Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie zdrowych i dysbiotycznych mikrośrodowisk pochwy w ludzkiej pochwie na chipie

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66486

⸱

16 lutego 2024

 ,  ,  , 
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Vascular Biology Program and Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School, 3Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje protokół tworzenia mikrofluidycznego urządzenia do hodowli pochwy na chipie (Vagina Chip), które umożliwia badanie interakcji ludzkiego gospodarza z żywym mikrobiomem pochwy w warunkach mikroaerofilnych. Ten chip może być wykorzystywany jako narzędzie do badania chorób pochwy oraz do opracowywania i testowania potencjalnych środków zaradczych terapeutycznych.

Streszczenie

Zdrowie kobiet, a szczególnie choroby kobiecego układu rozrodczego (FRT), nie otrzymały należnej im uwagi, mimo że niezdrowy układ rozrodczy może prowadzić do chorób zagrażających życiu, niepłodności lub niekorzystnych skutków w ciąży. Jedną z barier w tej dziedzinie jest niedobór przedklinicznych, eksperymentalnych modeli, które wiernie naśladowałyby fizjologię i patofizjologię FRT. Obecne modele in vitro i modele zwierzęce nie oddają w pełni zmian hormonalnych, warunków mikrotlenowych i interakcji z mikrobiomem pochwy. Pojawienie się technologii mikrofluidycznej hodowli Organ-on-a-Chip (Organ Chip), która może naśladować interfejsy tkanka-tkanka, perfuzję naczyniową, przepływy płynów śródmiąższowych oraz fizyczne mikrośrodowisko głównej podjednostki narządów ludzkich, może potencjalnie stanowić rozwiązanie tego problemu. Ostatnio opracowano ludzki chip pochwy wspierający współhodowlę ludzkich konsorcjum mikrobiologicznych pochwy z pierwotnym nabłonkiem pochwy, który jest również połączony ze stromą pochwy i doświadcza dynamicznego przepływu płynów. Ten chip odtwarza fizjologiczne reakcje ludzkiej pochwy na zdrowe i dysbiotyczne mikrobiomy. W tym artykule opisano szczegółowy protokół tworzenia ludzkich chipów pochwy.

Wprowadzenie

Mikrobiom pochwy zdominowany przez Lactobacillus spp., który pomaga utrzymać kwaśne mikrośrodowisko, odgrywa ważną rolę w utrzymaniu zdrowia reprodukcyjnego kobiet1. Jednak czasami może dojść do zmiany w składzie społeczności mikroorganizmów tworzących mikrobiom, co skutkuje wzrostem różnorodności bakterii pochwy. Te dysbiotyczne zmiany, które często prowadzą do przejścia ze stanu zdominowanego przez mlekowce na bardziej zróżnicowane beztlenowe gatunki bakterii (np. Gardnerella vaginalis), wiążą się z różnymi chorobami układu rozrodczego, takimi jak bakteryjna wagina, zanikliwe zapalenie pochwy, infekcje dróg moczowych, kandydoza pochwy sromowa, zapalenie cewki moczowej oraz chorioamnionitis: 2,3,4,5 . Te choroby z kolei zwiększają ryzyko zakażenia chorób przenoszonych drogą płciową oraz zapalenia miednicy 6,7,8,9. Stanowią one również wyższe ryzyko przedwczesnych porodów i poronień u kobietw ciąży 10, 11, 12, a także są powiązane z niepłodnością13, 14, 15, 16.

Chociaż podjęto próby modelowania dysbiozy pochwy za pomocą komórek nabłonkowych pochwy hodowanych w statycznych, dwuwymiarowych (2D) systemach hodowlanych17,18, nie oddają one skutecznie fizjologii i złożoności mikrośrodowiska pochwy19. Modele zwierzęce były również wykorzystywane do badania dysbiozy pochwy; Jednak ich fazy menstruacyjne oraz interakcje gospodarz z mikrobiomem znacznie różnią się od tych u ludzi, dlatego istotność fizjologiczna wyników tych badań pozostaje niejasna 19,20,21. Aby przeciwdziałać tym problemom, organoidy oraz modele wkładek Transwella tkanek pochwy były również wykorzystywane do badania interakcji gospodarz-patogen w FRT 19,22,23,24. Ponieważ są to statyczne hodowle, mogą one wspierać współhodowlę ludzkich komórek z żywymi mikroorganizmami tylko przez krótki czas (<16-24 godziny) i brakuje im wielu innych potencjalnie ważnych cech fizycznych mikrośrodowiska pochwy, takich jak produkcja śluzu i przepływ płynów22.

Chipy organowe to trójwymiarowe (3D) systemy hodowli mikrofluidycznej, które zawierają jeden lub więcej równoległych pustych mikrokanałów wyłożonych żywymi komórkami hodowanymi pod dynamicznym przepływem płynów. Układy dwukanałowe umożliwiają odtwarzanie interfejsów tkanek narządowych poprzez hodowanie różnych typów komórek (np. fibroblastów nabłonka i stromalnych lub nabłonka i śródbłonka naczyniowego) po przeciwnych stronach porowatej błony oddzielającej dwa równoległe kanały (Rysunek 1). Obie tkanki mogą być niezależnie narażone na przepływ płynów, a także mogą doświadczać warunków mikrotlenowych, co umożliwia współhodowlę z złożonym mikrobiomem 25,26,27,28. To podejście zostało niedawno wykorzystane do opracowania ludzkiego chipu pochwy wyłożonego hormonalnie wrażliwym, pierwotnym nabłonkiem pochwy, połączonym z leżącymi pod nimi fibroblastami stromalnymi, który utrzymuje niskie stężenie tlenu fizjologicznego w lumencie nabłonka i umożliwia współhodowlę zdrowych i dysbiotycznych mikrobiomow przez co najmniej 3 dni in vitro29. Wykazano, że chip pochwy może być wykorzystywany do badania kolonizacji przez optymalne (zdrowe) konsorcja L. crispatus oraz wykrywania stanu zapalnego i urazu spowodowanego przez nieoptymalne (niezdrowe) konsorcja zawierające G. vaginalis. Szczegółowo opisujemy tutaj metody wykorzystywane do tworzenia ludzkiego chipu pochwy oraz do tworzenia zdrowych i dysbiotycznych społeczności bakteryjnych na chipie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania te zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania ludzkich komórek. Komórki te zostały pozyskane komercyjnie (patrz Tabela materiałów). Wszystkie kroki powinny być wykonywane aseptycznie w szafie biosafety (BSC). Do tego protokołu używaj tylko końcówek filtrujących (lub barierowych).

1. Hodowanie ludzkich komórek nabłonka pochwy

  1. Podgrzej 50 mL nabłonkowego medium pochwy (VEM, patrz Tabela materiałów) do 37 °C.
  2. Aliquot 9 mL VEM do probówki 15 mL. Następnie rozmroź fiolkę z ludzkimi komórkami nabłonka pochwy (HVEC) i dodaj ją do rurki zawierającej VEM.
  3. Wiruj probówkę 15 mL w dawce 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i zasysaj supernatant, zostawiając granulat.
  4. Delikatnie ponownie zawiesij pellet w 2 mL VEM i dodaj po 1 ml do każdej z dwóch kolb T75 zawierających 14 mL VEM.
  5. Kolby inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2. Zmieniaj VEM co 2 dni, aż HVEC osiągną około 70% zbiegu (około 5 dni).

2. Hodowla ludzkich komórek fibroblastu macicy

  1. Przygotuj 10 mL roztworu poli-L-lizyny o pojemności 15 μg/mL (PLL) w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O). Dodaj 5 ml roztworu PLL do każdej z dwóch kolb T75 i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Podgrzej 50 mL nośnika fibroblastowego (FM, patrz Tabela materiałów) do 37 °C.
  3. Wdysaj roztwór PLL i przemyj każdą kolbę 5 mL ddH2O.
  4. Należy podać 9 mL FM do probówki 15 mL i rozmrażać fiolkę z ludzkimi fibroblastami macicy (HUF).
  5. Dodaj HUF do lampy 15 mL zawierającej FM.
  6. Wiruj probówkę 15 mL w 300 x g przez 5 minut w RT i zasysaj supernatant, pozostawiając osad komórkowy.
  7. Delikatnie ponownie zawiesz granulek w 2 mL FM i dodaj po 1 ml do każdej z dwóch kolb T75 zawierających po 14 mL FM.
  8. Inkubuj kolby w temperaturze 37 °C z 5%CO2 , aż komórki osiągną około 70% zbiegu, zmieniając podłoże co 2 dni.

3. Aktywacja chipu i powłoka kanałowa

  1. Odgazowywanie chipów (uzyskanych komercyjnie, patrz Tabela materiałów) przez 30 minut w próżniowym desykatorze.
  2. Pozwól, aby Odczynnik Aktywacyjny 1 (AR-1) i Aktywacyjny 2 (AR-2) (patrz Tabela materiałów) wyrównały się do RT przez 15 minut bez zdejmowania opakowania.
  3. Owiń stożkową tubkę o pojemności 15 ml folią, aby chronić ją przed światłem. Powoli dodaj 1 ml roztworu AR-2 do ścianek fiolki AR-1 i dobrze wymieszaj. Przelej mieszankę do probówki 15 mL owiniętej folią.
  4. Wielokrotnie dodawaj roztwór AR-2 do fiolki AR-1 w krokach po 1 mL, aż proszek AR-1 zostanie całkowicie wypłukany z fiolki.
  5. Uzupełnij roztwór AR-1 do 10 mL roztworem AR-2.
  6. Dodaj 200 μL tego roztworu do wlotu kanału wierzchołkowego każdego układu, zasysając z gniazda (Rysunek 1A). Powtórz dla kanału bazalnego. Trzymaj pipetę prostopadle do odprysku podczas dodawania roztworu, aby utrzymać szczelność i niezakłócony przepływ.
  7. Powtórz krok 3.6 dla wszystkich układów.
  8. Sprawdź wszystkie chipy pod kątem bąbelków. Usuń wszelkie bąbelki, dodając więcej roztworu do zakażonych kanałów.
  9. Aspiruj cały nadmiar roztworu AR-1 z powierzchni układu, unikając wlotów i wylotów kanałów.
  10. Włóż chipsy do 150 mm szalki Petriego i włóż tę odkrytą miskę do pudełka z UV światłami.
  11. Skieruj pudełko UV na tył obudowy i zostawij chipy pod stałym światłem UV przez 30 minut. Kolor roztworu w wiórach zmieni się z ciemnoróżowego na mahoniowy.
  12. Przepłukaj każdy kanał, dodając 200 μL roztworu AR-2 do wlotu, jednocześnie zasysając z wylotu.
  13. Przepłucz każdy kanał dwukrotnie, dodając 200 μL zimnego DPBS (-/-) do wlotu, jednocześnie zasysając z wylotu.
  14. Przygotuj powłokę kanału wierzchołkowego (200 μg/mL kolagenu I i 30 μg/mL mieszaniny kolagenu IV w DMEM) (patrz Tabela materiałów). Trzymaj się na lodzie.
  15. Przygotuj powłokę kanałową bazalną (15 μg/mL PLL i mieszanka kolagenu I 200 μg/mL w DMEM). Trzymaj się na lodzie.
  16. Dodaj 200 μL powłoki kanałowej bazalnej do wlotu kanału podstawowego. Zatkaj gniazdko końcówką P200, gdy roztwór powłoki pojawi się w gniazdku. Roztwór dolewaj do równych objętości wlotu i wylotu, a następnie odłącz końcówkę pipety, pozostawiając ją w wlocie.
  17. Podobnie, dodaj 200 μL powłoki kanału wierzchołkowego do kanału wierzchołkowego.
  18. Nadmiar roztworu zasysać z powierzchni układu.
  19. Sprawdź wszystkie chipy pod kątem bąbelków. Usuń wszelkie pęcherzyki, dodając więcej powłoki kanałowej na uszkodzony kanał(y).
  20. Inkubuj chipsy przez noc w szalce Petriego o średnicy 150 mm w temperaturze 37 °C z 5%CO2.

4. Siewowanie bazalnego kanału chipowego za pomocą HUF

  1. Codziennie obserwuj wzrost HUF w kolbie pod mikroskopem.
  2. Gdy hodowle HUF są zbiegające się w 70%-90% (~3 dni po pokryciu), podgrzej 25 mL FM, 5 mL Ca2+/Mg2+ wolnego DPBS (DPBS (-/-), 10 ml trypsyny/EDTA oraz 15 mL roztworu neutralizującego trypsynę (TNS, patrz Tabela materiałów) do 37 °C.
  3. Aspiruj medium z kolbek. Przemyj 5 ml DPBS (-/-), a następnie ponownie wciągnij.
  4. Dodaj 4 mL trypsyny-EDTA do każdej kolby i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, aż komórki się odłączą.
  5. Dodaj 6 mL TNS do każdej kolby i przenieś zawiesinę ogniwa do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
  6. Dobrze wymieszaj zawiesinę z pipetą i użyj 10 μL aliquotu do liczenia komórek. Wymieszaj 10 μL zawiesiny komórkowej z 10 μL trypan blue i licz za pomocą hemocytometru.
  7. Zawiesina komórek wirówkowych w stężeniu 300 x g przez 5 minut w RT. Aspiracja supernatantu i ponowna zawiesina pelletu w ciepłej warstwie FM do końcowego stężenia 7,5 x 105 komórek /mL.
  8. Przemyj kanał podstawowy 200 μL FM.
  9. Podgrzej 15 mL VEM do 37 °C. Przemyj kanał wierzchołkowy 200 μL VEM.
  10. Dodaj 200 μL kompletnego VEM do wlotu kanału apikalnego, zatykając gniazdko końcówką pipety. Dawkuj medium, aż objętość końcówki wlotowej i wylotowej będzie równa, następnie zdejmij końcówkę pipety z pipety, zostawiając końcówkę w wlocie. Trzymaj górny kanał napełniony i podłączony zarówno na wejściu, jak i na gniazdku.
  11. Powoli pipetować 50 μL zawiesiny ogniwa HUF do wlotu kanału podstawowego, jednocześnie zasysając z wylotu. Usuń końcówkę pipety z wlotu, gdy ~2 μL zawiesiny komórki pozostaje w końcówce pipety, bez naciskania lub puszczania tłoka, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Podłącz wlot i gniazdko końcówkami pipety.
  12. Sprawdź pod mikroskopem pod kątem bąbelków. Jeśli są obecne, myj kanał bazalny FM i powtarzaj krok 4.11.
  13. Odwróć zatkane chipy do góry nogami na stojaku 15 mL i inkubuj w 37 °C z 5%CO2 przez godzinę. Obserwuj chipy po inkubacji i sprawdź przyczepność komórek.
  14. Zatkaj gniazdko kanału podstawowego końcówką pipety. Dodaj 200 μL FM do wlotu kanału bazalnego bez naciskania na tłok pipety. Zwolnij końcówkę z pipety i pozwól medium swobodnie przepływać przez kanał do końcówki pipety wylotowej pod wpływem prądu grawitacyjnego.
  15. Inkubuj chipsy z nasionami HUF przez noc w 37 °C z 5%CO2.

5. Siewowanie chipowego kanału wierzchołkowego komórkami nabłonka pochwy

  1. Podgrzej 50 mL VEM do 37 °C.
  2. Przygotuj powłokę kanału wierzchołkowego (200 μg/mL kolagenu I w DMEM). Trzymaj się na lodzie.
  3. Załącz gniazdko kanałowe apikalne końcówką pipety.
  4. Dodaj 200 μL powłoki kanału wierzchołkowego do wlotu kanału wierzchołkowego. Roztwór powłoki wierzchołkowej dolewaj do równych objętości końcówki wlotowej i wylotowej, następnie zdejmij końcówkę pipety, pozostawiając ją w wlocie.
  5. Nadmiar roztworu zasysaj z powierzchni układu.
  6. Chipsy inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 1 godzinę.
  7. Po 1 godzinie myj powłokę kanału wierzchołkowego, dodając 200 μL VEM do wlotu kanału wierzchołkowego podczas zasysania z wylotu.
  8. Sprawdź wzrost HVEC pod mikroskopem pod kątem ~70%-90% zbieżności.
  9. Jeśli komórki są zbiegane w 70%-90%, podgrzej 6 mL kompletnego pożywkowego nabłonka i 4 mL trypsyny/EDTA w kołnierzu, do 37 °C.
  10. Aspiruj medium z kolby HVEC i myj 5 mL DPBS (-/-), a następnie zasysaj wodą.
  11. Dodaj 4 mL trypsyny do każdej kolby i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 3-5 minut, aż komórki się odłączą.
  12. Dodaj 6 mL VEM do kolby, aby dezaktywować trypsynę i przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 mL.
  13. Dobrze wymieszaj zawiesinę z pipetą i użyj 10 μL aliquotu do liczenia komórek. Wymieszaj 10 μL zawiesiny komórkowej z 10 μL trypan blue i licz za pomocą hemocytometru.
  14. Zawiesina komórek w wirówce w dawce 300 x g przez 5 minut w RT. Aspiracja supernatantu i ponowna zawiesina pelletu w VEM do końcowego stężenia 3,5-4 milionów komórek/mL.
  15. Ciepła temperatura od 25 mL do 37 °C.
  16. Załącz gniazdko kanałowe apikalne końcówką pipety. Powoli pipetować co najmniej 40 μL zawiesiny ogniwa HVEC do wlotu kanału wierzchołkowego. Rozpuszczaj zawiesinę ogniwa, aż objętość końcówki wlotowej i wylotowej będzie równa, następnie zdejmij końcówkę pipety z pipety, pozostawiając końcówkę w wlocie. Trzymaj kanał bazalny wypełniony FM i podłączony zarówno do wejścia, jak i gniazdka.
  17. Ostrożnie zasysaj nadmiar medium na powierzchni odprysków i sprawdź pod mikroskopem, czy nie ma pęcherzyków. Jeśli są obecne, powtórz krok 5.16.
  18. Włóż chipsy do dużej misy Petriego i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez noc.
  19. Następnego dnia obserwuj chipy pod mikroskopem pod kątem przyczepienia komórek.
  20. Usuń końcówki pipety z wlotów i wylotów zarówno kanałów wierzchołowych, jak i podstawowych.
  21. Zatkaj gniazdko kanału podstawowego końcówką pipety i dodaj 200 μL FM do wlotu kanału bazalnego, nie naciskając na tłok pipety. Zwolnij końcówkę pipety z pipety i pozwól medium swobodnie przepływać przez kanał do końcówki pipety wylotowej pod wpływem przepływu grawitacji.
  22. Powtórz krok 5.21 dla kanału apikalnego z użyciem VEM.
  23. Inkubuj chipsy z podwójnym nasionem w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 24 godziny.

6. Łączenie chipów z kapsułami i różnicowanie komórek nabłonka pochwy

  1. Wystarczy 50 mL FM i VEM do oddzielenia 50 mL stożkowych lamp i podgrzewania do 37 °C.
  2. Odgazowanie medium FM i VEM nagrzało się do 37 °C w sterylnej próżni przez 5 minut.
  3. Dezynfekować i czyścić tace dla modułu dynamicznego przepływu (DFM, patrz Tabela materiałów). Wyjmij kapsułki z opakowania i umieść je w tackach.
  4. Dodaj 2 mL odgazowanego VEM do zbiornika wlotowego (górny prawy zbiornik; Rysunek 1B). Dodaj podłoże wzdłuż ścian zbiornika, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.
  5. Dodaj 3 mL odgazowanego FM do zbiornika wlotowego u podstawy (lewy górny zbiornik, rysunek 1B). Dodaj podłoże wzdłuż ścian zbiornika, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.
  6. Dodaj 500 μL odgazowanego VEM do wierzchołkowego zbiornika wylotowego (dolny prawy zbiornik, rysunek 1B). Przechyl kapsułę tak, aby medium pokrywało całą dną powierzchnię zbiornika.
  7. Dodaj 500 μL odgazowanego FM do bazalnego zbiornika wylotowego (lewy dolny zbiornik, rysunek 1B). Przechyl kapsułę tak, aby medium pokrywało całą dną powierzchnię zbiornika.
  8. Wkładaj tacki z kapsułami do DFM i uruchamiaj cykl Prime dwukrotnie. Sprawdź, czy nie ma kropelek wychodzących z portów na spodzie każdego kapsuła.
  9. Jeśli kropla nie powstanie po 4 cyklach "Prime", należy bezpośrednio dotrzeć do portu wewnątrz zbiornika wylotowego kapsuły (Rysunek 1B) i pipetować 200 μL odpowiedniego medium, aby umożliwić przepływ medium między zbiornikiem a kanałem. Nazywa się to "zaparowaniem ręką".
  10. Zdejmij końcówki pipety z odprysków i umieść kroplę odpowiedniego medium na wszystkich otworach dla każdego odprysku.
  11. Włóż chipsy do kapsułek i umieść je na tackach.
  12. Aspiruj dowolne nośniki na powierzchni chipów i włóż każdą tackę do DFM.
  13. Ustaw następujące parametry na DFM: Góra i Dół - Ciekłość; Przepływ apikalny (górny kanał) – 15 μL/h; Przepływ bazalny (kanał dolny) - 30 μL/h; Stretch = 0%; Częstotliwość = 0 Hz.
  14. Uruchom cykl Regulate na DFM i pozwól na przepływ przez noc.
  15. Po 24 godzinach zmień ustawienia przepływu na 0 μL/h dla kanału wierzchołkowego i utrzymuj przepływ w kanale podstawowym na poziomie 30 μL/h przez kolejne 24 godziny.
  16. Przygotuj 500 mL pożywki różnicacyjnej (DM), dodając 4 mM L-glutaminy, 20 mM hydrokortyzonu, 1x ITES, 20 nM Trijodotyroniny, 100 μM O-fosforylowej etanolaminy, 180 μM Adeniny, 3,2 mM chlorku wapnia, 2% Heat inaktywowanego FBS, 1% Pen-Strep oraz 120 mL podłoża F-12 firmy Ham do niskoglukozowego DMEM (patrz Tabela materiałów) i sterylizuj filtrem.
  17. Podgrzej 50 ml DM do 37 °C.
  18. Dodaj 20 μL 10 μM estradiolu (patrz Tabela materiałów) do 50 mL DM, wymieszaj i odgazuj pod sterylnym próżnią przez 5 minut.
  19. Podgrzej 50 ml VEM do 37 °C w kąpieli wodnej i odgazuj pod sterylną próżnią przez 5 minut.
  20. Wyjmij tacy z DFM, umieść je w BSC i zasysaj medium z kapsułów, omijając porty w zbiornikach (Rysunek 1A). Następnie dodaj 2 mL VEM do zbiornika wlotowego kanału apikalnego oraz 3 mL DM do zbiornika wlotowego kanału podstawowego.
  21. Zwróć tacy do DFM i ustaw przepływ kanału wierzchołowego na 15 μL/h, a przepływ kanału podstawowego na 30 μL/h.
  22. Pozwól DFM płynąć przez 4-7 godzin. Następnie zatrzymaj przepływ kanału wierzchołkowego, ustawiając go na 0 μL/h. Niech kanał podstawowy płynie dalej z prędkością 30 μL/h.
  23. Zmiana mediów wykonuje kroki 6.16-6.19 co 48 godzin.
  24. Przepływ medium przerywane w kanale wierzchołkowym przez 4-7 godzin dziennie przez kolejne 5 dni zgodnie z krokami 6.20-6.21.
  25. Przygotuj zrównoważony roztwór soli Hanksa o niskiej mocy buforowej z nośnikiem glukozy (HBSS (LB/+G)) poprzez dodanie 1,26 mM chlorku wapnia, 0,49 mM chlorku magnezu, 0,406 mM siarczanu magnezu, 5,33 mM chlorku potasu, 137,93 mM chlorku sodu, 0,441 mM fosforanu potasu monozasadowego oraz 5,55 mM D- glukozy do ddH2O(patrz Tabela materiałów); pH 4,8.
  26. Przygotuj 500 mL DM bez anginy Pen, dodając 4 mM L-glutaminy, 20 mM hydrokortyzonu, 1x ITES, 20 nM Trijodothyroniny, 100 μM O-fosforylowej etanolaminy, 180 μM Adeniny, 3,2 mM chlorku wapnia, 2% Heat inaktywowanego FBS oraz 120 mL podłoża F-12 Ham do DMEM o niskiej zawartości glukozy, a następnie sterylizuj filtrem.
  27. W dniu 6 zastąp medium kanału apikalnego na (HBSS (LB/+G)) oraz medium kanału bazalnego na DM wolnym od penetracji penetracyjnej, wykonując kroki 6.16-6.19.
  28. Ustaw przepływ na DFM na 15 μL/h dla kanału wierzchołkowego i 30 μL/h dla kanału podstawowego na 24 godziny, zanim przystąpisz do inokulacji bakteryjnej.

7. Szczepienie bakteryjne w zróżnicowanych chipach

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w laboratorium i BSC, które spełniają przepisy dotyczące pracy z mikroorganizmami.

  1. Oblicz CFU/mL każdego szczepu bakteryjnego, który ma być uwzględniony w inokulum. Wymieszaj wymaganą ilość każdego szczepu bakterii, aby uzyskać łącznie ~5 x 106 CFU/mL.
  2. Wiruj mieszankę w 7 000 x g przez 7 minut w 4 °C i ostrożnie usuń supernatant. Ponownie zawiesić granulat (HBSS (LB/+G)). To będzie szczepienie bakteryjne.
  3. Odłącz chipy od kapsuł. Zatkaj gniazdko kanału podstawowego końcówką pipety i dodaj 200 μL bezpenetracyjnego DM do wlotu kanału podstawowego, nie naciskając na tłok pipety. Zwolnij końcówkę pipety z pipety i pozwól medium swobodnie przepływać przez kanał do wyjścia pod wpływem grawitacji.
  4. Dodaj 37 μL inokulum bakteryjnego do wlotu kanału wierzchołkowego, jednocześnie zasysając z wylotu. Gdy w końcówce pipety pozostało około 2 μL, wyciągnij końcówkę i zatkaj wlot i gniazdo kanału apikalnego końcówkami pipety.
  5. Dla układów sterujących (niezaszczepionych) powtórz krok 7.4 z 37 μL (HBSS (LB/+G)).
  6. Aspiruj dowolne nośniki na powierzchni układu. Umieść chipsy w szalce Petriego o średnicy 150 mm i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 24 godziny.
  7. Umieść kapsułki (bez chipsów) na tacach i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2 na 24 godziny.
  8. Ciepłe 50 mL (HBSS (LB/+G)) i 50 mL DM wolnego od pen-Streptokoka do 37 °C.
  9. Dodaj 20 μL 10 μM estradiolu do 50 mL DM wolnego od anginy penetracyjnej, dobrze wymieszaj i odgazuj pod sterylną próżnią przez 5 minut. Odgazuj (HBSS (LB/+G)) pod próżnią przez 5 minut.
  10. Ostrożnie zasysaj medium w kapsułach, unikając wlotów i wylotów zbiornika.
  11. Dodaj 3 mL odgazowanego (HBSS (LB/+G)) do zbiornika wlotowego na wierzchołku oraz 500 μL odgazowanego (HBSS (LB/+G)) do zbiornika na wylotie wierzchołkowym.
  12. Dodaj 3 mL odgazowanego DM wolnego od anginy penetracyjnej do zbiornika podstawowego wkładu oraz 500 μL odgazowanego DM wolnego od antybiotyków do zbiornika bazalnego wylotu.
  13. Przesuwaj tacki z kapsułami (bez chipów) do DFM i uruchamiaj cykl Prime dwa razy. Sprawdź, czy z każdego portu na spodzie kapsuły nie wypływają krople.
    UWAGA: Jeśli kropla nie powstanie po 4 cyklach "Prime", należy nawiązać bezpośredni kontakt z portem wewnątrz zbiornika wylotowego kapsuły (Rysunek 1B) i pipetować 200 μL odpowiedniego medium, aby umożliwić przepływ medium między zbiornikiem a kanałem.
  14. Usuń końcówki pipety z chipów i umieść kroplę odpowiedniego materiału nad wszystkimi wlotami i gniazdami kanału.
  15. Włóż chipsy do kapsułek i umieść kapsułki w tackach.
  16. Aspiruj media w zbiornikach kapsuł wierzchołkowych i bazalnych oraz w każdym medium na powierzchni układów. Następnie wsuń tace do DFM.
  17. Ustaw następujące parametry na DFM: Góra i Dół - Ciecz; Przepływ wierzchołkowy (górny) - 40 μL/h; Przepływ podstawowy (dolny) - 40 μL/h; Rozciąganie - 0%; Częstotliwość - 0 Hz. Uruchom cykl Regulować .
  18. Zatrzymaj przepływ po 4 godzinach i zbierz ścieki, czyli ośrodka z wierzchołkowego i bazalnego zbiornika wylotowego.
  19. Mierz i rejestruj objętości ścieków.
  20. Umieść chipy z powrotem w DFM i ustaw przepływ wierzchołkowy na 0 μL/h, a przepływ bazalny na 30 μL/h. Uruchom przepływ do pracy w nocy.
  21. Zgromadzić ścieki do różnych planowanych testów i przechowywać je w odpowiednich temperaturach.
    UWAGA: Do pomiaru CFU dodaj glicerol do końcowego stężenia 16% i natychmiast przechowuj w temperaturze -80 °C.
  22. Aspiruj medium tylko w zbiornikach wyjściowych bazalnych i ustaw przepływy szczytowe i bazalne na 40 μL/h w DFM. Rozpocznij flow na 4 godziny i powtórz kroki 7.18-7.21. To będzie zbiór ścieków przez 48 godzin.
  23. Powtarzaj krok 7.22 przez 72 godziny lub do zakończenia eksperymentu.
  24. Na końcu eksperymentu zbieraj ścieki zgodnie z krokami 7.18-7.19.
  25. Przygotuj roztwór trawienny, dodając 1 mg/mL kolagenazy IV w TrypLE express. Podgrzej 10 ml roztworu trawiennego do 37 °C.
  26. Podłącz gniazdko kanału bazalnego końcówką pipety. Dodaj 100 μL roztworu trawiennego do kanału podstawowego. Dobrze wymieszaj i za pomocą pipety zbierz cały roztwór z kanału w probówce oznaczonej jako 'Rurka B'.
  27. Podłącz gniazdko kanału apikalnego końcówką do pipety. Dodaj 100 μL roztworu trawiennego do kanału wierzchołkowego. Dobrze wymieszaj i za pomocą pipety zbieraj cały roztwór z kanału do rurki oznaczonej jako 'Rurka A'.
  28. Dodaj kolejne 100 μL roztworu trawiennego zarówno do wlotów kanału wierzchołowego, jak i bazalnego, jednocześnie zatykając gniazdka końcówkami pipety. Inkubuj chipy i rurki A i B w temperaturze 37 °C przez 1-1,5 godziny.
  29. Mieszaj zawartość trawienia dobrze wewnątrz kanałów, używając już zatkanych końcówek umieszczonych w wlotach i gniazdkach. Zbierz zawartość kanału wierzchołkowego i podstawowego do rurek A i B, odpowiednio. Są to chip apikalne i bazalne trawienia.
  30. Policz komórki w rurce A za pomocą hemocytometru. Usuń też aliquot z chip digest do pomiaru CFU zgodnie z krokiem 7.21.

8. Analiza ścieków i digestów chipów

  1. Aby wyliczyć bakterie z odpadów i trawien, rozcieńczaj je seryjnie w sterylnym DPBS (-/-) i na odpowiedniej płycie podłoża, inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24-48 godzin i licz kolonie na płytce.
  2. Do pomiaru pH należy pobrać 10 μL ze ścieków o stężeniu 72 godzin bezpośrednio po zebraniu i użyć paska pH do pomiaru pH ścieków.
  3. Do analizy cytokin wykorzystaj te ścieki do wykrywania konkretnych cytokin za pomocą testu opartego na Luminex, ELISA lub innej odpowiedniej techniki29,30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ludzka pochwa jest wyłożona warstwowym nabłonkiem, który leży nad włóknistą kolagenową zroąbą. Aby to zmodelować, utworzono interfejs tkankowy poprzez hodowanie pierwotnego nabłonka pochwy i fibroblastów ludzkiego pochwy po przeciwnych stronach wspólnej porowatej błony w dwukanałowym mikrofluidycznym urządzeniu Organ Chip. Tworzenie nabłonka pochwy monitorowane jest za pomocą mikroskopowego obrazowania jasnego pola, które ujawnia powstawanie ciągłej warstwy komórek, która stopniowo tworzy wiele warstw komórkowych (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wcześniejsze modele in vitro ludzkiej pochwy nie oddają wiernie struktur tkanek pochwy, przepływu płynów ani interakcji gospodarz-patogen19,22. Modele zwierzęce są również ograniczone przez zmienność mikrobiomu międzygatunkową oraz różnice w cyklu rujowym lub menstruacyjnym 19,22. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół mający na celu stworzenie modelu Organ Chip ludzkiej pochwy, który może skutecz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Donald Ingber jest założycielem, członkiem zarządu, przewodniczącym rady doradczej naukowej oraz posiadaczem udziałów w Emulate. Pozostali autorzy deklarują, że nie mają ze sobą konkurujących interesów.

Podziękowania

Badania te zostały sfinansowane przez Fundację Billa i Melindy Gatesów (INV-035977) oraz Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering na Uniwersytecie Harvarda. Dziękujemy również Gwenn E. Merry z Wyss Institute za redakcję tego rękopisu. Diagram na Rysunku 1 został stworzony za pomocą BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 & mikro; m SteriflipMillipore SCGP00525Do degazowania mediów
Układ 2-kanałowyEmulowaćBRK-S1-WER-24Część dwukanałowego zestawu Chip
200 μ Końcówki bariery L (lub końcówki filtrów)Thomas Scientific, SHARP1159M40Końcówki używane do siewu chip
Czynnik aktywacyjny 1 (lub proszek ER-1)  EmulowaćZestaw Podstawowy Chip S1 - 24PKCzęść dwukanałowego zestawu Chip; Temperatura magazynowania -20 stopni i stopni; C   
Czynnik aktywacyjny 2 (lub roztwór ER-2)  EmulowaćZestaw Podstawowy Chip S1 - 24PKCzęść dwukanałowego zestawu Chip; Temperatura przechowywania 4 i stopnie; C
AdenineSigma Aldrich  A2786Komponent mediów różnicujących
Płytki agaru krwi BrucellaVWR International Inc. 89405-032z Heminem i witaminą K; Do wyliczenia Gardnerella wagalis
Wolne DPBS Ca2+ i Mg2+ (DPBS (-/-)ScienCell303Do płukania komórek
Chlorek wapniaSigma Aldrich  C5670Komponent mediów różnicujących
Chlorek wapnia (anhyd.) Sigma Aldrich  499609Komponent HBSS (LB/+G)
Kolagen I Corning354236Dla roztworu powłokowego dla HVEC
Kolagen IV i bezpłodny;Sigma Aldrich  C7521Dla roztworu powłokowego dla HVEC
Kolagenaza IVGibco17104019Do dysocjacji komórek od chipów pochwy
Kompletne fibroblasty medium ScienCell2301Media dla kultury HUF
Kompletne nabłonkowe medium pochwyLifelineLL-0068Media dla kultury HVEC
D-glukoza (dekstroza)  Sigma Aldrich  158968Komponent HBSS (LB/+G)
DMEM (niska glukoza)  Thermofisher12320-032Komponent mediów różnicujących
Moduł Dynamicznego Przepływu (lub Zoë)EmulowaćZoë-CM1Reguluje przepływ chipów
F12 HamaThermofisher11765-054Komponent mediów różnicujących
Heat dezaktywował FBS Thermofisher  10438018Komponent mediów różnicujących
Ludzkie fibroblasty macicyScienCell7040HUF
Ludzkie komórki nabłonkowe pochwyLifelineFC-0083HVEC
HydrokortyzonSigma Aldrich  H0396Komponent mediów różnicujących
ITESLonza17-839ZKomponent mediów różnicujących
L-glutaminaThermofisher25030081Komponent mediów różnicujących
Heksahydrat chlorku magnezuSigma Aldrich  M2393Komponent HBSS (LB/+G)
Heptahydrat siarczanu magnezuSigma Aldrich  M1880Komponent HBSS (LB/+G)
Płyty agarowe MRSVWR International Inc. 89407-214Do wyliczania Lactobacillus
O-fosforylethanolaminaSigma Aldrich  P0503Komponent mediów różnicujących
Pen/StreptokokThermofisher  15070063Komponent mediów różnicujących
Paski pHFischer-Scientific13-640-520Do pomiaru pH 
Pody (1/chip)  EmulowaćBRK-S1-WER-24Część dwukanałowego zestawu Chip
Poli-L-lizynaScienCell403Dla roztworu powłokowego dla HUF
Chlorek potasu  Sigma Aldrich  P3911Komponent HBSS (LB/+G)
Fosforan potasu monozasadowySigma Aldrich  P0662Komponent HBSS (LB/+G)
Sterylny 80% glicerol & nbsp;MP Biomedyczno 113055034Do zamrażania próbek bakteryjnych
TrijodotyroninaSigma Aldrich    T6397Komponent mediów różnicujących
Trypan Blue Solution (0,4%)  Sigma Aldrich  T8154Do liczenia żywych i martwych komórek
TrypLE ExpressThermofisher  12605010Do dysocjacji komórek od chipów pochwy
Roztwór neutralizujący trypsynę (TNS) i nie do końca;ScienCell113Do neutralizacji trypsyny
Rozpuszczalność trypsyna/EDTA (0,25%)ScienCell103W przypadku dysocjacji komórki 
β-estradiol Sigma Aldrich  E2257Hormon do różnicowania ośrodka

Bibliografia

  1. Smith, S. B., Ravel, J. The vaginal microbiota, host defence and reproductive physiology. J Physiol. 595 (2), 451-463 (2017).
  2. Van De Wijgert, J., Jespers, V. The global health impact of vaginal dysbiosis. Res Microbiol. 168 (9-10), 859-864 (2017).
  3. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: Cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  4. Goldenberg, R. L., Hauth, J. C., Andrews, W. W. Intrauterine infection and preterm delivery. N Engl J Med. 342 (20), 1500-1507 (2000).
  5. Han, Y., Liu, Z., Chen, T. Role of vaginal microbiota dysbiosis in gynecological diseases and the potential interventions. Front Microbiol. 12, 643422(2021).
  6. Leitich, H., Kiss, H. Asymptomatic bacterial vaginosis and intermediate flora as risk factors for adverse pregnancy outcome. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 21 (3), 375-390 (2007).
  7. Torcia, M. G. Interplay among vaginal microbiome, immune response and sexually transmitted viral infections. Int J Mol Sci. 20 (2), 266(2019).
  8. Van Oostrum, N., De Sutter, P., Meys, J., Verstraelen, H. Risks associated with bacterial vaginosis in infertility patients: A systematic review and meta-analysis. Hum Reprod. 28 (7), 1809-1815 (2013).
  9. Lewis, F. M. T., Bernstein, K. T., Aral, S. O. Vaginal microbiome and its relationship to behavior, sexual health, and sexually transmitted diseases. Obstet Gynecol. 129 (4), 643-654 (2017).
  10. Hong, X., et al. The association between vaginal microbiota and female infertility: A systematic review and meta-analysis. Arch Gynecol Obstet. 302 (3), 569-578 (2020).
  11. Peelen, M. J., et al. The influence of the vaginal microbiota on preterm birth: A systematic review and recommendations for a minimum dataset for future research. Placenta. 79, 30-39 (2019).
  12. Smith, P. P., et al. Outcomes in prevention and management of miscarriage trials: A systematic review. BJOG. 126 (2), 176-189 (2019).
  13. Harp, D. F., Chowdhury, I. Trichomoniasis: Evaluation to execution. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 157 (1), 3-9 (2011).
  14. Pastorek, J. G., Cotch, M. F., Martin, D. H., Eschenbach, D. A. Clinical and microbiological correlates of vaginal trichomoniasis during pregnancy. The vaginal infections and prematurity study group. Clin Infect Dis. 23 (5), 1075-1080 (1996).
  15. Petrin, D., Delgaty, K., Bhatt, R., Garber, G. Clinical and microbiological aspects of trichomonas vaginalis. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 300-317 (1998).
  16. Edwards, T., Burke, P., Smalley, H., Hobbs, G. Trichomonas vaginalis: Clinical relevance, pathogenicity and diagnosis. Crit Rev Microbiol. 42 (3), 406-417 (2016).
  17. Eade, C. R., et al. Identification and characterization of bacterial vaginosis-associated pathogens using a comprehensive cervical-vaginal epithelial coculture assay. PLoS One. 7 (11), e50106(2012).
  18. Fichorova, R. N., Yamamoto, H. S., Delaney, M. L., Onderdonk, A. B., Doncel, G. F. Novel vaginal microflora colonization model providing new insight into microbicide mechanism of action. mBio. 2 (6), e00168(2011).
  19. Herbst-Kralovetz, M. M., Pyles, R. B., Ratner, A. J., Sycuro, L. K., Mitchell, C. New systems for studying intercellular interactions in bacterial vaginosis. J Infect Dis. 214, S6-S13 (2016).
  20. Johnson, A. P., et al. A study of the susceptibility of three species of primate to vaginal colonization with gardnerella vaginalis. Br J Exp Pathol. 65 (3), 389-396 (1984).
  21. Yildirim, S., et al. Primate vaginal microbiomes exhibit species specificity without universal lactobacillus dominance. ISME J. 8 (12), 2431-2444 (2014).
  22. Edwards, V. L., et al. Three-dimensional models of the cervicovaginal epithelia to study host-microbiome interactions and sexually transmitted infections. Pathog Dis. 80 (1), 026(2022).
  23. Zhu, Y., et al. Ex vivo 2D and 3D HSV-2 infection model using human normal vaginal epithelial cells. Oncotarget. 8 (9), 15267-15282 (2017).
  24. Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infect Immun. 86 (11), e00282(2018).
  25. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).
  26. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nat Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).
  27. Valiei, A., Aminian-Dehkordi, J., Mofrad, M. R. K. Gut-on-a-chip models for dissecting the gut microbiology and physiology. APL Bioeng. 7 (1), 011502(2023).
  28. Izadifar, Z., et al. Mucus production, host-microbiome interactions, hormone sensitivity, and innate immune responses modeled in human endo- and ecto-cervix chips. bioRxiv. , (2023).
  29. Mahajan, G., et al. Vaginal microbiome-host interactions modeled in a human vagina-on-a-chip. Microbiome. 10 (1), 201(2022).
  30. Masson, L., et al. Inflammatory cytokine biomarkers to identify women with asymptomatic sexually transmitted infections and bacterial vaginosis who are at high risk of HIV infection. Sex Transm Infect. 92 (3), 186-193 (2016).
  31. Amsel, R., et al. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med. 74 (1), 14-22 (1983).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Chip pochwyorgan-on-a-chipmikrobiom pochwynabłonek pochwyhodowla mikrofluidycznadynamiczny przepływ cieczydysbioza pochwyludzkie fibroblasty macicznekokultura bakteryjnażeński układ rozrodczy
Modelowanie zdrowych i dysbiotycznych mikrośrodowisk pochwy w ludzkiej pochwie na chipie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.