Modele ran u myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek

Podsumowanie

To badanie przedstawia dwie kluczowe techniki eksperymentalne: budowę mysiego modelu rany do oceny zamknięcia rany oraz przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej skóry w celu zachowania żywotności komórek.

Streszczenie

Leczenie ostrych urazów skóry na całej grubości stanowi spore wyzwanie w praktyce klinicznej. Złożoność gojenia się ran, obejmująca różne populacje komórek i skomplikowane mikrośrodowisko rany, komplikuje ocenę efektów leczenia i ich interakcji przy użyciu tradycyjnych podejść eksperymentalnych. Technologia sekwencjonowania transkryptomu pojedynczych komórek zrewolucjonizowała zrozumienie funkcji i mechanizmów komórkowych podczas gojenia się ran. Jednak zmienność w metodologiach tworzenia mysich modeli ran wprowadza czynniki zakłócające, które mogą wpływać na wyniki eksperymentalne. Co więcej, proces dysocjacji tkanek skóry myszy stanowi poważne przeszkody techniczne, podkreślając krytyczną potrzebę wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych do dokładnego sekwencjonowania transkryptomu. Dlatego badanie to ma na celu optymalizację konstrukcji mysich modeli ran w celu dokładnej oceny zmian w zamykaniu ran przy jednoczesnym wyeliminowaniu zmiennych, które mogłyby wpływać na późniejszy wynik sekwencjonowania. Ponadto przygotowanie zawiesin jednokomórkowych przeprowadzono przy użyciu zarówno protokołów przygotowania enzymów, jak i protokołów zestawów testowych w celu optymalizacji kosztów i skuteczności.

Wprowadzenie

Mysz jest powszechnie rozpoznawanym modelem zwierzęcym w badaniach ze względu na wysoce homologiczną sekwencję genetyczną do ludzkiej, szybką reprodukcję, opłacalność i łatwy do opanowania rozmiar¹. Istnieją jednak różnice w budowie skóry między myszami a ludźmi. Myszy mają wyraźną warstwę błony skórnej, która przyczynia się do skurczu skóry, odgrywając kluczową rolę w gojeniu się ran u tego gatunku. W przeciwieństwie do tego, gojenie się ran u ludzi obejmuje przede wszystkim reepitelializację i tworzenie tkanki ziarninowej¹.

Pomimo tych międzygatunkowych różnic w budowie skóry, model mysi pozostaje preferowanym wyborem w badaniach nad gojeniem ran i zachowuje znaczące znaczenie w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi^2,3. W przypadku stosowania skóry myszy do naśladowania procesów gojenia się ran u ludzi, konieczne jest dokładne rozważenie różnych czynników wpływających. Czynniki te obejmują wybór odpowiednich miejsc do zabiegów chirurgicznych, uwzględnienie cyklu mieszków włosowych myszy oraz zrozumienie skutków skurczu błony skórnej^4,5. Wdrożenie odpowiednich środków ma zasadnicze znaczenie dla optymalizacji warunków eksperymentalnych i poprawy dokładności wyników obserwacji.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) sekwencjonuje komórki na znacznie bardziej wyrafinowanym poziomie niż konwencjonalne sekwencjonowanie RNA i ma znacznie wyższe wymagania dotyczące jakości próbki przy minimalnych różnicach wewnątrzgrupowych. Przeprowadzono wiele eksperymentów w celu udoskonalenia stabilnego modelu ostrego ubytku skóry o pełnej grubości u myszy. W eksperymentach tych wykorzystano kombinację uznanych metod z literatury i innowacyjnych podejść do kompleksowej oceny gojenia się ran^2,5. Aby opracować model gojenia się ran, wykorzystano mysie wycięcie skóry o pełnej grubości, aby odtworzyć fizjologiczny proces gojenia i regeneracji ran. Jego celem była ocena potencjalnych zmian wywołanych przez różne terapie z wykorzystaniem sekwencjonowania scRNA. Dysocjacja tkanki skórnej u myszy stanowi wyzwanie, w tym niską żywotność komórek i wysokie wskaźniki agregacji, podczas przygotowywania zawiesin jednokomórkowych⁶. Trudności te mogą powodować problemy, takie jak zapychanie się instrumentów i nietypowe przechwytywanie komórek, co może pogorszyć jakość danych. Biorąc pod uwagę znaczne koszty sekwencjonowania pojedynczych komórek, przeprowadzenie wielu wstępnych eksperymentów ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia stabilności i niezawodności zawiesiny pojedynczej komórki. W tym badaniu oceniono skuteczność dysocjacji mieszanych enzymów i metody dysocjacji zestawu tkanek w celu określenia optymalnego podejścia do dysocjacji tkanek^6,7. Badanie to stanowi solidną podstawę do dalszych dogłębnych badań.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki siódmego Centrum Medycznego Chińskiego Szpitala Ogólnego PLA, Chiny. Użyto samców myszy C57/BL6 w wieku 6 tygodni.

1. Model gojenia ran myszy

1. Grupowanie zwierząt
   1. Losowo przypisz myszy do grup eksperymentalnych i kontrolnych (po 6 każda). Myszy trzymane są w zamkniętym pomieszczeniu wolnym od patogenów (SPF), w którym utrzymuje się temperaturę 23-25 °C, wilgotność 50%-60% i 12-godzinny cykl jasno-ciemny.
   2. Zapewnij myszom nieograniczony dostęp do standardowego pożywienia i autoklawizowanej wody z kranu.
2. Przygotowanie przedoperacyjne
   1. Delikatnie przytrzymuj mysz za pomocą ogranicznika lub trzymając ją bezpiecznie w pozycji leżącej. Napełnić strzykawkę 1% pentobarbitalem sodu przywróconym do temperatury pokojowej, podawanym w dawce 0,1 ml/20 g masy ciała.
      UWAGA: 1% pentobarbital roztwór sodu należy przechowywać w ciemnym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C.
   2. Oczyść brzuch myszy wacikami nasączonymi alkoholem. Wprowadzić strzykawkę pod niewielkim kątem do brzucha. Odessać przed wstrzyknięciem, aby zapobiec przypadkowemu podaniu do pęcherza moczowego lub jelit. Odczekaj 10 min.
   3. Gdy mysz przestanie drgać i nie będzie już reagować na bodźce, nałóż białą wazelinę na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Użyj golarki, aby przyciąć dłuższe futro na grzbiecie.
   4. Nałóż krem do depilacji na plecy, odczekaj 2 minuty i delikatnie wytrzyj wilgotną gazą, aby nie uszkodzić skóry myszy. Upewnij się, że krem do depilacji nie pozostaje na nim przez dłuższy czas.
   5. Delikatnie zdezynfekuj otaczającą skórę trzema naprzemiennymi wacikami z betadyną i 70% alkoholem.
   6. Autoklaw: stempel do biopsji skóry, nożyczki, kleszcze i inne narzędzia do sterylizacji. Utrzymuj sterylne miejsce pracy. Wykonaj kolejną operację na świeżej tkaninie chirurgicznej.
3. Wycięcie skóry na całej grubości
   UWAGA: Do oceny skuteczności leczenia gojenia się ran wykorzystano model szyny rany.
   1. Za pomocą markera permanentnego zaznacz górny środkowy obszar grzbietu myszy jednym okręgiem o średnicy 8 mm.
   2. Podnieś skórę grzbietową za pomocą czystych kleszczy i wykonaj pierwsze cięcie za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych. Po pierwszym cięciu przytrzymaj częściowo usunięty obszar skóry za pomocą kleszczy i ostrożnie wytnij zaznaczone kółka.
   3. Użyj specjalnie zaprojektowanego pierścienia ze stali nierdzewnej (średnica wewnętrzna 15 mm, średnica zewnętrzna 18 mm). Zszyj metalowy pierścień do obrzeża miejsca nacięcia za pomocą 5-0 niewchłanialnych szwów, zapobiegając skurczowi skóry w miejscu nacięcia (Rysunek 1A). Użyj stali nierdzewnej jako materiału pierścienia, aby zapobiec rdzewieniu i deformacji.
   4. Podać pojedyncze 0,1 ml wstrzyknięcia podskórnego 10% chlorowodorku buprenorfiny w pobliżu rany w celu leczenia bólu pooperacyjnego.
   5. Ponownie wprowadź mysz, aby wyczyścić poszczególne klatki. Umieść mysz w pozycji leżącej. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki mysz nie odzyska przytomności.
   6. Obserwuj i fotografuj ranę myszy co 2 dni, aby zmierzyć rozmiar rany po znieczuleniu, jak opisano w kroku 1.2.
4. Znakowanie stemplem rany w celu uzyskania tkanki biopsyjnej
   1. Przygotuj się do eksperymentu zgodnie z opisem w krokach 1.1 i 1.2.
   2. Twórz niestandardowe stemple do oznaczania ran myszy o średnicy okręgu 8 mm i boku kwadratowym o długości 10 mm (Rysunek 1B).
   3. Ustaw mysz w pozycji leżącej i zdezynfekuj skórę grzbietową wacikami nasączonymi alkoholem. Zanurz stempel w atramencie. Zaznacz stempel w górnej środkowej części grzbietu myszy.
   4. Ostrożnie wytnij całą warstwę skóry pleców wzdłuż okrągłego znaku za pomocą nożyczek chirurgicznych, całkowicie odsłaniając warstwę mięśniową. Pozostaw ranę otwartą bez opatrunku, aby uniknąć ingerencji w stan rany. Utrzymuj sterylność rany, umieszczając mysz w czystym i zdezynfekowanym środowisku i pozwalając ranie naturalnie uformować się w strup
   .
   5. Podać pojedyncze 0,1 ml wstrzyknięcia podskórnego 10% chlorowodorku buprenorfiny w pobliżu rany w celu leczenia bólu pooperacyjnego.
   6. Ponownie wprowadź mysz, aby wyczyścić poszczególne klatki. Umieść mysz w pozycji leżącej. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki mysz nie odzyska przytomności.
   7. Obserwuj i fotografuj ranę myszy co 2 dni, aby zmierzyć rozmiar rany po znieczuleniu, jak opisano w kroku 1.2.
   8. Przeprowadzić podawanie leku zgodnie z opisem w punkcie 1.4
5. Podawanie leczenia
   1. Po 4 godzinach od odzyskania przytomności myszy należy przeprowadzić znieczulenie zgodnie z opisem w krokach 1.2.2-1.2.3.
   2. Podskórnie wstrzyknąć żądane leczenie, tutaj 100 μg ludzkiego egzosomu pochodzącego z mezenchymalnych komórek macierzystych pępowiny (hucMSC-Exo) rozpuszczonych w 200 μl PBS wokół miejsca nacięcia dla grupy leczonej.
   3. Podskórnie wstrzyknąć 200 μl PBS wokół miejsca nacięcia dla grupy kontrolnej.
   4. Powtarzaj kroki 1.5.2 i 1.5.3 co dwa dni przez maksymalnie 14 dni. Należy sprawdzić miejsce wstrzyknięcia pod kątem obrzęku, zaczerwienienia lub objawów zakażenia.

2. Przygotowanie do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

1. Pobieranie i przygotowanie tkanek
   1. Wykonaj znieczulenie zgodnie z opisem w krokach 1.2.2-1.2.3.
   2. Podnieś skórę grzbietową za pomocą czystych kleszczy i usuń strupki. Odetnij około 2^cm2 skóry w pobliżu rany, odcinając tkankę tłuszczową i duże naczynia krwionośne.
   3. Przenieś biopsję skóry za pomocą sterylnych kleszczyków do studzienki z 6-dołkową płytką wypełnioną wstępnie schłodzonymi 4 ml PBS.
   4. Przemyć PBS, sekwencyjnie przenosząc biopsję do nowych studzienek (płytka 6-dołkowa) wypełnionych 4 ml PBS, aż do momentu, gdy nie będzie widocznej krwi.
   5. Pokrój skórę skalpelem na kawałki o wielkości około 2 mm, następnie umyj w DPBS zawierającym 0,04% BSA i usuń wszelkie zanieczyszczenia.
2. Dysocjacja enzymatyczna (Rysunek 2)
   1. Połącz 1 ml kolagenazy I (10 mg / ml), 1 ml kolagenazy IV (5 mg / ml), 1 ml kolagenazy D + Dyspazy II (15 mg / ml), 1 ml DNazy I (5 mg / ml) i 6 ml DPBS w sterylnej stożkowej probówce, aby przygotować roztwór do wytrawiania. Dokładnie wymieszaj składniki, aby zapewnić jednorodność.
   2. Umieść stożkową rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut, aby podgrzać roztwór wytrawiający.
   3. Dodać 2,5 ml roztworu trawiącego do tkanki i trawić w temperaturze 37 °C przez 70 minut, przewracając probówkę co 10 minut w celu dokładnego wymieszania.
   4. Wstępnie zwilżyć sitko o pojemności 70 μm z buforem płuczącym (0,2% BSA w PBS). Przenieść mieszaninę reakcyjną, w tym zdysocjowane komórki i resztki tkanek, za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze o pojemności 1 ml na sitku.
   5. Przefiltrować tę mieszaninę przez wstępnie zwilżone sitko komórkowe 70 μm do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
   6. Odwirować mieszaninę reakcyjną z strawioną tkanką o stężeniu 300 x g, w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i zachować osad (komórki) do następnego etapu dysocjacji.
3. Liza czerwonych krwinek
   1. Rozcieńczyć roztwór do lizy krwinek czerwonych (10x) w stosunku 1:10 wodą podwójnie destylowaną. Rozcieńczyć komórki 1x roztworem do lizy czerwonych krwinek w stosunku 1:10 w stożkowej probówce.
   2. Mieszać mieszaninę przez 5 s, inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie wirować przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w równej objętości DPBS i przechowywać je na lodzie.
4. filtracja
   1. Pobrać zawiesinę komórek i przefiltrować ją przez sitko 40 μm do nowej stożkowej probówki.
   2. Przepłucz probówkę 2x 4,5 ml RPMI (10% FCS), aby upewnić się, że wszystkie pozostałe komórki zostały zebrane.
   3. Przystąpić do odwirowania zawiesiny komórek o sile 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   4. Wyrzuć supernatant, delikatnie strzepnij osad i ponownie zawieś komórki z końcówkami o szerokim otworze w 50 μl 0,04% BSA PBS. Utrzymuj komórki na lodzie przez cały ten proces.
5. Usuwanie martwych komórek
   1. Wymieszaj zestaw do usuwania martwych komórek 20x bufor podstawowy z wodą wolną od nukleaz w stosunku 1:20, aby uzyskać 1x bufor wiążący.
   2. Odwirować próbkę o masie 300 x g, usunąć supernatant i dodać 10 μl mikrogranulek do usuwania martwych komórek na 60 mg próbki skóry.
   3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodać bufor podstawowy, aż osiągnie 500 μl. Załadować próbkę do przygotowanej kolumny w zestawie i podłączyć ją do dysocjatora.
   4. Uruchom program dysocjatora, aby oddzielić żywe komórki. Po zakończeniu programu przefiltrować zawiesinę przez filtr 30 μm i rozcieńczyć ją równą objętością D-PBS.
      UWAGA: Jeśli prędkość kapania zauważalnie spadnie, należy niezwłocznie wymienić kolumnę, aby zanieczyszczenia nie blokowały porów i nie wpływały na regenerację komórek.
   5. Wykonaj barwienie pomarańczą akrydynową/jodkiem propydu (AO/PI) i zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Stosuj następujące kryteria akceptacji: żywotność komórek ≥ 85%, szybkość agregacji komórek < 20% oraz brak widocznych czerwonych krwinek lub fragmentów komórek.
6. Procedura dysocjacji dla zestawu do dysocjacji wielotkankowej (alternatywa)
   1. Wymieszaj 2,5 ml RPMI 1640, 100 μl enzymu D, 50 μl enzymu R i 12,5 μl enzymu A1 w delikatnej probówce MACS C (składniki z zestawu do dysocjacji wielotkankowej).
   2. Przenieś tkankę do delikatnej probówki MACS C zawierającej mieszaninę enzymów i szczelnie ją zamknij.
   3. Umieścić probówkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej na 90 minut z delikatnym odwróceniem co 10 minut, aby zapewnić odpowiednią ekspozycję tkanek na roztwór dysocjacyjny.
   4. Odrzucić roztwór dysocjacyjny i przemyć tkanki DPBS.
   5. Przepuścić kolejno zawiesiny jednokomórkowe przez sitka do komórek 70 μm i 40 μm i odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 300 x g.
   6. Poddać lizie krwinki czerwone przy użyciu odczynnika do lizy krwinek czerwonych, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 2.3.
   7. Usuń martwe komórki za pomocą zestawu do usuwania martwych komórek, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 2.5⁸.
   8. Wykonaj barwienie AO/PI i zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Stosuj następujące kryteria akceptacji: żywotność komórek ≥ 85%, szybkość agregacji komórek < 20% oraz brak widocznych czerwonych krwinek lub fragmentów komórek.

Wyniki

Zbadano wiele wariantów procedury. Preferowano protokoły z użyciem stempli, ponieważ wywołują one minimalne zakłócenia w procesie gojenia ran i zachowują integralność rany, chroniąc ją przed takimi czynnikami jak drapanie czy szwy. Ma to na celu uniknięcie wprowadzenia szumu na poziomie pojedynczych komórek podczas późniejszego sekwencjonowania. Wykonanie ran po obu stronach ciała myszy doprowadziło do zauważalnych różnic w powierzchni rany ze względu na naturalną elastyczność skóry mysiej (Rysunek 3...

Dyskusja

Dla powodzenia protokołu niezbędnych było kilka kluczowych kroków. Kroki te obejmowały precyzyjne przygotowanie obszaru rany poprzez dokładne golenie i czyszczenie, tworzenie standaryzowanych ran o określonej wielkości i głębokości oraz staranną pielęgnację po ranie w celu monitorowania infekcji i zastosowania odpowiedniego leczenia. Standaryzacja tych procedur zapewniła spójność we wszystkich warunkach eksperymentalnych, zwiększając w ten sposób wiarygodność i odtwarzalność wyników¹⁰.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
75% myszy Alcolchol	Liuhe	JIUJING500ML
C57/BL6J	Charles River Laboratories
Kolagenaza D + Dyspaza II	Roche	11088858001
Kolagenaza I	Roche	5349907103
Kolagenaza IV	Waciki
	Haishi	MIANQIAN
Zestaw do usuwania martwych komórek	Miltenyi Biotec	130-090-10
DNase I	Roche	10104159001
gentleMAC Disocjator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Medyczna nić nylonowa	Jinlong	HM507
Zestaw do dysocjacji wielotkankowej 1	Miltenyi Biotec	130-110-201
igła do biopsji	Integra Miltex
roztwór do lizy czerwonych krwinek	Miltenyi Biotec	130-094-183
Nożyczki chirurgiczne	Jinglu	JIANDAO
Biała wazelina	Shangyuan	BAIFANSHILIN

bawełniane Roche 5267439001 Dziurkacz