Artykuł metodologiczny

Wpływ wywaru przeciwzmęczeniowego na zachowania i wskaźniki serologiczne w centralnym modelu szczura zmęczeniowego

921 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66481

⸱

12 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj wprowadzamy protokół do oceny wpływu wywaru przeciwzmęczeniowego (AFD) na centralne zmęczenie u szczurów, modelowany przez zmodyfikowaną metodę wieloplatformową (MMPM), monitorując zarówno ich reakcje behawioralne, jak i markery serologiczne.

Streszczenie

To badanie miało na celu ocenę wpływu wywaru przeciwzmęczeniowego (AFD) na zmęczenie centralne poprzez obserwację zachowań i wskaźników serologicznych szczurów modelowanych przez zmodyfikowaną metodę wieloplatformową (MMPM) po interwencji lekowej. Pomiary siły chwytu wykorzystano do oceny siły mięśni szczurów. Test otwartego pola został wykorzystany do oceny zachowania podobnego do lęku, podczas gdy test labiryntu wodnego Morrisa został przeprowadzony w celu oceny funkcji pamięci szczurów. Po ocenach behawioralnych pobrano próbki surowicy szczurów w celu zmierzenia stężeń kortykosteronu (CORT) i kwasu mlekowego (LAC). Stężenie LAC oznaczono metodą kolorymetryczną, natomiast stężenie CORT oznaczono metodą testu immunoenzymatycznego (ELISA). W porównaniu z ślepą próbą grupy kontrolnej, po modelowaniu MMPM, szczury wykazywały znaczne zmniejszenie siły chwytu i upośledzoną zdolność zapamiętywania. Analiza surowicy wykazała podwyższone poziomy LAC i CORT u szczurów z grupy modelowej. AFD może w pewnym stopniu zauważalnie odwrócić te niekorzystne zmiany. Odkrycia te podkreślają pozytywny wpływ AFD i koenzymu Q10 na zdolności fizyczne i poznawcze oraz zmiany w poziomach biomarkerów w surowicy szczurów z centralnym zmęczeniem.

Wprowadzenie

Zmęczenie jest wieloaspektowym i niespecyficznym zjawiskiem, które zazwyczaj charakteryzuje się uczuciem zmęczenia i zmniejszoną zdolnością do funkcjonowania1. Można je sklasyfikować jako zmęczenie obwodowe, które występuje na poziomie mięśniowym, lub zmęczenie ośrodkowe, pochodzące z ośrodkowego układu nerwowego3,4. Długotrwałe zmęczenie centralne może w znacznym stopniu przyczyniać się do problemów psychologicznych, w tym lęku, depresji, dystresu psychicznego i problemów z pamięcią5,6. Pomimo powodowania znacznego stresu, istnieje niedobór konkretnych leków ukierunkowanych na centralne zmęczenie7. Podczas gdy metylofenidat, stymulant ośrodkowego układu nerwowego, może przynieść tymczasową ulgę, jego skutki uboczne, takie jak bezsenność i kołatanie serca, mogą pogorszyć stan8,9.

W poprzednich zastosowaniach klinicznych, tradycyjna medycyna chińska wykazała obiecujące wyniki w leczeniu zmęczenia centralnego, włączając takie podejścia jak wywary doustne, akupunktura i Tai Chi10,11,12. Odwar przeciwzmęczeniowy (AFD) to skuteczna formuła opracowana przez profesora Li Fenga w oparciu o bogate doświadczenie kliniczne i wykazująca pozytywne efekty terapeutyczne. Składa się z Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) i Dendrobium officinale (Shihu), w stosunku 15: 15: 10: 5: 7: 8. Odwar AFD zagęszczono do 110 ml po trzykrotnym gotowaniu z dziesięciokrotnością objętości wody dejonizowanej przez 1 godzinę trzykrotnie. W poprzednim badaniu ustaliliśmy zwierzęcy model zmęczenia ośrodkowego przy użyciu zmodyfikowanej metody wielu platform (MMPM) i potwierdziliśmy manifestację zmęczenia ośrodkowego poprzez behawioralne i oceny neuroprzekaźników ośrodkowego układu nerwowego13. W tym badaniu wykorzystaliśmy interwencję AFD w zwierzęcym modelu centralnego zmęczenia, aby ocenić jego efekty farmakologiczne poprzez oceny behawioralne.

Protokół

Ta praca badawcza jest zgodna z etycznymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Utrzymano odpowiednie warunki opieki i przetrzymywania w celu zapewnienia zdrowia i dobrostanu zwierząt, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie (BUCM-4-2019041504-2094).

1. Hodowla i grupowanie zwierząt

UWAGA: Przez cały czas trwania badania, dobrostan zwierząt był utrzymywany zgodnie z zasadami 3R (Redukcja, Udoskonalenie i Wymiana).

  1. Do tego badania wybierz 54 sześciotygodniowe szczury Wistar wolne od specyficznych patogenów (SPF) o masie ciała 210 g ± 10 g.
  2. Zwierzęta należy trzymać w pomieszczeniach dla zwierząt w kontrolowanych warunkach: temperatura 23 ± 2 °C, wilgotność względna 50% i cykl 12 godzin/12 godzin światło/ciemność. Pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się przez 3 dni przed eksperymentem.
  3. Losowo podzielić szczury na ślepą grupę kontrolną (oznaczoną jako "a" na rysunkach), grupę modelową (oznaczoną jako "b" na rysunkach), grupę AFD-niskodawkową (AFD-L; oznaczoną jako "c" na rysunkach), grupę AFD-średnią dawkę (AFD-M; oznaczoną jako "d" na rysunkach), grupę AFD-wysokodawkową (AFD-H; oznaczoną jako "e" na rysunkach), grupę AFD-niskodawkową (AFD-L; oznaczoną jako "e" na rysunkach), grupa koenzymu Q10 (CoQ10; oznaczona jako "f" na rysunkach), z 9 szczurami w każdej grupie, przy użyciu metody tabeli liczb losowych.

2. Modelowanie i interwencja

UWAGA: Ustanowienie tego modelu opierało się na poprzedniej literaturze13.

  1. Skorzystaj z samodzielnie wykonanego pudełka do modelowania (dostarczonego przez Laboratorium Neuroimmunologii Pekińskiego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej).
    UWAGA: Modelarnia ma długość 110 cm, szerokość 60 cm i wysokość 40 cm. Dno mocowane jest za pomocą 15 okrągłych platform (średnica 6,5 cm, wysokość 8 cm). Odstęp poziomy między dwiema platformami wynosi 13 cm, a pionowy 10 cm. Otwarta skrzynka polowa ma długość, szerokość i wysokość odpowiednio 100 cm, 100 cm i 35 cm. Dno jest czarne, a ściana ciemnoniebieska. Dno pola otwartego jest podzielone na 25 kwadratowych sekcji o wymiarach 25 cm, przy czym środkowe 9 kwadratów jest oznaczonych jako strefa środkowa, a zewnętrzne 16 kwadratów jako strefa obwodowa.
  2. Upewnij się, że poziom wody w basenie znajduje się około 1 cm powyżej platformy i że temperatura wody jest utrzymywana na poziomie 23 ± 2 °C.
  3. Po rozpoczęciu eksperymentu umieść szczura w pudełku pokrytym siatką drucianą na powierzchni i dociśnij je ciężarkami, aby zapobiec ucieczce zwierząt. Zawieś wystarczającą ilość żywności pod siatką drucianą i zapewnij czystą wodę pitną.
  4. Szczura w grupie modeli umieszczaj w pudełku codziennie o godzinie 18:00 i wyjmuj go o 8:00 następnego dnia. Po każdej sesji modelowania osusz szczura i umieść go z powrotem w czystej klatce. Modelowanie należy wykonywać w sposób ciągły przez 21 dni.
  5. Podczas eksperymentu wyczyść pudełko, codziennie zmieniaj wodę i zapewnij wystarczającą ilość jedzenia.
  6. W 15 dniu modelowania należy podawać środki przez płukanie żołądka codziennie o godzinie 10:00 przez nieprzerwany okres 7 dni.
    1. Podawać grupie AFD-L w dawce 3,24 g/kg/d, grupie AFD-M 6,48 g/kg/d, a grupie AFD-H w dawce 12,96 g/kg/d. Podawać koenzym Q10 w dawce 10 mg/kg/d.
    2. W przypadku podawania środków przez płukanie żołądka należy przygotować zawiesinę, mieszając wymaganą dawkę z wodą destylowaną. Objętość podawania dla każdej grupy wynosi 10 ml/kg. Dać grupie ślepej próby i modelowi taką samą ilość wody destylowanej.
      UWAGA: Dawki podawane szczurom zostały obliczone przy użyciu metody powierzchni ciała (BSA) i przeliczone zgodnie z normalnymi dawkami terapeutycznymi dla ludzi14.

3. Oceny zachowania

  1. Siła chwytu szczurów
    1. Chwyć ogon szczura i delikatnie umieść go na mierniku siły chwytu.
    2. Pociągnij szczura do tyłu z jednakową siłą, upewniając się, że system komputerowy prawidłowo rejestruje dane.
      UWAGA: Przed eksperymentami technicy zostali przeszkoleni w zakresie obchodzenia się ze szczurami, aby konsekwentnie stosować siłę.
    3. Powtórz ten proces trzy razy i oblicz średnią z trzech pomiarów jako końcową wartość siły chwytu.
      UWAGA: Aby zminimalizować błędy spowodowane czynnikami ludzkimi, pozwól jednej osobie przeprowadzić cały eksperyment.
  2. Test w otwartym polu u szczurów
    1. Przeprowadzaj eksperymenty behawioralne w słabo oświetlonym i cichym otoczeniu. Przed rozpoczęciem każdego eksperymentu należy umieścić szczury w pomieszczeniu behawioralnym na 1 godzinę adaptacji.
    2. Upewnij się, że trzech eksperymentatorów jest zaangażowanych w operację i nosi czarne ubrania podczas umieszczania lub prowadzenia szczurów. Przez cały czas trwania eksperymentu upewnij się, że eksperymentatorzy nie przekraczają granic pudełka swoim ciałem lub ramionami.
    3. Otwórz oprogramowanie do analizy.
      1. Kliknij Plik w górnym menu i wybierz Nowy eksperyment, aby utworzyć nowy projekt. W ustawieniach areny wybierz kształt odpowiadający arenie, na której będzie się poruszał szczur.
      2. Za pomocą myszy narysuj arenę na ekranie. Skalibruj kamerę i zapisz ustawienia areny.
    4. Pozwól drugiemu eksperymentatorowi, ubranemu w czarne ubranie, przytrzymać szczura za grzbiet, kolejno umieść go na środku wyznaczonego obszaru i szybko wycofaj rękę.
    5. Rozpocznij nowe nagranie. Ustaw czas nagrywania na 5 minut.
    6. Po 5-minutowym okresie obserwacji szybko wyjmij szczura z pudełka na otwartym polu i wyczyść jego kał. Użyj 75% alkoholu do czyszczenia pudełka na otwartym polu.
    7. Powtórz ten proces dla wszystkich szczurów.
    8. Obserwuj i zapisuj (1) całkowitą przebytą odległość, (2) liczbę przekroczeń strefy centralnej: ile razy kończyny szczura krzyżują się w centralne kwadraty siatki, oraz (3) czas spędzony w strefie centralnej, tj. czas spędzony przez szczura w 9 centralnych kwadratach siatki.
  3. Labirynt wodny Morrisa u szczurów
    1. Przeprowadzaj eksperymenty behawioralne w słabo oświetlonym i cichym otoczeniu. Przed rozpoczęciem każdego eksperymentu umieść szczury w pomieszczeniu behawioralnym na 1 godzinę adaptacji.
      UWAGA: Szczury przeszły 4 dni treningowe; Piątego dnia rozpoczął się formalny eksperyment
      2. .
    2. Upewnij się, że poziom wody w basenie znajduje się około 1 cm powyżej platformy i że temperatura wody jest utrzymywana na poziomie 23 ± 2 °C.
    3. Upewnij się, że trzech eksperymentatorów jest zaangażowanych w operację i nosi czarne ubrania podczas umieszczania lub prowadzenia szczurów.
    4. Podziel basen wodny na cztery ćwiartki. Napraw platformę w środku drugiego kwadrantu. Przymocuj kawałki papieru o różnych kolorach i kształtach do środka ścian każdego kwadrantu.
    5. Otwórz oprogramowanie do analizy.
      1. Kliknij Plik w górnym menu i wybierz Nowy eksperyment, aby utworzyć nowy projekt. W ustawieniach areny wybierz kształt odpowiadający arenie, na której będzie się poruszał szczur.
      2. Za pomocą myszy narysuj arenę na ekranie. Skalibruj kamerę i zapisz ustawienia areny.
    6. Podczas okresu uczenia się, pozwól innemu eksperymentatorowi kolejno umieścić szczura przodem do ściany basenu w każdym kwadrancie. Kolejność umieszczania jest inna każdego dnia i przedstawia się następująco:
      1. Pierwszego dnia ułóż szczura w następującej kolejności: pierwsza ćwiartka, druga ćwiartka, trzecia ćwiartka, czwarta ćwiartka.
      2. Drugiego dnia ułóż szczura w następującej kolejności: druga ćwiartka, pierwsza ćwiartka, czwarta ćwiartka, trzecia ćwiartka.
      3. Trzeciego dnia ułóż szczura w następującej kolejności: czwarta ćwiartka, trzecia ćwiartka, druga ćwiartka, pierwsza ćwiartka;
      4. Czwartego dnia ułóż szczura w następującej kolejności: trzecia ćwiartka, pierwsza ćwiartka, czwarta ćwiartka, druga ćwiartka.
    7. Jeśli szczur nie znajdzie platformy w ciągu 120 sekund, poprowadź go do platformy i pozwól mu pozostać na niej przez 10 sekund.
    8. Po zakończeniu codziennego eksperymentu pozwól trzeciemu eksperymentatorowi wytrzeć wodę z ciała szczura za pomocą ręcznika i osuszyć ją suszarką do włosów. Zrób to w innym pomieszczeniu, aby uniknąć zakłóceń hałasu.
    9. W formalnym eksperymencie usuń platformę i umieść szczura w trzeciej ćwiartce. Zapisz trajektorię ruchu szczura w ciągu 120 sekund.
    10. Obserwuj i zapisuj (1) czas spędzony w kwadrancie, w którym znajdowała się platforma, oraz (2) opóźnienie ucieczki, czyli czas potrzebny szczurowi na dotarcie na platformę od pierwszego wejścia do basenu wodnego.

4. Analiza biochemiczna surowicy

  1. Przetwarzanie próbek
    UWAGA: Post na jedzeniu, ale nie na wodzie, był dozwolony dzień przed pobraniem próbki.
    1. Znieczulenie szczurów za pomocą 2% (w/v) roztworu pentobarbitalu sodu we wstrzyknięciu dootrzewnowym w dawce 0,5 ml/100 g masy ciała.
    2. Po całkowitym znieczuleniu pobierz krew z aorty brzusznej za pomocą naczynia do pobierania krwi.
    3. Umieścić krew pełną w temperaturze pokojowej (RT) na 2 godziny, a następnie odwirować ją w temperaturze 4 °C, 1522,38 x g przez 20 minut w celu uzyskania surowicy. Przechowywać serum w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.
  2. Oznaczenie kwasu mlekowego (LAC)
    UWAGA: Stężenie LAC oznaczono metodą kolorymetryczną.
    1. Zmieszać roztwór rezerwowy enzymu i roztwór rozcieńczający enzym w stosunku objętościowym 1:100, aby przygotować roztwór roboczy enzymu.
    2. Przygotuj wywoływacz kolorów zgodnie z instrukcjami w zestawie.
    3. Do pustej probówki dodać 20 μl wody destylowanej.
    4. W standardowej probówce dodać 3 mmol/l roztworu wzorcowego.
    5. Do probówki pomiarowej dodać 20 μl próbki.
    6. Do każdej probówki dodać 1 ml roztworu roboczego enzymu i 0,2 ml wywoływacza koloru. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie dodać 2 ml roztworu zatrzymującego.
    7. Przenieść 200 μl roztworu reakcyjnego na 96-dołkową płytkę ELISA. Zmierz wartość OD przy 530 nm. Obliczyć stężenie LAC na podstawie wartości OD.
      UWAGA: Stężenie LAC = (wartość OD w studzience próbki - wartość OD w studzience ślepej)/( wartość OD w studzience wzorcowej - wartość OD w studzience ślepej) x stężenie roztworu wzorcowego x współczynnik rozcieńczenia.
  3. Test kortykosteronu
    UWAGA: Zakupione w handlu zestawy ELISA służą do pomiaru stężenia kortyzonu w surowicy szczurów.
    1. Przed eksperymentem rozcieńczyć przeciwciała sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) i roztworem myjącym, aby uzyskać roztwór roboczy. Do powlekanej płytki dodać próbki wzorcowe o stężeniach 0 nmol/l, 5 nmol/l, 15 nmol/l, 30 nmol/l, 60 nmol/l, 120 nmol/l i 240 nmol/l w objętościach 20 μl.
    2. Dodać próbki surowicy (20 μl) do odpowiednich studzienek, a następnie dodać 200 μl koniugatu enzymu. Dokładnie wstrząśnij płytką i inkubuj ją przez 60 minut.
    3. Wyrzucić roztwór reakcyjny i przemyć płytkę trzykrotnie roztworem myjącym (za każdym razem 400 μl). Po wysuszeniu płytki na bibule chłonnej dodać 100 μl odczynnika barwiącego podłoże do każdej studzienki.
    4. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki.
    5. Zmierzyć wartości OD każdej studzienki przy 450 nm. Użyj wartości OD standardowych studzienek, aby wygenerować krzywą standardową, a następnie użyj jej do obliczenia stężeń w dołkach na próbki.

5. Analiza statystyczna

  1. Wykonaj analizę statystyczną za pomocą odpowiedniej aplikacji. Przedstawić dane pomiarowe jako średnią ± odchylenie standardowe.
  2. Jeśli dane były zgodne z rozkładem normalnym i wykazywały jednorodność wariancji, należy przeprowadzić niezależny test t.
  3. Jeśli dane były zgodne z rozkładem normalnym, ale nie miały równości wariancji, wykonaj przybliżony test t.
  4. Jeśli dane nie są zgodne z rozkładem normalnym, do porównania należy użyć testów nieparametrycznych.
  5. Użyj testu chi-kwadrat Pearsona do analizy danych wyliczenia/zliczania.
    UWAGA: Wybrano poziom istotności α = 0,05, gdzie P < 0,05 określa się jako istotny statystycznie.
  6. Wygeneruj rysunki za pomocą odpowiedniej aplikacji.

Wyniki

W porównaniu z grupą kontrolną, szczury w grupie modelowej wykazywały znaczne spadki siły chwytu. Jednak podawanie AFD w niskich, średnich i wysokich dawkach było w stanie odwrócić ten efekt w sposób zależny od dawki, jak pokazano na Rysunek 1. Podobnie, lek kontroli pozytywnej wykazał również zdolność do odwrócenia zmian siły chwytu (Rysunek 1).

W teście na otwartym polu, szczury z grupy modelowej wykazały zmniejszenie całkowitego przebytego dystansu, liczby przekroczeń strefy centralnej oraz czasu przebywania w strefie centralnej. Podawanie AFD w niskich, średnich i wysokich dawkach było w stanie odwrócić te efekty w sposób zależny od dawki, jak pokazano na Rysunek 2. W tym samym czasie lek kontroli pozytywnej był również w stanie złagodzić objawy (Ryc. 2). Mapy cieplne przedstawiające nałożone na siebie częstotliwości trajektorii z eksperymentów w otwartym polu każdej grupy można zaobserwować w Rysunek 3.

Podczas testu wodnego labiryntu Morrisa, szczury z grupy modelowej wykazywały wydłużone opóźnienia ucieczki i skrócony czas pływania w kwadrancie docelowym, co wskazuje na gorszą zdolność wyszukiwania przestrzennego. Lek kontroli pozytywnej, koenzym Q10, był w stanie odwrócić wyżej wymienione zmiany. Warto zauważyć, że AFD przy niskich, średnich i wysokich dawkach odwróciło przedłużone opóźnienie ucieczki, jak pokazano na Rysunek 4. Reprezentatywne mapy cieplne trajektorii szczurów w eksperymencie z labiryntem wodnym dla każdej grupy można zaobserwować w Rysunek 5.

Jeśli chodzi o poziomy w surowicy, szczury w grupie modelowej miały podwyższone poziomy LAC i CORT. Jednak podawanie AFD w niskich, średnich i wysokich dawkach odwróciło te zmiany w sposób zależny od dawki, podobnie jak w przypadku leku kontroli pozytywnej, jak pokazano na Rycina 6.

figure-results-1
Rysunek 1: Wyniki siły chwytu każdej grupy. a: grupa kontrolna; b: grupa modeli; c: grupa AFD-L; d: grupa AFD-M; e: grupa AFD-H; f: grupa CoQ10. *p < 0,05 w porównaniu z grupą kontrolną; #p < 0,05 w porównaniu z grupą modeli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Eksperyment na otwartym polu i pomiar poziomu aktywności lokomotorycznej. (A) Całkowita przebyta odległość. (B) Liczba przekroczeń strefy centralnej. (C) Czas trwania strefy centralnej zamieszkiwany. a: grupa kontrolna; b: grupa modeli; c: grupa AFD-L; d: grupa AFD-M; e: grupa AFD-H; f: grupa CoQ10. *p < 0,05 w porównaniu z grupą kontrolną; #p < 0,05 w porównaniu z grupą modeli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Mapy cieplne pokazujące nałożone częstotliwości trajektorii z eksperymentów w otwartym polu każdej grupy. a: grupa kontrolna; b: grupa modeli; c: grupa AFD-L; d: grupa AFD-M; e: grupa AFD-H; f: grupa CoQ10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wyniki eksperymentu z labiryntem wodnym Morrisa w każdej grupie. (A) Opóźnienie ucieczki. (B) Czas pływania w kwadrancie docelowym. a: grupa kontrolna; b: grupa modeli; c: grupa AFD-L; d: grupa AFD-M; e: grupa AFD-H; f: grupa CoQ10. *p < 0,05 w porównaniu z grupą kontrolną; #p < 0,05 w porównaniu z grupą modeli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentatywne mapy cieplne trajektorii szczurów w eksperymencie z labiryntem wodnym Morrisa dla każdej grupy. a: grupa kontrolna; b: grupa modeli; c: grupa AFD-L; d: grupa AFD-M; e: grupa AFD-H; f: grupa CoQ10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wyniki poziomów LAC i CORT w surowicy w każdej grupie. (A) Poziomy LAC w surowicy. (B) Poziomy CORT w surowicy. a: grupa kontrolna; b: grupa modeli; c: grupa AFD-L; d: grupa AFD-M; e: grupa AFD-H; f: grupa CoQ10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

AFD składa się z Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) i Dendrobium officinale (Shihu), które uważa się, że w tradycyjnej medycynie chińskiej pełnią funkcję ożywiania śledziony i rozpraszania zastanej energii wątroby. Uważa się również, że wszystkie te zioła mają korzystny profil bezpieczeństwa i dlatego są powszechnie stosowane jako żywność w Chinach. W dotychczasowej praktyce klinicznej AFD wykazywała dobrą skuteczność w leczeniu pacjentów ze zmęczeniem ośrodkowym, ale ten specyficzny mechanizm terapeutyczny nadal wymaga dalszych badań. Dlatego naszym celem jest walidacja wpływu AFD na poprawę zmęczenia ośrodkowego poprzez eksperymenty na zwierzętach i dalsze wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska.

Stworzenie modeli zwierzęcych, które dokładnie reprezentują patogenezę choroby i charakterystykę kliniczną, ma zasadnicze znaczenie dla prowadzenia badań farmakologicznych15. Nasz zespół wcześniej ustalił szczurzy model centralnego zmęczenia poprzez brak snu, co skutkuje zmniejszoną siłą chwytu, lękiem i upośledzeniempamięci. Jednak w poprzednim badaniu nie udało nam się wykryć odpowiednich wskaźników serologicznych. Jednocześnie obserwacja istotnych zmian w biomarkerach surowicy związanych ze zmęczeniem wzmacnia wiarygodność tego modelu zwierzęcego jako wiarygodnej reprezentacji zmęczenia centralnego. W tym badaniu zastosowano różne dawki AFD w celu interwencji w szczurzym modelu zmęczenia centralnego, z koenzymem Q10 (lekiem znanym z poprawy zmęczenia poprzez poprawę metabolizmu energetycznego)16 jako kontrolą pozytywną. Ocena behawioralna jest kluczowym krokiem w badaniu eksperymentów na zwierzętach związanych ze zmęczeniem. W związku z tym konieczne jest, aby badacze zapewnili precyzję tej procedury17. Po przeprowadzeniu testu w terenie otwartym zwierzęta umieszczono na zamkniętej platformie, której celem była ocena zmian ich nastroju poprzez obserwację odpowiednich czynności18,19. Labirynt wodny Morrisa to rodzaj eksperymentu, który zmusza zwierzęta laboratoryjne do pływania i uczenia się znajdowania ukrytych platform w wodzie, co służy głównie do oceny zdolności uczenia się i zapamiętywania20,21. Modele centralnego zmęczenia wykazały wyraźne zmiany w zachowaniu, w związku z czym zastosowaliśmy te dwa testy, aby obserwować i oceniać zmiany w zachowaniach szczurów. Wyniki pokazują, że szczury w modelu MMPM wykazują wyraźne zachowania podobne do lęku i upośledzone zdolności uczenia się i zapamiętywania, co jest zgodne z poprzednimi wynikami badań13.

Stres może prowadzić do nadmiernej aktywacji osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA), co skutkuje nadprodukcją glikokortykosteroidów22. Długotrwały wzrost kortyzolu może powodować nieodwracalne uszkodzenia neuronów, co jest istotnym czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju bezsenności, depresji i lęku23,24. Procesy te są ściśle związane z występowaniem i rozwojem zmęczenia ośrodkowego, dlatego uważa się, że kortyzol w surowicy jest związany ze stopniem zmęczenia25. Modele zwierzęce centralnego zmęczenia wykazały wyraźny wzrost poziomu kortykosteronu, który można skutecznie odwrócić poprzez interwencję za pomocą odpowiednich leków26. Wyniki tego badania wskazują, że AFD może skutecznie hamować wzrost kortykosteronu w surowicy spowodowany stresem i zmęczeniem ośrodkowym, wykazując efekt zależny od dawki. Wynik ten częściowo wyjaśnia, dlaczego AFD może poprawić zachowanie podobne do lęku w centralnym modelu zmęczenia u szczurów.

Mleczan był wcześniej uważany za produkt uboczny mięśni szkieletowych. Gdy intensywność ćwiczeń wzrasta, zapotrzebowanie na energię przewyższa wydolność tlenową, co prowadzi do zwiększonej zależności od metabolizmu beztlenowegow produkcji ATP. Nagromadzenie kwasu mlekowego jest odpowiedzialne za stymulację receptorów chemicznych w mięśniach, a to pobudzenie jest przekazywane do mózgu i staje się sygnałem bólu i zmęczenia28. Niektóre czynniki patologiczne indukują również nadprodukcję mleczanu, aktywując w ten sposób ten łuk odruchowy. Ostatnie badania kliniczne opisały ścisły związek między poziomem kwasu mlekowego w surowicy a stopniem zmęczenia29. W naszej powyższej obserwacji, szczury MMPM wykazały znaczne podwyższenie surowicy w porównaniu z ślepą próbą, co potencjalnie wskazuje na silną korelację między zwiększonym poziomem mleczanu a zmęczeniem mięśni odczuwanym podczas stania na małej platformie. Zastosowanie AFD jest w stanie znacznie obniżyć poziom kwasu mlekowego w surowicy pobranej od szczurów WMPV do pewnego stopnia, sekwencyjnie poprawiając stopień zmęczenia.

Podsumowując, badanie to wykazało, że AFD skutecznie odwróciło spadek siły chwytu, złagodziło niepokój i poprawiło pamięć, potencjalnie dzięki zdolności do obniżania poziomu kortykosteronu i poprawy metabolizmu mleczanu. Oczekuje się, że niniejsza praca będzie stanowić szablon do eksperymentalnego badania TCM przeciwko centralnemu zmęczeniu in vivo. Ograniczeniem badania jest to, że nie ma zaawansowanego kroku w celu zbadania podstaw powiązanych mechanizmów molekularnych. W przyszłości będziemy nadal badać wpływ AFD na ośrodkowy układ nerwowy i badać związane z nim mechanizmy.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów w związku z publikacją niniejszej pracy. Nie mamy żadnych finansowych ani osobistych powiązań z organizacjami lub osobami, które mogłyby w niewłaściwy sposób wpływać na nasze badania.

Podziękowania

Wszyscy autorzy chcieliby wyrazić swoją wdzięczność za wsparcie ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NO. 81874428) oraz projektu badawczego Pekińskiego Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (NO.2023-JYB-JBZD-001).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw testowy kortykosteronuNiemiecka firma DRGEIA4164Krok 4.3
Oprogramowanie Curve Expert 1.4CurveExpert ProfessionalVersion 1.4Do obliczeń w teście kortykosteronu
Oprogramowanie Ethovision Noldus Information Technology, HolandiaWersja 15oprogramowanie analityczne i system śledzenia wideo
Urządzenie do badania siły chwytuBeijing Zhongshi Di Chuang limited companyZS-ZLKrok 3.1
Zestaw do testowania kwasu mlekowegoInstytut Badawczy Bioinżynierii Nanjing JianchengA019-2-1Krok 4.2
Zmodyfikowana metodawieloplatformowaLaboratorium Neuroimmunologii Pekińskiego Uniwersytetu Medycyny ChińskiejBrakKrok 2.1
Urządzenie do badania labiryntu wodnego MorrisPekin Zhongshi Di Chuang spółka z ograniczonąodpowiedzialnością ZS-MorrisKrok 3.3
Urządzenie do testowania w otwartym poluPekin Zhongshi Di Chuang spółka z ograniczoną odpowiedzialnościąZS-KCKrok 3.2
Prism GraphPad Verson 8Do generowania danych
SPSS 26.0IBMVerson 26.0Analiza statystyczna 
Szczury Wistar Numer licencji SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd: SCXK (Jing) 2019-0010

Bibliografia

  1. Dukes, J. C., Chakan, M., Mills, A., Marcaurd, M. Approach to fatigue: Best practice. Med Clin North Am. 105 (1), 137-148 (2021).
  2. Zargari Marandi, R., Madeleine, P., Omland, Ø, Vuillerme, N., Samani, A. Eye movement characteristics reflected fatigue development in both young and elderly individuals. Sci Rep. 8 (1), 13148(2018).
  3. Tornero-Aguilera, J. F., Jimenez-Morcillo, J., Rubio-Zarapuz, A., Clemente-Suárez, V. J. Central and peripheral fatigue in physical exercise explained: A narrative review. Int J Environ Res Public Health. 19 (7), 3909(2022).
  4. Dotan, R., Woods, S., Contessa, P. On the reliability and validity of central fatigue determination. Eur J Appl Physiol. 121 (9), 2393-2411 (2021).
  5. AlSaeed, S., et al. Fatigue, depression, and anxiety among ambulating multiple sclerosis patients. Front Immunol. 13, 844461(2022).
  6. Lee, C. H., Giuliani, F. The role of inflammation in depression and fatigue. Front Immunol. 10, 1696(2019).
  7. Meeusen, R., Watson, P., Hasegawa, H., Roelands, B., Piacentini, M. F. Central fatigue: the serotonin hypothesis and beyond. Sports Med. 36 (10), 881-909 (2006).
  8. Nourbakhsh, B., et al. Safety and efficacy of amantadine, modafinil, and methylphenidate for fatigue in multiple sclerosis: a randomised, placebo-controlled, crossover, double-blind trial. Lancet Neurol. 20 (1), 38-48 (2021).
  9. Rojí, R., Centeno, C. The use of methylphenidate to relieve fatigue. Curr Opin Support Palliat Care. 11 (4), 299-305 (2017).
  10. Luo, C., et al. Natural medicines for the treatment of fatigue: Bioactive components, pharmacology, and mechanisms. Pharmacol Res. 148, 104409(2019).
  11. Wang, T., Xu, C., Pan, K., Xiong, H. Acupuncture and moxibustion for chronic fatigue syndrome in traditional Chinese medicine: a systematic review and meta-analysis. BMC Complement Altern Med. 17 (1), 163(2017).
  12. Xiang, Y., Lu, L., Chen, X., Wen, Z. Does Tai Chi relieve fatigue? A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. PLoS One. 12 (4), e0174872(2017).
  13. Zhang, W., et al. A rat model of central fatigue using a modified multiple platform method. J Vis Exp. (138), e57362(2018).
  14. Drug Ther Bull. Body surface area for adjustment of drug dose. Drug Ther Bull. 48 (3), 33-36 (2010).
  15. Harrison, E. L., Baune, B. T. Modulation of early stress-induced neurobiological changes: a review of behavioural and pharmacological interventions in animal models. Transl Psychiatry. 4 (5), e390(2014).
  16. Sanoobar, M., Dehghan, P., Khalili, M., Azimi, A., Seifar, F. Coenzyme Q10 as a treatment for fatigue and depression in multiple sclerosis patients: A double blind randomized clinical trial. Nutr Neurosci. 19 (3), 138-143 (2016).
  17. Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
  18. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods Mol Biol. 1916, 99-103 (2019).
  19. Jin, Q., et al. Network and experimental pharmacology to decode the action of wendan decoction against generalized anxiety disorder. Drug Des Devel Ther. 16, 3297-3314 (2022).
  20. Othman, M. Z., Hassan, Z., Che Has, A. T. Morris water maze: a versatile and pertinent tool for assessing spatial learning and memory. Exp Anim. 71 (3), 264-280 (2022).
  21. Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J Vis Exp. (53), e2920(2011).
  22. Richardson, A. E., VanderKaay Tomasulo, M. M. Stress-induced HPA activation in virtual navigation and spatial attention performance. BMC Neurosci. 23 (1), 40(2022).
  23. Mikulska, J., Juszczyk, G., Gawrońska-Grzywacz, M., Herbet, M. HPA axis in the pathomechanism of depression and schizophrenia: New therapeutic strategies based on its participation. Brain Sci. 11 (10), 1298(2021).
  24. Passos, G. S. Insomnia severity is associated with morning cortisol and psychological health. Sleep Sci. 16 (1), 92-96 (2023).
  25. Herane-Vives, A., et al. Cortisol levels in chronic fatigue syndrome and atypical depression measured using hair and saliva specimens. J Affect Disord. 267, 307-314 (2020).
  26. Kang, J. Y., et al. Korean red ginseng ameliorates fatigue via modulation of 5-HT and corticosterone in a sleep-deprived mouse model. Nutrients. 13 (9), 3121(2021).
  27. Rabinowitz, J. D., Enerbäck, S. Lactate: the ugly duckling of energy metabolism. Nat Metab. 2 (7), 566-571 (2020).
  28. Proia, P., Di Liegro, C. M., Schiera, G., Fricano, A., Di Liegro, I. Lactate as a metabolite and a regulator in the central nervous system. Int J Mol Sci. 17 (9), 1450(2016).
  29. Zu, Y., Lu, X., Yu, Q., Yu, L., Li, H., Wang, S. Higher postdialysis lactic acid is associated with postdialysis fatigue in maintenance of hemodialysis patients. Blood Purif. 49 (5), 535-541 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

si a chwytutest otwartego polawodny labirynt Morrisakwas mlekowypoziom kortykosteronuimmunoenzymatyczny test przeciwcia

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.