Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Podsumowanie

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Streszczenie

Infekcje, choroby autoimmunologiczne, pożądane i niekorzystne reakcje immunologiczne na leczenie mogą prowadzić do złożonej i dynamicznej odpowiedzi cytokin in vivo. Odpowiedź ta obejmuje liczne komórki odpornościowe wydzielające różne cytokiny w celu koordynowania reakcji immunologicznej. Jednak dynamika wydzielania, ilości i współwystępowanie różnych cytokin przez różne podtypy komórek pozostają słabo poznane z powodu braku odpowiednich narzędzi do ich badania. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący mikroprzepływową platformę kropelkową, która umożliwia ilościowy pomiar dynamiki wydzielania kilku cytokin równolegle na poziomie pojedynczej komórki z rozdzielczością czasową. Jest to możliwe dzięki enkapsulacji pojedynczych komórek w kropelkach mikroprzepływowych wraz z multipleksowanym testem immunologicznym do równoległej kwantyfikacji stężeń cytokin, ich unieruchomienia w celu dynamicznego obrazowania fluorescencyjnego oraz analizie odpowiednich obrazów w celu określenia wydzielanych ilości i dynamiki. Protokół opisuje przygotowanie funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, eksperymenty kalibracyjne, przygotowanie komórek oraz enkapsulację komórek i nanocząstek w kropelki do obrazowania fluorescencyjnego oraz późniejszą analizę obrazu i danych na przykładzie stymulowanych lipopolisacharydem ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Zaprezentowana platforma zidentyfikowała odrębne zachowanie wydzielania cytokin dla komórek pojedynczych i jednocześnie wydzielających, charakteryzując oczekiwaną heterogeniczność fenotypową w mierzonej próbce komórki. Co więcej, modułowy charakter testu pozwala na jego adaptację i zastosowanie do badania różnych białek, cytokin i próbek komórek, co potencjalnie prowadzi do głębszego zrozumienia wzajemnych zależności między różnymi typami komórek odpornościowych oraz roli różnych cytokin wydzielanych dynamicznie w celu kształtowania ściśle regulowanej odpowiedzi immunologicznej. Te nowe spostrzeżenia mogą być szczególnie interesujące w badaniach nad dysregulacją immunologiczną lub w identyfikacji populacji docelowych w terapii i opracowywaniu leków.

Wprowadzenie

Infekcje często wywołują złożone reakcje gospodarza obejmujące wrodzony i adaptacyjny układ odpornościowy^1,2. Po zakażeniu lub rozpoznaniu czynników zakaźnych, komórki gospodarza mogą wytwarzać różnorodny zakres chemo- i cytokin, które są małymi białkami znanymi jako krytyczne komunikatory i modulujące układ odpornościowy³. Cytokiny prozapalne są uwalniane wcześnie po zakażeniu, aby zainicjować odpowiedź immunologiczną, a następnie cytokiny przeciwzapalne, które mają kluczowe znaczenie dla zapobiegania uszkodzeniom tkanek i późniejszym chorobom przewlekłym lub autozapalnym. Ta równowaga między eliminacją zagrożenia a ochroną tkanek przejawia się jako szeroki repertuar cytokin pełniących różne funkcje podczas infekcji, co pozwala na precyzyjne dostrojenie odpowiedzi^4,5. W tej mieszaninie można zaobserwować unikalne sygnatury w zależności od patogenu i sygnałów, które wywołuje, lokalizacji tkanki i komórek odpornościowych, z których pochodzą. Jednak uwalnianie cytokin wydaje się również stanowić wielofunkcyjny proces biologiczny unikalny dla każdej populacji komórek, zróżnicowany pod względem dynamiki wydzielania i indywidualnej odpowiedzi. Ta heterogeniczność jest opisywana w literaturze od wielu lat, na przykład wśród subpopulacji komórek T^6,7, gdzie badania nad chorobami autozapalnymi i ciężkimi infekcjami COVID-19 wykazały dużą różnorodność funkcjonalną markerów stanu zapalnego w obrębie pacjentów i pomiędzy nimi^8,9. Ostatnio pojawienie się sekwencjonowania pojedynczych komórek uwypukliło wysoką plastyczność i wzajemne oddziaływanie między subpopulacjami w mikrośrodowiskach immunologicznych, które wcześniej nie były widoczne, co wskazuje, że metody jednokomórkowe są niezbędne do uchwycenia tej niejednorodności^10,11. Podczas gdy opracowywane są nowe metody analizy transkryptomu, analiza fenotypowa pozostaje wyzwaniem, ponieważ wymaga jednoczesnych, ilościowych i rozdzielczych w czasie pomiarów wydzielania białek na poziomie pojedynczej komórki. Takie pomiary pozwalają nam badać tożsamość komórek wydzielających, dynamikę i wzorce wydzielania (wolne/szybkie, wczesne/późne, jednoczesne/sekwencyjne) dla repertuaru lub panelu cytokin. Umożliwiając ilościowe i czasowe badanie dynamiki uwalniania cytokin podczas odpowiedzi immunologicznej, uzyskane informacje mogą pozwolić na zrozumienie zespołu komórkowego i indukowanej odpowiedzi.

W standardowych protokołach, cytokiny są zwykle wykrywane w supernatancie zawiesin komórkowych i surowicy za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), co daje ilości wydzielane masowo. Pomiary masowe nie pozwalają na ilościowe określenie ilości cytokin wytwarzanych przez każdą komórkę, co jest szczególnie uwydatnionym problemem w heterogenicznych próbkach komórek. Alternatywne metody, takie jak barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, test immunoenzymatyczny (ELISpot) lub testy mikrograwerowane (np. Isoplexis) wykrywają cytokiny wyrażane przez pojedyncze komórki, ale zapewniają tylko pomiary punktu końcowego^12,13. Oznacza to, że dynamika wydzielania i zmiany, które mogą wystąpić we wzorcu wydzielania komórkowego w czasie inkubacji, są ignorowane. Ponadto pomiary punktów końcowych nie są w stanie rozróżnić między jednoczesnym a sekwencyjnym wydzielaniem cytokin, więc prawdziwy zakres jednoczesnej polifunkcjonalności komórek odpornościowych w wydzielaniu cytokin pozostaje niejasny przy użyciu tych metod.

Rozdzielczość pojedynczej komórki można osiągnąć za pomocą mikrofluidyki kropelkowej do generowania i przetwarzania fizycznych przedziałów wielkości pikolitrów w celu badania komórek odpornościowych pod kątem ich unikalnych fenotypów wydzielania cytokin na poziomie pojedynczej komórki^14,15. Przedziały te składają się z emulsji typu woda w oleju i mogą być generowane za pomocą chipów mikroprzepływowych^16,17. Rzeczywiście, testy mikroprzepływowe oparte na kropelkach wykazały niezwykłą wszechstronność w umożliwianiu analizy różnych próbek biologicznych i repertuarów na poziomie pojedynczej komórki oraz ich integracji z procesami poprzedzającymi (przetwarzanie komórek i odczynników) i następczymi (sortowanie pojedynczych komórek, proteomika lub sekwencjonowanie)^{18,19,20,21,22}. W szczególności konfiguracje, które umożliwiają immobilizację kropelkową, pozwalają na pomiar funkcjonalności pojedynczej komórki w czasie, co jest cenne dla analizy wydzielania białek¹⁸. Co więcej, integracja multipleksowanych, ilościowych testów ułatwia dodatkowe badania w wcześniej niedostępnych wymiarach, dotyczące procesów takich jak współwydzielanie i identyfikacja wielofunkcyjnych komórek odpornościowych^23,24.

W tym protokole opisujemy unieruchomiony przepływ pracy oparty na kropelkach pojedynczej komórki, aby wykryć, określić ilościowo i czasowo zmierzyć wydzielanie do trzech cytokin równolegle z pojedynczych komórek^17,23. Technologia ta oferuje możliwość równoległego monitorowania odpowiedzi cytokin z ponad 20 000 komórek.

Prezentowany przepływ pracy składa się z mikroprzepływowej enkapsulacji pojedynczych komórek odpornościowych i funkcjonalizowanych nanocząsteczek w 60 litrach kropelek wody w oleju. Unieruchomienie >100 000 kropel w komorze obserwacyjnej i czasowo-rozdzielcza mikroskopia fluorescencyjna pozwalają na pomiar dynamiki wydzielania cytokin w każdej kropli i każdej cytokinie (Rysunek 1A). Dla każdej pojedynczej komórki w kropelce wydzielanie cytokin mierzy się za pomocą testu immunologicznego typu sandwich, w którym nanocząstki magnetyczne funkcjonalizowane specyficznym przeciwciałem wychwytującym wiążą wydzielaną cytokinę, co prowadzi do późniejszego przemieszczenia i związania znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał detekcyjnych (Rysunek 1B, C). Linia koralików powstaje przez wyrównanie nanocząstek magnetycznych, do których można określić ilościowo przemieszczenie fluorescencji w obecności cytokiny. W tym przypadku przemieszczenie fluorescencji definiuje się jako średnią intensywność fluorescencji znajdującą się na linii koralików podzieloną przez średnią intensywność fluorescencji pozostałej kropli. Test ten można multipleksować dla kilku cytokin poprzez mieszanie różnie funkcjonalizowanych partii nanocząstek i odpowiednich przeciwciał detekcyjnych znakowanych w różnych kanałach fluorescencyjnych²³, co skutkuje specyficznymi przemieszczeniami fluorescencji w różnych kanałach. Za pomocą dostosowanego skryptu analitycznego można wyodrębnić wartości relokacji fluorescencji, a obrazy można przekształcić w dynamiczne profile wydzielania dla każdej pojedynczej komórki i cytokiny. W związku z tym uzyskane zestawy danych dostarczają licznych odczytów, takich jak ilościowy pomiar wydzielania w czasie, identyfikacja subpopulacji współwydzielających oraz rozmieszczenie komórek w zależności od wydzielanych ilości, szybkości i kombinacji cytokin.

Rysunek 1: Przebieg pracy i zasada testowania. (A) Przegląd przepływu pracy w analizie komórek wydzielających cytokiny po stymulacji. Zawiesiny jednokomórkowe i nanocząstki magnetyczne są przygotowywane i kapsułkowane w 60 pL w objętościowych emulsjach olejowo-wodnych (kropelkach). Kropelki są unieruchamiane, a nanocząstki ustawiane w polu magnetycznym przed pomiarem do 4 godzin co 30 minut. Na koniec obrazy są analizowane i wyodrębniane są parametry dla każdej kropli, punktu czasowego i kanału fluorescencyjnego. Ten rysunek został zmodyfikowany z¹⁷. (B) Zasada testu biologicznego z kropelkami kanapkowymi. Funkcjonalizowane nanocząstki wiążą wydzielane cytokiny, co prowadzi do późniejszego przemieszczenia znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał detekcyjnych do nanocząstek. To przemieszczenie fluorescencji jest określane ilościowo i walidowane za pomocą eksperymentów kalibracyjnych przeprowadzonych z rekombinowanymi cytokinami. Mieszanie różnych funkcjonalizowanych nanocząstek pozwala na multipleksowane pomiary do trzech cytokin jednocześnie. (C) W eksperymentach komórkowych kropelki są śledzone przez czas pomiaru, a komórki wydzielające są identyfikowane przez zwiększanie z czasem relokacji fluorescencji na nanocząstki. Schematy nie są w odpowiedniej skali. Figura utworzona za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z umową etyczną EK202-N-56 i zatwierdzone przez komisję etyki ETH Zurich. Postępowanie z komórkami ludzkimi przeprowadzono w komorze z przepływem laminarnym znajdującej się w laboratorium o 2 poziomie bezpieczeństwa biologicznego.

UWAGA: Poniższe sekcje szczegółowo opisują protokół pomiaru czasowo rozdzielczego wydzielania cytokin na poziomie pojedynczej komórki. Opisana tutaj procedura jest stosowana do stymulacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) za pomocą lipopolisacharydu (LPS) i równoległego pomiaru cytokin IL-6, TNFα i IL-1β. Jednak w razie potrzeby protokół można dostosować do innych typów komórek, stymulantów i cytokin.

1. Produkcja komory obserwacyjnej

UWAGA: Aby uniknąć ruchu kropel podczas obrazowania, przygotowuje się komorę obserwacyjną o wysokości około 10% mniejszej niż średnica kropli.

1. Przygotowanie taśmy dwustronnej do cięcia i szkiełka górnego
   1. Narysuj lub załaduj żądany projekt wycięcia w studzience w zakładce Projekt w oprogramowaniu do cięcia. Aby zapoznać się z konkretnymi wymiarami użytymi w tym miejscu, zobacz Rysunek 2E.
   2. Przymocuj dwustronną taśmę klejącą o grubości 32 μm do samoprzylepnej maty do cięcia za pomocą taśmy i umieść matę do cięcia w automatycznej maszynie do cięcia.
   3. Wytnij konstrukcję komory z taśmy, zwracając uwagę na przycięcie długich krawędzi komory w tym samym kierunku, aby ułatwić odczepianie w kroku 1.3.
   4. Przechowuj wycięcia z taśmy w temperaturze pokojowej do długotrwałego przechowywania. W przypadku krótkotrwałego przechowywania należy je przechowywać w temperaturze -20 °C i wyjmować dopiero na krótko przed krokiem 1.3. dla łatwiejszej obsługi.
   5. Wywierć dwa otwory o średnicy około 1 mm w środku jednego standardowego szkiełka mikroskopowego (76 mm x 26 mm x 1 mm), przy odległości między dwoma otworami około 3.5 cm.
2. Czyszczenie i aktywacja plazmowa szkiełek szkiełkowych
   1. Wyczyść jedną szklaną szkiełko z otworami i jedną bez otworów za pomocą mydła. Dobrze spłucz wodą destylowaną i osusz niestrzępiącymi się precyzyjnymi chusteczkami.
   2. Umieść szkiełka podstawowe w urządzeniu do czyszczenia plazmowego i poddaj je obróbce plazmowej górne powierzchnie o mocy 55 W przez 10 minut. Wyjmij szkiełka podstawowe i przejdź do kroku 1.3.
3. Montaż komory
   1. Umieść szkiełko z otworami na czystej powierzchni stroną aktywowaną plazmą do góry, nie dotykając aktywowanej powierzchni.
   2. Usuń warstwę ochronną z jednej strony dwustronnej taśmy klejącej, w tym samym kierunku cięcia. Nie dotykając wyrównaj wycięcie taśmy z krawędziami szkiełka i wywierconymi otworami i powoli przyłóż taśmę do szkiełka szklanego, zaczynając od krótszej krawędzi.
      UWAGA: Zwróć uwagę, aby nie generować żadnych rozciągnięć ani fałd na taśmie, ponieważ spowoduje to nieprawidłowe wysokości komory. Ponieważ ten krok jest podatny na błędy i wymaga pewnego praktycznego doświadczenia, zaleca się przygotowanie kilku szkiełek równolegle.
   3. Usuń drugą warstwę ochronną z taśmy, ponownie w kierunku cięcia i umieść drugi szkiełko bez otworów z aktywowaną powierzchnią skierowaną w dół. Dociśnij do siebie całą powierzchnię dwóch szkiełek szkiełkowych, kładąc płaską deskę na górze i dociskając z siłą górnej części ciała przez około 10 sekund.
   4. Po zamontowaniu dwóch szklanych szkiełek odwróć komorę tak, aby dwa otwory były skierowane w Twoją stronę. Przyklej nanoporty do dwóch otworów, umieszczając niewielką ilość kleju utwardzanego promieniami UV w pierścieniu poniżej portu i umieszczając port na górze otworu w szklanym szkiełku. Dodaj pierścień kleju utwardzanego promieniami UV wokół portu i utwardź klej lampą UV. Komora powinna teraz wyglądać tak, jak pokazano na Rysunek 2E. Przejdź natychmiast do kroku 1.4.
      UWAGA: Światło UV może uszkodzić oczy i skórę. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny.
4. Powłoka fluorofilowa powierzchni komory
   UWAGA: Ten etap powinien nastąpić w ciągu 1 godziny po obróbce plazmowej szkiełek (krok 1.2.2), aby zapewnić dobrą skuteczność powlekania.
   1. Świeżo przygotować 1 ml 1% roztworu fluorozylanu (1H,1H,2H,2H-perfluorodecylotrichlorosilanu) w oleju fluorowanym (HFE-7500) i wlać do strzykawki. Przepchnąć roztwór powlekający przez filtr strzykawkowy z PTFE i igłę 27G x 0,75 cala podłączoną do mikrorurki PTFE 0,3 mm x 0,76 mm do komory obserwacyjnej.
   2. Po 1 minutach inkubacji wypłukać roztwór powlekający z komory za pomocą ciśnienia azotu pod wyciągiem. Przepłukać komorę olejem fluorowanym (tylko HFE-7500) za pomocą innego zestawu strzykawki.
   3. Przechowywać komorę wypełnioną olejem fluorowym z zamkniętymi wlotami w temperaturze pokojowej (RT). Po każdym eksperymencie należy bezpośrednio wypłukać komórki i kropelki, aby zapewnić dobrą konserwację powłoki.
      UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany, a komory mogą być przechowywane i ponownie wykorzystywane przez kilka miesięcy.
5. Uchwyt komory z magnesami
   1. W celu wyrównania nanocząstek magnetycznych należy przyłożyć statyczne pole magnetyczne do komory obserwacyjnej podczas enkapsulacji kropel i obrazowania. W tym celu umieść komorę w niestandardowym uchwycie mikroskopowym wydrukowanym w 3D (zobacz Rysunek 2D i plik znaleziony w Bounab et al.¹⁷ Dane uzupełniające 4), który zawiera dwa magnesy neodymowe wzdłuż dłuższych boków komory.

2. Funkcjonalizacja nanocząstek

UWAGA: Proces funkcjonalizacji nanocząstek jest podobny dla każdej cytokiny, jedyną różnicą jest dodanie przeciwciał wychwytujących specyficzne dla cytokin. Funkcjonalizacja każdej cytokiny odbywa się równolegle w różnych, indywidualnych probówkach reakcyjnych. Przed tym protokołem przeciwciało wychwytujące TNFα i przeciwciało wykrywające IL-1β były znakowane we własnym zakresie odpowiednio biotyną i Alexa Fluor 647. Koniugację przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta znajdującym się na stronie internetowej dostawcy (patrz linki w Tabeli materiałów), a przeciwciała podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze -20 °C.

1. Dodać 50 μl nanocząstek funkcjonalizowanych streptawidyną (średnica (Ø) 300 nm) do probówki przeznaczonej do wykrywania TNFα, 50 μl dla IL-1β i 100 μL dla IL-6. Rozcieńczyć roztwór nanocząstek w stosunku 1:1 (v/v) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
2. Dodać do każdej probówki 1/20 (v/v) odpowiedniej objętości biotynylowanych przeciwciał wychwytujących (stężenia podstawowe przy 0,5 mg/ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze RT.
   UWAGA: Dodając małe objętości do roztworu nanocząstek, umieść objętość na górze probówki i przepłucz ją wielokrotnie większością roztworu. Zapewnia to prawidłowe mieszanie i zapobiega tworzeniu się kruszyw.
3. Dodać 1/100 (v/v) 1 mM roztworu D-biotyny do probówki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W ten sposób uzyskuje się końcowe stężenie biotyny na poziomie 10 μM,
   UWAGA: Nadmiar biotyny blokuje wolne strony wiązania na nanocząstkach i ogranicza niepożądane tworzenie się agregatów.
4. Zbierz cząstki, trzymając magnes neodymowy blisko rurki. Poczekaj, aż supernatant będzie czysty i wyrzuć supernatant.
   UWAGA: Magnesy stosowane w całym teście wykazują bardzo silne siły przyciągania, które mogą spowodować obrażenia fizyczne, jeśli dwa magnesy przypadkowo się ze sobą sprzątną.
5. Aby zredukować niespecyficzną adsorpcję na powierzchni nanocząstek, należy natychmiast ponownie zawiesić nanocząstki w 0,5-krotności końcowej objętości kroku 2,1 Pluronic F-127 (10%) i 0,5-krotności objętości PBS. Inkubować roztwór przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
6. Zbierz cząstki za pomocą magnesu, odrzuć supernatant i ponownie zawieś w 1 razy większej objętości buforu do przechowywania (RPMI 1640, 5% wymiana surowicy nokautującej, 1% Pen/Strep, 1% rekombinowana albumina surowicy ludzkiej (HSA), 25 mM HEPES, 0,1% Pluronic F-127). Inkubować roztwór przez 30 minut w temperaturze RT.
   UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a cząstki mogą być teraz przechowywane przez okres do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
7. Bezpośrednio przed enkapsulacją należy ponownie zawiesić cząstki przez pipetowanie i wymieszać sprzężone nanocząstki w stosunku 2:1:1 (v/v) odpowiednio dla IL-6:TNFα:IL-1β.
   UWAGA: Różne proporcje funkcjonalizowanych nanocząstek zależą od użytej pary przeciwciał dla każdej cytokiny i zostały określone eksperymentalnie za pomocą próbek kalibracyjnych w celu uzyskania optymalnego zakresu dynamiki.
8. Przemyć kompletnymi mediami (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 25 mM HEPES), zbierając cząstki za pomocą magnesu, odrzucając supernatant i ponownie zawieszając. Powtórz ten krok, ale ponownie wymieszaj tylko w 0,5 raza większej objętości całego nośnika niż w kroku 2.7.
9. Dodaj do roztworu różnie znakowane przeciwciała wykrywające IL-6, TNFα i IL-1β, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 nM każde. Roztwór jest teraz gotowy do użycia w eksperymentach kropelkowych.

3. Przygotowanie komórek

UWAGA: PBMC zostały wyizolowane z kożucha otrzymanego z banku krwi w Zurychu. Komórki zamrożono i przechowywano w kriowiach (1 x 10 7 komórek/fiolkę) w ciekłym azocie przez kilka miesięcy.

1. Rozmrażanie komórek
   1. Na 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu pozostawić całe podłoże i bufor MACS (2 mM EDTA, 0,5% BSA w DPBS, sterylnie przefiltrowane) do ogrzania w temperaturze pokojowej. Przygotować probówkę zawierającą komórki, dodając 9 ml kompletnej pożywki do probówki o pojemności 15 ml i trzymając ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
   2. Pobrać kriowial PBMC (zawierający ~1 x 10⁷ komórek) z jego przechowywania w ciekłym azocie. Obracać krioprobówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko niewielka ilość lodu.
   3. Przetrzyj rurkę 70% EtOH i przenieś ją do komory laminarnej. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki do kriowialu, delikatnie wymieszać i przenieść wszystkie komórki do probówki zawierającej ciepłą kompletną pożywkę. Kriowial można przemyć 1 ml ciepłej, kompletnej pożywki, aby odzyskać maksymalną liczbę komórek.
   4. Wirować komórki pod ciśnieniem 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić pipetą osad komórek z 1 ml kompletnej pożywki. Dodać 9 ml kompletnego podłoża.
   5. Obracać komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić jak poprzednio w 1 ml kompletnej pożywki.
   6. Policz komórki, korzystając z dostępnego licznika komórek. W tym przypadku użyto automatycznego licznika komórek. Komórki liczono przez zmieszanie 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego i przeniesienie 10 μl mieszaniny na szkiełko do liczenia komórek.
2. Barwienie i blokowanie FcR
   1. Obliczyć całkowitą liczbę komórek i objętość potrzebną do ponownego zawieszenia komórek przy 2 x 10⁶ żywych komórkach/ml. Przygotować roztwór do barwienia komórek (CellTrace Violet), rozcieńczając materiał podstawowy (5 mM) 1000 razy w PBS (stężenie robocze 5 μM).
   2. Obracać komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w obliczonej objętości roztworu do barwienia komórek, przygotowanego w kroku 3.2.1. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   3. Pod koniec inkubacji schłodzić pozostały barwnik w roztworze, dodając całe podłoże (co najmniej 2x objętość roztworu barwnika). Wiruj komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 60 μl buforu MACS i dodać 20 μl ludzkiego bloku FcR na 1 x 10⁷ komórek. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Napełnij probówkę do 10 ml buforem MACS i obracaj komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki Policz komórki zgodnie z opisem w kroku 3.1.6.
3. Stymulacja komórek za pomocą LPS
   1. Korzystając z liczby komórek, rozcieńczyć komórki w proporcji 1 x 10⁶ komórek/ml i przenieść 2 ml komórek do każdej studzienki na 6-dołkowej płytce o bardzo niskim poziomie wiązania.
   2. Rozcieńczyć LPS w kompletnych pożywkach i dodać go do studzienki zawierającej komórki, aby uzyskać końcowe stężenie LPS wynoszące 1 μg/ml. Inkubować komórki przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.
4. Przygotowanie do kapsułkowania
   1. Pod koniec czasu stymulacji przenieś zawiesinę komórek do nowej probówki o pojemności 15 ml.
   2. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki do pustego dołka. Za pomocą skrobaka do komórek odłącz pozostałe komórki. Przenieś komórki do nowej probówki o pojemności 15 ml. Przemyć studzienkę 1 ml kompletnego podłoża i przenieść do innej probówki o pojemności 15 ml.
   3. Obracać dwie probówki o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przenieść 1 ml nierozcieńczonego roztworu supernatantu (z pierwszej probówki zawierającej nieprzemyte komórki) do nowej probówki w celu dalszej analizy, jeśli jest to konieczne (np. ELISA).
   4. Odrzucić resztę supernatantów.
   5. Ponownie zawiesić granulki w 0,5 ml kompletnej pożywki, połączyć komórki z tej samej studzienki i przenieść je do probówki wirówkowej. Policz komórki zgodnie z opisem w kroku 3.1.6.
   6. Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić większość supernatantu (pozostawiając około 100 μl). Bez ponownego zawieszania osadu należy bardzo ostrożnie dodać 200 μl kompletnej pożywki.
   7. Odrzucić supernatant. Zawiesić komórki w kompletnym pożywce w stężeniu 6,6 do 13,3 x 10⁶ komórek/ml, aby uzyskać średnią liczbę komórek na kroplę λ = 0,2-0,4 dla enkapsulacji, jak określono w kroku 8.6.
      UWAGA: Kroki 3.4.6 i 3.4.7 należy wykonać bezpośrednio przed enkapsulacją, aby uniknąć wydzielania cytokin do supernatantu. Liczba komórek w kropli jest zgodna z rozkładem Poissona: , gdzie P oznacza frakcję kropel zawierających X komórek, a λ oznacza średnią liczbę komórek w kropli.

4. Enkapsulacja i produkcja kropelek

UWAGA: Enkapsulacja komórek w kropelkach jest możliwa dzięki mikroprzepływowemu generatorowi kropel, którego produkcja jest szczegółowo opisana gdzie indziej¹⁷. Alternatywy są dostępne na rynku (patrz przykład w Tabeli materiałów). Odpowiednia konstrukcja chipa generatora kropel ma dwa wloty dla faz wodnych, jeden wlot dla fazy olejowej i jeden wylot dla generowanych kropel. Ponadto odpowiedni komercyjny generator kropel powinien umożliwiać wytwarzanie wody w kropelkach oleju fluorowanego o objętości 40-60 pL. Opisany tutaj protokół daje w wyniku emulsje (kropelki) wodno-olejowe o średnicy 50 μm. Korzystanie z różnych opcji zmiany protokołu może skutkować większymi lub mniejszymi kropelkami.

1. Przygotowanie pompy strzykawkowej (Rysunek 2A)
   1. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 500 μl fazy ciągłej składającej się z 2% 008-Fluorosurfaktantu w oleju fluorowanym HFE-7500. Podłączyć igłę 27G x 0,75 cala do mikrorurki PTFE 0,30 mm x 0,76 mm i zamontować zespół na strzykawce, a następnie na pompie strzykawki.
      UWAGA: Upewnij się, że w strzykawce lub kaniuli nie pozostało powietrze, ponieważ uniemożliwia to stałe natężenie przepływu.
   2. Przygotuj dwa wykonane na zamówienie łączniki końcówek pipet do faz wodnych (Rysunek 2B): Przebij otwór za pomocą dziurkacza do biopsji Ø0,75 mm w środku wycięcia PDMS o wysokości ~5 mm o Ø6 mm. Przeciągnij ~3 cm rurki PTFE (średnica wewnętrzna 0,56 mm, średnica zewnętrzna 1,07 mm) przez otwór w wycięciu PDMS i wepchnij zespół w górną część końcówki pipety o pojemności 200 μl. Podłącz drugą stronę rurki do igły 23Gx 1.25 cala. Uszczelnij złącze, rozprowadzając klej utwardzany promieniami UV na wierzchu pipety i utwardź je światłem UV.
      UWAGA: Ponieważ światło UV jest szkodliwe dla oczu, noś okulary blokujące promieniowanie UV w celu ochrony.
   3. Napełnij dwie strzykawki o pojemności 1 ml 500 μl lekkiego oleju mineralnego, przymocuj dwie igły 23G za pomocą specjalnie wykonanych nasadek i zamontuj obie na pompie strzykawkowej.
   4. Odessać 30 μl nanocząstek i 30 μl roztworu komórkowego do końcówek pipet faz wodnych za pomocą oprogramowania sterującego pompą strzykawkową.
   5. Przygotuj komorę obserwacyjną, czyszcząc powierzchnię wodą w celu usunięcia brudu i kurzu i osusz ją precyzyjnymi chusteczkami. Zacisnąć komorę w drukowanym uchwycie komory wyposażonym w dwa magnesy neodymowe.
      UWAGA: Upewnij się, że magnesy są skierowane we właściwym kierunku (przyciągając się nawzajem), tworząc wydłużone agregaty.
   6. Lekko pochylić komorę (30°). Otwórz oba porty i włóż ręcznik papierowy do górnego portu, aby wchłonąć nadmiar fazy zewnętrznej podczas napełniania.
2. Produkcja kropel i napełnianie komory
   1. Podłącz fazę ciągłą za pomocą rurki do górnego wlotu chipa mikroprzepływowego (Rysunek 2A, C, F). Przepłukiwać wiór przez około 30 sekund fazą ciągłą przy natężeniu przepływu 1800 μl/h.
   2. Podłącz końcówki pipet roztworów wodnych do dwóch środkowych wlotów (Rysunek 2A,C,F).
   3. Rozpocząć przepływ roztworu wodnego od 200 μl/h każdy i pozwolić, aby kanały i wylot zostały wypełnione cieczą. W przypadku stosowania nanocząstek magnetycznych z wylotu chipa powinien wypłynąć jednorodny, brązowo-czerwony roztwór.
   4. Gdy ciecz pojawi się na wylocie, należy uruchomić przepływ fazy oleju fluorowanego przy 800 μl/h i poczekać, aż ustabilizuje się produkcja kropel, potwierdzona wypływem jednorodnego, szarego, błyszczącego roztworu na wylocie.
   5. Po ustaleniu stabilnej produkcji kropel, zbierz wytworzone kropelki, podłączając mikrorurki PTFE (średnica wewnętrzna 0,3 mm x średnica zewnętrzna 0,76 mm) do portu wylotowego i skieruj je do komory obserwacyjnej, przepuszczając mikrorurkę przez moduł tulejowy jednoczęściowej złączki szczelnej dla palców (Rysunek 2A).
   6. Jeśli dojdzie do prawidłowego wytwarzania kropel, jednorodna, błyszcząca ciecz powinna wypełnić komorę z prostym frontem od dołu do góry.
   7. Po napełnieniu komory zatrzymaj przepływ i zamknij porty zaślepkami portów za pomocą docisku palca.
      UWAGA: Zwróć uwagę, aby nie zamykać komory zbyt mocno. Uwięzienie lub napływ powietrza może prowadzić do ruchów kropel, a tym samym zakłócić śledzenie podczas pomiaru.
   8. Po wytworzeniu kropelki przepłucz chip olejem fluorowym i przedmuchnij wszelkie pozostałości płynu azotem, aby zachować jego funkcję. Wióry mogą być wielokrotnie używane i przechowywane przez wiele miesięcy, o ile nie są zatkane.

Rysunek 2: Przegląd konfiguracji mikroprzepływowej. (A) Zestaw do kapsułkowania kropelek z pompą strzykawkową, chipem do wytwarzania kropel oraz komorą obserwacyjną i uchwytem mikroskopu. (B) Zdjęcie wytłoczonej zatyczki PDMS (u góry) tworzącej łącznik z końcówką pipety o pojemności 200 μl (na dole), zgodnie z opisem w kroku 4.1.2 protokołu. (C) Obrazy połączenia rurek i końcówek pipet z chipem generującym kropelki. (D) Zdjęcie komory umieszczonej wewnątrz niestandardowego uchwytu mikroskopu wydrukowanego w 3D z dwoma magnesami na górze i na dole. (E) Zdjęcie komory obserwacyjnej (z białą taśmą dla ilustracji). (F) Układ układu mikroprzepływowego do tworzenia kropel (podziałka skali: 750 μm). Ten rysunek został zmodyfikowany z¹⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Akwizycja i pomiar obrazu

UWAGA: Akwizycja obrazu odbywa się na standardowym odwróconym mikroskopie epi-fluorescencyjnym zamkniętym w inkubatorze, co pozwala na pomiary w temperaturze 37 °C. Opisane tutaj ustawienia są specyficzne dla mikroskopu Nikon Eclipse Ti2 działającego z oprogramowaniem NIS Elements (wersja 5.30.04) wyposażonego w kamerę Orca Fusion, ale generalnie można je dostosować do dowolnych innych mikroskopów i aparatów fluorescencyjnych.

1. Ustawianie parametrów pomiarowych
   1. Aby ustawić rozmiar obrazu, wybierz rozmiar tablicy 10 x 10 obrazów. Ta tablica będzie zawierała około 50 000-70 000 kropel. Użyj 1% nakładania i aktywuj mieszanie do zszywania obrazów.
   2. Aby ustawić liczbę mierzonych kanałów, wybierz kanał DAPI do wykrywania komórek, kanały FITC, TRITC, Cy5 do wykrywania cytokin (kulki) oraz kanał BF do wykrywania kropel. Użyj łączenia pikseli w grupy 2 x 2 i 16-bitowej, aby uzyskać głębię bitową. Dostosuj ustawienia kamery, aby uzyskać wartości pikseli intensywności kropli, które nie osiągają maksimum kamery dla każdego kanału fluorescencji.
      UWAGA: Dokładne czasy naświetlania i intensywności lampy dla każdego kanału zależą od używanego modelu i odczynników i są ustalane przed wygenerowaniem krzywych kalibracyjnych (krok 7). Używanie tych samych ustawień akwizycji w kalibracji i pomiarach celi jest ważne dla dokładnej kwantyfikacji.
   3. Aby skonfigurować pomiar czasowo-rozdzielczy, wybierz pomiar co 30 minut, co daje łącznie 9 pomiarów.
      UWAGA: Parametry pomiaru mogą się różnić dla używanych komórek, stymulantów, odczynników, mierzonych cytokin, temperatury inkubacji i modeli mikroskopowych.
2. Rozpoczęcie pomiaru
   1. Zamontuj uchwyt komory na mikroskopie za pomocą stolika w formacie płytki studzienkowej (Rysunek 2D) i przełącz się na kanał jasnego pola (BF) za pomocą obiektywu 10x.
   2. Skoncentruj się na unieruchomionych kropelkach w BF i upewnij się, że zespół jest zamontowany w idealnej płaszczyźnie, przesuwając się i dostosowując w razie potrzeby. Przejdź do środka komory, aby wykonać kolejne kroki.
   3. Aktywuj system automatycznego ustawiania ostrości (PFS) i ustaw go na optymalną płaszczyznę pomiarową na kanale BF, tak aby krawędzie kropel wyglądały jak czarne, ostre okręgi, które można łatwo odróżnić od fazy olejowej i tła.
      UWAGA: Pomiary są również możliwe bez automatycznego systemu ustawiania ostrości, ale jeśli mikroskop jest w niego wyposażony, zdecydowanie zalecamy jego użycie. Poprawia to jakość pomiaru w przypadku dużych i mocno zszytych obrazów.
   4. Przejdź przez wszystkie kanały fluorescencyjne i ustaw optymalną płaszczyznę pomiarową dla każdego z nich. W przypadku pomiarów relokacji na kanałach FITC, TRITC i Cy5 upewnij się, że agregat nanocząstek jest idealnie ostry, w przypadku kanału DAPI upewnij się, że komórki są w ognisku.
      UWAGA: Optymalne płaszczyzny ogniskowych i wartości z mogą się różnić dla wszystkich mierzonych kanałów. Upewnij się, że zapisałeś indywidualne przesunięcia PFS dla każdego kanału.
   5. Przed rozpoczęciem pomiaru przejdź przez wszystkie kanały, aby dokładnie sprawdzić poszczególne ogniska i odczekaj 5 minut, aby się zrównoważyć, ponieważ ruch może wystąpić początkowo, gdy roztwory się nagrzewają.
   6. Rozpocznij pomiar. Po wygenerowaniu pierwszego obrazu sprawdź, czy nie ma żadnych nieprawidłowości (ostrość, poruszające się krople, niewłaściwe kanały itp.). W razie potrzeby uruchom ponownie akwizycję lub, w przypadku powietrza, napełnij komorę (zacznij od kroku 4.1.4). Pozostaw zespół do zobrazowania kropel przez 4 godziny.

6. Analiza obrazu

1. Zainstaluj oprogramowanie do analizy obrazu (DropMap Analyzer App v 4.023) w MatLab (https://github.com/ESPCI-LCMD/MiMB) i przenieś wygenerowany plik .nd2 z eksperymentu na komputer analityczny.
2. Otwórz aplikację. Wybierz określone ustawienia, w przeciwnym razie pozostaw wartość domyślną: CH1: DAPI, WD (cała kropla) wybrana; CH2: wybrany FITC, BL (beadline); CH3: TRITC, BL wybrany; CH4: Cy5, BL wybrane; Maksymalna średnica kropli (μm): 70; Wykrywanie upuszczenia: pełne; Śledzenie: Tak. Naciśnij przycisk Start (ikona owocu), aby wybrać lokalizację pliku .nd2 i rozpocząć analizę.
3. Po kilku minutach program wyświetli przykładowy fragment obrazu (Rysunek 3A). Naciskaj spację, aż znajdziesz odpowiednią do wykrywania kropel, a następnie naciśnij Enter. W tej samej sekcji obrazu narysuj prostokąt w reprezentatywnym obszarze, aby znaleźć parametry progowe do wykrywania kropel.
4. Po kilku minutach otworzy się kolejne okno pokazujące rozkład intensywności kanału DAPI. Przeciągnij i upuść suwak, aby wykryć tylko sygnał z poplamionych komórek, a następnie kliknij Gotowe w prawym górnym rogu.
5. Po podziale obrazu na pojedyncze kropelki o średnicy mniejszej niż Max. Średnica kropli (μm), program wykona teraz następujące kroki dla każdej kropli, punktu czasowego i kanału fluorescencji bez dalszego wprowadzania danych przez użytkownika (patrz Rysunek 3).
   1. Oprogramowanie oblicza przesunięte piksele kropli między punktami czasowymi (krople poruszające się o więcej niż 40 pikseli są automatycznie wykluczane).
   2. Oprogramowanie mierzy średnią wartość fluorescencji całej kropli, wykrywając i mierząc średnią intensywność linii koralików, znajdując najjaśniejszy piksel na linii poziomej i uśredniając wszystkie intensywności pikseli na linii pionowej od góry do dołu kropli. Odbywa się to automatycznie i służy do obliczania średnich wartości relokacji linii koralików (Rysunek 3B) zgodnie z równaniem:
      
   3. Oprogramowanie oblicza procent całkowitej liczby pikseli w obszarze kropli powyżej progu ustawionego na kanale DAPI.
6. Wynikowy plik .xslx będzie zawierał następujące kolumny interesujące do dalszej analizy: DropIdX (ID kropli śledzonej w czasie), TrueCentroid_ t*2-1 i t+2 (odpowiednio współrzędne x i y środka kropli dla punktu czasowego t), DiameterMicrons (średnica kropli w μm), TrackingMove (liczba pikseli przesuniętych w całym czasie pomiaru), FluoChannel_BL_Ratio_t (wartość relokacji dla FluoChannel w punkcie czasowym t), DAPI_WD_PosPxlCount_t (liczba pikseli powyżej progu w całej kropli w kanale DAPI w punkcie czasowym t).

Rysunek 3: Analiza obrazu wykonywana przez oprogramowanie do analizy obrazu. (A) Kropelki są wykrywane w kanale jasnego pola (BF) za pomocą transformacji Hougha, oznaczając każdą kroplę czerwonym kółkiem. Podziałka skali: 200 μm. (B) W każdej kropli linia kulki nanocząstek jest identyfikowana za pomocą najjaśniejszych pikseli w płaszczyźnie poziomej, a intensywność fluorescencji jest uśredniona dla wszystkich pikseli rozciągających się od góry do dołu kropli. Dodatkowo komórka jest identyfikowana za pomocą procentu pikseli >0 powyżej progu dla całego obszaru kropli. Podziałka skali: 20 μm. (C) Oprogramowanie analizatora porównuje intensywność fluorescencji nanocząstek z tłem kropli dla kanałów FITC, TRITC i Cy5 we wszystkich zmierzonych punktach czasowych dla każdej pojedynczej kropli. Pokazane są punkty czasowe 0, 4 (120 min) i 9 (240 min). Aby ręcznie sprawdzić, czy wykrywanie kropel i komórek jest prawidłowe, wyświetlane są również kanały DAPI i BF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Kalibracja

UWAGA: Dla odczytu ilościowego, kalibracja stężeń cytokin do wartości relokacji fluorescencji musi być wykonana raz, ponieważ mogą wystąpić różnice między różnymi ustawieniami eksperymentalnymi. Wszystkie wymagane kroki są szczegółowo opisane w poprzednich sekcjach protokołu, do których się odniesiono.

1. Przygotuj nanocząstki zgodnie z opisem w kroku 2.
2. Rozpuść ludzkie białka rekombinowane IL-6, TNFα i IL-1β zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Upewnij się, że zamrożone porcje są rozmrażane tylko raz i niezwłocznie zużywane.
3. Przygotować serię 2-krotnego rozcieńczania dla wszystkich trzech białek razem, używając kompletnych pożywek (10% FBS, 1% Pen/Strep, 25 mM HEPES) o stężeniu początkowym 80 nM do 0,625 nM.
4. Przeprowadzić enkapsulację zgodnie z opisem w kroku 4 z funkcjonalizowanymi nanocząstkami w pierwszej i RPMI tylko w drugiej fazie wodnej. Pomiar ten służy jako ślepa próba, a zmierzone odchylenie standardowe jest wykorzystywane do późniejszej analizy danych.
5. Odczekaj 5 minut i zobrazuj kropelki zgodnie z opisem w kroku 5. Wykonaj 3 zdjęcia o rozmiarze matrycy 2 x 2 w odpowiednich kanałach fluorescencyjnych.
6. Powtórzyć kroki 7.4 i 7.5 dla wszystkich przygotowanych roztworów kalibracyjnych, zaczynając od najniższego i kończąc na najwyższym stężeniu.
7. Przeanalizuj obrazy zgodnie z opisem w kroku 6. Nie używaj opcji WD dla kanału DAPI i ustaw Śledzenie na Nie.
8. Analiza generuje wartości relokacji fluorescencji dla każdej zmierzonej kropli na jednym obrazie. Wyodrębnij medianę i odchylenie standardowe dla każdego kanału fluorescencji. Uśrednić medianę i odchylenie standardowe dla każdego zmierzonego obrazu na stężenie.
9. Wygeneruj krzywą kalibracyjną, wykreślając uśrednioną medianę przemieszczenia w stosunku do zmierzonych stężeń każdego rekombinowanego białka.
10. Dopasuj krzywe za pomocą asocjacji jednofazowej: ,
    gdzie Y = przemieszczenie w punkcie x, Y₀ = przemieszczenie ślepej próby pomiaru, a x użyte stężenie. Uzyskana krzywa kalibracyjna służy do ilościowego określenia wartości relokacji zgodnie z opisem w kroku 8.
    UWAGA: Dopasuj tylko wartości do najwyższego zmierzonego przemieszczenia i wyklucz wartości z wyższych stężeń przy niższym zmierzonym przeniesieniu. Spodziewany jest spadek mierzonych wartości relokacji przy wyższych stężeniach, który występuje z powodu efektu Hooka i ograniczonej zdolności wiązania nanocząstek.

8. Analiza danych

1. Wyklucz kropelki o wartości TrackingMove większej niż 10, tj. takie, które przemieściły się o więcej niż 10 pikseli w czasie pomiaru.
2. Zidentyfikuj kropelki zawierające barwione komórki (kanał DAPI) w pierwszym punkcie czasowym, sortując kropelki o wartościach wyższych niż 0 w kolumnie DAPI_WD_PosPxlPercent_1.
3. Zidentyfikuj kropelki zawierające komórki wydzielające, stosując następujące 3 kryteria do relokacji fluorescencji każdego kanału fluorescencji (FluoChannel_BL_Ratio_t kolumny).
   1. Identyfikacja kropel o rosnących wartościach relokacji poprzez sortowanie pod kątem dodatniego nachylenia w czasie pomiaru.
   2. Identyfikacja kropel, w przypadku których wartości relokacji osiągają granicę wykrywalności (LOD). Kropla jest wybierana, gdy maksymalne przemieszczenie fluorescencji w czasie pomiaru jest większe niż LOD, obliczone zgodnie z opisem w innym miejscu²⁵: , gdzie μ_{Relokacja t0} jest medianą wszystkich wartości relokacji w punkcie czasowym 0 i σ_BLK odchylenie standardowe ślepej próby zmierzonej podczas kalibracji, z których każda jest specyficzna dla cytokin
   .
   3. Sprawdzenie, czy wzrost wartości relokacji jest znaczący, poprzez sprawdzenie, czy zmiana między maksymalną a minimalną zmierzoną relokacją fluorescencji w czasie pomiaru jest większa niż: .
4. Zidentyfikuj komórki współwydzielające, spełniając kryteria opisane w kroku 8.3. dla więcej niż jednego kanału fluorescencyjnego jednocześnie.
5. Powtórzyć krok 8.3 dla wszystkich kropel bez komórki (DAPI_WD_PosPxlPercent_1 = 0). Użyj tych kropel, aby obliczyć odsetek wyników fałszywie dodatnich.
6. Określ dokładną wartość λ pomiaru, wybierając losowo 200 - 500 kropel i sprawdzając je za pomocą funkcji Verify and sort w oprogramowaniu do analizy obrazu. Policz liczbę komórek w tych kropelkach i oblicz:
   λ = liczba zliczonych komórek / liczba analizowanych kropelek
7. Oblicz całkowitą liczbę zamkniętych komórek do pomiaru według:
   Całkowita liczba komórek = λ × liczba analizowanych kropel
8. Oblicz procent komórek wydzielających przy użyciu określonej liczby komórek. Dodatkowo oblicz procent wyników fałszywie dodatnich dla każdej cytokiny (zwykle mniej niż 3%-5% w stosunku do liczby naprawdę dodatnich wyników na kanał) i użyj ich jako wewnętrznej kontroli spójności i odtwarzalności eksperymentalnej.
9. Aby obliczyć wydzielane stężenia cytokin, przelicz wartości relokacji na stężenie, korzystając z ustalonych równań kalibracyjnych z kroku 7.10.
10. Oblicz szybkość wydzielania (SR) między punktami czasowymi, używając następującego równania.
    
11. Oblicz średnią szybkość wydzielania w trakcie pomiaru, uśredniając poszczególne szybkości wydzielania między punktami czasowymi. Jeżeli maksymalne mierzalne przemieszczenie zostało osiągnięte przed zakończeniem pomiaru, należy ustawić stężenie na maksymalne mierzalne stężenie (wartość ta jest specyficzna dla cytokin i odpowiada maksymalnemu stężeniu zmierzonemu i zastosowanemu w krzywej kalibracyjnej w kroku 6.10) i nie obliczaj dalszego stężenia. Oblicz szybkość wydzielania i uśrednij tylko do tego punktu czasowego.
    UWAGA: Jeśli w jednym kanale fluorescencyjnym zostanie wykrytych mniej niż 50 komórek wydzielających, kropelki należy zbadać wizualnie za pomocą funkcji weryfikacji i sortowania, a kropelki zawierające fluorescencję lub agregaty nanocząstek można wykluczyć z analizy.
12. Aby wyodrębnić dalsze parametry z krzywej wydzielania każdej pojedynczej komórki, wykonaj najmniejsze kwadratowe dopasowanie do krzywej czasowo-stężeniowej dla każdej komórki i cytokiny za pomocą niestandardowego skryptu Pythona (dostępnego na żądanie). Funkcja dopasowania jest krzywą sigmoidalną zgodnie ze wzorem opisanym poniżej (pasowania do R²<0,95 są wyłączone z następujących etapów):
    
    gdzie C odpowiada plateau stężenia [nM], t₅₀ przesunięciu połówki maksimum [s], a m zboczu wzgórza [^min-1]. Z tych parametrów wyodrębniane są następujące deskryptory krzywych zgodnie z poniższym opisem.
    1. C_max [nM]: Maksymalne zmierzone stężenie.
    2. : Czas rozpoczęcia wydzielania, gdzie dopasowanie osiąga 10% C.
    3. : szybkość wydzielania jako przybliżone nachylenie liniowe krzywej między 10% a 90% krzywej koncentracji czasu.

Wyniki

Prezentowana funkcjonalna platforma jednokomórkowa pozwoliła na pomiar kilku parametrów. Po pierwsze, podobnie jak w przypadku standardowych technik, częstotliwość wydzielania komórek jest przedstawiona na końcu pomiaru (Rysunek 4A). Po stymulacji 1 μg/ml lipopolisacharydu (LPS) przez 6 godzin komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), 5,81% komórek wydzielało IL-6 (n = 1270), 4,55% TNFα (n = 995) i 6,06% IL-1β (n = 1326).

Aby określić ilościowo wydzielanie cytokin, wygenerowano krzywe kalibracyjne ze znanymi stężeniami rekombinowanych cytokin (Rysunek 4B). Te krzywe kalibracyjne umożliwiają ilościowe określenie stężeń cytokin w kroplach w czasie. Na przykład średnie stężenie IL-6 w kropli osiągnęło plateau po 90 minutach dla PBMC stymulowanego przez LPS, podczas gdy średnie stężenie IL-1β w kropli rosło szybciej od 90 minut, co pokazuje dynamiczną rozdzielczość platformy i możliwość ekstrakcji subpopulacji komórek wydzielających określone cytokiny (Rysunek 4C). Ponieważ stężenie zmienia się między punktami pomiarowymi, możliwe jest obliczenie dynamicznych wskaźników wydzielania na cytokinę. Biorąc pod uwagę średnią szybkość wydzielania dla każdej cytokiny (Ryc. 4D), komórki wydzielające IL-6 wykazywały stały spadek średniej szybkości wydzielania, podczas gdy komórki wydzielające TNFα i IL-1β wykazały wzrost szybkości wydzielania po 90 minutach pomiaru i drugi spadek po 150 minutach.

Ponadto, możliwe jest grupowanie komórek w subpopulacje w zależności od wydzielanych i współwydzielanych cytokin (Rysunek 4E). W tym przypadku IL-6 i TNFα są wydzielane pojedynczo przez 30,2% i 26,4% komórek wydzielających odpowiednio IL-6 lub TNFα, podczas gdy komórki IL-1β wydzielające pojedynczo stanowiły 68,8% wszystkich komórek wydzielających IL-1β. Dodatkowo, wpływ współwydzielania na wydzielane stężenia i szybkość wydzielania można rozwiązać (Rysunek 4F). Patrząc na komórki wydzielające IL-6, różne ilości IL-6 były wydzielane, jeśli komórki dodatkowo wytwarzały TNFα lub IL-1β. Podobnie, rozkład uśrednionych szybkości wydzielania w trakcie pomiaru różnił się statystycznie między komórkami wydzielającymi tylko IL-6 lub IL-6 wraz z TNFα (wyższe wskaźniki wydzielania) i IL-1β (niższe wskaźniki wydzielania IL-6).

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki wydzielania PBMC przez IL-6, TNFα i IL-1β po 6 godzinnej stymulacji 1 μg/ml LPS. (A) Procent PBMC wydzielających IL-6, TNFα i IL-1β pod koniec 4-godzinnego pomiaru. (B) Krzywe kalibracji cytokin multipleksowanych są generowane ze znanymi stężeniami cytokin rekombinowanych. Pozwala to na ilościowe określenie eksperymentów komórkowych poprzez obliczenie na podstawie wartości relokacji stężenia cytokin w kropli. Punkty dopasowano za pomocą nieliniowej jednofazowej krzywej asocjacyjnej, r²=0,9926 (IL-6), 0,9901 (TNFα), 0,9990 (IL-1β). (C) Średnie wydzielane stężenia IL-6, TNFα i IL-1β uwalniane przez wydzielanie PBMC w ciągu 4-godzinnego czasu pomiaru. (D) Średnie tempo wydzielania IL-6, TNFα i IL-1β w czasie pomiaru 4 godzin. (E) Względny odsetek komórek współwydzielających IL-6, TNFα lub IL-1β i ich kombinacje. Znormalizowane do wszystkich komórek wydzielających wykrytych dla każdej cytokiny. (F) Uśrednione stężenia IL-6 w czasie pomiaru i rozkłady średniej szybkości wydzielania (log) dla komórek wydzielających IL-6 z rozdzielczością współwydzielania (n = 383 tylko dla IL-6, n = 531 dla IL-6 + TNFα, n = 213 dla IL-6 + IL-1β i n = 143 dla IL-6 + TNFα + IL-1β). Statystyczne różnice w rozkładach szybkości wydzielania oceniano za pomocą dwustronnych, niesparowanych, nieparametrycznych testów Kołmogorowa-Smirnowa z 95% pewnością, reprezentowane są wartości p. ** (p <0,002) i **** (p <0,0001). Pełna linia reprezentuje medianę, a linia przerywana kwartyle. n_{komórek ogółem} = 21 866. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby uzyskać dodatkowe informacje na poziomie pojedynczej komórki, funkcja esicy może być dopasowana do punktów stężenia-czasu każdej komórki i cytokiny (Rysunek 5). Przykładowy zestaw danych stężenia w czasie dla jednej komórki i odpowiadającego jej dopasowania sigmoidalnego przedstawiono na rysunku Rysunek 5A. W tym przypadku procedura dopasowania metodą najmniejszych kwadratów daje następujące parametry: C, odpowiadający górnej wartości plateau krzywej, t₅₀ określający ilościowo przesunięcie krzywej w czasie od zera oraz nachylenie wzgórza m, opisujące stromość wznoszącej się części krzywej esicy z wartościami stężeń 10% i 90% osiągniętymi podczas pomiaru. Z tych parametrów dopasowania można wyodrębnić niektóre deskryptory krzywych, jak wyjaśniono w kroku 7.12. uzyskując C_max, najwyższą wartość stężenia w danych, t_start, czas rozpoczęcia wydzielania, zdefiniowany jako osiągnięcie 10% wartości stężenia na górnym platau, oraz SR_lin, szybkość wydzielania w rosnącej części krzywej.

Aby sklasyfikować subpopulacje komórek, deskryptory krzywych uzyskane ze wszystkich dopasowań pojedynczych komórek zostały podzielone na trzy kategorie:_Maksymalne wartości C zostały pogrupowane na niskie, średnie i wysokie dla_{t start} na wczesny, średni i późny, a SR_lin na wolne, średnie i szybkie wydzielacze. Aby zilustrować tę klasyfikację, pokazano cztery przykładowe krzywe wydzielania pojedynczych komórek i odpowiadające im deskryptory krzywych (Rysunek 5A-D), gdzie krzywa A wykazuje cechy wczesnego niskiego wydzielacza o średniej szybkości, krzywa B jest wczesnym, wolnym i wysokim wydzielaczem, krzywa C jest wczesnym szybkim wysokim wydzielaczem, a krzywa D pokazuje późne niskie wydzielanie. Ważne jest, aby pamiętać, że punkty odcięcia dla tych kryteriów są specyficzne dla komórki, cytokin i parametrów testu i muszą być dostosowane do każdego pytania badawczego. Co więcej, uwzględniono tutaj tylko wydzielanie IL-6 PBMC po stymulacji 1 μg / ml LPS przez 6 godzin, co oznacza, że większość komórek była wczesna i wysoko wydzielająca odpowiednio 80% i 79% (Figura 5E-F). Jeśli chodzi o szybkość wydzielania, zaobserwowano odpowiedź dwubiegunową, przy czym 55% komórek wydzielających IL-6 to powolne wydzielacze, a 39% to szybkie wydzielacze (Figura 5G).

Aby dokładniej scharakteryzować zachowanie wydzielania, deskryptory krzywych dla każdej komórki zostały wykreślone względem siebie i wyodrębniono różne klastry (Rysunek 5H-J). Nie podano wyraźnej korelacji między_początkiem t a C_max (Ryc. 5H): dwie największe populacje były wczesnymi niskimi wydzielaczami i wysokimi wydzielaczami, niezależnie od początku wydzielania. Biorąc pod uwagę związek między_początkiem t a SR_lin (Ryc. 5I), większość komórek była wczesnymi powolnymi wydzielaczami z wyraźną populacją wczesnych wysokich wydzielaczy i kilkoma wolnymi/średnimi do późnych wydzielaczy. Jeśli chodzi o korelacje SR_lin i C_max (Rysunek 5J), prawie nie występowały szybkie niskie i średnie wydzielacze, a tylko większa populacja szybkich niskich wydzielaczy. Co więcej, istniała duża populacja szybkich wydzielaczy, które nie zależały od maksymalnego zmierzonego stężenia, oraz dwie populacje wysokich wydzielaczy wydzielanych albo wolno, albo szybko. Podsumowując, można stwierdzić, że badanie związku między deskryptorami krzywych dla poszczególnych komórek daje znacznie bardziej szczegółową analizę i może potencjalnie wydobyć nowe odkrycia biologiczne z pomiarów wydzielania pojedynczych komórek.

Za pomocą analizy przedstawionej powyżej, wyodrębniliśmy dynamikę wydzielania komórek współwydzielających (Rysunek 6). Dwie przykładowe krzywe pokazują różną dynamikę współwydzielania IL-6 i TNFα z dwóch pojedynczych komórek z jednoczesnym początkiem obu cytokin (Figura 6A) lub sekwencyjnym początkiem wydzielania, przy czym IL-6 jest wydzielana jako pierwsza (Figura 6B). Aby sklasyfikować wszystkie komórki współwydzielające, zdefiniowano opóźnienie wydzielania wynoszące 60 minut, gdzie wszystkie komórki rozpoczynające wydzielanie w tym zakresie są uważane za równoczesne wydzielacze, a wszystkie komórki z dłuższymi opóźnieniami są uważane za sektory sekwencyjne. Analiza ta pozwoliła również zaobserwować, która cytokina została wydzielona jako pierwsza. W przypadku IL-6 i TNFα głównie jednoczesne współwydzielanie zaobserwowano w 76% komórek (Figura 6C), podczas gdy w przypadku IL-6 i IL-1β sekwencyjne współwydzielanie zaobserwowano w 86% komórek, przy czym IL-6 była pierwszą cytokiną, która była wydzielana w większości przypadków (Figura 6D).

Patrząc na czas rozpoczęcia wydzielania dla różnych cytokin dla wszystkich indywidualnych komórek współwydzielających, nie zaobserwowano wyraźnej korelacji między czasami rozpoczęcia wydzielania w przeprowadzonych eksperymentach. W przypadku współwydzielania IL-6 i TNFα (Rysunek 6E) występowało większe pionowe skupisko około 0 minut, odpowiadające komórkom współwydzielającym częściej począwszy od IL-6. W przypadku jednoczesnego wydzielania IL-6 i IL-1β (Figura 6F), większość komórek zaczęła wydzielać IL-6 na początku pomiaru, podczas gdy IL-1β była głównie wydzielana później. Podsumowując, przedstawiona analiza umożliwiła identyfikację różnych subpopulacji wydzielaczy i złożonej dynamiki współwydzielania cytokin.

Rysunek 5: Szczegółowa analiza różnych wzorców dynamicznych wydzielania dla krzywych pojedynczych komórek wydzielających IL-6. (A) Reprezentatywne dane dotyczące stężenia cytokin w pojedynczej komórce w czasie pomiaru z dopasowaną krzywą esicy i wyekstrahowanymi parametrami. (B-D) Trzy przykładowe krzywe stężenia cytokin jednokomórkowych dla różnych typów wydzielaczy cytokin znalezione dla wydzielania IL-6 po stymulacji LPS. (E-G) Procentowy udział komórek wydzielających IL-6, które są klasyfikowane do różnych typów wydzielaczy według następujących kryteriów (n = 633): E. C_max: niskie <5 nM, wysokie >19,5 nM, F. t_początek: wcześnie <30 min, późno >120 min, G. SR_lin: wolno <250 cząsteczek/s, szybko >750 molekuł/s. (H-J) Zależność między trzema deskryptorami krzywej wydzielania C_max, t_start i SR_lin dla każdej pojedynczej komórki (n=633). Duża populacja przy C_max=20nM wynika z osiągnięcia górnej granicy wykrywalności testu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Ekstrakcja wzorców współwydzielania z krzywych koncentracji pojedynczej komórki. (A-B) Reprezentatywne krzywe stężenia dla pojedynczych komórek współwydzielających IL-6 i TNFα (A) odpowiednio jednocześnie i (B) sekwencyjnie. (C-D) Odsetek komórek wykazujących jednoczesne i sekwencyjne współwydzielanie IL-6 i TNFα (n = 249) lub odpowiednio IL-6 i IL-1β (n = 72). Wydzielanie sekwencyjne definiuje się jako opóźnienie między rozpoczęciem wydzielania cytokin większe niż 60 minut. Kolory wskazują, które z cytokin zaczęły wydzielać jako pierwsze. (E-F) Zależność między czasami rozpoczęcia wydzielania dla różnych cytokin dla każdej komórki wydzielającej (n_IL6-TNFα=249, n_IL6-IL1β=72). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Uwalnianie i wydzielanie cytokin jest często badane w immunologii i medycynie klinicznej³. Niezrównoważone wydzielanie cytokin może prowadzić do szkodliwych skutków dla pacjentów cierpiących na infekcje, ale także w chorobach neurologicznych, stanach zapalnych lub nowotworach 26,27,28. Mimo że ich znaczenie dla zdrowia i choroby jest dobrze znane, badanie cytokin i ich komórek wydzielających pozostaje wyzwaniem, ponieważ obecne metodologie nie są w stanie dokładnie wykryć i określić ilościowo cytokin pochodzących z pojedynczej komórki w sposób rozdzielczy w czasie. Do przedstawionego tutaj przepływu pracy wykorzystano ustalony protokół stymulacji PBMC i zmierzono wydzielanie przez nie IL-6, TNF-α i IL-1β. Wybór stosowania PBMC zamiast indywidualnych, oczyszczonych subpopulacji wynikał z poprzedniego wniosku do badania zespołów uwalniania cytokin (CRS)²³, stanu charakteryzującego się wysoce podwyższonymi stężeniami cytokin prozapalnych w osoczu, w tym IL-6, TNF-α i IL-1β²⁹. Ponieważ CRS zwykle nie jest związany tylko z jedną populacją, użyliśmy PBMC tak, jak byłyby one obecne in vivo. Jednak subpopulacje komórkowe mogą być oczyszczane i oceniane indywidualnie, jeśli wymaga tego kwestia naukowa. Czas inkubacji, warunki stymulacji i zakresy testów dynamicznych zostały zoptymalizowane w celu pomiaru wydzielania trzech cytokin będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawiony tutaj przepływ pracy i dane pokazują, jak ustawiać, kalibrować, kwantyfikować, mierzyć i analizować czasowo rozdzielone wydzielanie pojedynczych komórek wielu cytokin. Protokół ten zawiera plan tego, w jaki sposób wielofunkcyjna analiza wydzielania cytokin może umożliwić dużą funkcjonalną i dynamiczną różnorodność cytokin wydzielanych przez pacjentów.

Kilka kluczowych aspektów opisanego protokołu testowego umożliwia unikalny odczyt biologiczny. Po pierwsze, enkapsulacja pojedynczej komórki w kropelkach mikroprzepływowych pozwoliła na ekstrakcję danych dla każdej pojedynczej komórki. Zdarzenia związane z enkapsulacją wielu komórek mogą być wykrywane i sortowane za pomocą analizy obrazu, w zależności od pytania badawczego. Po drugie, włączenie kilku niezależnych testów immunologicznych fluorescencyjnych w kropelkach i wyrównanie funkcjonalizowanych nanocząstek pozwoliło na ilościowy pomiar do trzech stężeń cytokin równolegle. To multipleksowanie umożliwiło analizę wzorców współwydzielania cytokin na poziomie pojedynczej komórki. Po trzecie, unieruchomienie kropelek pozwoliło na pomiar w czasie i korelację wydzielania cytokin dla każdej komórki wydzielającej oraz pozwoliło na odróżnienie wydzielania współobecnego od sekwencyjnego. Rozdzielczość czasowa w unikalny sposób dostarczyła danych na temat wzorców wydzielania i subpopulacji różnych typów wydzielaczy. Wreszcie, równoległa analiza obrazu umożliwiła efektywne wyodrębnianie i śledzenie dużych ilości danych z pomiarów na ponad 20 000 pojedynczych komórek. Ekstrakcja z pojedynczych krzywych wydzielania pozwoliła na dalsze odkrycie subpopulacji i funkcji fenotypowych.

Oprócz unikalnego odczytu, test ma również zalety techniczne w porównaniu ze standardową analizą cytokin. Dzięki niewielkim rozmiarom komór enkapsulacyjnych wynoszącym około 60 pl, bezwzględne ilości wydzielanych cytokin mogą być wykrywane bezpośrednio ze źródła biologicznego z limitami wykrywalności dopasowanymi do wydzielania komórkowego. Miniaturyzacja testu wykorzystuje również mniejsze ilości drogich bioodczynników. Co więcej, instalacja wymaga bardzo niewielkiej ilości specjalistycznego sprzętu, który często jest już dostępny w laboratoriach biologicznych i bioinżynieryjnych. Mikroskopy fluorescencyjne są szeroko dostępne, a pompy strzykawkowe są często używane w laboratoriach bioinżynieryjnych lub można je kupić po stosunkowo niskich kosztach. Jeśli obecna jest hodowla komórkowa, koszt pełnego sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia eksperymentów wynosi około 148 000 euro, z czego większość pochodzi z automatycznego mikroskopu epifluorescencyjnego (130 000 euro). Jednak taki instrument można często znaleźć w laboratoriach biologicznych, a reszta kosztów jest rozdzielana na pompę strzykawkową (13 000 euro, ale dostępne są tańsze alternatywy) i mniejszy sprzęt. Wytwarzanie chipa kropelkowego i komory obserwacyjnej jest bardzo dobrze opisane¹⁷ i może być wykonane poza środowiskiem pomieszczenia czystego z niezbędną infrastrukturą, taką jak piece i urządzenia do czyszczenia plazmowego obecne w większości laboratoriów bioinżynieryjnych. Alternatywnie, dostępni są różni dostawcy, którzy dostarczają zainteresowanym laboratoriom chipy generatora kropel. Ze względu na małe potrzebne objętości test jest opłacalny i prosty w konfiguracji.

Aby zapewnić najwyższy stopień odtwarzalności, zidentyfikowaliśmy kilka kluczowych kroków dla sukcesu protokołu. Częstym problemem dla początkujących użytkowników jest ruch kropel podczas pomiaru. Chociaż oprogramowanie analityczne może do pewnego stopnia śledzić poszczególne kropelki, nadmierny ruch prowadzi do utraty rozdzielczości pojedynczej komórki i niedokładnych wyników. Ruchu można uniknąć, stosując odpowiednio szczelne komory pomiarowe, prawidłową wielkość kropel i rozmiary komór, krótki okres równowagi przed rozpoczęciem pomiaru oraz odpowiednie stężenie środka powierzchniowo czynnego. Kolejnym krytycznym krokiem jest dokładne ustawienie ostrości przed rozpoczęciem pomiaru. Niewłaściwe ogniskowanie prowadzi do znacznego obniżenia wartości relokacji fluorescencji i niedoszacowania ilości wydzielanej cytokiny. Wreszcie, w zależności od danego pytania i protokołu, prawidłowe wyczucie czasu między różnymi krokami ma ogromne znaczenie dla odtwarzalności. Szczególnie czas oczekiwania między napełnieniem komory a rozpoczęciem pomiaru powinien być stały, w przeciwnym razie okno pomiarowe wydzielanych cytokin może zostać pominięte.

Do ograniczeń prezentowanej technologii należy ograniczenie możliwości dalszego manipulowania komórkami po enkapsulacji. W związku z tym obecnie nie jest możliwe dodawanie lub usuwanie stymulantów, przeciwciał lub dodatkowych odczynników. Dodatkowo, ponieważ komórki są zamknięte w izolowanym bioreaktorze, podczas pomiaru nie mogą zachodzić żadne interakcje między komórkami (sygnalizacja kontaktowa lub parakrynna). To ograniczenie można częściowo przezwyciężyć dzięki wcześniejszej inkubacji masowej. Poza tym możliwe są również zwiększone efekty autokrynne wydzielanych cytokin i nie można ich określić ilościowo ani wykluczyć z całą pewnością, ponieważ mierzone są tylko wydzielane cytokiny wykryte przez przeciwciała. Tak więc odosobniony pogląd na wydzielanie cytokin musi być zawsze opisany w kontekście odpowiedniego pytania i zastosowania. Jednak to ograniczenie może być również wykorzystane do szczegółowego badania zamkniętych wielokrotności, dubletów i trojaczków, jeśli jest to interesujące. Zapewniłoby to interesującą konfigurację przydatną do badania kontaktów komórka-komórka lub pytań opartych na parakrynności. Wreszcie, również zakres dynamiczny testu jest ograniczony i wymaga dostosowania do konkretnego zastosowania. W tym przypadku dostosowaliśmy zakres dynamiczny testu do oczekiwanej wydzielanej ilości mierzonych cytokin.

Aby jeszcze bardziej zwiększyć możliwości i możliwości zastosowania testu, w przyszłości można będzie zająć się kilkoma osiągnięciami w aspektach biologicznych, technicznych i analizy danych. Od strony biologicznej pomiar dodatkowych cytokin, innych wydzielanych białek, markerów metabolicznych lub markerów powierzchniowych komórek można zintegrować poprzez dostosowanie testu. Co więcej, test ten można zintegrować z przepływem pracy wraz z innymi testami opartymi na komórkach w celu poszerzenia odczytów (np. barwienie cytometrią przepływową lub sekwencjonowanie). Ponadto można uprościć użyteczność testu, np. poprzez stworzenie zintegrowanego chipa mikroprzepływowego do tworzenia i obserwacji kropel, co potencjalnie umożliwi szersze zastosowanie poza laboratoriami bioinżynieryjnymi w warunkach klinicznych. Jeśli chodzi o analizę danych, ekstrakcję i śledzenie informacji z obrazów można rozszerzyć poprzez zwiększenie automatyzacji i wykorzystanie podejść opartych na uczeniu maszynowym, np. w celu wykrycia obecności i położenia komórki (komórek) oraz linii kulek w każdej kropli bez znakowania fluorescencyjnego. W ten sposób otworzyłoby się dodatkowe kanały fluorescencyjne, które można by wykorzystać do testów immunologicznych, co pozwoliłoby na równoległy pomiar jeszcze większej liczby cytokin.

Przedstawiony test oraz związane z nim protokoły i analizy mogą być stosowane w różnych potencjalnych przypadkach użycia związanych z dynamiką wydzielania cytokin. Dokładniej rzecz ujmując, test może potencjalnie odpowiedzieć na podstawowe pytania immunologiczne, takie jak identyfikacja profili wydzielania cytokin specyficznych dla typu komórki i aktywacji, polifunkcjonalność komórek wydzielających cytokiny lub czasowość i mechanizmy utrzymania równowagi cytokin. Co więcej, w zastosowaniach klinicznych platforma może umożliwić rozwikłanie zagadki roli cytokin podczas aktywnych lub przewlekłych reakcji zapalnych, jak zaobserwowano w przypadku COVID-19³⁰, lub zapewnić narzędzie do stratyfikacji pacjentów i personalizacji leczenia w oparciu o unikalne sygnatury, takie jak w przypadku autozapalenia³¹. Podsumowując, ilościowa ocena wydzielania cytokin przez pojedyncze komórki w czasie jest bardzo potrzebną metodą, ponieważ wyjaśnia, w jaki sposób dany lek, infekcja, zmiana genetyczna lub stymulacja ex vivo indukuje określoną odpowiedź.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
008-FluoroSurfaktant	RAN Biotechnologies	008-FluoroSurfaktant-10G
2-Strumieniowy ekspres kropelkowy skupiający przepływ, 30 i mikro; m dysza, hydrofobowa obróbka powierzchni PFOS	Chipsy
Alexa Fluor 647 NHS Ester	ThermoFisher	A20006	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html
Anty-ludzka IL-1β (Mysz monoklonalna), AF647 z oznaczeniem własnym	PeproTech	500-M01B
ARcare92524 dwustronna taśma klejąca	Adhesvies Reasearch	ARcare92524
Bio-Adembeads Streptavidin plus 300nm	Ademtech	Cat#03233
Biotynylowana koza Anti-Human IL-1β	PeproTech	500-P21BGBT
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059
Skrobak	do komórek TPP	99002
CellTrace Zestaw do proliferacji komórek fioletowych	Invitrogen	C34557	Roztwór do barwienia komórek
Chromafil Xtra Filtry strzykawkowe PTFE-45/25	Macherey-Nagel	729205
Costar 6-dołkowy przezroczysty płaski Dolna ultra-niska nasadka	Corning	3471
Countess Szkiełka komory do liczenia komórek	Invitrogen	C10283
D-Biotyna	Fluorochem	M02926
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco	14196-094
epT.I.P.S.  Standardowy 2-200 i mikro; l	Eppendorf	30000889
Roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego	Sigma-Aldrich	3690
EZ-LINK-NHS-PEG4-Biotin	ThermoFisher	A39259	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217
Odczynnik blokujący FcR, ludzki	Miltenyi Biotec	130-059-901
Surowica bydlęca	płodu Gibco	10270-106
Poręczny płyn do mycia naczyń	Migros	5.01002E+11
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080 HFE-7500
Olej 3M TM Novec	Fluorochem	B40045191
Idex F-120 Jednoczęściowe złącze, standardowe radełkowanie, naturalny PEEK, rurka o średnicy zewnętrznej 1/16", 10-32 stożek	Cole-Parmer	GZ-02014-15
Przeciwciało monoklonalne IL-6 (MQ2-13A5 - szczur), FITC	ThermoFisher	11-7069-81
Przeciwciało monoklonalne IL-6 (MQ2-39C3), biotyna	ThermoFisher	13-7068-85
Zamiennik serum do nokautu	ThermoFisher	10828-010
Loctite AA 3491 utwardzalny klej UV	Henkel AG & Co	3491
Szkiełka mikroskopowe (76x26x1mm, przezroczyste białe)	Menzel Glä ser
Lampa do oleju mineralnego	Sigma-Aldrich	330779
NanoPort Assembly Headless, 10-32 Coned, do 1/16" OD	Idex	N-333
Neodymowy magnes blokowy	K& J Magnetics	BZX082
Omnifix-F Spritze, 1 ml, LS	Braun	9161406V
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)	Gibco	15140-122
Solanka buforowana fosforanem	Sigma-Aldrich	P4417
Pluronic F-127, 0,2 &mikro; m filtrowane (10% roztwór w wodzie)	ThermoFisher	P6866
Chusteczki precyzyjne	Kimtech Science	5511
Mikrorurki PTFE 0,30 i razy; 0,76 mm	FisherScientific	1191-9445
Mikrorurki PTFE 0,56 i razy; 1,07 mm	FisherScientific	1192-9445
Rekombinowana ludzka IL-1β	Peprotech	Cat#200-01B
Rekombinowany ludzki IL-6	Peprotech	Cat#200-06
Rekombinowana ludzka albumina surowicy (HSA)	Sigma-Aldrich	A9731
Rekombinowana ludzka TNF-α	Peprotech	Cat#300-01A
Stemple do biopsji wielokrotnego użytku o średnicy 0,75 mm i 6 mm	Stiefel	504529 i 504532
RPMI 1640 Medium, bez czerwieni fenolowej	Gibco	11835-030
Standard LPS, E. coli K12	InvivoGen	tlrl-eklps
Igły Sterican 23 G do mikrorurek o średnicy 0,56 mm	FisherScientific	15351547
Igły Sterican 27 G do mikrorurek o średnicy 0,30 mm	FisherScientific	15341557
Przeciwciało monoklonalne TNF alfa (MAb11), PE	ThermoFisher	12-7349-81
Przeciwciało monoklonalne TNF-alfa (MAb1), biotynylowane we własnym zakresie	ThermoFisher	14-7348-85
Trypan Blue Stain (0,4%) do stosowania z automatycznym licznikiem komórek Countess	Invitrogen	T10282
Filtracja próżniowa "rapid"-Filtermax	TPP	99500
Urządzenia
Automatyczna maszyna do cięcia Cameo 4	Silhouette
Cetoni Base 120 + 3x Niskociśnieniowe pompy strzykawkowe NEMESYS	Cetoni	NEM-B101-03 A
Hrabina II Automatyczny licznik komórek	ThermoFisher
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny Ti2	Nikon	ECLIPSE Ti2-E, Ti2-E/B*1
OKO Klatka laboratoryjna Inkubator, ciemne panele	OKO Lab
ORCA-Fusion Cyfrowa kamera CMOS	Hammatsu	C14440
SOLA Light Engine	Lumencor	sola 80-10247