen lab Oligo database
Elementarz: Glut 4 (starter do przodu) 10 μ M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT CCT 3'			Chen lab Oligo database
Elementarz: Glut 4 (odwrócony) 10 μ M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'			Chen lab Oligo database
Elementarz: PPARg (do przodu) 10 μ M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'			Chen lab Baza danych oligo
Elementarz: PPARg (rezerwa) 10 μ M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'			Chen lab Oligo database
Elementarz: Ppargc1a (odwrócony) 10 μ M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'			Chen lab Oligo database
Elementarz: Ppargc1a(naprzód) 10 μ M 5' ACG TCC CTG CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'			Chen lab Oligo database
Elementarz: Ucp1 (do przodu) 10 μ M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'			Chen lab Oligo
database Primer: Ucp1 (odwrócony) 10 μ M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'			Chen lab Baza danych Oligo
Roztwór do izolacji RNA (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (odkażanie powierzchni)	Thermo Scientific	1437535
RNaza H	NEB	M0297S
Inhibitor rnazy (RNaza na zewnątrz)	Invitrogen	10777019
Fiolka scyntylacyjna (szkło)	Mikroskopia elektronowa Sciences	72632
Ławka do suszenia szkiełek	Elektrotermiczny (Cole-Parmer)	MH6616
Stojak do barwienia ze stali nierdzewnej	Mikroskopia elektronowa Sciences	70312-54
Mikroskop stereoskopowy (do zabudowy)	Nożyczki	SZ51
	McKesson	43-1-104
Kleszcze preparacyjne proste Superfine point	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-550-15
Indeks górny III Odwrotna transkryptaza (zawiera 5x bufor pierwszej nici i 0,1 M DTT)	Invitrogen	18080044
Strzykawka SUR-VET z igłą 25 G x 5/8", 1 ml	Terumo	100281
SYBR Green (główna mieszanina enzymów qPCR)	Applied Biosystems	A25778
Manualny zestaw do barwienia szkiełek Tissue-Tek (słoiki)	Nauki o mikroskopii elektronowej	SKU: 62540-01
Toluen	Fisher Chemical	T324-1
Pipeta transferowa	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL