Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych w celu zbadania bariery nabłonkowej w eozynofilowym zapaleniu przełyku

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66503

⸱

10 maja 2024

 , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, University Digestive Healthcare Center, Clarunis

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj dostępny jest protokół hodowli ludzkich organoidów przełykowych i kultury na granicy faz powietrze-ciecz. Kultura granicy faz powietrze-ciecz organoidów przełyku może być wykorzystana do badania wpływu cytokin na barierę nabłonkową przełyku.

Streszczenie

Nabłonek płaskonabłonkowy przełyku jest bezpośrednio wystawiony na działanie środowiska, stale napotykając obce antygeny, w tym antygeny pokarmowe i mikroby. Utrzymanie integralności bariery nabłonkowej ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania infekcjom i unikania stanów zapalnych spowodowanych przez nieszkodliwe antygeny pochodzące z żywności. Niniejszy artykuł zawiera uproszczone protokoły generowania ludzkich organoidów przełyku i kultur granicy faz powietrze-ciecz z biopsji pacjenta w celu zbadania przedziału nabłonkowego przełyku w kontekście homeostazy tkanek i choroby. Protokoły te były znaczącymi kamieniami milowymi w nauce w ostatniej dekadzie, opisując trójwymiarowe struktury przypominające narządy z komórek pierwotnych pochodzących od pacjenta, organoidów i kultur granicy faz powietrze-ciecz. Dają one możliwość zbadania funkcji określonych cytokin, czynników wzrostu i szlaków sygnałowych w nabłonku przełyku w trójwymiarowych ramach przy jednoczesnym zachowaniu właściwości fenotypowych i genetycznych dawcy. Organoidy dostarczają informacji na temat mikroarchitektury tkanek poprzez ocenę transkryptomu i proteomu po stymulacji cytokin. Natomiast kultury granicy faz powietrze-ciecz umożliwiają ocenę integralności bariery nabłonkowej poprzez pomiary oporu przeznabłonkowego (TEER) lub strumienia makrocząsteczek. Połączenie tych organoidów i kultur granicy faz powietrze-ciecz jest potężnym narzędziem do przyspieszenia badań nad upośledzoną barierą nabłonkową przełyku.

Wprowadzenie

Zapalenie przełyku narusza integralność bariery nabłonkowej1,2,3,4,5, jak zaobserwowano w eozynofilowym zapaleniu przełyku (EoE), przewlekłej chorobie zapalnej przełyku zdominowanej przez Th26. EoE został po raz pierwszy opisany w latach 90. XX wieku7,8 i jest głównie indukowany przez antygeny pokarmowe9,10,11,12,13. Najczęściej występującymi objawami EoE w populacji dorosłych są dysfagia i zaklinowanie pokarmowe14. U dzieci EoE zazwyczaj objawia się brakiem rozwoju, odmową jedzenia, wymiotami i bólem brzucha15. Badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) zidentyfikowały geny ryzyka EoE zaangażowane w integralność bariery nabłonkowej, przenosząc nabłonek w centrum badań EoE16,17,18. Transkryptomika EoE ujawniła ponadto, że upośledzony proces różnicowania i reaktywny przerost strefy podstawowej powodują upośledzoną funkcję bariery nabłonka przełyku3,5,19,20,21,22. Wczesne zrozumienie, że EoE jest chorobą zależną od Th26 doprowadziło do odkrycia IL-13 jako mediatora napędzającego poprzez naruszenie integralności nabłonka3,4,21,23. Systemy eksperymentalne pozwalające na analizę wpływu cytokin na integralność nabłonka od wewnętrznego uszkodzenia bariery poprzez predyspozycje genetyczne dają możliwość badania złożonych interakcji między komórkami odpornościowymi a nabłonkiem w EoE. Ludzkie organoidy przełykowe i kultury granicy faz powietrze-ciecz (ALI) zostały zaproponowane jako cenne narzędzia do analizy wpływu stymulacji cytokin na integralność nabłonka5.

Pierwszy protokół generowania organoidów przełyku pochodzących z dorosłych tkanek macierzystych (ASC) został ustanowiony pięć lat po pierwszych opublikowanych raportach o organoidach jelitowych w 2009 roku przy użyciu jelitowych LGR5+ ASC rekapitulujących nabłonek jelita cienkiego24. DeWard i wsp. byli pionierami w generowaniu organoidów z mysich komórek nabłonka przełyku25. W 2018 roku Kasagi i in. wygenerowali ludzkie organoidy przełyku z unieśmiertelnionej ludzkiej linii komórkowej nabłonka płaskonabłonkowego przełyku EPC2-hTERT i pierwotnych komórek pochodzących od pacjenta26. W tym samym roku Zhang i in. z powodzeniem wygenerowali organoidy przełyku pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Określili znaczenie TGFβ i hamowania morfogenetycznego białka kostnego (BMP) dla rozwoju komórek progenitorowych przełyku (EPC) oraz kluczową rolę sygnalizacji Notch w różnicowaniu warstwowego nabłonka płaskonabłonkowego26,27. Trisno i współpracownicy uzupełnili te odkrycia, identyfikując Sox2 jako inhibitor Wnt, który kieruje losy rozwojowe w kierunku różnicowania przełyku28. Kolejne udoskonalenia protokołów, składu podłoża i warunków hodowli zwiększyły tempo tworzenia organoidów i umożliwiły subkulturację i odzyskiwanie organoidów po kriokonserwacji26,29,30,31,32. Chociaż organoidy te są potężnymi narzędziami do badania architektury tkanek i ekspresji potencjalnych genów docelowych po stymulacji cytokinami, organoidy przełyku nie zapewnią możliwości pomiaru oporności przeznabłonkowej (TEER) lub strumienia makrocząsteczek jako bezpośrednich miar integralności bariery. Jak wcześniej opisali Sherrill i współpracownicy22, kultury ALI modelujące różnicowanie nabłonka4 umożliwiają bezpośrednią ocenę integralności nabłonka. Połączenie organoidów pochodzących od pacjentów i kultur ALI jest potężnym narzędziem do badania architektury tkanek i integralności bariery nabłonkowej w EoE.

Oto procedury z instrukcjami izolowania żywych komórek z biopsji przełyku i tworzenia organoidów przełyku oraz kultur ALI, które mogą być dalej wykorzystywane do badania wpływu cytokin na integralność bariery.

Protokół

Procedury zostały zatwierdzone przez komisję etyki północno-zachodniej i środkowej Szwajcarii (EKNZ; Identyfikator projektu 2019-00273). Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę na eksperymentalne zastosowanie biopsji przed badaniem endoskopowym. Odczynniki i sprzęt użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja komórek dla organoidów przełyku pochodzących od pacjenta

UWAGA: Lista składników podłoża do hodowli ludzkich organoidów przełyku znajduje się w Tabeli 1.

  1. Uzyskaj biopsje.
    UWAGA: W niniejszym badaniu dwie biopsje z jednego segmentu przełyku są uzyskiwane podczas ezofagogastroduodenoskopii z kleszczami biopsyjnymi przy użyciu gastroskopu z kanałem roboczym 2,8 mm.
  2. Przenieś biopsje do dostępnego na rynku podłoża wolnego od keratynocytów (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE).
    UWAGA: Biopsje można przechowywać na lodzie przez kilka godzin, aż do użycia.
  3. Zastąp pożywkę KSFM 1 ml leku Dispase I (10 j./ml) i inkubuj biopsje przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odwirować biopsje w temperaturze pokojowej przy 300 x g przez 2 min.
  5. Odessać Dispase za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, nie dotykając biopsji i osadu z resztek komórek.
  6. Przepłukać biopsje 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
  7. Odwirować biopsje w temperaturze pokojowej przy 300 x g przez 2 min.
  8. Odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 1000 μl.
  9. Inkubować biopsje z 500 μl trypsyny-EDTA (0,05%) w temperaturze 37 °C przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 800 obr./min.
  10. Przerywanie mechaniczne należy przeprowadzać poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół, aż do uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
  11. Przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 70 μm za pomocą gumowej głowicy tłoka strzykawki tuberkulinowej .
  12. Umyj sitko 2-4 ml inhibitora trypsyny sojowej (250 μg/ml).
  13. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 35 μm z zatrzaskową nakrętką na okrągłodennej probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml.
  14. Przenieść roztwór jednokomórkowy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  15. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  16. Odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 1000 μl.
  17. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl pożywki KSFM.
  18. Zmieszaj 10 μl błękitu trypanowego z 10 μl zawiesiny komórek.
  19. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.

2. Hodowla organoidów pochodzących od pacjenta

  1. Po odliczeniu dodać 1-2 ml KSFM do zawiesiny komórek.
  2. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, nie naruszając osadu komórkowego.
  4. Zawiesić osad komórkowy w hydrożelowej matrycy ekstraktu z błony podstawnej (BME) (40 μl BME na 20 000 komórek).
    UWAGA: Po dodaniu BME trzymaj komórki na lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu BME.
  5. Odetnij końcówkę pipety o pojemności 200 μl, aby zassać lepką mieszaninę zawiesiny komórek BME.
  6. Uformuj 40 μl kropelek we wstępnie ogrzanej (37 °C) płytce do hodowli komórek w zawiesinie.
  7. Inkubować płytkę bez pożywki przez 20-30 minut w temperaturze 37 °C, aby zapewnić zestalenie kropelek BME.
  8. Dodaj wstępnie podgrzane podłoże KSFM-C uzupełnione 10 μM Y27632 (inhibitor ROCK) przez pierwsze dwa dni hodowli.
  9. Wymieniaj pożywkę na nową pożywkę KSFM-C (bez Y27632 i +/- cytokiny będącej przedmiotem zainteresowania) co drugi dzień.
  10. Zassać pożywkę i zeskrobać kropelki końcówką pipety, ciągle dodając 1 ml Dispase II (1,5 U/ml) do dołka.
  11. Przenieść mieszaninę BME-dispazy do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i inkubować ją przez 20 minut w temperaturze 37 °C w wytrząsającej łaźni wodnej w celu wytrawienia BME.
  12. Wirować przy 250 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i zasysać Dispazę II.
  13. Postępuj zgodnie z protokołem odczytu zainteresowania (np. izolacja RNA, izolacja białka lub utrwalenie z 4% PFA do histologii).

3. Izolacja komórek dla kultur na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) pochodzących od pacjenta

  1. Uzyskaj biopsje. Podczas ezofagogastroduodenoskopii przy użyciu gastroskopu z kanałem roboczym 2,8 mm pobiera się dwie biopsje z jednego odcinka przełyku za pomocą kleszczy biopsyjnych.
  2. Umieścić biopsje w dostępnym na rynku podłożu bez surowicy keratynocytów (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE) i przechowywać na lodzie przez kilka godzin do użycia.
  3. Zamień KSFM na 1 ml dypazy (10 U/ml). Następnie inkubować biopsje przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odwirować biopsje w temperaturze pokojowej przy 300 x g przez 2 min.
  5. Usunąć Dispase za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, nie dotykając biopsji i osadu z resztek komórek.
  6. Umyj biopsje 1 ml DPBS.
  7. W temperaturze pokojowej odwirowywać biopsje przy 300 x g przez 2 minuty.
  8. Odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 1000 μl.
  9. Inkubować biopsje w 500 μl trypsyny-EDTA (0,05%) w temperaturze 37 °C przez 10 minut i ciągle mieszać z prędkością 800 obr./min podczas inkubacji.
  10. Mechanicznie przerwać biopsje, powtarzając pipetowanie góra-dół, aż do uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
  11. Przepuścić zdysocjowane komórki przez sitko o wielkości 70 μm z gumową głowicą tłokową ze strzykawki tuberkulinowej i zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  12. Umyj sitko 2-4 ml inhibitora trypsyny sojowej (250 μg/ml), aby usunąć pozostałe komórki z sitka.
  13. Przefiltruj komórki za pomocą zatrzaskowego sitka o średnicy 35 μm do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml.
  14. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  15. Wirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min.
  16. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
  17. Zawiesić osad komórkowy w 4 ml pożywki KSFM (Ca2 + 0,09 mM), w tym 10 μM Y27632.
  18. Przenieść komórki do kolby do hodowli komórek T25.
  19. Aby rozszerzyć pierwotne keratynocyty, hoduj komórki do zbiegu 60%-80% przez około 1 tydzień.
    UWAGA: Pasaż (P)0 tworzy konglomeraty komórkowe przypominające wysepki i nie jest monowarstwą. Keratynocyty pierwotne tworzą monowarstwy od P1 wzwyż.
  20. Pasaż przy konfluencji 60%-80% i ponowne wysiewanie P1 w 2-3 kolbach do hodowli komórkowych T25 lub 1-2 T75.
  21. Ponownie pasaż P1, gdy keratynocyty tworzą monowarstwę o zbiegu 60%-80%.

4. Hodowla interfejsu powietrze-ciecz (ALI) pochodząca od pacjenta

  1. Wysiewaj pierwotne keratynocyty P2 na wkładki transwell do hodowli ALI.
    UWAGA: Wysiewaj 400 000 komórek w 12 wkładkach dołkowych (200 000 keratynocytów na 0,6 cm2) w 500 μl KSFM (Ca2 + 0,09 mM, 1 ng / ml EGF, 50 μg / ml BPE).
    1. Wysiewaj 150 000 komórek w 24 wkładkach dołkowych (155 000 keratynocytów na 0,5 cm2) w 100 μl KSFM (Ca2 + 0,09 mM, 1 ng / ml EGF, 50 μg / ml BPE).
    2. Alternatywnie, zamrozić w pożywce KSFM (Ca2 + 0,09 mM + 10% DMSO) w temperaturze -80 °C przez 24 godziny, a następnie przenieść zamrożone komórki do ciekłego azotu w celu późniejszego wykorzystania.
      UWAGA: W przypadku stosowania zamrożonych fiolek, należy ponownie przejść przez nie po rozmrożeniu przed użyciem komórek do hodowli ALI.
  2. Dodać pożywkę do dolnej studzienki pod wkładką płytki hodowlanej transwell.
    UWAGA: Dla płytek 12-dołkowych: 1,5 ml KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE). Dla płytek 24-dołkowych: 600 μl KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE).
  3. Wymień średni lub wysoki poziom wapnia KSFM (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE) po 2 dniach.
  4. Zmieniaj pożywkę KSFM o wysokiej zawartości wapnia co drugi dzień, aż do 7 dnia.
  5. Wykonaj transport powietrzny w dniu 7, odsysając pożywkę z górnej komory i zastępując pożywkę w dolnej komorze KSFM o wysokiej zawartości wapnia (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/ml EGF, 50 μg/ml BPE) zawierającą 10 ng/ml KGF (=FGF7), 75 μg/ml kwasu askorbinowego (AA).
    1. Opcjonalnie: Dodać do pożywki interesujące nas cytokiny o pożądanym stężeniu.
  6. Zmieniaj podłoże co drugi dzień aż do 14 dnia.

5. Pomiar przezepitelowej rezystancji elektrycznej (TEER)

  1. Wysterylizuj elektrodę miernika TEER, zanurzając ją w studzience 24-dołkowej płytki z 5% podchlorynem sodu na 10-15 minut.
  2. Zmyć 5% podchloryn sodu, zanurzając elektrodę w 4 kolejnych studzienkach ze sterylnym ddH2O i pozostawiając elektrodę do wyschnięcia na powietrzu.
  3. Ustawić ślepą próbę, umieszczając jedną elektrodę w studzience, a drugą elektrodę we wkładzie transwell, wypełniając ją PBS i mierząc TEER.
    UWAGA: Zalecane objętości do pomiarów TEER: Dla płytki 12-dołkowej (1900 μl w studzience i 900 μl we wkładce). Do płytki 24-dołkowej (750-1000 μl w studzience i 250 μl we wkładce).
  4. Zastąp pożywkę z kultur ALI sterylnym PBS.
    w temperaturze pokojowej UWAGA: Usuń pożywkę z dolnej studzienki, a w drugim kroku z wkładu transwell. Podobnie, należy dodać PBS najpierw do wkładki, a następnie do dolnej studzienki, aby zapobiec oderwaniu się kultury ALI od membrany transwell.
  5. Umieść elektrody miernika TEER w dołkach doświadczalnych z kulturami ALI i wykonaj pomiar TEER1.
    UWAGA: Pomiary TEER należy wykonywać co drugi dzień przed wymianą podłoża.

6. Strumień makromolekularny

  1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy FITC-Dekstranu (3-5 kDa) do roboczego stężenia 1 mg/ml.
    UWAGA: Zawsze chroń FITC-Dextran przed ekspozycją na światło.
  2. Przygotować rząd rozcieńczeń ze zmniejszającym się stężeniem FITC (od 1000 μg/ml do 0,25 μg/ml) jako wzorzec do odczytu.
  3. Dodać 500 μl roztworu FITC-dekstranu (1 mg/ml) do górnej komory transwella i 1,5 ml pożywki (+/- cytokiny będące przedmiotem zainteresowania) do dolnej komory i umieścić płytkę w inkubatorze.
  4. Zebrać 120 μl pożywki z dolnej komory w odpowiednich punktach czasowych (np. 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min i 180 min).
  5. Pipeta duplikuje (50 μl/studzienkę) każdego punktu czasowego na czarną, 96-dołkową, przezroczystą płytkę z płaskim dnem.
  6. Wzbudzić dekstran FITC przy długości fali 490 nm i odczytać emisję przy długości fali 520 nm za pomocą czytnika płytek.
  7. Oblicz wielkość strumienia wielkocząsteczkowego zgodnie z normą.

Wyniki

Organoidy przełyku będą rosły z komórek pierwotnych wyizolowanych z biopsji pacjentów zgodnie z instrukcjami dostarczonego protokołu, co udokumentowano za pomocą odwróconego mikroskopu w polu jasnym (Rysunek 1). Nabłonkowe ASC zaczynają tworzyć skupiska komórek w sposób samoorganizujący się w ciągu pierwszych dwóch dni hodowli po wysianiu wyizolowanych komórek w ekstrakt błony podstawnej, który służy jako rusztowanie. Wielkość i liczba skupisk komórek, widoczne w odwróconym mikroskopie w polu jasnym, stale wzrastają w ciągu pierwszego tygodnia (Rysunek 2). Jednak na tym etapie skupiska komórek nie posiadają struktury przypominającej cebulę, charakterystycznej dla wielowarstwowego nabłonka płaskiego organoidu przełyku pochodzącego z ASC. W 9. dniu hodowli widoczna staje się wielowarstwowa struktura przypominająca cebulę oraz rosnący zrogowaciały rdzeń w centrum organoidu (Rysunek 2A). Hodowla organoidów może być utrzymywana do 21 dni26. Wykazano jednak, że organoidy osiągają pełną dojrzałość i maksymalną wielkość między 11. a 14. dniem. Od 11. dnia proces hodowli charakteryzuje się głównie postępującym zrogowaceniem i zmniejszeniem liczby metabolicznie aktywnych, żywych komórek5,26. Zatem optymalny czas pobrania organoidów do eksperymentów zależy od pożądanego stopnia różnicowania i przypada między 5. a 11. dniem.

Możliwe jest przeprowadzenie do 3 pasaży, zanim organoidy przestaną rosnąć z powodu zwiększającego się rdzenia keratynowego, który redukuje liczbę żywotnych komórek. Organoidy można zebrać w wybranych dniach w celu izolacji RNA lub białek do analizy ekspresji genów/białek, a także do badań histologicznych i biobankowania.

Wstępne etapy izolacji komórek dla hodowli ALI i organoidów są identyczne. Zanim zostanie ustanowiona hodowla ALI, świeżo wyizolowane komórki pierwotne muszą zostać namnożone, w przeciwieństwie do protokołu dla organoidów. Po drugim pasażu pierwotne keratynocyty wysiewa się na wkładki transwell i hoduje w medium o niskim stężeniu wapnia, aby indukować tworzenie monowarstwy i zapobiec przedwczesnemu różnicowaniu wyizolowanych pierwotnych keratynocytów. Po 48 h, gdy powstanie konfluentna monowarstwa, stężenie wapnia w medium zwiększa się do 1.8 mM, co indukuje różnicowanie i stratyfikację warstwy nabłonka. Po 7 dniach procedura airlift wystawia stronę apikalną wielowarstwowego nabłonka na działanie powietrza, aby wywołać keratynizację. Hodowle ALI można zazwyczaj utrzymywać do 14 dni (Rysunek 2B). Funkcjonalność nabłonka będzie monitorowana za pomocą pomiarów TEER i eksperymentów dotyczących strumienia makromolekularnego. W niniejszej pracy pomiary TEER przeprowadzono w hodowlach ALI z pierwotnych keratynocytów przełyku, w hodowlach ALI z pierwotnych keratynocytów z warstwą wspomagającą fibroblastów NIH/3T3 na dnie każdej studni oraz w hodowlach ALI z pierwotnych keratynocytów z warstwą wspomagającą fibroblastów NIH/3T3 na każdej wkładce (Rysunek 2C).

Proces hodowli organoidów: pobranie próbki, dysocjacja enzymatyczna, hodowla, analiza; schemat.
Rycina 1: Proces hodowli organoidów przełyku pochodzących od pacjenta. Schemat ilustrujący procedurę pobierania próbek, izolację komórek, hodowlę organoidów oraz potencjalne zastosowania eksperymentalne organoidów przełyku pochodzących od pacjenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Etapy wzrostu hodowli keratynocytów, przekrój histologiczny, wykres TEER; badanie z zakresu eksperymentalnej biologii komórki.
Rysunek 2: Tworzenie i różnicowanie organoidów przełyku pochodzących od pacjentów. (A) Reprezentatywne obrazy w polu jasnym organoidów przełyku hodowanych z pierwotnych komórek pochodzących z biopsji pacjenta. (B) Reprezentatywne obrazy w polu jasnym kultur ALI przełyku hodowanych z pierwotnych komórek pochodzących z biopsji w 14. dniu. Paski skali: 50μM. (C) Pomiary transepitelialnej oporności elektrycznej (TEER) we wskazanych dniach w kulturach na granicy powietrze-ciecz (ALI) z pierwotnych keratynocytów przełyku, kulturach ALI z pierwotnych keratynocytów z warstwą zasilającą fibroblastów NIH/3T3 na dnie każdej studni oraz kulturach ALI z pierwotnych keratynocytów z warstwą zasilającą fibroblastów NIH/3T3 na każdym wkładzie pod warstwą keratynocytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

PożywkaKSFMKSFM-C
Pożywka podstawowapodłoże Keratinocyte-SFMKeratinocyte-SFM
Materiały uzupełniającePenicylina/Streptomycyna1%1%
ekstrakt z przysadki bydlęcej (BPE)50 μg/mL50 μg/mL
Epidermalny czynnik wzrostu (EGF)1 ng/ml1 ng/mL
chlorek wapnia (CaCl2)2)0,09 mM0,6 mM
Y-27632 (inhibitor ROCK)-10 μM

Tabela 1: Pożywka do organoidów przełyku pochodzących z komórek pierwotnych.Lista składników pożywki do hodowli ludzkich organoidów przełyku. SFM: Pożywka bezsurowicza.

Dyskusja

Dostarczone procedury pozwalają na hodowlę organoidów i kultur ALI pochodzących od pacjentów z dużymi szansami na sukces. Protokół organoidowy został zaadaptowany z pierwszego opublikowanego protokołu opisującego wytwarzanie ludzkich organoidów przełyku26 oraz z niedawno opublikowanego protokołu32. Sherill i jego współpracownicy opisali model ALI22. Organoidy i modele hodowli ALI pomagają sobie nawzajem w badaniu wpływu cytokin i innych mediatorów na barierę nabłonkową przełyku w kontekście chorób przełyku, takich jak EoE 5,26.

Jedną z zalet protokołu organoidowego jest jego prostota w procesie hodowli i składzie pożywki do hodowli komórkowych. W przeciwieństwie do innych protokołów opartych na ASC i PSC, które w większości wymagają dodania wielu drogich suplementów i czynników wzrostu 24,25,27,28,33, podłoże KSFM jest stosunkowo niedrogie. Wymaga jedynie dodania ludzkiego rekombinowanego nabłonkowego czynnika wzrostu (hEGF) i ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE). KSFM jest pożywką bazową zoptymalizowaną pod kątem hodowli keratynocytów i eliminuje potrzebę stosowania warstwy zasilającej fibroblasty34. Konieczne jest miareczkowanie stężenia Ca2+ w KSFM od 0,09 mM do 0,6 mM przy użyciu CaCl2 w celu otrzymania pożywki KSFM-C stosowanej do hodowli organoidów. Hodowle ALI wymagają wyższego stężenia Ca2+ wynoszącego 1,8 mM niż model organoidowy. Wysokie stężenie Ca2 + jest niezbędne do zainicjowania różnicowania keratynocytów, a następnie ułatwienia tworzenia typowej cebuli konfiguracji wielowarstwowego nabłonka płaskonabłonkowego obecnego w organoidach przełyku 26,34,35 i stratyfikacji nabłonka w kulturach ALI 22.

Zapobieganie przedwczesnemu różnicowaniu keratynocytów, wytwarzaniu organoidów i kultur ALI wymaga unikania wysokich stężeń Ca2+ podczas izolacji komórek. Wczesne różnicowanie zmniejsza tworzenie się kolonii i utrudnia samoorganizujące się tworzenie organoidów oraz tworzenie zlewającej się monowarstwy niezróżnicowanych keratynocytów jako podstawy kultur ALI. Użycie pożywki zawierającej surowicę w celu zatrzymania aktywności enzymatycznej trypsyny podczas izolacji komórki upośledza pomyślne wytwarzanie organoidów poprzez wywołanie przedwczesnego różnicowania, podobnie jak przy użyciu pożywki wzbogaconej w Ca2 + podczas izolacji komórek36. Zamiast tego zaleca się inhibitor trypsyny sojowej lub inny inhibitor trypsyny bez surowicy, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną po trawieniu trypsyną podczas biopsji. Pożywka hodowlana jest uzupełniana inhibitorem kinazy Rho (ROCK) Y27632 w ciągu pierwszych dwóch dni hodowli w celu zwiększenia szybkości tworzenia kolonii. Hamowanie ROCK ma działanie antyapoptotyczne, zapobiega starzeniu się keratynocytów, a tym samym poprawia tempo tworzenia organoidów37,38.

Zaleca się wysiewanie około 20 000 komórek w 40 μl kropli BME, aby zapewnić kwitnącą hodowlę organoidów i od 150 000 do 400 000 komórek do hodowli ALI. Odpowiednia liczba wysiewów komórek zagwarantuje wystarczającą ilość materiału do późniejszej transkryptomiki, proteomiki i histologii. W przypadku wykorzystania linii komórkowych, takich jak ludzka linia komórkowa nabłonka przełyku EPC2-hTERT, liczba komórek wysiewających może zostać zmniejszona ze względu na zwiększoną szybkość tworzenia organoidów wykazywaną przez tę linię komórkową26. Zjawisko to jest prawdopodobnie przypisywane jednorodności i lepszej synchronizacji cyklu komórkowego wykazywanej przez linie komórkowe w porównaniu z komórkami pierwotnymi pochodzącymi z biopsji. Unieśmiertelniona linia komórkowa EPC2-hTERT zachowuje również swoją zdolność proliferacyjną, umożliwiając nieskończone pasażowanie organoidów.

I odwrotnie, ludzkie organoidy pochodzące z biopsji przełyku nie mogą być utrzymywane przez długotrwałą hodowlę26,28. Spadek dzielących się, żywotnych komórek w obrębie w pełni rozwiniętych organoidów przełyku i zmniejszające się tempo tworzenia organoidów z każdym pasażem26 wskazuje, że utrata zdolności proliferacyjnej w organoidach pochodzących z pierwotnych komórek jest spowodowana końcowym różnicowaniem i keratynizacją komórek progenitorowych. Poprzednie próby utrzymania zdolności proliferacyjnej poprzez uzupełnienie pożywki hodowlanej Nogginem, Wnt3a lub A83-01 zakończyły się niepowodzeniem 26,28,32. W związku z tym długoterminowe biobankowanie organoidów przełyku pochodzących od pacjentów pozostaje wyzwaniem, które musi zostać rozwiązane w przyszłych badaniach.

Pojawienie się hodowli organoidów przyniosło nowe możliwości eksperymentalne, które w znacznym stopniu umożliwiły odkrycie kluczowych mediatorów stanu zapalnego i czynników środowiskowych odpowiedzialnych za zmiany nabłonkowe w EoE 5,39,40,41,42. Niemniej jednak należy zauważyć, że organoidy przełyku pochodzące z ASC i PSC mają ograniczenia, ponieważ nie oddają idealnie wszystkich przedziałów komórkowych przełyku. Organoidy pochodzące z ASC rekapitulują przedział nabłonkowy 24,26,27,33, podczas gdy organoidy pochodzące z PSC rekapitulują przedziały nabłonkowe, śródbłonkowe i mezenchymalne 28,43,44. Jednak wszystkie obecne modele organoidów nie mają mikrośrodowiska immunologicznego. W niedawnym badaniu ludzkie organoidy przełyku i kultury ALI zostały stymulowane cytokinami z rodziny cytokin IL-20 w celu rozszyfrowania nowego aspektu dysfunkcji bariery nabłonkowej w EoE5. Połączenie obu trójwymiarowych modeli kultur pozwoliło ocenić pośrednie i bezpośrednie miary integralności bariery nabłonkowej. W kolejnych publikacjach prawdopodobnie zostaną wykorzystane organoidy przełykowe w połączeniu z kulturami ALI, aby wyjaśnić wpływ zdefiniowanych cytokin na nabłonek. Chociaż takie podejście zmniejsza złożoność wzajemnych oddziaływań między układem odpornościowym a nabłonkiem, aby ujawnić funkcję określonych mediatorów na nabłonku, zaniedbuje wiele innych potencjalnie zaangażowanych czynników. Połączenie technologii organoidów i narządów na chipie może stanowić rozwiązanie tego problemu. Oparta na mikrofluidyce technologia organ-on-a-chip może replikować mikrośrodowisko świetlne i podstawno-boczne narządów rurkowych, umożliwiając wnikanie i odpływ komórek odpornościowych oraz innych elementów krążenia i światła. Umożliwia to badanie interakcji między nabłonkiem a komórkami odpornościowymi w homeostazie i chorobie45,46. Udana hodowla fizjologicznie spolaryzowanych organoidów kanalików nerkowych wykazujących nienaruszoną barierę nabłonkową i funkcjonalny transnabłonkowy transport jonów na platformie narządu na chipie47 wspiera szersze zastosowanie technologii organoidów na chipie pochodzących od pacjenta. Co więcej, kolejny postęp w wykorzystaniu technologii organoidów na chipie wykazano poprzez rozszerzoną hodowlę organoidów pochodzących z komórek pierwotnych poprzez wdrożenie przepływu światła przez kanały mikroprzepływowe po wierzchołkowej stronie organoidów rurkowych w celu wyeliminowania złuszczania komórek nabłonkowych46. Postępy te podkreślają potencjał tej technologii w zakresie replikacji środowisk in vivo in vitro.

Zdolność do hodowli organoidów 3D, które przypominają wszystko, od przedziału nabłonkowego po prawie kompletny mini-narząd z większością typów komórek, skłania do możliwych zastosowań klinicznych 5,26,46. Chociaż w ostatnich latach poczyniono znaczne postępy, należy pokonać dodatkowe przeszkody, zanim organoidy będą mogły być stosowane w praktyce klinicznej. Istotną przeszkodą w klinicznym wdrożeniu organoidów jest obecność białek pochodzenia zwierzęcego w pożywce hodowlanej i rusztowaniach ECM. Chociaż pożywki do hodowli keratynocytów bez białek zwierzęcych są już dostępne, a ostatnio pojawiły się warianty KSFM wolne od BPE, produkcja bezbiałkowych alternatyw ECM o podobnych właściwościach i wynikach hodowli do tradycyjnych produktów ECM wydaje się bardziej wymagająca. Ostatnio doniesiono o potencjalnie obiecującej, w pełni zsyntetyzowanej chemicznie alternatywie48. Niemniej jednak obecnie nie ma komercyjnie dostępnego produktu ECM wolnego od pochodzenia zwierzęcego.

Organoidy przełyku i hodowle ALI są niezbędnymi instrumentami do badania EoE. Hodowla organoidów i kultur ALI z dostarczonymi tutaj protokołami posłużyła jako podstawa dla nowych odkryć dotyczących udziału przedziału nabłonkowego w eozynofilowym zapaleniu przełyku 5,26,39,41,42,49,50 . Prosta implementacja tych protokołów i ciągły postęp technologii trójwymiarowych hodowli komórkowych ułatwia eksperymentalne przybliżenie do środowiska in vivo, co skutkuje zwiększoną przekładalnością odkryć i być może stopniowym ograniczeniem eksperymentów na zwierzętach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Grant SNSF 310030_219210 dla J.H.N. wsparł publikację tego manuskryptu bez ograniczeń. Rysunek 1 został stworzony przy pomocy BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1250 i mikro; L Griptip - FiltrIntegra4445
300 µ L Griptip - FiltrIntegra4435
70 µ Sitko do komórek MSarstedt83.3945.070
Kwas askorbinowySigma-Aldrich (Merck)A4544
Ekstrakt z przysadki bydlęcejGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Chlorek wapniaSigma-Aldrich (Merck)21115
Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych CELLSTAR do kultur zawiesinowychGreiner Bio-One7.657 185
Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex (BME), typ 2, PathclearR& D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimetylosulfotlenek (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Sól fizjologiczna buforowana fosforanem  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Automatyczny licznik komórekNanoEntekEVE-MC
EVE Szkiełko do liczenia komórekNanoEntekEVS-050
Falcon 5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z sitkiem do komórek Snap CapFalcon352235
Izotiocyjanian fluorescyny (FITC)-dekstranSigma-Aldrich (Merck)FD4średnia mol wag. 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Ludzki rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostuGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratynocyty-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicylina-StreptomycynaGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Rekombinowane ludzkie białko KGF/FGF-7 R& D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Rurka z nakrętką, 15 mLSarstedt62.554.502
Jednokanałowa EVOLVE 100-1000 µ L Integra3018
jednokanałowy EVOLVE 20-200 µ L Integra3016
Strzykawka 1 ml1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Inhibitor trypsyny z Glycine max (soja)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTA,SAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dichlorowodorekTocris (Bio-Techne)1254

Bibliografia

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355(2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755(2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), e1010 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593(2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), e515 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), e507 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109(2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106(2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 1 Suppl 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), jcs.260990 (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416(2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736(2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy prze ykugranica powietrze cieczr nicowanie nab onkowehodowla keratynocyt woporno transepitelialnastymulacja cytokinamiszlak kinazy MAP
Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych w celu zbadania bariery nabłonkowej w eozynofilowym zapaleniu przełyku
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.