To badanie przedstawia dwie kluczowe techniki eksperymentalne: budowę mysiego modelu rany do oceny zamknięcia rany oraz przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej skóry w celu zachowania żywotności komórek.
Artykuł metodologiczny
Modele ran u myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Leczenie ostrych urazów skóry na całej grubości stanowi spore wyzwanie w praktyce klinicznej. Złożoność gojenia się ran, obejmująca różne populacje komórek i skomplikowane mikrośrodowisko rany, komplikuje ocenę efektów leczenia i ich interakcji przy użyciu tradycyjnych podejść eksperymentalnych. Technologia sekwencjonowania transkryptomu pojedynczych komórek zrewolucjonizowała zrozumienie funkcji i mechanizmów komórkowych podczas gojenia się ran. Jednak zmienność w metodologiach tworzenia mysich modeli ran wprowadza czynniki zakłócające, które mogą wpływać na wyniki eksperymentalne. Co więcej, proces dysocjacji tkanek skóry myszy stanowi poważne przeszkody techniczne, podkreślając krytyczną potrzebę wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych do dokładnego sekwencjonowania transkryptomu. Dlatego badanie to ma na celu optymalizację konstrukcji mysich modeli ran w celu dokładnej oceny zmian w zamykaniu ran przy jednoczesnym wyeliminowaniu zmiennych, które mogłyby wpływać na późniejszy wynik sekwencjonowania. Ponadto przygotowanie zawiesin jednokomórkowych przeprowadzono przy użyciu zarówno protokołów przygotowania enzymów, jak i protokołów zestawów testowych w celu optymalizacji kosztów i skuteczności.
Wprowadzenie
Mysz jest powszechnie rozpoznawanym modelem zwierzęcym w badaniach ze względu na wysoce homologiczną sekwencję genetyczną do ludzkiej, szybką reprodukcję, opłacalność i łatwy do opanowania rozmiar1. Istnieją jednak różnice w budowie skóry między myszami a ludźmi. Myszy mają wyraźną warstwę błony skórnej, która przyczynia się do skurczu skóry, odgrywając kluczową rolę w gojeniu się ran u tego gatunku. W przeciwieństwie do tego, gojenie się ran u ludzi obejmuje przede wszystkim reepitelializację i tworzenie tkanki ziarninowej1.
Pomimo tych międzygatunkowych różnic w budowie skóry, model mysi pozostaje preferowanym wyborem w badaniach nad gojeniem ran i zachowuje znaczące znaczenie w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi2,3. W przypadku stosowania skóry myszy do naśladowania procesów gojenia się ran u ludzi, konieczne jest dokładne rozważenie różnych czynników wpływających. Czynniki te obejmują wybór odpowiednich miejsc do zabiegów chirurgicznych, uwzględnienie cyklu mieszków włosowych myszy oraz zrozumienie skutków skurczu błony skórnej4,5. Wdrożenie odpowiednich środków ma zasadnicze znaczenie dla optymalizacji warunków eksperymentalnych i poprawy dokładności wyników obserwacji.
Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) sekwencjonuje komórki na znacznie bardziej wyrafinowanym poziomie niż konwencjonalne sekwencjonowanie RNA i ma znacznie wyższe wymagania dotyczące jakości próbki przy minimalnych różnicach wewnątrzgrupowych. Przeprowadzono wiele eksperymentów w celu udoskonalenia stabilnego modelu ostrego ubytku skóry o pełnej grubości u myszy. W eksperymentach tych wykorzystano kombinację uznanych metod z literatury i innowacyjnych podejść do kompleksowej oceny gojenia się ran2,5. Aby opracować model gojenia się ran, wykorzystano mysie wycięcie skóry o pełnej grubości, aby odtworzyć fizjologiczny proces gojenia i regeneracji ran. Jego celem była ocena potencjalnych zmian wywołanych przez różne terapie z wykorzystaniem sekwencjonowania scRNA. Dysocjacja tkanki skórnej u myszy stanowi wyzwanie, w tym niską żywotność komórek i wysokie wskaźniki agregacji, podczas przygotowywania zawiesin jednokomórkowych6. Trudności te mogą powodować problemy, takie jak zapychanie się instrumentów i nietypowe przechwytywanie komórek, co może pogorszyć jakość danych. Biorąc pod uwagę znaczne koszty sekwencjonowania pojedynczych komórek, przeprowadzenie wielu wstępnych eksperymentów ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia stabilności i niezawodności zawiesiny pojedynczej komórki. W tym badaniu oceniono skuteczność dysocjacji mieszanych enzymów i metody dysocjacji zestawu tkanek w celu określenia optymalnego podejścia do dysocjacji tkanek6,7. Badanie to stanowi solidną podstawę do dalszych dogłębnych badań.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki siódmego Centrum Medycznego Chińskiego Szpitala Ogólnego PLA, Chiny. Użyto samców myszy C57/BL6 w wieku 6 tygodni.
1. Model gojenia ran myszy
- Grupowanie zwierząt
- Losowo przypisz myszy do grup eksperymentalnych i kontrolnych (po 6 każda). Myszy trzymane są w zamkniętym pomieszczeniu wolnym od patogenów (SPF), w którym utrzymuje się temperaturę 23-25 °C, wilgotność 50%-60% i 12-godzinny cykl jasno-ciemny.
- Zapewnij myszom nieograniczony dostęp do standardowego pożywienia i autoklawizowanej wody z kranu.
- Przygotowanie przedoperacyjne
- Delikatnie przytrzymuj mysz za pomocą ogranicznika lub trzymając ją bezpiecznie w pozycji leżącej. Napełnić strzykawkę 1% pentobarbitalem sodu przywróconym do temperatury pokojowej, podawanym w dawce 0,1 ml/20 g masy ciała.
UWAGA: 1% pentobarbital roztwór sodu należy przechowywać w ciemnym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C. - Oczyść brzuch myszy wacikami nasączonymi alkoholem. Wprowadzić strzykawkę pod niewielkim kątem do brzucha. Odessać przed wstrzyknięciem, aby zapobiec przypadkowemu podaniu do pęcherza moczowego lub jelit. Odczekaj 10 min.
- Gdy mysz przestanie drgać i nie będzie już reagować na bodźce, nałóż białą wazelinę na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Użyj golarki, aby przyciąć dłuższe futro na grzbiecie.
- Nałóż krem do depilacji na plecy, odczekaj 2 minuty i delikatnie wytrzyj wilgotną gazą, aby nie uszkodzić skóry myszy. Upewnij się, że krem do depilacji nie pozostaje na nim przez dłuższy czas.
- Delikatnie zdezynfekuj otaczającą skórę trzema naprzemiennymi wacikami z betadyną i 70% alkoholem.
- Autoklaw: stempel do biopsji skóry, nożyczki, kleszcze i inne narzędzia do sterylizacji. Utrzymuj sterylne miejsce pracy. Wykonaj kolejną operację na świeżej tkaninie chirurgicznej.
- Delikatnie przytrzymuj mysz za pomocą ogranicznika lub trzymając ją bezpiecznie w pozycji leżącej. Napełnić strzykawkę 1% pentobarbitalem sodu przywróconym do temperatury pokojowej, podawanym w dawce 0,1 ml/20 g masy ciała.
- Wycięcie skóry na całej grubości
UWAGA: Do oceny skuteczności leczenia gojenia się ran wykorzystano model szyny rany.- Za pomocą markera permanentnego zaznacz górny środkowy obszar grzbietu myszy jednym okręgiem o średnicy 8 mm.
- Podnieś skórę grzbietową za pomocą czystych kleszczy i wykonaj pierwsze cięcie za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych. Po pierwszym cięciu przytrzymaj częściowo usunięty obszar skóry za pomocą kleszczy i ostrożnie wytnij zaznaczone kółka.
- Użyj specjalnie zaprojektowanego pierścienia ze stali nierdzewnej (średnica wewnętrzna 15 mm, średnica zewnętrzna 18 mm). Zszyj metalowy pierścień do obrzeża miejsca nacięcia za pomocą 5-0 niewchłanialnych szwów, zapobiegając skurczowi skóry w miejscu nacięcia (Rysunek 1A). Użyj stali nierdzewnej jako materiału pierścienia, aby zapobiec rdzewieniu i deformacji.
- Podać pojedyncze 0,1 ml wstrzyknięcia podskórnego 10% chlorowodorku buprenorfiny w pobliżu rany w celu leczenia bólu pooperacyjnego.
- Ponownie wprowadź mysz, aby wyczyścić poszczególne klatki. Umieść mysz w pozycji leżącej. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki mysz nie odzyska przytomności.
- Obserwuj i fotografuj ranę myszy co 2 dni, aby zmierzyć rozmiar rany po znieczuleniu, jak opisano w kroku 1.2.
- Znakowanie stemplem rany w celu uzyskania tkanki biopsyjnej
- Przygotuj się do eksperymentu zgodnie z opisem w krokach 1.1 i 1.2.
- Twórz niestandardowe stemple do oznaczania ran myszy o średnicy okręgu 8 mm i boku kwadratowym o długości 10 mm (Rysunek 1B).
- Ustaw mysz w pozycji leżącej i zdezynfekuj skórę grzbietową wacikami nasączonymi alkoholem. Zanurz stempel w atramencie. Zaznacz stempel w górnej środkowej części grzbietu myszy.
- Ostrożnie wytnij całą warstwę skóry pleców wzdłuż okrągłego znaku za pomocą nożyczek chirurgicznych, całkowicie odsłaniając warstwę mięśniową. Pozostaw ranę otwartą bez opatrunku, aby uniknąć ingerencji w stan rany. Utrzymuj sterylność rany, umieszczając mysz w czystym i zdezynfekowanym środowisku i pozwalając ranie naturalnie uformować się w strup .
- Podać pojedyncze 0,1 ml wstrzyknięcia podskórnego 10% chlorowodorku buprenorfiny w pobliżu rany w celu leczenia bólu pooperacyjnego.
- Ponownie wprowadź mysz, aby wyczyścić poszczególne klatki. Umieść mysz w pozycji leżącej. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki mysz nie odzyska przytomności.
- Obserwuj i fotografuj ranę myszy co 2 dni, aby zmierzyć rozmiar rany po znieczuleniu, jak opisano w kroku 1.2.
- Przeprowadzić podawanie leku zgodnie z opisem w punkcie 1.4
- Podawanie leczenia
- Po 4 godzinach od odzyskania przytomności myszy należy przeprowadzić znieczulenie zgodnie z opisem w krokach 1.2.2-1.2.3.
- Podskórnie wstrzyknąć żądane leczenie, tutaj 100 μg ludzkiego egzosomu pochodzącego z mezenchymalnych komórek macierzystych pępowiny (hucMSC-Exo) rozpuszczonych w 200 μl PBS wokół miejsca nacięcia dla grupy leczonej.
- Podskórnie wstrzyknąć 200 μl PBS wokół miejsca nacięcia dla grupy kontrolnej.
- Powtarzaj kroki 1.5.2 i 1.5.3 co dwa dni przez maksymalnie 14 dni. Należy sprawdzić miejsce wstrzyknięcia pod kątem obrzęku, zaczerwienienia lub objawów zakażenia.
2. Przygotowanie do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki
- Pobieranie i przygotowanie tkanek
- Wykonaj znieczulenie zgodnie z opisem w krokach 1.2.2-1.2.3.
- Podnieś skórę grzbietową za pomocą czystych kleszczy i usuń strupki. Odetnij około 2cm2 skóry w pobliżu rany, odcinając tkankę tłuszczową i duże naczynia krwionośne.
- Przenieś biopsję skóry za pomocą sterylnych kleszczyków do studzienki z 6-dołkową płytką wypełnioną wstępnie schłodzonymi 4 ml PBS.
- Przemyć PBS, sekwencyjnie przenosząc biopsję do nowych studzienek (płytka 6-dołkowa) wypełnionych 4 ml PBS, aż do momentu, gdy nie będzie widocznej krwi.
- Pokrój skórę skalpelem na kawałki o wielkości około 2 mm, następnie umyj w DPBS zawierającym 0,04% BSA i usuń wszelkie zanieczyszczenia.
- Dysocjacja enzymatyczna (Rysunek 2)
- Połącz 1 ml kolagenazy I (10 mg / ml), 1 ml kolagenazy IV (5 mg / ml), 1 ml kolagenazy D + Dyspazy II (15 mg / ml), 1 ml DNazy I (5 mg / ml) i 6 ml DPBS w sterylnej stożkowej probówce, aby przygotować roztwór do wytrawiania. Dokładnie wymieszaj składniki, aby zapewnić jednorodność.
- Umieść stożkową rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut, aby podgrzać roztwór wytrawiający.
- Dodać 2,5 ml roztworu trawiącego do tkanki i trawić w temperaturze 37 °C przez 70 minut, przewracając probówkę co 10 minut w celu dokładnego wymieszania.
- Wstępnie zwilżyć sitko o pojemności 70 μm z buforem płuczącym (0,2% BSA w PBS). Przenieść mieszaninę reakcyjną, w tym zdysocjowane komórki i resztki tkanek, za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze o pojemności 1 ml na sitku.
- Przefiltrować tę mieszaninę przez wstępnie zwilżone sitko komórkowe 70 μm do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Odwirować mieszaninę reakcyjną z strawioną tkanką o stężeniu 300 x g, w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i zachować osad (komórki) do następnego etapu dysocjacji.
- Liza czerwonych krwinek
- Rozcieńczyć roztwór do lizy krwinek czerwonych (10x) w stosunku 1:10 wodą podwójnie destylowaną. Rozcieńczyć komórki 1x roztworem do lizy czerwonych krwinek w stosunku 1:10 w stożkowej probówce.
- Mieszać mieszaninę przez 5 s, inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie wirować przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w równej objętości DPBS i przechowywać je na lodzie.
- filtracja
- Pobrać zawiesinę komórek i przefiltrować ją przez sitko 40 μm do nowej stożkowej probówki.
- Przepłucz probówkę 2x 4,5 ml RPMI (10% FCS), aby upewnić się, że wszystkie pozostałe komórki zostały zebrane.
- Przystąpić do odwirowania zawiesiny komórek o sile 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Wyrzuć supernatant, delikatnie strzepnij osad i ponownie zawieś komórki z końcówkami o szerokim otworze w 50 μl 0,04% BSA PBS. Utrzymuj komórki na lodzie przez cały ten proces.
- Usuwanie martwych komórek
- Wymieszaj zestaw do usuwania martwych komórek 20x bufor podstawowy z wodą wolną od nukleaz w stosunku 1:20, aby uzyskać 1x bufor wiążący.
- Odwirować próbkę o masie 300 x g, usunąć supernatant i dodać 10 μl mikrogranulek do usuwania martwych komórek na 60 mg próbki skóry.
- Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodać bufor podstawowy, aż osiągnie 500 μl. Załadować próbkę do przygotowanej kolumny w zestawie i podłączyć ją do dysocjatora.
- Uruchom program dysocjatora, aby oddzielić żywe komórki. Po zakończeniu programu przefiltrować zawiesinę przez filtr 30 μm i rozcieńczyć ją równą objętością D-PBS.
UWAGA: Jeśli prędkość kapania zauważalnie spadnie, należy niezwłocznie wymienić kolumnę, aby zanieczyszczenia nie blokowały porów i nie wpływały na regenerację komórek. - Wykonaj barwienie pomarańczą akrydynową/jodkiem propydu (AO/PI) i zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Stosuj następujące kryteria akceptacji: żywotność komórek ≥ 85%, szybkość agregacji komórek < 20% oraz brak widocznych czerwonych krwinek lub fragmentów komórek.
- Procedura dysocjacji dla zestawu do dysocjacji wielotkankowej (alternatywa)
- Wymieszaj 2,5 ml RPMI 1640, 100 μl enzymu D, 50 μl enzymu R i 12,5 μl enzymu A1 w delikatnej probówce MACS C (składniki z zestawu do dysocjacji wielotkankowej).
- Przenieś tkankę do delikatnej probówki MACS C zawierającej mieszaninę enzymów i szczelnie ją zamknij.
- Umieścić probówkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej na 90 minut z delikatnym odwróceniem co 10 minut, aby zapewnić odpowiednią ekspozycję tkanek na roztwór dysocjacyjny.
- Odrzucić roztwór dysocjacyjny i przemyć tkanki DPBS.
- Przepuścić kolejno zawiesiny jednokomórkowe przez sitka do komórek 70 μm i 40 μm i odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 300 x g.
- Poddać lizie krwinki czerwone przy użyciu odczynnika do lizy krwinek czerwonych, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 2.3.
- Usuń martwe komórki za pomocą zestawu do usuwania martwych komórek, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 2.58.
- Wykonaj barwienie AO/PI i zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Stosuj następujące kryteria akceptacji: żywotność komórek ≥ 85%, szybkość agregacji komórek < 20% oraz brak widocznych czerwonych krwinek lub fragmentów komórek.
Wyniki
Zbadano wiele wariantów procedury. Preferowano protokoły z użyciem stempli, ponieważ wywołują one minimalne zakłócenia w procesie gojenia ran i zachowują integralność rany, chroniąc ją przed takimi czynnikami jak drapanie czy szwy. Ma to na celu uniknięcie wprowadzenia szumu na poziomie pojedynczych komórek podczas późniejszego sekwencjonowania. Wykonanie ran po obu stronach ciała myszy doprowadziło do zauważalnych różnic w powierzchni rany ze względu na naturalną elastyczność skóry mysiej (Rysunek 3A,B). Obustronne nakłucia spowodowały przesunięcie ran bliżej krawędzi, w obszarze podatnym na drapanie się myszy. Myszy w wieku 7 tygodni i starsze uznano za nieodpowiednie do badania, ponieważ u części z nich około 10tego dnia po zabiegu wystąpiło nieregularne ciemnienie skóry grzbietu, co wskazywało na początek odrastania sierści (Rysunek 4A). Wprowadziło to niepożądaną dodatkową zmienną.
W przypadku zastosowania pierścieni gumowych, niezależnie od tego, czy użyto gumy miękkiej czy twardej, pierścienie te miały tendencję do odrywania się i często przemieszczały się z miejsca rany w ciągu około 12 h z powodu częstych ruchów myszy oraz ograniczonych właściwości przylegania pierścieni. Pierścienie gumowe mocowane szwami były podatne na rozrywanie, co wymagało wielokrotnego szycia w celu ich stabilizacji. Ta powtarzalna procedura szycia powodowała z kolei dodatkowe urazy u myszy (Rycina 4B,C). W przeciwieństwie do nich, pierścienie metalowe wykazały lepszą stabilność i poprawione właściwości retencyjne, co umożliwiło ocenę efektów reepitelializacji bez zakłóceń spowodowanych kurczeniem się rany.
Biorąc pod uwagę możliwość spowodowania przez szynę z metalowym pierścieniem zszytym szwami dodatkowych uszkodzeń skóry poza obszarem rany oraz wywierania nierównomiernych naprężeń mechanicznych w obrębie rany, w celu ułatwienia późniejszych analiz zastosowano zestandaryzowany stempel o stałych wymiarach.
Badanie wykazało, że grupa poddana przykładowej terapii (hucMSC-Exo) wykazywała szybsze tempo gojenia w porównaniu z grupą kontrolną (Rycina 5A). Chociaż całkowite gojenie nastąpiło szybciej w modelu stemplowym niż w grupie z zaszytym metalowym pierścieniem, który ogranicza skurcz rany, w początkowym 7-dniowym okresie nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w tempie gojenia (Rycina 5B). Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami przeprowadzonymi przez Lin i wsp., sugerującymi, że pierwsze 10 dni gojenia skóry myszy obejmuje przede wszystkim reepitelializację, a nie skurcz rany9.
Porównanie dysocjacji
Po szerokiej optymalizacji składu enzymatycznego kombinacja Dispase II i kolagenazy wykazała lepszą skuteczność w porównaniu z zastosowaniem pojedynczego enzymu (Tabela 1). Co istotne, obecność erytrocytów lub debris komórkowych była minimalna, co spełniało kluczowe kryteria do zastosowania w urządzeniu, obejmujące żywotność komórek powyżej 85% oraz stopień agregacji poniżej 20%.
W przeciwieństwie do tego, podejście z wykorzystaniem zestawu testowego przyniosło obiecujące rezultaty, charakteryzujące się stosunkowo wyższą żywotnością komórek i niższym wskaźnikiem agregacji komórkowej (Tabela 1). Co więcej, nie zaobserwowano erytrocytów ani fragmentów komórek, co wskazuje na ogólnie wyższą jakość komórek w porównaniu z innymi metodami.
Rysunek 1: Sfinalizowany model rany u myszy. (A) Reprezentatywne zdjęcie zaszytego niestandardowego metalowego pierścienia. (B) Reprezentatywne zdjęcie stempla do skóry i wyciętej rany. Średnica: 8 mm. Krawędź: 1 cm. (C) Tempo gojenia rany. Słupek błędu: błąd standardowy. Dwustronny test t (n=6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Schemat przygotowania zawiesin jednokomórkowych. Kroki obejmują pobieranie próbek, dysocjację, lizę krwinek czerwonych, usuwanie martwych komórek oraz otrzymanie zawiesiny jednokomórkowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Model rany u myszy z ranami po obu stronach. (A) Przedstawiono reprezentacyjny obraz modelu rany u myszy z ranami po obu stronach. Białe okrągłe odniesienie średnicy: 8 mm. (B) Reprezentacyjny obraz gojenia ran w różnych punktach czasowych dla ran po obu stronach. Skóra na grzbiecie myszy w pobliżu ogona goiła się szybciej niż ta w pobliżu karku. Biały kwadratowy obiekt referencyjny krawędź: 1 cm. Biały okrągły obiekt referencyjny średnica: 8 mm. Skróty: POD = dni pooperacyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Model rany u myszy z pojedynczymi ranami. (A) Reprezentatywne zdjęcie gojenia ran na różnych etapach wzrostu włosów u 7-tygodniowych myszy. Myszy znajdują się na różnych etapach wzrostu włosów w POD 10. Ciemniejsza skóra goiła się szybciej. (B) Reprezentatywne zdjęcie gumowych pierścieni klejących. Krawędź białego kwadratowego obiektu referencyjnego: 1 cm. (C) Reprezentatywne zdjęcie linii szwów. Średnica białego okrągłego obiektu referencyjnego: 8 mm. Skróty: POD = dni pooperacyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 5: Szybkość zamykania rany. (A) Porównanie między grupą kontrolną a grupą hucMSC-Exo. Słupki błędów reprezentują błędy standardowe. Dwustronny test T (n=6). (B) Porównanie między grupą ze stemplami a grupą z metalowymi pierścieniami. Słupki błędów reprezentują błędy standardowe. Istotność obliczono za pomocą dwustronnego testu t (n=6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Wskaźnik żywotności komórek | Szybkość agregacji komórek | |
| Metoda opracowana wewnętrznie | 86.90% | 18.50% |
| Metoda z wykorzystaniem zestawu testowego | 90.65% | 13.73% |
Tabela 1: Żywotność i stopień agregacji dla dwóch podejść do przygotowania komórek.
Dyskusja
Dla powodzenia protokołu niezbędnych było kilka kluczowych kroków. Kroki te obejmowały precyzyjne przygotowanie obszaru rany poprzez dokładne golenie i czyszczenie, tworzenie standaryzowanych ran o określonej wielkości i głębokości oraz staranną pielęgnację po ranie w celu monitorowania infekcji i zastosowania odpowiedniego leczenia. Standaryzacja tych procedur zapewniła spójność we wszystkich warunkach eksperymentalnych, zwiększając w ten sposób wiarygodność i odtwarzalność wyników10.
Do sekwencjonowania zastosowaliśmy znakowanie stemplem rany, ponieważ inne metody wprowadzają dodatkowe zmienne, takie jak zadrapanie rany myszy i rozdarcie szwu 2,5. Model stempla poprawia początkową konsystencję ran u myszy i zapewnia ustandaryzowany punkt odniesienia do oceny gojenia się ran, zmniejszając potencjalne niedokładności w szacowaniu szybkości gojenia się ran w modelach mysich. Dodatkowo stempel ułatwia korzystanie z oprogramowania takiego jak ImageJ. Ponieważ jednak do zakrycia rany nie stosuje się opatrunku, metoda stemplowania ma znacznie wyższe wymagania dotyczące dezynfekcji środowiska. Eksperyment będzie musiał zostać powtórzony, jeśli dojdzie do infekcji.
Zmienność biologiczna wśród poszczególnych myszy może wprowadzać zmienność do wyników eksperymentalnych, co wymaga większych rozmiarów próbek do solidnych analiz statystycznych. Model ten można rozszerzyć na inne techniki sekwencjonowania, takie jak sekwencjonowanie przestrzenne, aby jeszcze bardziej zwiększyć jego użyteczność.
Optymalizacja warunków dysocjacji scRNA-Seq i wybór odpowiednich metod dysocjacji są krytycznymi krokami w przebiegu eksperymentu. Obecnie powszechnie stosowane metodologie obejmują trawienie enzymatyczne w połączeniu z zalecanym podejściem opartym na odczynnikach 10x genomics11. Warto zauważyć, że trawienie enzymatyczne jest znacznie bardziej opłacalne niż metoda oparta na odczynnikach; Wymaga jednak wielu iteracji przedeksperymentalnych, aby zoptymalizować wybór enzymów i czas trawienia.
W tym badaniu przeprowadzono wstępne eksperymenty z użyciem różnych kombinacji enzymów. Wybrana metoda spełniała podstawowe wymagania dotyczące dalszej kontroli jakości, pomimo braku zestawu 10-krotnego odczynnika genomicznego zaprojektowanego specjalnie do dysocjacji skóry myszy o pełnej grubości. Zamiast tego użyto zestawu do dysocjacji wielotkankowej 1 w celu uzyskania wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych. Należy jednak zwrócić uwagę na stosunkowo wysokie koszty związane z tą metodą, chociaż oferuje ona lepszą stabilność w porównaniu z wewnętrznymi technikami trawienia enzymatycznego. W przypadku cennych próbek zaleca się stosowanie metody dysocjacji opartej na odczynniku 10x genomics.
Kluczowe znaczenie ma rozważenie potencjalnego wpływu zmienności międzyosobniczej na żywotność komórek, ponieważ może to spowodować, że niektóre próbki nie spełnią wymaganych kryteriów, a tym samym wpłyną na jakość dalszych danych12.
Pozytywnym aspektem jest to, że metoda ta stwarza możliwości integracji z transkryptomiką przestrzenną lub innymi podejściami multiomicznymi, oferując w ten sposób bardziej kompleksowe ramy analityczne13. Co więcej, jego potencjalne zastosowania kliniczne podkreślają jego wszechstronność i znaczenie wykraczające poza podstawowe konteksty badawcze.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (#82373494).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 75% myszy Alcolchol | Liuhe | JIUJING500ML | |
| C57/BL6J | Charles River Laboratories | ||
| Kolagenaza D + Dyspaza II | Roche | 11088858001 | |
| Kolagenaza I | Roche | 5349907103 | |
| Kolagenaza IV | Waciki | ||
| Haishi | MIANQIAN | ||
| Zestaw do usuwania martwych komórek | Miltenyi Biotec | 130-090-10 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| gentleMAC Disocjator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Medyczna nić nylonowa | Jinlong | HM507 | |
| Zestaw do dysocjacji wielotkankowej 1 | Miltenyi Biotec | 130-110-201 | |
| igła do biopsji | Integra Miltex | ||
| roztwór do lizy czerwonych krwinek | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| Nożyczki chirurgiczne | Jinglu | JIANDAO | |
| Biała wazelina | Shangyuan | BAIFANSHILIN |
Bibliografia
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wu, J., Landén, N. X. Investigation of skin wound healing using a mouse model. Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265(2013).
- Ganguli-Indra, G. Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model. Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).
- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
- Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells. Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).
- Dead cell removal kit. , Available from: https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline (2015).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
- Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy. STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).
- Gao, C., Zhang, M., Chen, L. The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium. Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
Przedruki i uprawnienia
