Method Article

Kwantyfikacja dendrytycznego kręgosłupa za pomocą automatycznego oprogramowania do trójwymiarowej rekonstrukcji neuronów

DOI:

10.3791/66493

⸱

September 27th, 2024

 ,  ,  , 
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, 2Colgate University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolce dendrytyczne są postsynaptycznymi przedziałami większości synaps pobudzających. Zmiany w morfologii kolców dendrytycznych występują podczas rozwoju neurologicznego, starzenia się, uczenia się oraz wielu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, co podkreśla znaczenie wiarygodnej analizy kręgosłupa dendrytycznego. Protokół ten opisuje ilościowe określanie morfologii kolców dendrytycznych w sposób dokładny i powtarzalny przy użyciu oprogramowania do automatycznej trójwymiarowej rekonstrukcji neuronów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenia synaptyczne pozwalają na wymianę i przetwarzanie informacji między neuronami. Miejsce postsynaptyczne synaps pobudzających często tworzy się na kolcach dendrytycznych. Kolce dendrytyczne to struktury cieszące się dużym zainteresowaniem w badaniach skupionych wokół plastyczności synaptycznej, rozwoju neurologicznego oraz zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych. Kolce dendrytyczne ulegają modyfikacjom strukturalnym w ciągu swojego życia, z właściwościami takimi jak całkowita liczba kolców, rozmiar kolców dendrytycznych i morfologicznie zdefiniowany podtyp zmieniający się w odpowiedzi na różne procesy. Określenie mechanizmów molekularnych regulujących te zmiany strukturalne kolców dendrytycznych opiera się na pomiarach morfologicznych. Wymaga to dokładnej i powtarzalnej analizy kolców dendrytycznych w celu dostarczenia dowodów eksperymentalnych. W niniejszym badaniu przedstawiono szczegółowy protokół kwantyfikacji i klasyfikacji dendrytycznego kręgosłupa za pomocą Neurolucida 360 (oprogramowanie do automatycznej trójwymiarowej rekonstrukcji neuronów). Protokół ten pozwala na określenie kluczowych właściwości kolców dendrytycznych, takich jak całkowita gęstość kręgosłupa, objętość głowy kręgosłupa oraz klasyfikacja do podtypów kręgosłupa, umożliwiając w ten sposób skuteczną analizę fenotypów strukturalnych kręgosłupa dendrytycznego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolce dendrytyczne to wypukłości dendrytów, często tworzące postsynaptyczne miejsce synaps glutaminergiczne1,2. Kolce dendrytyczne są szczególnie interesujące w dziedzinie plastyczności synaptycznej. Kolce są często zmieniane, gdy zmienia się siła synaptyczna, stając się większe i silniejsze w długotrwałym wzmocnieniu synaps lub mniejsze i słabsze w długotrwałej depresji synaptycznej3,4,5,6,7. Poza plastycznością synaptyczną, profil kolców dendrytycznych zmienia się przez całe życie. We wczesnym rozwoju następuje okres tworzenia i wzrostu kolców dendrytycznych, po którym następuje przycinanie kolców dendrytycznych aż do osiągnięcia stanu ustalonego8,9,10. W starzejącym się mózgu utrata kręgosłupa towarzyszy kurczeniu się mózgu i pogorszeniu funkcji poznawczych11. Ponadto wiele zaburzeń neurologicznych, neurodegeneracyjnych i psychiatrycznych charakteryzuje się nieprawidłowymi kolcami dendrytycznymi. Wiele obszarów mózgu u osób dotkniętych schizofrenią ma mniej kolców dendrytycznych, co prawdopodobnie wynika ze zmienionego przycinania synaptycznego12. Zaburzenia ze spektrum autyzmu charakteryzują się również dendrytycznymi patologiami kręgosłupa13. Dendrytyczny ubytek kręgosłupa jest cechą charakterystyczną zarówno choroby Alzheimera, jak i Parkinsona14,15. Biorąc pod uwagę szeroki zakres tematów badawczych obejmujących badania nad właściwościami kolców dendrytycznych, techniki dokładnej kwantyfikacji kręgosłupa mają ogromne znaczenie.

Barwienie, tj. metoda Golgiego, lub znakowanie neuronów za pomocą wypełniania barwnikiem lub ekspresji białek fluorescencyjnych są powszechnymi metodami wizualizacji kręgosłupa dendrytycznego16,17,18. Po wizualizacji grzbiety mogą być analizowane za pomocą różnych bezpłatnych i dostępnych na rynku programów klienckich. Pożądany wynik analizy jest ważnym czynnikiem decydującym o tym, które oprogramowanie będzie najbardziej przydatne. Fidżi jest realną opcją oprogramowania dla pytań skoncentrowanych wokół gęstości kolców dendrytycznych. Jednak ta technika w dużej mierze opiera się na czasochłonnym ręcznym liczeniu, które może wprowadzić potencjał do błędu systematycznego. Nowe wtyczki, takie jak SpineJ, pozwalają na automatyczną kwantyfikację, dodatkowo pozwalając na dokładniejszą analizę szyi kręgosłupa19. Wadą tych podejść jest utrata trójwymiarowej analizy do określenia objętości kręgosłupa, ponieważ SpineJ jest ograniczony do dwuwymiarowych stosów obrazów. Ponadto uzyskanie informacji o podtypach kręgosłupa staje się wyzwaniem w wyniku tych procesów. Cztery dominujące podtypy kręgosłupa, cienki, grzybowy, przysadzisty i filopodia, kojarzą się z indywidualnymi funkcjami i są w dużej mierze klasyfikowane za pomocą morfologii20. Cienkie kolce charakteryzują się wydłużoną szyją i zdefiniowaną głową21. Kolce grzybów mają znacznie większy i wyraźny grzbiet head22. Krótkie kolce są krótkie i mają niewielką różnicę między głową a szyją23. Filopodia to niedojrzałe kolce z długą, cienką szyją i bez wyraźnie widocznej głowy24. Podczas gdy klasyfikacja dostarcza cennych informacji, kolce istnieją w kontinuum wymiarów. Klasyfikacja na kategorie opiera się na zakresach pomiarów morfologicznych25,26. Ręczny pomiar kolców w celu klasyfikacji zwiększa obciążenie logistyczne dla badaczy w tym podejściu.

Inne opcje oprogramowania skupiające się konkretnie na trójwymiarowej analizie kręgosłupa dendrytycznego są lepiej odpowiednie do badań nad objętością kręgosłupa i właściwościami podtypów27,28,29,30,31. Pomimo trudności związanych z analizą trójwymiarową, takich jak słaba rozdzielczość płaszczyzny Z i rozmazy, te opcje oprogramowania pozwalają na niezawodną trójwymiarową rekonstrukcję dendrytów i kolców dendrytycznych w sposób półautomatyczny kierowany przez użytkownika. Automatyczna klasyfikacja zidentyfikowanych kolców do ich podtypów jest również funkcją obecną w niektórych z tych pakietów oprogramowania do analizy kręgosłupa. Może to złagodzić obawy związane z potencjalnym obciążeniem pracą i błędem systematycznym. Neurolucida 360 to jedno z dostępnych na rynku programów pozwalających na wiarygodną i powtarzalną trójwymiarową identyfikację i klasyfikację kolców dendrytycznych 32. Tutaj przedstawiamy kompleksowy protokół skutecznego przygotowania utrwalonej tkanki, pozyskiwania obrazów, a ostatecznie ilościowego określania i klasyfikacji kolców dendrytycznych za pomocą tego oprogramowania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z wytycznymi amerykańskiego Narodowego Instytutu Zdrowia (National Institutes of Health) dotyczącymi wykorzystywania zwierząt w badaniach wewnętrznych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego.

1. Przygotowanie stałych plastrów hipokampa

  1. Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy/ksylazyny (ketamina: 100 mg/kg; Ksylazyna: 8 mg/kg). Zweryfikuj znieczulenie za pomocą uszczypnięcia ogona i przymocuj mysz do płytki perfuzyjnej.
  2. Za pomocą dużych nożyczek chirurgicznych usuń skórę i sierść z klatki piersiowej, co ułatwia wizualizację leżącej pod spodem klatki piersiowej.
  3. Wykonaj poziome cięcie poniżej szerokości klatki piersiowej, omijając wątrobę i przeponę. Za pomocą cienkich kleszczy pociągnij wyrostek mieczykowaty do góry i odetnij każdą boczną stronę klatki piersiowej. Podnieś klatkę piersiową do okolicy szyi i zaciśnij na miejscu za pomocą kleszczy do hemostatów.
  4. Włóż igłę motylkową 21 G do lewej komory serca i rozpocznij perfuzję w temperaturze pokojowej 1x PBS przy około 5 ml / min. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku za pomocą małych nożyczek chirurgicznych. Perfuzję z PBS do momentu, gdy roztwór opuszczający przedsionek będzie klarowny.
  5. Wyłącz pompę perfuzyjną, aby upewnić się, że do rurki nie dostały się pęcherzyki. Umieść rurkę z PBS w lodowatym 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS. Perfuzję z PFA z szybkością 5 ml/min, aż zwierzę całkowicie zesztywnieje, około 25 ml.
    UWAGA: Upewnij się, że PFA jest świeży (nie starszy niż 1 tydzień, jeśli materiał jest przechowywany w temperaturze 4°C), aby zapewnić optymalne utrwalenie.
  6. Usuń skórę z powierzchni czaszki małymi nożyczkami chirurgicznymi. Wykonaj cięcie śródstrzałkowe małymi nożyczkami chirurgicznymi wzdłuż centralnej szczeliny czaszki. Wykonuj boczne nacięcia rostralnie do opuszki węchowej i nad móżdżkiem.
  7. Otwórz czaszkę cienkimi kleszczami, aby odsłonić mózg. Za pomocą szpatułki delikatnie wyjmij mózg z opuszki węchowej i umieść na noc w 4% PFA w PBS.
    UWAGA: Aby uzyskać bardziej wyczerpujący protokół perfuzji gryzoni, zapoznaj się z Gage et al.33.
  8. Krioprotekcjonuj utrwalony mózg, zastępując 4% PFA 15% sacharozą w PBS przez 1 dzień. Następnie zastąp 15% sacharozy 30% sacharozą w roztworze PBS na 1 dzień, aż mózg zatonie w roztworze.
  9. Wyjmij mózg z roztworu sacharozy i umieść go na szalce Petriego z PBS. Odetnij móżdżek i opuszkę węchową za pomocą ostrza skalpela.
  10. Umieść niewielką ilość związku o średnicy 1-2 cm (OCT) na powierzchni uchwytu próbki. Zamontuj mózg koronalnie do uchwytu próbki za pomocą ogonowej powierzchni cięcia w OCT. Szybko zamroź mózg, umieszczając uchwyt na próbkę w sproszkowanym suchym lodzie do widocznego zamrożenia, około 5-7 minut.
  11. Upewnij się, że kąt ostrza kriostatu jest ustawiony w zakresie od 0° do 5°, aby uzyskać jednolite sekcje. Dostosuj kąt płyty rolki, aby uzyskać optymalne spłaszczenie plastra. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w instrukcji obsługi sprzętu.
  12. Umieść uchwyt na próbkę w kriostacie tak, aby brzuszna powierzchnia mózgu znajdowała się najbliżej ostrza. Pokrój mózg na 30 μm grzbietowe odcinki hipokampa, odrzucając wszystkie plasterki rostralne do hipokampa.
    UWAGA: Ta część protokołu może być dostosowana do dowolnego wybranego obszaru mózgu. Kroki 1.9-1.12 będą się zmieniać w zależności od regionu zainteresowania.
  13. Przenieś grzbietowe plastry hipokampa do PBS. Za pomocą pędzla delikatnie zamontuj sekcje hipokampa na szkiełku mikroskopowym. Usuń nadmiar roztworu za pomocą bawełnianych wacików lub delikatnych chusteczek do zadań.
  14. Nanieść 100 μl twardego podłoża mocującego na szkiełko mikroskopowe pokrywające wszystkie wycinki mózgu. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków, powoli opuść szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy na podłoże montażowe. Jeśli utworzą się bąbelki, delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe kleszczami, aby umożliwić im ucieczkę. Pozwól slajdom zastygnąć przez noc przed obrazowaniem.

2. Obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości

  1. Używaj okularów o małym powiększeniu, aby zidentyfikować komórki fluorescencyjne. Przełącz się na obiektyw 63x (NA = 1.4) lub wyższy, nakładając odpowiedni medium immersyjne na obiektyw.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 63x lub większym.
  2. Zidentyfikuj dobrze oznaczone segmenty dendrytyczne z ograniczonym nakładaniem się na siebie w celu uzyskania obrazu. Ustaw moc lasera i wzmocnienie, aby upewnić się, że dendryty fluorescencyjne nie są nasycone. Ponadto zmniejszenie prędkości skanowania może zapewnić lepszą rozdzielczość obrazu.
  3. Zdobądź stosy z obejmujące pełne segmenty dendrytyczne do przyszłej analizy. Stosy Z większe niż 10 μm są niepożądane ze względu na dodatkowy potencjał nakładania się dendrytycznego w płaszczyźnie z.
    UWAGA: Użyj najmniejszego dostępnego rozmiaru kroku Z (0,2-0,7 μm) i 1 przewiewnego rozmiaru otworka. Mniejszy rozmiar kroku skutkuje większą liczbą obrazów w stosie z, co kompensuje ograniczoną rozdzielczość Z w wielu mikroskopach.
  4. Opcjonalnie: Jeśli to możliwe, wykorzystaj odpowiednią funkcję oprogramowania do dekonwolucji mikroskopu, aby zdekonwoluować obrazy. Pozwoli to na uzyskanie obrazów o wyższej rozdzielczości.

3. Kwantyfikacja kręgosłupa dendrytycznego

  1. Otwórz Neurolucida 360 (wersja 2022.1.1 lub nowsza). Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy kręgosłupa (Plik > Otwórz > obrazie). Upewnij się, że plik obrazu jest widoczny w oknie głównym i środowisku 3D. Jeśli okno środowiska 3D nie zostanie wyświetlone, kliknij lewym przyciskiem myszy Środowisko 3D na górnym pasku narzędzi okna głównego w zakładce Śledzenie (Rysunek uzupełniający 1)
    UWAGA: Ta sekcja protokołu może być dostosowana do dowolnych obrazów dendrytycznych, nie tylko dendrytów z tkanek myszy.
  2. Na karcie Zmienianie wyświetlania obrazu w oknie Środowisko 3D upewnij się, że obraz jest wyświetlany jako wolumin 3D w polu Wyświetl obraz jako. W polu Image Stack Settings (Ustawienia stosu obrazów) na karcie Image (Obraz) wybierz opcję Max Projection (Maksymalna projekcja) z menu rozwijanego Show Surface (Pokaż powierzchnię jako). (Rysunek uzupełniający 2)
  3. Zidentyfikuj odpowiedni segment dendrytyczny do śledzenia.
    1. Kliknij lewym przyciskiem myszy narzędzie Przesuń punkt obrotu na górnym pasku narzędzi okna Środowisko 3D. Kliknij lewym przyciskiem myszy żądany dendryt, aby ustawić nowy punkt obrotu. Spowoduje to zmianę orientacji, aby umożliwić efektywne powiększanie.
    2. Przywróć pierwotną orientację, klikając lewym przyciskiem myszy ikonę Resetuj orientację. Po ustawieniu punktu obrotu kliknij lewym przyciskiem myszy narzędzie Przesuń punkt obrotu, aby rozpocząć śledzenie dendrytu. (Rysunek uzupełniający 2).
      UWAGA: Idealny dendryt to taki, który w ograniczonym stopniu nakłada się na inne dendryty w dowolnej płaszczyźnie współrzędnych i nie przecina się z innym dendrytem lub jest powierzchowny do innego pod spodem. Dendryty znajdujące się w niewielkiej odległości od innych w płaszczyźnie XY są również preferowane, aby zapobiec niewłaściwemu przypisaniu sąsiednich kolców do śledzonego dendrytu. Należy również zauważyć, że dendryty o różnych grubościach, rzędach i odległościach od somy mają różną gęstość kolców dendrytycznych34,35. Należy to uwzględnić w projekcie eksperymentalnym. Dendryty drugiego rzędu o grubości <1,5 μm są idealnymi kandydatami do śledzenia (Rysunek 1).
  4. Kliknij lewym przyciskiem myszy kartę Drzewo w oknie Środowisko 3D. Kliknij lewym przyciskiem myszy pozycję Wskazówki użytkownika dla trybu śledzenia i Jądra kierunkowe jako metodę w opcjach śledzenia kierowanego przez użytkownika.
  5. Kliknij lewym przyciskiem myszy na dendrycie, gdy pojawi się okrągłe jądro, aby rozpocząć śledzenie. Przesuń kursor wzdłuż segmentu dendrytycznego. Spowoduje to automatyczne wypełnienie jąder. Jeśli jądra nie są wypełniane automatycznie, zobacz krok 3.51.
    1. Delikatnie przesuwaj kursor w przód iw tył na dendrycie, aż ziarna się zapełnią. Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zachować istniejące wykryte jądra. Jeśli jądra przestaną się zapełniać, kliknij lewym przyciskiem myszy, gdy jądro wypełni się w dalszej części dendrytu, aby umieścić je ręcznie. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć śledzenie. Upewnij się, że narysowany dendryt ma długość co najmniej 7 μm (rysunek uzupełniający 3).
  6. Sprawdź dokładność śledzenia dendrytycznego we wszystkich trzech kierunkach środowiska 3D: pochyleniu, odchyleniu i przechyleniu, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając okno Środowisko 3D. Zidentyfikuj punkty, w których ślad dendrytyczny znajduje się poza odpowiednim miejscem na dendrycie. Mogą wystąpić przypadki, w których wygląda na dokładnie prześledzony od góry do dołu, ale w wymiarze z punkty nie znajdują się na dendrycie (Rysunek 2).
  7. Aby poprawić nieprawidłowo obrysowane segmenty dendrytyczne, kliknij lewym przyciskiem myszy kartę Edycja w menu Drzewo. Kliknij lewym przyciskiem myszy interesujący Cię dendryt, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy pozycję Punkty.
  8. Przesuń nieprawidłowo umieszczone punkty z powrotem na segment dendrytu za pomocą kliknięcia i przeciągnięcia. Usuń zbędne punkty, klikając je lewym przyciskiem myszy i klikając przycisk Usuń. Zmień rozmiar punktów, jeśli dendryt nie jest odpowiednio wypełniony. Aby zmienić rozmiar punktu, kliknij go lewym przyciskiem myszy i dostosuj suwak grubości, aby zmienić rozmiar (Rysunek uzupełniający 4).
    UWAGA: Nieodpowiednio wypełnione dendryty mogą skutkować identyfikacją fałszywych kolców, które są składnikami segmentu dendrytycznego. I odwrotnie, przepełnienie dendrytów może zasłaniać prawdziwe kolce.
  9. Powtórz kroki 3.3-3.8 dla wielu dendrytów na obrazie, zanim przejdziesz do identyfikacji kręgosłupa w kroku 3.10.
  10. Kliknij lewym przyciskiem myszy kartę Grzbiet w oknie Środowisko 3D. Ustaw ustawienia wykrywania dla zasięgu zewnętrznego, minimalnej wysokości i minimalnej liczby wokseli. W zależności od przygotowania, zadane wartości mogą wymagać zmiany w przypadku jasnego i konkretnego uzasadnienia zmian. Wstępnie ustawione warunki to: Zakres zewnętrzny: 2,5 μm, Minimalna wysokość: 0,3 μm, Minimalna liczba wokseli: 10 wokseli.
    UWAGA: Różne preparaty, takie jak hodowle komórkowe i ostre tkanki, a także różne punkty czasowe rozwoju będą wymagały różnych kryteriów, które muszą być wyprowadzone z istniejącej literatury. Należy również pamiętać, że zmiana ustawień wykrywania może znacznie zmienić wyniki. Na przykład wyższa minimalna wysokość może wykluczyć krótkie kolce. Ustawienia wykrywania muszą być spójne przez cały czas trwania eksperymentu.
  11. Ustaw czułość detektora na 70% i kliknij lewym przyciskiem myszy Wykryj wszystko. Spowoduje to wypełnienie kolców zidentyfikowanych przez czułość tego detektora na wszystkich dendrytach. Jeśli pożądane jest wybranie kolców w sposób specyficzny dla dendrytu, kliknij lewym przyciskiem myszy pole Kliknij obraz, aby wykryć wszystko na najbliższej gałęzi, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy każdy dendryt ręcznie z różnymi czułościami detektora.
    UWAGA: Na tym etapie normalne jest, że nie wszystkie kolce dendrytyczne zostaną zasiedlone. Podobnie, nie-kolce mogą nieprawidłowo się zapełniać. Początkowa czułość 70% jest również elastyczna; Może się to zmienić w zależności od przygotowania.
  12. Zbadaj kolce wybrane przez tę czułość detektora, klikając i przeciągając dendryt we wszystkich trzech kierunkach. Jeśli większość wykrytych kolców nie jest w pełni wypełniona, przejdź do kroku 3.12.1. Jeśli wykryte kolce są przepełnione, przejdź do kroku 3.12.2. Jeśli wykryte kolce wydają się być odpowiednio wypełnione, przejdź do kroku 3.13.
    1. Zwiększ czułość detektora o 5%-10% i ponownie kliknij lewym przyciskiem myszy Wykryj wszystko. Spowoduje to zastąpienie wszystkich wcześniej wykrytych kolców nowymi o wyższej czułości. Powtarzaj w razie potrzeby, aż wykryte kolce zostaną odpowiednio wypełnione.
    2. Zmniejsz czułość detektora o 5%-10% i ponownie kliknij lewym przyciskiem myszy Wykryj wszystko. Spowoduje to zastąpienie wszystkich wcześniej wykrytych kolców nowymi o niższej czułości . Powtarzaj w razie potrzeby, aż wykryte kolce zostaną odpowiednio wypełnione.
  13. Kliknij lewym przyciskiem myszy opcję Zachowaj istniejące grzbiety na karcie Grzbiet w środowisku 3D. Jeśli wybrano opcję Kliknij obraz, aby wykryć wszystko w najbliższej gałęzi, usuń jej zaznaczenie.
    UWAGA: Zaznaczenie opcji Zachowaj istniejące kolce gwarantuje, że ręczna identyfikacja nowo zidentyfikowanych kolców dendrytycznych nie zastąpi poprzednio zidentyfikowanych kolców. Upewnij się, że to pole jest zaznaczone przed kontynuowaniem, aby nie nadpisać poprzedniej pracy.
  14. Kliknij lewym przyciskiem myszy Przesuń punkt obrotu i kliknij lewym przyciskiem myszy dendryt wymagający dalszego wykrywania kręgosłupa, aby ustawić punkt obrotu.
    1. Usuń zaznaczenie opcji Przesuń punkt obrotu. Zidentyfikuj niewypełniony kręgosłup dendrytyczny. Zwiększ czułość detektora o 10%-20% w stosunku do poprzedniego wykrywania i kliknij lewym przyciskiem myszy na grzbiecie. Jeśli wykryty kręgosłup jest niedopełniony lub przepełniony, przejdź do kroku 3.14.3 lub 3.14.4. Jeśli grzbiet nie zostanie wypełniony, pojawi się komunikat Nie można wykryć grzbietu w wybranej lokalizacji. W takim przypadku przejdź do kroku 3.14.2.
    2. Zwiększaj czułość detektora stopniowo, możliwie powyżej 100%, aż kręgosłup zostanie wykryty i odpowiednio wypełniony. Jeśli kręgosłup zostanie wykryty, ale nie jest odpowiednio wypełniony, przejdź do kroku 3.14.3. Jeśli grzbiet jest przepełniony, przejdź do kroku 3.14.4 (Rysunek 3).
    3. Kliknij lewym przyciskiem myszy zakładkę Edytuj i kliknij lewym przyciskiem myszy niedopełniony grzbiet. Kliknij lewym przyciskiem myszy Usuń. Usuń zaznaczenie karty Edycja. Zwiększ czułość o 5%-10% i kliknij lewym przyciskiem myszy na kręgosłupie. Powtórz ten krok, jeśli kręgosłup jest nadal niedopełniony.
    4. Kliknij lewym przyciskiem myszy kartę Edytuj i kliknij lewym przyciskiem myszy przepełniony grzbiet. Kliknij lewym przyciskiem myszy Usuń. Usuń zaznaczenie karty Edycja. Zmniejsz czułość o 5%-10% i kliknij na grzbiet. Powtórz ten krok, jeśli kręgosłup jest nadal przepełniony.
  15. Powtarzać kroki 3.14–3.14.4 aż do momentu wykrycia wszystkich kolców zidentyfikowanych za pomocą identyfikacji wizualnej. Dokładnie sprawdź dendryt pod kątem kolców należących do sąsiednich dendrytów, fałszywych kolców odpowiadających żadnemu prawdziwemu sygnałowi lub potencjalnych segmentów dendrytu błędnie oznaczonych jako kręgosłup. Usuń te fałszywe kolce za pomocą funkcji Remove.
  16. Zbadaj zidentyfikowane kolce na dendrycie. W niektórych przypadkach wiele kolców może wyglądać jak jeden kręgosłup konglomeratowy. Jeśli wydaje się, że grzbiet obejmuje dwa, kliknij lewym przyciskiem myszy kartę Edycja. Kliknij lewym przyciskiem myszy grzbiet i kliknij lewym przyciskiem myszy Ukryj zaznaczenie. Po potwierdzeniu grzbietu konglomeratu, na karcie Edycja kliknij lewym przyciskiem myszy Pokaż zaznaczenie i wybierz Podziel. Jeśli w jednym konglomeracie znajdują się więcej niż dwa kolce, może być konieczne powtórzenie tego kroku (Rysunek 4).
    UWAGA: Jeśli grzbiet konglomeratu nie pęknie po kroku 3.16, usuń grzbiet . Następnie wybierz bardziej intensywny grzbiet konglomeratu o niższej czułości. Po wypełnieniu bardziej intensywnego grzbietu zwiększ czułość, aby wybrać drugi niewypełniony kręgosłup. Alternatywnie, usunięcie grzbietu konglomeratu, a następnie zwiększenie czułości może pozwolić na prawidłowe rozszczepienie.
  17. Po wykryciu i odpowiednim wypełnieniu wszystkich wizualnie rozpoznawalnych kolców, na karcie Grzbiet kliknij lewym przyciskiem myszy Klasyfikuj wszystko, aby sklasyfikować kolce na cztery podtypy: cienkie, grzybowe, przysadziste i filopodia (Rysunek 5).
    UWAGA: Parametry klasyfikacji kręgosłupa można zmienić w oknie Ustawienia w polu Klasyfikacja w zakładce Kręgosłup. Podobnie jak w przypadku ustawień detektora, zdecydowanie zaleca się jasne uzasadnienie zmiany istniejących parametrów. Wstępnie ustawione wartości to stosunek głowy do szyi: 1,1, stosunek długości do głowy: 2,5, rozmiar główki grzyba: 0,35 μm, długość Filopodium - 3 μm.
  18. Na górnym pasku narzędzi okna Środowisko 3D wybierz Zapisz i wyświetl w Neurolucida Explorer. Neurolucida Explorer to miejsce, w którym zbierane są dane ze śledzenia. Praca zostanie zapisana jako plik .dat zawierający wszystkie kalki i grzbiety.
  19. W oknie Eksploratora na karcie Widok kliknij lewym przyciskiem myszy Zaznacz wszystko, aby podświetlić wszystkie dendryty i kolce.
  20. Kliknij lewym przyciskiem myszy kartę Analizuj na górnym pasku narzędzi. Kliknij lewym przyciskiem myszy menu rozwijane Struktura. Kliknij lewym przyciskiem myszy Analiza struktury rozgałęzionej.
  21. W zależności od interesujących zmiennych można wybrać dowolną z analiz. Dwa najbardziej przydatne pytania dotyczące gęstości grzbietu i średniej objętości kręgosłupa to Każde drzewo > Każdy dendryt oraz Kolce > Szczegóły kręgosłupa. Wybierz przycisk OK, a dane pojawią się w dwóch oddzielnych oknach.
  22. Skopiuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej kompilacji i analizy.
    UWAGA: Poszczególne drzewa zostaną oddzielone dendrytem, ale objętość grzbietu nie będzie. Korzystając z funkcji sortowania w arkuszu kalkulacyjnym, szczegóły grzbietu można filtrować według cech.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efektywne wykorzystanie tej metody analizy zaczyna się od wyboru segmentów dendrytycznych do śledzenia. Jak opisano w Rysunek 1, idealne dendryty do śledzenia nie znajdują się w bliskiej odległości od innych dendrytów. Dendryty biegnące równolegle mogą powodować nieprawidłową identyfikację kolców z sąsiedniego dendrytu. Dendryty przecinające się lub biegnące prostopadle w innej płaszczyźnie z również znacznie utrudniają dokładne śledzenie dendrytyczne. Ważne jest również, aby zwrócić uwagę na różnice w grubości dendrytów. Jak już wcześniej informowaliśmy, istnieją kluczowe różnice w gęstości grzbietu z dendrytami o różnej grubości36. Mogą również występować różnice w tym samym dendrycie ze zwiększoną odległością od punktu rozgałęzienia37. Śledzenie dendrytów o tym samym rzędzie i grubości, najlepiej o podobnym początku rozgałęzienia, może kontrolować istniejącą niejednorodność gęstości kolców dendrytycznych. Identyfikacja punktu rozgałęzienia w niektórych preparatach może okazać się niewykonalna, ale grubość dendrytu powinna zawsze być kontrolowanym czynnikiem w śledzeniu dendrytów. Dokładne śledzenie segmentów dendrytycznych ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych wyników tej analizy. Konieczne jest upewnienie się, że wszystkie punkty śledzonego dendrytu rzeczywiście znajdują się w dendrycie. Oglądanie trójwymiarowego dendrytu z różnych kierunków może pomóc w tym procesie. Jak pokazano w Rysunek 2A,B, widok z góry pokazuje coś, co wydaje się być prawidłowo narysowanym dendrytem. W widoku z boku; Jednak wiele punktów nie znajduje się na samym dendrycie. Te problemy nie występują w widoku z boku Rysunek 2C. Ważne jest również, aby upewnić się, że dendryty są prawidłowo wypełnione podczas śledzenia. Niedostatecznie wypełniony dendryt może spowodować, że kawałki dendrytów zostaną niewłaściwie zidentyfikowane jako kolce. Przepełniony dendryt może uniemożliwić identyfikację prawdziwych kolców ze względu na próg minimalnej wysokości. Ta ręczna ocena śledzenia kierowanego przez użytkownika ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia dokładnej analizy kolców dendrytycznych.

Identyfikacja kolców dendrytycznych również wymaga podejścia kierowanego przez użytkownika. Korzystanie z funkcji "Wykryj wszystko" w celu ustawienia jednolitego progu czułości detektora jest niewystarczające z wielu powodów. Korzystanie z funkcji "Wykryj wszystko" jest przydatne do identyfikacji najbardziej rażąco oczywistych kolców, ale wypełnienie tych kolców musi zostać sprawdzone w celu weryfikacji. Zidentyfikowane kolce z początkowym napisem "Wykryj wszystko" mogą być niedopełnione. Aby to skorygować, zidentyfikowany kręgosłup musi zostać indywidualnie usunięty, a następnie ponownie zidentyfikowany ręcznie z wyższą czułością detektora (Rysunek 3A-C). Dzięki temu ma pewność, że kręgosłup jest odpowiednio wypełniony. Istnieje znaczna niejednorodność wymaganej czułości detektora dla kolców, którą należy uwzględnić ręcznie. Zwiększenie czułości detektora w celu wykrycia wszystkich może skutkować nadmiernie wypełnionymi kolcami, które również wymagają ręcznej korekty (Rysunek 3D). Dodatkowym problemem związanym z niewłaściwą czułością detektora jest niewłaściwe utworzenie grzbietu konglomeratowego, jednego wypełnionego kręgosłupa dendrytycznego, który obejmuje wiele kolców. Dwa kolce znajdujące się w bliskiej odległości od siebie mogą być nieprawidłowo połączone w jeden kręgosłup konglomeratowy (Rysunek 4A,B). Oprogramowanie do wykrywania kręgosłupa ma funkcję "Split", która może być używana do oddzielania kolców, które zostały połączone przez przepełnienie. Funkcja "Split" pozwala na łatwe wygenerowanie pojedynczych kolców z grzbietu konglomeratu (Rysunek 4C). Dokładne śledzenie dendrytów i dendrytyczne wypełnienie kolców pozwala na dokładną klasyfikację do podtypów kręgosłupa. Klasyfikacja kręgosłupa opiera się na morfologii na podstawie wypełnionych kolców i odległości od dendrytów, więc każdy krok w procesie odgrywa rolę w klasyfikacji morfologicznej (Ryc. 5).

Ze względu na konieczność ręcznego wyboru i progowania, kluczowe jest przestrzeganie jednolitego standardu dla wszystkich analiz. Jest to szczególnie istotne, jeśli wielu użytkowników przyczynia się do analizy danych. Aby upewnić się, że wszyscy badacze przeprowadzający analizę przestrzegają tego samego standardu, badacze powinni porównać dane z tych samych śledzonych dendrytów. Może to zmniejszyć ryzyko stronniczości eksperymentatora poprzez zapewnienie, że każdy badacz identyfikuje kolce na podstawie wspólnych, jednolitych kryteriów w ślepy sposób. Istnieje również możliwość stronniczości ze strony jednego badacza między dniami lub nawet tego samego dnia z powodu zmęczenia. Powinno to być monitorowane przez cały proces analizy danych. Aby jeszcze bardziej zapewnić wiarygodność analizy, porównanie wstępnych wyników z tymi opublikowanymi w literaturze gwarantuje, że protokół jest skutecznie przestrzegany. Należy zauważyć, że to porównanie będzie skuteczne tylko wtedy, gdy preparat i parametry będą wspólne. Różnice w barwieniu, pozyskiwaniu sygnałów fluorescencyjnych, kolejności i grubości dendrytów lub regionie mózgu mogą przyczyniać się do różnych wyników8,36. W przypadku braku opublikowanych wyników, wykorzystanie wielu badaczy do walidacji identyfikacji kręgosłupa pozwala na zwiększenie pewności co do wiarygodności i odtwarzalności analizy. Do niniejszego manuskryptu dołączono folder z analizą uzupełniającą. Ten folder zawiera pliki z przykładowymi obrazami segmentów dendrytycznych, dendrytów śledzonych, dendrytów śledzonych ze zidentyfikowanymi i sklasyfikowanymi kolcami oraz danych wyjściowych (tabela uzupełniająca 1, plik uzupełniający 1, plik uzupełniający 2, plik uzupełniający 3 i plik uzupełniający 4). Nowi użytkownicy mogą trenować na tym zestawie danych, aby ćwiczyć procedury opisane w tym dokumencie. Wyniki wygenerowane przez użytkownika w obrębie 10% dostarczonego przykładowego zestawu danych są uważane za dopuszczalne do odtworzenia standardu analizy. Ze względu na potencjalnie subiektywne kryteria w pełni wypełnionego kręgosłupa i potrzebę ręcznego badania automatycznie wykrywanych kolców, wariancja między badaczami i w ich obrębie jest normalną częścią analizy. Jeżeli uzyskane wyniki przekroczą ten próg; Należy jednak przeprowadzić porównanie obok siebie w celu określenia przypadków różnych objętości kręgosłupa, a także nieprawidłowo włączonych lub wykluczonych kolców. Przykładowy zestaw danych można następnie ponownie przeanalizować, aż do osiągnięcia akceptowalnego progu.

figure-results-1
Rysunek 1: Wybór dendrytów do analizy kolców dendrytycznych. (A) Wyświetlanie objętości 3D obrazów konfokalnych stosu z proksymalnych dendrytów CA1 w linii myszy transgenicznych THY1-YFP. Zwróć uwagę na niejednorodność rzędu dendrytów z grubszymi dendrytami pierwotnymi w niebieskich owalanach i cieńszymi, drugorzędowymi i trzeciorzędowymi dendrytami w różowych owaliści. (B) Idealni kandydaci do śledzenia dendrytów są oznaczeni zielonymi owalami. Zwróć uwagę na grubość i ograniczone przecięcia, nakładanie się i bliskość innych dendrytów. Czerwony owal oznacza segmenty dendrytyczne, których należy unikać przy śledzeniu dendrytycznym ze względu na wysokie skrzyżowania, nakładanie się i bliskość innych dendrytów. Grubsze, pierwotne dendryty również nie nadają się do śledzenia. Podziałka = 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Dokładne śledzenie segmentów dendrytycznych. (A) Wyświetlanie objętości 3D obrazów konfokalnych stosu z osi Z pobranych z proksymalnych dendrytów CA1 w transgenicznej linii myszy THY1-YFP, które mają być śledzone za pomocą metody jądra kierunkowego kierowanego przez użytkownika. Podziałka liniowa = 10 μm. (B) Przykład słabego śledzenia dendrytów. Wydaje się, że dendryt jest prawidłowo śledzony w widoku z góry na dół. Widok z boku pokazuje, że dendryt jest nieprawidłowo wypełniony punktami odbiegającymi od dendrytu. (C) Przykład prawidłowego śledzenia dendrytów. Widok z góry wygląda podobnie do widoku B, ale widok z boku znacznie się różni. Dendryt w C jest prawidłowo śledzony, na co wskazuje pełne wypełnienie bez odchyleń od dendrytu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Dokładne wypełnianie kolców dendrytycznych za pomocą ręcznego wyboru. (A) Wyświetlanie objętości 3D obrazów konfokalnych stosu z proksymalnych dendrytów CA1 w linii myszy transgenicznej THY1-YFP kręgosłupa oczekującego na ręczne wykrycie. Podziałka = 0,5 μm. (B) Przykład niedopełnionego grzbietu dendrytycznego. Z powodu niepełnego napełnienia nadal widoczny jest znaczny sygnał fluorescencyjny. (C) Przykład prawidłowo wypełnionego grzbietu dendrytycznego. Obecność "korony" sygnału, ledwo widocznej na zewnątrz wypełnienia, jest standardem w dokładnym wypełnianiu kolców dendrytycznych. (D) Przykład przepełnionego grzbietu dendrytycznego. Czułość detektora jest zbyt wysoka, co skutkuje przepełnionym kręgosłupem. Wypełnienie wyszło poza granice fluorescencji i ma prawie niewyczuwalną koronę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Rozdzielanie kolców dendrytycznych konglomeratu. (A) Wyświetlanie objętości 3D obrazów konfokalnych stosu z z, wykonanych z proksymalnych dendrytów CA1 w linii myszy transgenicznej THY1-YFP z dwoma kolcami w bliskiej odległości. Podziałka = 0,15 μm. (B) Przykład dwóch niezależnych kolców nieprawidłowo wypełnionych jako jeden konglomeratowy grzbiet dendrytyczny. (C) Po zastosowaniu funkcji "Split", grzbiet konglomeratu jest dzielony na dwa odrębne, prawidłowo wypełnione kolce dendrytyczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Identyfikacja i klasyfikacja kolców dendrytycznych do podtypów. (A) Wyświetlanie 3D objętości obrazów konfokalnych stosu z proksymalnych dendrytów CA1 w transgenicznej linii myszy THY1-YFP wyizolowanego segmentu dendrytycznego w celu kwantyfikacji i klasyfikacji kolców dendrytycznych. Podziałka = 5 μm. (B) Śledzony segment dendrytyczny ze wszystkimi kolcami dendrytycznymi zidentyfikowanymi i zbadanymi w celu zapewnienia prawidłowego wypełnienia i rozszczepienia. Na tym etapie oprogramowanie arbitralnie przypisuje kolory zidentyfikowanym kolcom. (C) Klasyfikacja wszystkich zidentyfikowanych kolców dendrytycznych na podtypy za pomocą zdefiniowanych parametrów w oprogramowaniu. Niebieski = grzyb, żółty = cienki, a zielony = przysadzisty. Filopodia nie są obecne ze względu na wiek tej tkanki. (D) Reprezentatywne obrazy grzybów, cienkich i przysadzistych kolców niewypełnionych (na górze) i wypełnionych (na dole). Podziałka = 0,3 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Dostęp do środowiska 3D. Stos Z obrazów konfokalnych wyświetlanych w interfejsie oprogramowania. Nawigacja w środowisku 3D z zakładki Śledzenie w głównej przeglądarce została podświetlona na żółto. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Parametry obrazu i ustawienia orientacji dla środowiska 3D. Przeglądarka środowiska 3D dla konfokalnych obrazów z-stack. Parametry na wyróżnionej karcie Zmień wyświetlanie obrazu, oznaczone żółtymi strzałkami, są ustawione na Wyświetl obraz jako: objętość 3D i Pokaż powierzchnię jako: Maksymalna projekcja. Przesuń punkt obrotu i zresetuj orientację są oznaczone żółtymi strzałkami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Śledzenie segmentów dendrytów. (A) Objętość 3D obrazów konfokalnych stosu z dla śledzenia dendrytów. Po wybraniu zakładki drzewa, jąder kierowanych przez użytkownika i kierunkowych, śledzenie rozpoczyna się od umieszczenia początkowego jądra na dendrycie za pomocą lewego przycisku myszy. (B) Propagacja kierunkowych jąder w dół dendrytu po ruchu kursora. (C) Kliknięcie lewym przyciskiem myszy w dalszej części dendrytu wypełnia jądra kierunkowe. (D) Przykład kierunkowych jąder nie zasiedlających dendrytu. Zamiast tego w dalszej części segmentu znajduje się pojedyncze jądro. (E) Kliknięcie lewym przyciskiem myszy na samotne jądro wypełnia dendryt pomiędzy dwoma punktami. Kliknięcie prawym przyciskiem myszy kończy obrysowywanie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Regulacja punktów w śledzonych dendrytach. (A) Śledzony segment dendrytu oczekujący na korektę punktu. Edycja dendrytów wymaga wybrania zakładki "Drzewo" i zakładki "Edycja". Oba są podświetlone na żółto. Dendrite został wybrany do edycji za pomocą lewego przycisku myszy. (B) Wybranie zakładki punktów, podświetlonej na żółto, pozwala na wybór poszczególnych punktów na segmencie dendrytu. Zielony punkt ma grubość 1,2 μm. (C) Dostosowano punkt, aby dokładniej wypełnić dendryt. Nowa wartość grubości zielonego punktu wynosi 0,6 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Przykładowe wyniki analizy obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Przykładowe szkice obrazu z dendrytami i spines.dat Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Przykładowe ślady z dendrites.dat Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Przykładowy plik obrazu dendrytu.czi Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Przykładowy plik obrazu dendrytu.jpx Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten szczegółowo opisuje poszczególne etapy przygotowania próbki, obrazowania oraz procesu kwantyfikacji i klasyfikacji kolców dendrytycznych przy użyciu oprogramowania do rekonstrukcji trójwymiarowej. To oprogramowanie jest potężnym narzędziem zdolnym do generowania solidnych danych strukturalnych, które przyczyniają się do różnorodnych badań. W trakcie całego procesu istnieje kilka krytycznych kroków, które sprawiają, że protokół ten jest mniejszym obciążeniem metodologicznym i zwiększa ogólną wydajność danych. Metoda znakowania kolców dendrytycznych jest jedną z pierwszych rzeczy, które naukowcy powinni rozważyć przed przystąpieniem do tego protokołu. Problemy z kwantyfikacją kręgosłupa mogą wynikać z niewystarczających metod znakowania. Barwienie niektórych białek ulegających ekspresji na niskich poziomach w kolcach może skutkować sygnałami, które są zbyt niskie dla oprogramowania. Należy również zauważyć, że odchylenie można wprowadzić, śledząc najjaśniejsze dendryty fluorescencyjne. Chociaż nie jest jasne, czy różne dendryty fluorescencyjne mają różne właściwości fizjologiczne, nadal jest to ograniczenie protokołu, które należy wziąć pod uwagę. Dodatkowo, w niektórych liniach transgenicznych, takich jak linia THY1-YFP-H, fluorescencja w kolcach dendrytycznych pojawia się dopiero około P21. To sprawia, że ta linia nie nadaje się do badań nad młodszymi punktami czasowymi rozwoju. Rozważenie metody zastosowanej do oznaczania kolców na potrzeby badań nie jest trywialnym aspektem, ponieważ bez wystarczającej fluorescencji oprogramowanie zmniejszyło użyteczność. Podobnie należy wziąć pod uwagę sprzęt do akwizycji obrazu. Istnieją pewne typy plików, które okazują się mniej kompatybilne z oprogramowaniem do analizy niż inne. W szczególności pliki ND2 zostały zidentyfikowane jako problematyczne typy plików dla efektywnego korzystania z oprogramowania. Dostawcy oprogramowania zalecają konwersję na typy plików, takie jak JPEG2000 przypadku wystąpienia problemów.

Przygotowanie tkanek i akwizycja obrazu są również ważnymi etapami wysokiej jakości oceny ilościowej kręgosłupa. Właściwe utrwalenie, pokrojenie i przymocowanie tkanek zapewnia długotrwałą próbkę z minimalnymi artefaktami, które mogą zakłócać analizę danych. Obrazowanie tkanki nie jest po prostu kwestią wykonania zdjęć całego wycinka mózgu w skali Z. Podczas obrazowania zawsze należy dążyć do pozyskania stosów zawierających dendryty w celu ilościowego określenia kręgosłupa. Należy położyć nacisk na pozyskanie stosów z zawierających dendryty, które będą łatwe do wyśledzenia. Grubszy stos z zazwyczaj skutkuje większą liczbą dendrytów tła. Utrudnia to skuteczne śledzenie dendrytów za pomocą oprogramowania. Poświęcenie dodatkowego czasu podczas obrazowania na znalezienie lepszych kandydatów do śledzenia pozwoli zaoszczędzić więcej czasu podczas analizy ilościowej kręgosłupa. Dodatkowo upewnij się, że obrazy z-stack zawierają całe dendryty, które mają być śledzone. Jeśli dendryty są tylko częściowo widoczne w stosie z, śledzenie dendrytów i identyfikacja grzbietów okażą się trudne i niedokładne z powodu niekompletnego renderowania 3D.

Proces śledzenia dendrytów i uzyskania dokładnego profilu zidentyfikowanych kolców dendrytycznych może być żmudnym procesem. Jest w tym pewien stopień niuansów. Podczas śledzenia dendrytów funkcja sterowana przez użytkownika może czasami nie działać zgodnie z przeznaczeniem. Czasami jądra kierunkowe nie zapełniają określonego segmentu lub nie zaczynają wypełniać niepożądanego segmentu. Jednym ze sposobów obejścia tego problemu jest rozpoczęcie od mniejszej typowej szerokości procesu. To sprawia, że dendryt jest bardziej wykrywalny w oprogramowaniu, co pozwala na łatwiejsze śledzenie. Jeśli jądro kierunkowe nie zostanie całkowicie wypełnione, kliknięcie lewym przyciskiem myszy na dendrycie spowoduje jego ręczne umieszczenie. Dojdzie do bardzo małego punktu i nie wypełni dendrytu, ale można to skorygować za pomocą regulacji grubości, jak opisano w kroku 3.8 protokołu. Podczas gdy dendryty można śledzić ręcznie, jeśli oprogramowanie okaże się nieodpowiednie, ręczne śledzenie kolców nie jest funkcją oprogramowania. Zdarzają się przypadki, w których wyraźny grzbiet wydaje się być widoczny, ale bez względu na to, jak wysoka jest czułość detektora, oprogramowanie nie będzie w stanie go wykryć. Jedną rzeczą do sprawdzenia jest to, czy podejrzany kręgosłup jest poza zasięgiem. Jeśli znajduje się w zasięgu, ale nadal nie jest identyfikowany przez oprogramowanie, to ten grzbiet zostanie wykluczony z analizy. Chociaż może się to zdarzyć rzadko, jest to ograniczenie, które należy wziąć pod uwagę. Podobnie jak w przypadku każdej analizy wymagającej progowania i komponentu ręcznej klasyfikacji, istnieje możliwość wprowadzenia błędu systematycznego. Ten problem może być jeszcze bardziej spotęgowany podczas porównywania danych generowanych przez wielu użytkowników. Półautomatyczny charakter tej analizy ma na celu zminimalizowanie wprowadzenia tego błędu, ale nie jest on całkowicie wyeliminowany. W naszym laboratorium 10% odchylenie między badaczami na standardowym zbiorze danych było rozsądne przy wystarczającej praktyce i szkoleniu. Chociaż podjęto wysiłki w celu zminimalizowania stronniczości, nadal ważne jest, aby wziąć pod uwagę stronniczość między badaczami podczas oceny danych generowanych za pomocą tego protokołu.

Biorąc pod uwagę drobne wady oprogramowania, wyniki analizy kręgosłupa dendrytycznego przy użyciu tej techniki są bardzo solidne. Jak opisano wcześniej, istnieje niezliczona ilość wskaźników, które można ekstrapolować na podstawie dokładnego śledzenia segmentów dendrytycznych i identyfikacji kręgosłupa. Możliwość uzyskania informacji o podtypach kręgosłupa zapewnia cenny wgląd na głębszym poziomie niż podstawowe wskaźniki. Dane te są ważne ze względu na wzajemne powiązania między strukturą a funkcją. Każdy podtyp kręgosłupa kojarzy się z funkcją. Cienkie kolce są dominującym podtypem podlegającym obfitemu obrotowi21. Cienkie kolce mają również potencjał do przekształcenia się w kolce grzybowe38. Jest to zgodne z tym, że kolce grzybów są silnie związane z uczeniem się i pamięcią38,39. Uważa się również, że przysadziste kolce są składnikiem uczenia się, potencjalnie jako pozostałości po kolcach grzybów40. Filopodia, choć nie występują w wielu dorosłych tkankach, są prekursorami kręgosłupa, które mają kluczowe znaczenie dla rozwoju41,42. Mikroskopia elektronowa 3D pozostaje złotym standardem w najdokładniejszej klasyfikacji podtypów kręgosłupa. Chociaż technika ta jest cenna, jest ograniczona przez żmudne ręczne sortowanie i klasyfikację, które są podatne na błędy ludzkie. Półautomatyczna konstrukcja tej analizy zmniejsza liczbę przypadków, w których można wprowadzić subiektywne uprzedzenia. Chociaż mogą istnieć wady pod względem bezwzględnej rozdzielczości i intensywności fluorescencji wymaganych do dokonania doskonałych klasyfikacji w tym protokole, nadal stanowi on metodologicznie mniej obciążającą alternatywę dla mikroskopii elektronowej 3D i ręcznej klasyfikacji. Co więcej, możliwa jest pełna analiza dendrytowa wielu gałęzi dendrytycznych z szerszego zestawu regionów mózgu przy użyciu analizy opisanej w tej pracy. Inaczej jest w przypadku mikroskopii elektronowej. Dzięki zastosowaniu tego protokołu możliwe jest rozwiązywanie problemów skoncentrowanych na strukturze w wielu dyscyplinach, w tym między innymi plastyczności synaptycznej, rozwoju oraz zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, w wiarygodny i powtarzalny sposób.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Carolyn Smith, Sarah Williams Avram, Tedowi Usdinowi i NIMH SNIR za pomoc techniczną. Chcielibyśmy również podziękować Colgate University Bethesda Biomedical Research Study Group. Praca ta jest wspierana przez NIMH Intramural Program (1ZIAMH002881 do Z.L.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
518F Olejek immersyjnyZeiss444960-0000-000
CryostatLeicaCM3050SDo przygotowania plastrów
Kleszcze drobneFST11150-10
Kleszcze do hemostatuFST13020-12
Duże nożyczki chirurgiczneFST14002-16
LSM 880 Mikroskop konfokalnyZeissLSM 880
Szklana osłona mikroskopuFisherbrand12-541-035
Mini-pompa perystaltyczna IIAparat Harvard70-2027Do perfuzji
Neurolucida 360MBF Biosciencev2022.1.1Oprogramowanie do analizy kręgosłupa
Neurolucida ExplorerMBF Biosciencev2022.1.1Oprogramowanie do analizy kręgosłupa
Związek OCTSakura Finetek4583Do cięcia kriostatu
Paraformaldehyd (37%)FisherbrandF79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Olej DICZeiss440762-9904-000
Ostrze skalpelaFST10022-00
Małe nożyczki chirurgiczneFST14060-09
Szpatułka FST10091-12
SacharozaFIs5-500
Superfrost Plus MicroslidesDiaggerES4951+
Vectashield HardSet MediumVector LaboratoriesH-1400-10
montażowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).">Gray, E. G. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).
  2. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).">Ramón Y Cajal, S. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).
  3. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).">Desmond, N. L., Levy, W. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).
  4. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).">Engert, F., Bonhoeffer, T. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).
  5. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).">Yang, Y., Wang, X. B., Frerking, M., Zhou, Q. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).
  6. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).">Oh, W. C., Parajuli, L. K., Zito, K. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).
  7. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).">Shinoda, Y., Tanaka, T., Tominaga-Yoshino, K., Ogura, A. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).
  8. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).">Markus, E. J., Petit, T. L. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).
  9. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).">Duan, H., Wearne, S. L., Rocher, A. B., Macedo, A., Morrison, J. H., Hof, P. R. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).
  10. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).">Chen, C. C., Lu, J., Zuo, Y. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).
  11. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).">Dickstein, D. L., Weaver, C. M., Luebke, J. I., Hof, P. R. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).
  12. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).">Glausier, J. R., Lewis, D. A. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).
  13. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).">Phillips, M., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).
  14. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).">Dorostkar, M. M., Zou, C., Blazquez-Llorca, L., Herms, J. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).
  15. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).">Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).
  16. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).">Cheng, C., Trzcinski, O., Doering, L. C. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).
  17. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).">Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  18. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).">Baloyannis, S. J. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).
  19. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).">Levet, F., Tonnesen, J., Nagerl, U. V., Sibarita, J. B. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).
  20. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).">Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).
  21. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).">Pfeiffer, T., et al. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).
  22. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).">Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
  23. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).">Hering, H., Sheng, M. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).
  24. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).">Jontes, J. D., Smith, S. J. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).
  25. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).">Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).
  26. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).">Berry, K. P., Nedivi, E. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
  27. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).">Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).
  28. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).">Swanger, S. A., Yao, X., Gross, C., Bassell, G. J. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).
  29. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).">Basu, S., et al. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).
  30. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).">Ekaterina, P., Peter, V., Smirnova, D., Vyacheslav, C., Ilya, B. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).
  31. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).">Li, B. Z., Sumera, A., Booker, S. A., Mccullagh, E. A. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).
  32. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).">Dickstein, D. L., et al. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).
  33. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).">Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  34. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).">Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).
  35. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).">Ferreira, J. S., et al. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).
  36. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).">Megias, M., Emri, Z. s, Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).
  37. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).">Katz, Y., et al. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).
  38. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).">Bourne, J., Harris, K. M. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).
  39. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).">Runge, K., Cardoso, C., De Chevigny, A. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).
  40. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).">Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).
  41. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).">Mattila, P. K., Lappalainen, P. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).
  42. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).">Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic Spine QuantificationThree Dimensional Neuron ReconstructionDendritic Spine AnalysisSpine DensitySpine Head VolumeSpine Subtype ClassificationSynaptic PlasticityNeurolucida 360Hippocampal DendritesSpine Morphology

Related Articles