Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hemostaza rany kłutej i przygotowanie próbek do analizy w zmontowanej mikroskopii elektronowej

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66479

⸱

24 maja 2024

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Procedura nawleczenia ran kłutych w celu tworzenia hemostatycznej skrzepliny jest przedstawiona tutaj. Powstałe skrzepliny są duże i mają średnicę setek mikronów. W związku z tym odpowiednie są podejścia do obrazowania objętościowego. Sugerujemy zmontowaną transmisyjną mikroskopię elektronową o dużym obszarze jako podejście o wysokiej rozdzielczości dostępne dla wielu osób i szczegółowo opisując protokół przygotowawczy.

Streszczenie

Hemostaza, proces normalnej fizjologicznej kontroli uszkodzeń naczyń krwionośnych, ma fundamentalne znaczenie dla ludzkiego życia. Wszyscy od czasu do czasu doznajemy drobnych skaleczeń i ran kłutych. W hemostazie samoograniczająca się agregacja płytek krwi prowadzi do powstania strukturalnej skrzepliny, w której zatamowanie krwawienia następuje poprzez zakrycie otworu od zewnątrz. Szczegółowa charakterystyka tej struktury może prowadzić do rozróżnienia między hemostazą a zakrzepicą, przypadkiem nadmiernej agregacji płytek krwi prowadzącej do zakrzepów okluzyjnych. Przedstawiono tutaj oparte na obrazowaniu podejście do struktury skrzepliny po nakłuciu, które wykorzystuje zdolność cienkowarstwowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wnętrza hemostatycznych skrzeplin. Najbardziej podstawowym krokiem w każdym protokole eksperymentalnym opartym na obrazowaniu jest dobre przygotowanie próbki. Protokół zawiera szczegółowe procedury przygotowania ran kłutych i skrzeplin bogatopłytkowych u myszy do późniejszej mikroskopii elektronowej. Podano szczegółową procedurę utrwalania in situ tworzącej się skrzepliny z rany kłutej i jej późniejszego przetwarzania w celu barwienia i zatapiania w mikroskopii elektronowej. Mikroskopia elektronowa jest przedstawiana jako końcowa technika obrazowania ze względu na jej zdolność, w połączeniu z sekwencyjnym przekrojem, do wizualizacji szczegółów wnętrza skrzepliny w wysokiej rozdzielczości. Jako metoda obrazowania, mikroskopia elektronowa daje bezstronne próbkowanie i wynik eksperymentu, który skaluje się od nanometrów do milimetrów w 2 lub 3 wymiarach. Cytowane jest odpowiednie darmowe oprogramowanie do mikroskopii elektronowej, które będzie obsługiwać szerokoobszarową mikroskopię elektronową, w której setki ramek można mieszać, aby uzyskać obrazowanie w skali nanometrowej całych przekrojów skrzeplin ran kłutych. W związku z tym każdy podregion pliku obrazu można łatwo umieścić w kontekście pełnego przekroju.

Wprowadzenie

Powstawanie skrzepliny po ranach kłutych, która prowadzi do zatamowania krwawienia, jest jednym z najważniejszych wydarzeń w życiu1. Jednak pomimo tej istotności, wiedza na temat tego, co zachodzi strukturalnie podczas tworzenia skrzepliny, czy to w żyle, tętnicy, zdarzeniu miażdżycowym czy skrzepie okluzyjnym, była ograniczona rozdzielczością i głębokością obrazowania. Konwencjonalna mikroskopia świetlna ma ograniczoną głębokość w porównaniu z w pełni uformowaną skrzepliną po nakłuciu, od 200 do 300 μm w klasie Z1, oraz poziom rozdzielczości w porównaniu z rozmiarem organelli płytkowych i ich odstępami, często mniejszymi niż 30 nm2. Mikroskopia światła dwufotonowego może zapewnić wymaganą głębię obrazowania, ale nie poprawia znacząco rozdzielczości. Najnowsze osiągnięcia mikroskopii świetlnej, na przykład techniki superrozdzielcze, są nadal ograniczone rozdzielczością, w praktyce ~20 nm w XY i dwa razy więcej w Z, oraz ograniczoną głębokością, nie większą niż konwencjonalna mikroskopia świetlna. Co więcej, mikroskopia świetlna o wysokiej rozdzielczości, podobnie jak większość mikroskopii świetlnej w badaniach, opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej, technice, która jest z natury stronnicza w stosunku do małego zestawu białek kandydujących, dla których istnieją dobre przeciwciała lub dobrze oznaczone konstrukty3. Podsumowując, konwencjonalna skaningowa mikroskopia elektronowa może co najwyżej uwidocznić powierzchnię tworzącej się skrzepliny bogatopłytkowej.

Aby przezwyciężyć te techniczne ograniczenia w charakterystyce struktury skrzepliny, mieliśmy trzy cele. Po pierwsze, w sposób powtarzalny należy wytworzyć zdefiniowaną ranę kłutą w żyle lub tętnicy myszy, którą można następnie łatwo ustabilizować in situ za pomocą utrwalenia chemicznego. Po drugie, należy zastosować procedurę przygotowawczą, która kładzie nacisk na zachowanie błony, co jest celem zgodnym z celem określenia pozycji poszczególnych płytek krwi w tworzącej się skrzeplinie. Po trzecie, użyj bezstronnej techniki wizualizacji, którą na pojedynczym obrazie można skalować od skali nanometrowej do prawie milimetrowej.

Zmontowana, szerokoobszarowa mikroskopia elektronowa została wybrana jako główna technika wizualizacji końcowej z jednego ważnego powodu: w obrazowaniu mikroskopem elektronowym można zobaczyć szeroki wachlarz cech w komórce, które zarysowują jej organelle i cechy w organellach. Można rozpoznać małe obiekty, takie jak rybosomy. Ten zakres cech jest widoczny, ponieważ gęste od elektronów plamy metali ciężkich, uranylu, ołowiu i osmu, które są używane w mikroskopii elektronowej w celu uzyskania kontrastu, wiążą się z szeroką gamą cząsteczek. Na obrazie z mikroskopu elektronowego widać wiele z tego, co tam jest, podczas gdy w przypadku podejścia immunofluorescencyjnego i znakowania białek widzi się tylko to, co się świeci. Oznacza to na przykład miejsca antygenowe obecne na danym gatunku białka. W przypadku znakowanej cząsteczki, często białka, jest to miejsce (miejsca), w którym znajduje się to białko. Wszystkie inne cząsteczki są ciemne i nie świecą. Czy jednak taki wybór mikroskopii elektronowej jest praktyczny? Zakrzep po ukłuciu ma rozmiar 300 na 500 μm, a przy rozmiarze piksela 3 nm jest to obraz o wymiarach 100 000 na 167 000 pikseli. Wysokiej jakości kamera mikroskopu elektronowego ma 4000 na 4000 pikseli. Oznacza to, że około 1000 klatek musi zostać zszytych/zmieszanych, aby uzyskać pojedynczy obraz. Jest to możliwość, która była obecna w większości mikroskopów elektronowych wyprodukowanych w ciągu ostatnich 15 lat. Stolik mikroskopowy jest skomputeryzowany, a obrazy można zszywać ze sobą za pomocą komputera. Jest to przesłanka, która doprowadziła do wyborów leżących u podstaw sformułowania przedstawionego protokołu.

Podsumowując, poniżej przedstawiamy serię kroków, które dają powtarzalną ranę w żyle lub tętnicy myszy, które następnie, po krokach fiksacji in situ, a następnie etapach osadzania, mogą być wizualizowane przez zmontowaną, szerokoobszarową transmisyjną mikroskopię elektronową w skali nm i na zszytym obrazie wizualizowanym w skali bliskiej mm, skali rzeczywistego in situ Naprawiono skrzeplinę. Skalowalność tego rodzaju jest niezbędna do zrozumienia powstawania skrzeplin zarówno jako problemu w hematologii/zdrowiu, jak i jako systemu biologii rozwojowej, w którym płytki krwi są głównym typem komórek. Postęp ten ma jedną główną zaletę mikroskopii elektronowej, a mianowicie, że widzi się to, co jest, a nie tylko to, co się świeci. Aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem przygotowania próbek do mikroskopii elektronowej ze skaningiem szeregowym (SBF-SEM), czytelnik jest kierowany do niedawnego artykułu Joshi et al.4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Nauk Medycznych w Arkansas. Tutaj wykorzystano 8 - 12-tygodniowe, dzikie samce i samice myszy C57BL/6. Te myszy to młodzi dorośli z niewielkim nagromadzeniem tłuszczu. Te same procedury mają zastosowanie do mutantów myszy dla różnych białek ważnych dla hemostazy, takich jak czynnik von Willebranda lub glikoproteina płytkowa VI (GPVI)5,6. Cały sprzęt, narzędzia chirurgiczne, odczynniki i inne użyte materiały są pokazane w Rysunek 1 i wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Rana po przebiciu żyły szyjnej/tętnicy udowej1,7

  1. Znieczulenie myszy
    1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i ustaw parownik izofluranu na wysokie natężenie przepływu (500 ml/min, 3% izofluranu). Izofluran jest wybierany, ponieważ ma niewielki wpływ na średnicę naczyń krwionośnych.
      UWAGA: Długotrwałe narażenie na izofluran może powodować niekorzystne skutki zdrowotne. Zastosowanie waporyzatora o niskim przepływie, kanistrów z gazem anestezjologicznym i dobrej wentylacji pomieszczenia może znacznie zmniejszyć narażenie.
    2. Gdy mysz wydaje się spać, ściśnij jeden z palców u nogi myszy, aby sprawdzić, czy mysz zareaguje. Jeśli tak, umieść mysz z powrotem w komorze indukcyjnej na kilka minut, a następnie spróbuj ponownie wykonać test szczypania. Jeśli mysz nie reaguje, umieść ją w pozycji leżącej na płycie grzewczej (wcześniej przykrytej folią aluminiową).
    3. Zmniejsz przepływ waporyzatora na niski (100 ml/min, 1,75% izofluranu). Umieść nos myszy w stożku nosowym. Rozciągnij każdą kończynę i przyklej taśmą małe kawałki taśmy klejącej.
    4. Włóż sondę temperatury doodbytniczej i ustaw temperaturę na 37 °C na regulatorze temperatury. Przyklej taśmą przewód sondy temperatury, aby zapobiec przypadkowemu wyciągnięciu sondy.
  2. Nacięcie myszy
    1. Za pomocą maszynki do strzyżenia ogol szyję i klatkę piersiową myszy (w przypadku żyły szyjnej) lub wewnętrzną stronę prawej nogi (w przypadku tętnicy udowej). Zetrzyj ścinki futra wacikiem nasączonym alkoholem. W razie potrzeby ponownie przeszukaj obszar maszynką do strzyżenia, aby usunąć pozostałą sierść.
    2. Ponownie przetrzyj obszar świeżym wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć wszystkie ścinki. Bardzo ważne jest, aby obszar był tak czysty, jak to tylko możliwe. Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
    3. Za pomocą nożyczek i kleszczy podnieś i przetnij skórę nad prawą żyłą szyjną. Wytnij okrągłe okienko w skórze wystarczająco duże, aby odsłonić żyłę szyjną i część otaczającej tkanki.
  3. Czyszczenie żyły szyjnej (te same zasady dotyczą tętnicy udowej)
    1. Stosując technikę preparowania, delikatnie odepchnij na bok węzły tłuszczowe i limfatyczne oraz tkankę łączną.
      UWAGA: Na tym etapie odbywa się ogólne czyszczenie wokół naczynia; Jednak staranne, dokładne czyszczenie odbędzie się pod mikroskopem po utrwaleniu żyły szyjnej w paraformaldehydzie przez 24 godziny.
    2. Napełnić strzykawkę o pojemności 20 ml roztworem soli fizjologicznej ogrzanym do temperatury 37 °C. Załadować strzykawkę do pompy infuzyjnej strzykawki. Podłączyć igłę motylkową 27G i związany z nią rurkę do strzykawki.
    3. Ustawić pompę strzykawkową na natężenie przepływu 0,5 ml/min. Delikatny strumień soli fizjologicznej zmyje krew z przebitej żyły/tętnicy. Strumień soli fizjologicznej należy skierować kilka mm z boku miejsca nakłucia, a nie bezpośrednio nad nim.
  4. Nakłucie żyły szyjnej/tętnicy udowej
    1. Uruchom minutnik. Zaopatrzyć się w igłę podskórną 30G (średnica nominalna 300 μm) do żyły szyjnej i igłę podskórną 33G (średnica 200 μm) do tętnicy udowej. Użycie mniejszej igły daje tylko nieznacznie dłuższy czas krwawienia w przypadku tętnicy o wyższym ciśnieniu.
    2. Obróć skos do góry. Ustawić igłę pod kątem 25° nad żyłą szyjną/tętnicą udową. Zanotuj godzinę.
    3. Szybko przebij naczynie, upewniając się, że przebijasz tylko górną część naczynia. Uważaj, aby nie przebić również dna naczynia. Zwróć uwagę na czas, w którym krwawienie całkowicie ustaje.
    4. Poczekaj odpowiednią ilość czasu, aby uzyskać tworzenie skrzepliny (Rysunek 2A) przed rozpoczęciem utrwalania perfuzji (tj. 1, 5, 10 lub 20 minut, aby uzyskać różne etapy rozwoju skrzepliny). Poddaj zwierzę eutanazji przez wykrwawienie lub postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi eutanazji.
  5. Wykonywanie fiksacji perfuzji przezsercowej
    1. Ustaw pompę perystaltyczną przed rozpoczęciem operacji. Umieść dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml w stojaku na probówki. Napełnić jedną probówkę 4% roztworem utrwalającym paraformaldehyd przygotowanym w roztworze buforowym kakodylanu sodu (0,2 M kakodylan sodu, 0,15 M chlorek sodu o pH 7,4) do badań nakłucia szyjki i napełnić drugą probówkę roztworem buforowym kakodylanu sodu.
      UWAGA: Opisane tutaj warunki są wystarczające dla przypadku niskiego ciśnienia tętnicy szyjnej, a następnie są modyfikowane dla przypadku tętnicy o wyższym ciśnieniu. W przypadku badań systemu wyższego ciśnienia z tętnicami, tj. tętnicą udową, utrwalacz paraformaldehydu jest uzupełniany 0,1% aldehydem glutarowym, a zewnętrzne utrwalanie kroplowe łączy się z utrwalaniem perfuzyjnym.
    2. Umieścić końcówkę wlotową rurki pompy w rurce zawierającej roztwór buforowy. Przymocuj igłę motylkową 27G wraz z dołączonymi rurkami do końcówki wyjściowej rurki pompy i umieść igłę w czystej zlewce.
    3. Ustaw pompę perystaltyczną na natężenie przepływu 10 ml/min. Włącz pompę perfuzyjną.
    4. Gdy roztwór buforowy zacznie przepływać z igły do zlewki, wyłącz pompę. Rurka i igła są teraz przygotowane do perfuzji przezsercowej.
    5. Odsłoń jamę klatki piersiowej, wykonując nacięcie w skórze linii środkowej od górnej części mostka do kilku milimetrów poza dno mostka za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy. Wykonaj poprzeczne nacięcia wzdłuż podstawy klatki piersiowej, zaczynając od linii środkowej i przecinając od przyśrodkowej do bocznej z każdej strony.
    6. Bezpośrednio przed rozpoczęciem perfuzji przezsercowej szybko rozetnij klatkę piersiową i odbij każdą stronę, aby odsłonić serce.
    7. Włącz pompę perystaltyczną. Umieść końcówkę igły motylkowej 27G u podstawy lewej komory.
    8. Trzymając igłę bezpiecznie w lewej komorze, wytnij szczelinę w prawej małżowinie usznej za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych, aby umożliwić wypływ krwi i płynu perfuzyjnego. Zanotuj godzinę na timerze.
    9. Ukrwić roztworem buforowym przez 3 minuty, aby wypłukać krew z układu krążenia. Trzymając igłę bezpiecznie w lewej komorze, wyłącz pompę perystaltyczną i przesuń końcówkę wychwytową rurki pompy perystaltycznej do 50 ml probówki zawierającej roztwór utrwalający.
    10. Zanotuj godzinę na timerze. Ponownie włączyć pompę perystaltyczną i perfekować roztworem utrwalającym przez 7 minut. Wyłącz pompę perystaltyczną.
    11. Wyjąć igłę z lewej komory i umieścić ją w zlewce na odpady. Umieść końcówkę wlotową rurki pompy w zlewce z wodą destylowaną.
    12. Włącz pompę perystaltyczną i pozwól, aby około 20 ml wody przepłynęło przez rurkę i wypłynęło igłą 27G do zlewki na odpady, aby wyczyścić rurkę. Upewnij się, że cała woda wydostanie się z rurki i igły przed wyłączeniem pompy.

2. Pobieranie próbek do mikroskopii elektronowej

  1. Po zespoleniu perfuzyjnym uzupełnionym początkowym 2-minutowym zewnętrznym stabilizatorem w przypadku ran po przebiciu tętnicy udowej, należy dokładnie wypreparować część żyły szyjnej/tętnicy udowej zawierającą miejsce nakłucia i skrzeplinę (Rysunek 2A). Ostrymi nożyczkami wykonaj ukośne cięcie w poprzek dystalnego końca segmentu naczynia i wykonaj proste cięcie w poprzek bliższego końca segmentu naczynia.
    UWAGA: Wykonywanie nacięć w ten sposób pomaga w późniejszej orientacji naczynia i określeniu kierunku przepływu krwi w naczyniu.
  2. Zanurzyć segment naczynia w świeżym, 4% paraformaldehydzie o temperaturze pokojowej w roztworze buforowym kakodylanu sodu (0,2 M kakodylanu sodu, 0,15 M chlorku sodu o pH 7,4) i umieścić w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
  3. Przenieść utrwaloną tkankę do temperatury 4 °C na 24 godziny. Następnego dnia weź naczynie hodowlane o średnicy 35 mm zawierające matę silikonową o grubości ~5 mm (przygotowaną wcześniej zgodnie z instrukcjami producenta). Wlej wystarczającą ilość roztworu buforowego kakodylanu sodu do naczynia, aby zanurzyć nieruchomy segment żyły.
  4. Podczas oglądania pod mikroskopem świetlnym (~15-krotne powiększenie) ostrożnie przenieś tkankę do naczynia o średnicy 35 mm zawierającej roztwór buforowy i przypnij każdy koniec naczynia do maty silikonowej za pomocą szpilek ze stali nierdzewnej i drobnych kleszczyków.
  5. Ostrożnie oczyść odcinek żyły szyjnej/tętnicy udowej za pomocą mikronożyczek i bardzo cienkich kleszczy.
    1. Tylko w przypadku żyły szyjnej: Usuń jedną ze szpilek i za pomocą mikronożyczek przetnij ścianę naczynia naprzeciwko miejsca nakłucia/skrzepliny wzdłuż. Delikatnie otwórz naczynie i za pomocą 4 do 5 kołków (każdy przecięty na pół za pomocą przecinaków do drutu) przypnij je do maty silikonowej stroną śródświatełną skierowaną do góry.
  6. Odessać roztwór buforowy, szybko zastąpić go 1% roztworem paraformaldehydu w roztworze buforowym kakodylanu sodu i przykryć pokrywką naczynie. W żadnym momencie nie pozwól, aby chusteczka wyschła. Zawsze trzymaj go zanurzonego w płynie.
  7. Przechowuj tkankę w temperaturze 4 °C, aż nadejdzie czas na przetworzenie jej do mikroskopii elektronowej (Rysunek 2B). Przetwarzaj niektóre próbki ran po przebiciu żyły szyjnej/tętnicy udowej do obrazowania za pomocą SBF-SEM4, a inne do obrazowania za pomocą WA-TEM8,9. Kroki WA-TEM są szczegółowo opisane poniżej.
    UWAGA: Wszystkie prace związane z formaldehydem, tlenkiem propylenu, OsO4 i 2,4,6-tris(dimetyloaminometylo)fenolem (DMP-30) należy wykonywać w dygestoriach chemicznych. Są to niebezpieczne chemikalia. Narażenie na OsO4 może spowodować ślepotę i śmierć.
    UWAGA: Wszystkie objętości płukania i plam są co najmniej 2 razy większe od objętości próbki. 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) może być zastąpiona 0,1 M buforem kakodylanu sodu. Podczas procedury utrwalania bardzo ważne jest, aby nigdy nie dopuścić do wyschnięcia próbek, ponieważ miałoby to znaczący wpływ na ultrastrukturę. Użyj rurek polipropylenowych.

3. Przygotowanie próbki do montażu transmisyjnej mikroskopii elektronowej (WA-TEM)

UWAGA: Ten krok reprezentuje punkt decyzyjny, w którym badacz zobowiązuje się do przygotowania do WA-TEM. Ta procedura przygotowawcza nie obsługuje SBF-SEM. W przypadku SBF-SEM objętość EM wszystkie barwienia należy wykonać przed zatopieniem w plastiku. Proszę zobaczyć4 dla protokołu przygotowania SBF-SEM.

  1. Umyj próbkę tkanki w naczyniu o średnicy 35 mm 2x zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) lub PBS w temperaturze pokojowej (RT). Utrzymuj próbkę przypiętą, co pozwala na śledzenie orientacji próbki w tych krokach przygotowawczych.
  2. Utrwal 0,8 ml 0,05% zieleni malachitowej / 2,5% aldehydu glutarowego / 0,1 M kakodylanu sodu (pH 6,7 - 7,0) przez 20 minut na lodzie.
  3. Usunąć utrwalacz i przemyć próbkę 4x przez 5 minut kakodylanem sodu o stężeniu 0,1 M. Usunąć 0,1 M kakodylanu sodu.
  4. Postfix z 0,8 ml 0,8% K3Fe(CN)6 lub K4Fe(CN)6 / 1,0% OsO4 K3Fe(CN)6 w 0,1 M kakodylanu sodu. Umieść pokrywę na naczyniu, aby nie dopuścić do światła (OsO4 jest wrażliwy na światło). Bejcowanie przez 20 min do 1 h w RT.
  5. Usunąć OsO4 i płukać 4x przez 5 minut każdy 0,1 M buforem kakodylanu sodu. Usuń bufor kakodylanu sodu i zabarwij 1% kwasem garbnikowym przez 20 minut na lodzie.
  6. Usunąć kwas garbnikowy i myć przez 5 minut 0,1 M buforem kakodylanu sodu 1x i 2x przez 5 minut wodą destylowaną (DI).
  7. Barwieć 0,5% octanem uranylu (UA) przez 1 godzinę RT lub przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.
  8. Usuń octan uranylu i płucz 5 razy przez 5 minut wodą destylowaną o jakości molekularnej. Przed ostatnim myciem i gdy próbka jest nadal zanurzona w wodzie demineralizowanej, przeciąć matę silikonową wokół przypiętej próbki za pomocą żyletki. Wyjmij ten mały kawałek maty silikonowej z talerza i umieść go w polipropylenowej tubie.
    UWAGA: Ważne jest, aby próbka pozostała przypięta do elementu silikonowego w probówce. Przejście na rurki polipropylenowe na tym etapie jest konieczne, ponieważ tlenek propylenu stosowany w kolejnych krokach będzie degradował polistyren płyt o średnicy 35 mm.
  9. Po usunięciu ostatniego buforu krótko spłukać 1x 25% etanolem. Wyrzuć 25% etanol i inkubuj z 25% etanolem przez 3 minuty na lodzie.
  10. Usuń 25% etanolu. Krótko spłukać 1x 50% etanolem. Wyrzuć 50% etanolu i inkubuj z 50% etanolem przez 3 minuty na lodzie.
  11. Usuń 50% etanolu i krótko spłucz 1x 75% etanolem. Wyrzuć 75% etanol i inkubuj z 75% etanolem przez 3 minuty na lodzie.
  12. Usuń 75% etanolu i krótko spłucz 1x 95% etanolem. Wyrzuć 95% etanolu i inkubuj z 95% etanolem przez 3 minuty na lodzie.
  13. Usuń 95% etanolu i umyj 3x, za każdym razem co najmniej 10 minut, 100% etanolem (200 proof). Usuń 100% etanolu i dodaj tlenek propylenu (PO). Płukać 3x co najmniej 10 min każdy, z PO.
  14. Przygotuj mieszankę żywic zgodnie z poniższym opisem.
    1. Podgrzej składniki żywicy w temperaturze 60 °C, aby w pełni się upłynniły. Dokładnie wymieszaj 12,5 ml Embed-218, 7,5 ml Araldite 502 i 27,5 ml DDSA w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 60 °C. Mieszaninę tę można przechowywać przez 6 miesięcy w temperaturze 4 °C. Przed użyciem podgrzać ją do 60 °C. Podać wymaganą ilość przed użyciem.
  15. Osadź próbki zgodnie z poniższym opisem.
    1. Umieść porcję mieszanki żywic w probówce i dodaj 20 μl/ml aktywatora DMP-30. Dokładnie wymieszać, obracając w temperaturze 60 °C; Kolor powinien ciemniejeć.
    2. Rozcieńczyć tę porcję żywicy aktywnej przez 50% w PO i pozostawić żywicę i PO do całkowitego wymieszania.
    3. Usuń ostatnie płukanie PO z probówki zawierającej próbkę i zastąp ją 50% mieszaniną żywicy/PO, prawie całkowicie wypełniając probówkę. Obracać próbkę przez noc w temperaturze pokojowej.
    4. Następnego dnia wymieszaj nową porcję żywicy (1 ml na próbkę) z 20 μl/ml DMP-30.
  16. Umieść próbkę w naczyniu polipropylenowym z niewielką objętością 50% mieszanki żywicy/PO z probówki z próbką pod mikroskopem preparacyjnym (powiększenie ~6x) i ostrożnie wyjmij szpilki z tkanki. Przenieś tylko tkankę do innego naczynia polipropylenowego zawierającego niewielką ilość 100% żywicy z aktywatorem DMP-30.
  17. Napełnij silikonową formę do zatapiania 100% żywicą za pomocą aktywatora DMP-30 i ostrożnie umieść próbkę w formie. Umieść formę w piekarniku i piecz w temperaturze 60 °C przez co najmniej 48 godzin. Przygotowana próbka jest pokazana w Rysunek 2B.
  18. Wykonaj obrazowanie w zmontowanej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (WA-TEM) zgodnie z opisem w10,11. Zobacz Rysunek 3 przedstawia proces od początkowego nakłucia do trójwymiarowo renderowanej 1-minutowej skrzepliny. Włączenie szczegółowego protokołu obrazowania w zmontowanej mikroskopii elektronowej WA-TEM nie zostało tutaj uwzględnione i wykracza poza zakres niniejszych protokołów przygotowania próbek.
    UWAGA: WA-TEM to niedoceniana funkcja większości nowoczesnych transmisyjnych mikroskopów elektronowych ze skomputeryzowanym stolikiem. Oprogramowanie shareware obsługujące te funkcje10,11 jest dostępne w grupie dr Davida Mastronarde, University of Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ilościowe określenie wpływu leku na czas krwawienia z rany kłutej
Czas krwawienia z rany kłutej stanowi model fizjologiczny ryzyka związanego z podaniem leku, który można łatwo przeprowadzić u myszy. Wyniki uzyskane w eksperymencie z raną kłutą mają charakter predykcyjny. Przedstawiamy tutaj krzywą zależności czasu krwawienia od dawki dabigatranu. Dabigatran, inhibitor trombiny, jest stosowany jako doustny bezpośrednio działający lek przeciwzakrzepowy, tzw. DOAC12. Model rany ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy szczegółową procedurę badania ran kłutych w celu wytworzenia hemostatycznych skrzeplin w żyłach szyjnych i tętnicach udowych, ich utrwalenia perfuzji in situ oraz przetwarzania próbek do zmontowanej transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ogólne procedury są przydatne do generowania hemostatycznych skrzeplin do analizy ultrastrukturalnej oraz do porównywania czasów krwawienia u myszy eksperymentalnych, na przykład myszy leczonych różnymi rodzajami i dawkami farmaceutyków. Jest to również przydatne ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Podziękowania

Autorzy dziękują kolegom z University of Arkansas for Medical Sciences (Jerry Ware i Sung W. Rhee), University of Pennsylvania (Tim Stalker i Lawrence Brass), University of Kentucky (Sidney W. Whiteheart i Smita Joshi) oraz National Institute of Bioimaging and Bioengineering of the National Institutes of Health (Richard D. Leapman i Maria A. Aronova), od których wiele się nauczyliśmy. Autorzy wyrażają wdzięczność Amerykańskiemu Towarzystwu Kardiologicznemu i Narodowemu Instytutowi Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 155519 do BS oraz dotacjom z NIH R01 HL146373 i R35 HL150818) za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% roztwór soli fizjologicznejMedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint zestaw żył skóry głowyIgły
30G x 1/2MedlineNDA264372
33G x 1/2 Specjalistyczne igły podskórne EXELintMedlineNDA26393
50 mL Rurki stożkoweFisher Scientific06-443-20
Podkładki alkoholowe (70% alkoholu izopropylowego)MedlineMDS090670Z
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213-100
Płyta grzewcza dla zwierzątInstrumenty PhysitempHP-1M
Araldite GY 502Mikroskopia elektronowa Sciences10900
Axiocam 305 Color R2Mikroskopia Carl Zeiss Mikroskopia426560-9031-000
Strzykawki BD Luer-Lok, 20 mlMedlineB-D303310Z
Chlorek wapniaFisher ScientificC79-500
Naczynia do hodowli komórkowych 35mm x 10mmCorning Inc.
Aplikatory z bawełnianą końcówkąMedlineMDS202055H
DMP-30 AktywatorMikroskopia elektronowa Sciences13600
Bezwodnik bursztynowy dodecenylu / Mikroskopia elektronowa DDSASciences13700
Kleszcze opatrunkowe, 5", zakrzywione, ząbkowane, z wąską końcówkąKleszczyki opatrunkowe Integra Miltex6-100
, 5", standardowy, ząbkowanyIntegra Miltex6-6
EMBED 812 Żywicznamikroskopia elektronowa Sciences14900
Alkohol etylowy, bezwodny 200 proofMikroskopia elektronowa Sciences15055
Fisherbrand 4-drożny stojak na rurkiFisher Scientific03-448-17
Cyfrowy zegar FisherbrandFisher Scientific14-649-17
Fisherbrand Pojedyncza strzykawka Pompa infuzyjnaFisher Scientific 7801001
Gąbki z gazy 2 "x 2"- 4 warstwyMedlineNON26224H
Aldehyd glutarowy (10% roztwór)Mikroskopia elektronowa Sciences16120
Izofluran Płynny środek wziewny znieczulający, 100 mlMedline66794-017-10
Jubiler Style Micro-Fine Kleszcze, styl 5FIntegra Miltex17-305Potrzebujesz 2 par.
L/S Rurka do pompy, silikon, L/S 15; 25 stópVWRMFLX96410-15
Kwas L-asparaginowyFisher ScientificBP374-100
Azotan ołowiuFisher ScientificL-62
Zieleń malachitowa 4Mikroskopia elektronowa Sciences18100
Głowica pompy Masterflex L/S Easy-Load IIVWRMFLX77200-62
Masterflex L/S Napęd cyfrowy o zmiennej prędkościVWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Nożyce do drutuFisher Scientific50-191-9855
Tetratlenek osmu 4% roztwór wodnyMikroskopia elektronowa Sciences19150
Paraformaldehyd (16% roztwór)Mikroskopia elektronowa Sciences15710
Kontrolertemperatury PhysitempPhysitemp InstrumentsTCAT-2LV
Żelazocyjanek potasuSigma-AldrichP-8131
Tlenek propylenu, odczynnik ACSMikroskopia elektronowa Sciences20401
Zlewki ze szkła pyrexowegoFisher Scientific02-555-25B
Sonda temperatury doodbytnicy dla myszyPhysitemp InstrumentsRET-3
Taśma Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"3M Company305289
Bufor kakodylanu sodu 0,2 m, pH 7,4Mikroskopia elektronowa Sciences11623
SomnoFlo Elektroniczny waporyzator o niskim przepływieKent ScientificSF-01
SomnoFlo Zestaw startowy dla myszyKent ScientificSF-MSEKIT
Szpilki Mintinien ze stali nierdzewnej FineScience Narzędzia26002-10
Mikroskop stereoskopowy steREO Discovery.V12Mikroskopia Carl Zeiss495015-9880-010
Sylgard 184 Świat elastomerusilikonowego Instrumenty precyzyjneSYLG184mata silikonowa Mikroskopia
elektronowakwasu garbnikowego21700
Tiokarbohydrazyd (TCH)Sigma-Aldrich88535
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Sciences22400
Vannas Spring Micro ScissorsFine Science Tools15000-08
Kleszczyki do opatrunków do oczu von Graefe, 2,75 ", zakrzywione, ząbkowaneIntegra Miltex18-818Potrzebujesz 2 par.
Nożyczki WagneraNarzędzia naukowe14068-12
Wahl MiniFigura Trymer do zwierzątBraintree ScientificCLP-9868
Oprogramowanie Zen LiteMikroskopia Carl Zeiss410135-1001-000
podskórne EXELint NDA26709 430165 Nauki

Bibliografia

  1. Rhee, S. W., et al. Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates. Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).
  2. Pokrovskaya, I. D., et al. Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site. Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058(2023).
  3. Yadav, S., Storrie, B. The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships. Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).
  4. Joshi, S., et al. Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis. J Vis Exp. (193), e64985(2023).
  5. Guerrero, J. A., et al. Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation. Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).
  6. Kato, K., et al. The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion. Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).
  7. Tomaiuolo, M., et al. Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury. Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).
  8. Cocchiaro, J. L., et al. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  9. Pokrovskaya, I. D., et al. Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway. Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).
  10. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  11. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  12. Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants. Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).
  13. Kiernan, J. A. Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do. Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).
  14. Storrie, B., Attardi, G. Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation. J CellBiol. 56, 819-831 (1973).
  15. Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking. Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).
  16. Klarhofer, M., et al. High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger. Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).
  17. Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. Physiology, cardiovascular. StatPearls. , Treasure Island, FL, USA. (2022).
  18. Pokrovskaya, I. D., et al. SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets. Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).
  19. Pokrovskaya, I. D., et al. 3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets. Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

agregacja płytek krwistruktura zakrzepuprzygotowanie próbekmodele mysiefiksacja perfuzyjnaobrazowanie szerokopolowesekcjonowanie sekwencyjneuszkodzenie naczyniowe
Hemostaza rany kłutej i przygotowanie próbek do analizy w zmontowanej mikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.