Artykuł metodologiczny

Z-score do oceny rezerwy jajnikowej u młodych pacjentek poddawanych zabiegowi zachowania płodności

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66504

⸱

25 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Obstetrics and Gynecology, Department of Clinical Science, Intervention and Technology, Karolinska Institutet, 2Department of Gynecology and Reproductive Medicine, Karolinska University Hospital, 3Applied Tumor Genomics Research Program, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 4Department of Medical and Clinical Genetics, Medicum, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 5Children's Hospital, Pediatric Research Centre, University of Helsinki and Helsinki University Hospital, 6NORDFERTIL Research Lab Stockholm, Department of Women's, and Children's Health, Karolinska Institutet, and Karolinska University Hospital, 7Department of Obstetrics and Gynecology, Helsinki University Hospital, University of Helsinki, 8Department of Cell and Molecular Biology, Uppsala University, 9Department of Women's and Children's Health, Uppsala University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę oceny rezerwy jajnikowej u pacjentek poniżej 25 roku życia, które wymagają zachowania płodności poprzez krioprezerwację tkanki jajnika. Metoda ta obejmuje: (1) ocenę histologiczną rezerwy jajnikowej w próbkach korowych, (2) porównanie z referencyjnym zbiorem danych oraz (3) obliczenie wskaźników Z.

Streszczenie

Kobiety rodzą się z nieodnawialną pulą pęcherzyków jajnikowych, określaną jako rezerwa jajnikowa. Rezerwa ta składa się z pęcherzyków pierwotnych w jajnikach i może mieć wpływ wiele czynników, takich jak zaburzenia genetyczne i endokrynologiczne, interwencje medyczne i substancje zaburzające gospodarkę hormonalną. Zachowanie płodności jest zalecane, gdy konieczne jest leczenie gonadotoksyczne. Preferowanymi opcjami dla kobiet są kriokonserwacja oocytów i zarodków. Jednak u bardzo młodych, niedojrzałych płciowo pacjentek jedyną opcją jest kriokonserwacja tkanki jajnikowej. Znajomość gęstości pęcherzyków w kriokonserwowanych próbkach tkanek jest niezbędna w poradnictwie dotyczącym płodności dla młodych pacjentów. Protokół ten demonstruje wykorzystanie wskaźników Z dla gęstości pęcherzyków korowych jako narzędzia do oceny jakości tkanki jajnikowej u dziewcząt i młodych kobiet w wieku 25 lat i młodszych, które są poddawane zachowaniu płodności. Gęstość pęcherzyków w próbkach pobranych od pacjentów porównuje się ze znormalizowanymi pod względem wieku wzorcami referencyjnymi, opracowanymi przez Hassana i wsp. w celu oszacowania możliwych odchyleń od normy. Gęstość pęcherzyków mierzy się za pomocą kwantyfikacji histologicznej. W tym celu mały fragment tkanki korowej jajnika (~2 mm x 2 mm x 2 mm) utrwala się w roztworze Bouina lub roztworze formaldehydu, zatapia w parafinie, dzieli na części o grubości 4 μm, barwi hematoksyliną i eozyną i digitalizuje za pomocą skanera do slajdów. Stadia pęcherzykowe obecne w korze wahają się od pęcherzyków pierwotnych do pierwotnych. Obszar korowy znajdował się 1 mm od powierzchni nabłonka na odcinkach histologicznych. Gęstość pęcherzyków oblicza się przy użyciu zmodyfikowanego wzoru przedstawionego przez Schmidta i wsp., a wskaźnik Z określa się przy użyciu średniej referencyjnej i odchylenia standardowego. Wskaźnik Z wskazuje, jak bardzo zmierzona wartość odbiega od średniej referencyjnej, określając obniżoną (<-1,7 Z-score) rezerwę jajnikową. Dzięki tej metodzie gęstość pęcherzyków może być wykorzystana jako cenny pomiar rezerwy jajnikowej dla młodych pacjentek wymagających zachowania płodności.

Wprowadzenie

Jajnik jest dynamicznym, endokrynologicznie aktywnym organem, składającym się z zewnętrznej kory i wewnętrznego rdzenia. Niejednorodnie rozmieszczone w jajnikach są pęcherzyki, które zawierają oocyt gonady otoczony komórkami ziarnistymi zrębu1. Wszystkie pęcherzyki są już formowane podczas rozwoju płodu, osiągając szczyt około 20 tygodnia wieku ciążowego, po którym następuje wykładniczy spadek. Po urodzeniu w korze pozostaje 1-2 miliony pierwotnych pęcherzyków, a tylko kilkaset tysięcy pęcherzyków przeżywa do okresu dojrzewania2. Nierosnąca pula pęcherzyków, zwana również rezerwą jajnikową, wpływa między innymi na płodność kobiety. Rezerwa jajnikowa znajduje się w korze mózgowej i przemieszcza się do rdzenia, gdy pęcherzyki rosną i dojrzewają. Niektórzy badacze uznają, że rezerwa jajnikowa składa się tylko z pęcherzyków pierwotnych, podczas gdy inni obejmują wszystkie pęcherzyki jednojajnikowe (tj. pierwotne, pośrednie i pierwotne)3,4,5,6. W ciągu życia kobiety tylko 300-400 mieszków włosowych dojrzewa i przeżywa, aby ostatecznie przejść owulację. Menopauza rozpoczyna się, gdy liczba pęcherzyków spada do około tysiąca, co zwykle występuje w wieku około 50 lat2,7. Obecnie toczy się debata na temat obecności ooogonialnych komórek macierzystych (OSC) w jajnikach dorosłych ludzi, które mogą tworzyć oocyty po ksenotransplantacji. Niektóre badania sugerują izolowanie komórek, które wyrażają profil genowy prymitywnych komórek rozrodczych i różnicują się w oocyty8,9, podczas gdy inne wskazują, że domniemane OSC są komórkami okołonaczyniowymi naczyń krwionośnych10,11,12.

Przedwczesna niewydolność jajników (POI) jest definiowana jako przerwanie cyklu miesiączkowego z podwyższonym poziomem FSH przed 40 rokiem życia13. Przyczyny POI są wieloczynnikowe i mogą występować idiopatycznie; Jednak często pojawia się w wyniku schorzeń14. Na przykład niektóre wrodzone choroby genetyczne są związane z POI ze względu na zmniejszoną rezerwę jajnikową już po urodzeniu, takie jak zespół Turnera15. POI może również wystąpić jako efekt uboczny leczenia gonadotoksycznego, co jest szczególnie problematyczne u bardzo młodych pacjentek, ponieważ może prowadzić do niemożności przejścia normalnego dojrzewania płciowego i drastycznie upośledzać rezerwę jajnikową. W zależności od ryzyka wystąpienia POI i wieku pacjentki dostępnych jest kilka opcji zachowania płodności, takich jak kriokonserwacja dojrzałych oocytów, kriokonserwacja zarodków po zapłodnieniu in vitro oraz kriokonserwacja tkanki jajnika (OTC). Dla pacjentów przed okresem dojrzewania OTC jest jedyną możliwą opcją ze względu na ich niedojrzałość płciową16,17. W Stanach Zjednoczonych zachowanie płodności za pomocą OTC zostało ostatnio uznane za akceptowalną rutynę kliniczną18. Jednak OTC jest nadal uważany za eksperymentalny w wielu krajach europejskich i wymagana jest zgoda etyczna, szczególnie w przypadku autotransplantacji19,20. W związku z tym należy dokładnie rozważyć kryteria włączenia do protokołów OTC, a dla każdego pacjenta należy przeprowadzić analizę ryzyka i korzyści. Nie wszystkie dzieci otrzymujące terapie gonadotoksyczne kwalifikują się do zachowania płodności. W Szwecji tylko pacjentom z wysokim lub bardzo wysokim ryzykiem zaleca się zachowanie płodności zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zachowania płodności Nordyckiego Towarzystwa Hematologii i Onkologii Dziecięcej21. Do tej grupy zalicza się (1) dzieci przed i po okresie dojrzewania wymagające przeszczepienia komórek macierzystych lub otrzymujące radioterapię z jajnikiem w zakresie zakresu, oraz (2) dzieci po okresie dojrzewania z wysokimi skumulowanymi dawkami chemioterapii alkilowej. W przypadku dziewcząt przed miesiączką kryteria włączenia do grupy bardzo wysokiego ryzyka niepłodności obejmują osoby leczone jednym z poniższych: dawka promieniowania >10 Gy do jajnika lub terapia allogenicznymi lub autologicznymi krwiotwórczymi komórkami macierzystymi (HSCT). Kryteria wykluczenia obejmują osoby, które potrzebują dodatkowych produktów krwiopochodnych do innych preparatów przeciwzakrzepowych przed zabiegiem chirurgicznym lub mają liczbę granulocytów obojętnochłonnych <1. W przypadku dziewcząt/kobiet po menarche kryteria włączenia wysokiego lub bardzo wysokiego ryzyka niepłodności obejmują osoby leczone jednym z poniższych: dawka promieniowania >10 Gy do jajnika lub allogeniczny HSCT, cyklofosfamid >9 g/m², ifosfamid >60 g/m², prokarbazyna lub związki nitrozomocznika (BCNU/CCNU) >360 mg/m². Kryteria wykluczenia obejmują osoby o zwiększonym ryzyku krwawienia, zwiększonym ryzyku infekcji, zwiększonym ryzyku powikłań chirurgicznych lub zwiększonym ryzyku problemów bólowych, zgodnie z oceną lekarza prowadzącego.

Dla OTC, tkanka jajnika jest pobierana podczas operacji jamy brzusznej poprzez laparotomię lub laparoskopię poprzez jednostronną resekcję jajników lub biopsję. Rdzeń jest usuwany z pobranej tkanki jajnika, a pozostała kora jest następnie dzielona na mniejsze fragmenty w celu kriokonserwacji poprzez kontrolowane zamrażanie lub witryfikację w celu późniejszego wykorzystania w przywracaniu płodności22. Próbki są następnie przechowywane w ciekłym azocie do czasu, gdy pacjentka wyzdrowieje po leczeniu i będzie chciała założyć rodzinę. W zależności od rodzaju nowotworu i przy braku przeciwwskazań do przeszczepu tkanki jajnikowej, tkanka jest następnie rozmrażana i autoprzeszczepiona w celu przywrócenia funkcji hormonalnej i jajników. Udowodniono, że OTC jest skuteczny, z 50% wskaźnikiem ciąż i ponad 200 żywymi porodami zgłoszonymi po przeszczepieniu kriokonserwowanej tkanki jajnika pobranej w wieku dorosłym23,24,25. Zgłoszonych żywych urodzeń po autotransplantacji tkanki jajnika pobranej w dzieciństwie jest niewiele, a po autotransplantacji niewątpliwie tkanki jajnika sprzed okresu dojrzewania nie zgłoszono żadnej, a po autotransplantacji niewątpliwie tkanki jajnika sprzed okresu dojrzewaniaxref"26,27,28,29,30. Jakość tkanek jest warunkiem wstępnym pomyślnego przywrócenia płodności31. Dlatego tak ważne jest zbadanie jakości pobranych próbek tkanek.

Obecnie sposobem na oszacowanie jakości tkanki jajnikowej jest wykonywanie sekcji histologicznych i ręczne liczenie pęcherzyków. Ocena normalności gęstości mieszków włosowych jest jednak trudna ze względu na naturalny spadek rezerwy wraz z wiekiem i niejednorodne rozmieszczenie mieszków włosowych. Ponadto porównanie z wartościami referencyjnymi jest trudne, ponieważ nie są one standaryzowane pod względem wielkości biopsji i wieku. Inne opcje oceny, takie jak stężenie AMH w surowicy lub barwienie strawionej tkanki kalceiną lub neutralną czerwienią, nie są dobrze ugruntowane lub mają swoje własne ograniczenia. Wallace i Kelsey wcześniej opublikowali model normalnej rezerwy jajnikowej w miarę wieku, zbierając dane na temat liczby pęcherzyków jajnikowych z całych jajników pacjentek bez znanych patologii jajników2. Ponadto, ponieważ biopsje nie są reprezentatywne dla całego jajnika, Schmidt i wsp. opracowali metodę szacowania całkowitej liczby pęcherzyków na podstawie biopsji korowych32. Korzystając ze zmodyfikowanej wersji tej metody i modelu prawidłowej rezerwy jajnikowej, ustalono referencyjny zestaw danych dla gęstości pęcherzyków u kobiet w wieku 0-25 lat33.

Ten artykuł opisuje strategię oceny normalności gęstości pęcherzyków na podstawie małych próbek jajników poprzez (1) bezpośrednią kwantyfikację pęcherzyków za pomocą histologii i (2) porównanie wyników ze standardowymi odniesieniami znormalizowanymi pod względem wieku za pomocą wskaźników Z. Zastosowanie wskaźników Z opisuje związek gęstości pęcherzyków jajnika w biopii jajnika ze średnią grupy referencyjnej standaryzowanej pod względem wieku i wielkości. Będzie to miało ogromne znaczenie dla lekarzy w doradzaniu swoim pacjentom w zakresie autotransplantacji i dalszego leczenia po zachowaniu płodności.

Protokół

Wszystkie przeprowadzone procedury zostały zatwierdzone przez Szwedzki Urząd Przeglądu Etycznego (pacjenci Sveafertil, Dnr: 2019-03802) oraz przez Komisję Etyczną Szpitala Uniwersyteckiego w Helsinkach (pacjenci HCH, Dnr 340/13/03/03/2015). Pielęgniarki badawcze przekazały pisemne i ustne informacje na temat badania, a świadoma zgoda została uzyskana zgodnie z Deklaracją Helsińską. W przypadku pacjentów poniżej 18 roku życia świadomą zgodę uzyskano od opiekunów prawnych. Wszystkie próbki zostały spseudonimizowane i przetworzone zgodnie z Ogólnym Rozporządzeniem o Ochronie Danych (RODO). Szczegółowe informacje dotyczące odczynników i sprzętu wykorzystanego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Pobieranie i opracowywanie tkanki jajnika

UWAGA: Należy zidentyfikować wszystkich uprawnionych pacjentów do zachowania płodności w przypadku wystąpienia wskazania do wysokiego lub bardzo wysokiego ryzyka niepłodności, zgodnie z lokalnymi wytycznymi (np. nordyckimi, europejskimi lub specyficznymi wytycznymi międzynarodowymi). W Europie pacjentów nieletnich należy rekrutować wyłącznie w ramach programów badawczych nad zachowaniem płodności. Ryzyko niepłodności należy określić zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zachowania płodności obowiązującymi w danym kraju.

  1. Zabieg chirurgiczny należy przeprowadzić w znieczuleniu ogólnym. W celu indukcji znieczulenia podać dożylnie propofol (2 mg/kg), sufentanyl (0,5 µg/kg) oraz bromek rokuronium (0,6 mg/kg).
    1. Zaintubuj pacjenta i wentyluj go przy objętości oddechowej 6–8 ml/kg oraz dodatnim ciśnieniu końcowowydechowym 6–8 cm H2O.2O. Podaj sewofluran w stężeniu od 1% do 2% poprzez rurkę endotrachealną w celu utrzymania znieczulenia wziewnego.
    2. Utrzymuj blokadę nerwowo-mięśniową za pomocą bromku rokuronium (0,15 mg/kg) podczas procedury chirurgicznej, aby zapewnić odpowiednie rozluźnienie mięśni i umożliwić przeprowadzenie laparoskopii przy niższym ciśnieniu insufflacji w jamie brzusznej.
    3. Stosuj wskaźnik bispektralny do monitorowania głębokości znieczulenia w celu ułatwienia szybkiego wybudzenia przy zredukowanej dawce leku anestetycznego. Przeciwdziałaj pozostałemu blokowi nerwowo-mięśniowemu za pomocą sugammadexu (2–4 mg/kg).
  2. Stosując technikę trójpörtową, wprowadź trokar 10 mm do jamy otrzewnej w okolicy pępka w celu wprowadzenia soczewki optycznej z przymocowaną kamerą, a następnie, pod kontrolą wzroku, wprowadź dwa trokary 5 mm w lewym i prawym regionie biodrowym (2 cm powyżej i 2 cm przyśrodkowo względem odpowiedniej kolca przedniego górnego kości biodrowej) dla instrumentarium chirurgicznego i pobierania tkanek. Przeprowadź inspekcję narządów miednicy, w tym obu jajników, aby potwierdzić ich prawidłowy stan.
    1. Zidentyfikuj jajnik, który jest najłatwiejszy do odsłonięcia, a następnie go chwyć. Wycięcie fragmentu o objętości około jednej trzeciej jajnika (lub zgodnie z zapisami w pozwoleniu etycznym), a w razie potrzeby zastosuj diatermię w celu uzyskania hemostazy.
      UWAGA: Biopsję należy przeprowadzić wyłącznie w przypadku braku przeciwwskazań, takich jak czynniki ryzyka nadmiernego krwawienia śródoperacyjnego lub pooperacyjnego bądź zwiększone ryzyko infekcji. Należy jasno określić i przestrzegać krajowych kryteriów włączenia i wyłączenia. Można usunąć cały jajnik, jeżeli ryzyko bezpłodności jest bardzo wysokie i/lub ryzyko wycięcia jedynie fragmentu uznaje się za zbyt duże (np. ze względu na krwawienie). Należy unikać stosowania diatermii przed pobraniem próbki, ponieważ może ona uszkodzić tkankę.
  3. W sali operacyjnej umieścić tkankę w probówce zawierającej 5 ml 1x buforu fosforanowo-solnego Dulbecco (PBS) z CaCl2.2, MgCl22, 1 g/L D-glukozy, 36 mg/L pirogronianu, oba podgrzane do 37 °C jeśli próbka zostanie natychmiast przetworzona w laboratorium (w ciągu 30 min) lub przechowywana w 4 °C podczas dłuższego transportu (do 24 h).
    UWAGA: Roztwory transportowe obejmują szereg dostępnych komercyjnie roztworów do transportu i perfuzji organów, a także proste bufory, takie jak PBS i MEM34.
  4. Wyciąć niewielki fragment tkanki jajnika (2 mm x 2 mm x 2 mm) z powierzchni jajnika. Fragment ten zawiera korę, która jest zewnętrzną częścią jajnika, w której znajdują się pęcherzyki jajnikowe.35.
    UWAGA: Tkanki ludzkie, takie jak jajnik, należy traktować zgodnie z praktykami i procedurami dla 2. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).
    UWAGA: Specjalistyczny oddział medycyny rozrodu klinicznie krio konserwuje pozostałą tkankę jajnika w celu jej ewentualnego przyszłego wykorzystania w przywracaniu płodności pacjentek.
  5. Umieść tkankę w 350 µL roztwór Bouina w temperaturze pokojowej przez 2 h lub w 350 µL 4% formaldehydu w temperaturze 4 °C przez noc, upewniając się, że tkanka jest całkowicie zanurzona. Po inkubacji przemyć tkankę trzykrotnie 70% etanolem.
    1. W przypadku roztworu Bouina płukać do momentu zniknięcia żółtego zabarwienia. Osadzić tkankę w parafinie.36Wykonaj co najmniej 30 seryjnych skrawków tkankowych o grubości 4 µm i umieścić je na szkiełkach przedmiotowych.
      UWAGA: Roztwór Bouina oraz formaldehyd należy stosować w dygestorium, używając odpowiedniego sprzętu ochronnego.
      UWAGA: Formaldehyd może prowadzić do powstania artefaktów związanych ze skurczem tkanki. Dlatego w celu utrwalenia preparatów histologicznych preferowany jest płyn Bouina. Jednakże płyn Bouina wiąże się z dodatkowymi zagrożeniami, co sprawia, że wiele instytucji preferuje stosowanie formaldehydu.37.

2. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

  1. Odważyć 5 g proszku eozyny Y do autoklawowanej szklanej butelki o pojemności 100 mL. Dodać 800 mL 95% etanolu i 200 mL wody dejonizowanej, aby przygotować 0,5% roztwór zapasowy eozyny. Przygotować 0,25% roztwór roboczy eozyny poprzez rozcieńczenie 200 mL 0,5% roztworu zapasowego eozyny za pomocą 160 mL 100% etanolu, 1 mL kwasu octowego i 40 mL wody dejonizowanej.
    UWAGA: Proszek może nie rozpuścić się całkowicie. Przed użyciem przefiltrować roztwór, aby zmniejszyć ilość osadu.
  2. Umieścić preparaty w koszyczkach. Zanurzyć koszyczek z preparatami w odpowiednich pojemnikach w następującej kolejności: 15 min w ksylenie, 5 min w 100% etanolu, 10-krotne zanurzenie w 70% etanolu, 10-krotne zanurzenie w 50% etanolu, a następnie 10-krotne zanurzenie w wodzie dejonizowanej.
    1. Zanurzyć koszyczek z preparatami w roztworze hematoksyliny na 3 min, a następnie przenieść koszyczek z preparatami do pojemnika z destylowaną wodą kranową na 30 s, aby wypłukać nadmiar barwnika hematoksyliny.
    2. Umieścić koszyczek z preparatami w pojemniku z roztworem różnicującym (1 mL 37% HCl dodany do 100 mL 70% etanolu) na 1 min, a następnie przenieść koszyczek z preparatami do pojemnika z destylowaną wodą kranową na 30 s.
      UWAGA: Upewnić się, że skrawki tkanki są całkowicie zanurzone w cieczy. W razie potrzeby dodać do pojemnika więcej odczynnika. Przy barwieniu dużych ilości materiału wymieniać ksylen co 5 użyć. Przygotować 50% etanol poprzez rozcieńczenie 70% etanolu (np. dodać 35 mL 70% etanolu do 15 mL DPBS, aby otrzymać 50 mL 50% etanolu).
      OSTROŻNIE: Ksylen należy stosować pod wyciągiem i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.
  3. Umieścić koszyczek z preparatami w wodzie kranowej Scotta (znanej również jako roztwór błękitniejący) na 30-60 s, a następnie przenieść koszyczek z preparatami do pojemnika z destylowaną wodą kranową na 30 s. Zanurzyć koszyczek z preparatami w roztworze roboczym eozyny na 1 min.
    1. Odwodnić preparaty, umieszczając je w następujących odczynnikach: 100% etanol przez 30 s, drugi pojemnik z 100% etanolem przez 30 s, a następnie dwukrotne zanurzenie w ksylenie. Po wyjęciu koszyczka z roztworu ksylenu pozostawić go do wyschnięcia w szklanym pojemniku, aby zapobiec skapywaniu ksylenu wewnątrz dygestorium.
    2. Zamontować preparat, stosując 2 krople medium montażowego. Ostrożnie nałożyć szkiełka nakrywkowe, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, i pozostawić medium montażowe do wyschnięcia.
      OSTROŻNIE: Ksylen należy stosować pod wyciągiem i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.
  4. Zdigitalizować preparaty, skanując je za pomocą skanerów do slajdów, jeśli jest to możliwe. Jeśli ta opcja jest niedostępna, użyć zwykłego mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 20-40x do bezpośredniego przeliczenia mieszków. Należy pamiętać o wykonaniu zdjęcia całej biopsji, aby ułatwić pomiar powierzchni w oprogramowaniu do analizy obrazu.

3. Liczenie mieszków

  1. Jeśli preparaty zostały zdigitalizowane, należy otworzyć pliki za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. oprogramowania open-source QuPath38). W przypadku braku digitalizacji analizę należy przeprowadzić bezpośrednio przy użyciu mikroskopu odwróconego i odpowiedniego oprogramowania.
    1. Przeciągnij plik do głównego okna programu QuPath. Ustaw typ obrazu na Brightfield H&E (patrz Rycina 1A). Wyznacz odległość 1 mm od nabłonka powierzchniowego (pojedynczej warstwy komórek sześciennych wyścielających powierzchnię), korzystając z paska skali. Kliknij narzędzie elipsa i zaznacz pęcherzyki (patrz Rycina 1B).
    2. Policz liczbę pęcherzyków w obszarze 1 mm, od stadium primordialnego do pierwotnego. Określ stadium każdego pęcherzyka (primordialny – warstwa spłaszczonych komórek ziarnistych otaczająca oocyt; stadium pośrednie – mieszanka spłaszczonych i sześciennych komórek ziarnistych; pierwotny – jedna pełna warstwa sześciennych komórek ziarnistych otaczająca oocyt).
    3. Wprowadź ID próbki, wiek, liczbę pęcherzyków dla każdego preparatu, grubość przekroju oraz numer policzonego przekroju (nth) do arkusza o nazwie Follicle in mm3 w pliku Excel kalkulatora Z-score dla pęcherzyków (patrz Plik uzupełniający 1 i Rycina 2A).
      UWAGA: Ze względu na średnicę pęcherzyków (najmniejsze pęcherzyki >35 µm), ten sam pęcherzyk może pojawić się w kolejnych przekrojach. Należy zachować szczególną ostrożność podczas liczenia w przekrojach, w których odległość między nimi jest mniejsza niż średnica pęcherzyka. Zaleca się liczenie pęcherzyków z każdego 10th przekroju (np. przekrój nr 10, 20, 30). Nabłonek powierzchniowy może oddzielić się podczas przetwarzania tkanki i może być obecny na preparatach tylko częściowo. Licz tylko pęcherzyki z widoczną cytoplazmą. W ramach kontroli jakości dwie osoby powinny niezależnie policzyć pęcherzyki, a następnie należy ustalić stopień zgodności wyników. Oblicz zgodność między obserwatorami za pomocą prostej funkcji korelacji między liczbą pęcherzyków policzonych przez każdego obserwatora dla tej samej próbki.
  2. W każdym policzonym przekroju wytypuj wzrokowo 10% największych pęcherzyków. Zmierz średnią średnicę tych oocytów, klikając narzędzie linia, rysując dwie prostopadłe linie przechodzące przez błonę oocytu, a następnie wybierając Measure, a potem Show annotation measurements (patrz Rycina 1C).
    1. Zapisz pomiary w kolumnie Length µm (patrz Rycina 1D). Wprowadź średnią średnicę wszystkich oocytów do pola Mean oocyte diameter (µm) dla każdego preparatu w pliku Excel kalkulatora Z-score dla pęcherzyków (Follicle in mm3, patrz Plik uzupełniający 1 i Rycina 2A).
  3. Umieść obraz w centrum ekranu w programie QuPath, a następnie kliknij ikonę ImageJ . Wybierz Send snapshot to ImageJ (patrz Rycina 3A). W programie ImageJ wyznacz odległość 1 mm od krawędzi za pomocą narzędzia pędzel. Kliknij Image, następnie Type i wybierz 8-bit (patrz Rycina 3B).
    1. Kliknij narzędzie linia, narysuj linię na pasku skali w lewym dolnym rogu ekranu (patrz Rycina 3C). Kliknij Analyze, następnie Set Scale, wpisz długość wskazaną na pasku skali w polu Known Distance i kliknij OK (patrz Rycina 3C). Kliknij Image, następnie Adjust, Brightness/Contrast i wybierz Auto (patrz Rycina 3D).
    2. Kliknij Image, następnie Adjust, Threshold i wybierz Auto (patrz Rycina 3E). Kliknij narzędzie różdżka, zaznacz obszar, a następnie naciśnij Ctrl + M (patrz Rycina 3F). Wprowadź wartość powierzchni do pliku Excel kalkulatora Z-score dla pęcherzyków (Follicle in mm3, patrz Plik uzupełniający 1 i Rycina 2A).

4. Obliczenia gęstości mieszków, objętości kory i wskaźnika Z-score

  1. Aby automatycznie wykonać poniższe obliczenia, należy użyć dołączonego pliku Excel „Follicle Z-score calculator”. Wyniki pojawią się w arkuszu „Z-score (follicle per mm³)” w kalkulatorze Excel (patrz Supplementary File 1), pod warunkiem wprowadzenia szczegółów wskazanych w sekcji 3 do arkusza „follicles in mm³”.
  2. W celu obliczenia gęstości mieszyków w tych przekrojach należy zastosować zmodyfikowany wzór przedstawiony przez Schmidta i wsp.32. Najpierw należy zastosować współczynnik korekcji α, aby uwzględnić podwójne liczenie tego samego mieszyka. Zmodyfikowany wzór jest następujący:
    Wzór na obliczenie alfa, równanie równowagi statycznej, matematyczna koncepcja edukacyjna.
    Równania dla ciągów rekurencyjnych, ilustrujące progresję matematyczną i zależności między zmiennymi.
    UWAGA: W tym wzorze t oznacza grubość przekroju, d średnicę oocytu, a q iloraz średnicy mieszyka podzielonej przez grubość przekroju.
  3. Całkowitą liczbę mieszyków (n follicles) w korze należy wyekstrapolować z liczby mieszyków w przekroju za pomocą następującego wzoru33:
    Wzór na liczbę mieszyków z symbolem sumowania, analiza równania, zastosowanie edukacyjne.
    UWAGA: Wzór ten uwzględnia również wszystkie nieobliczane przekroje. Tutaj γ reprezentuje liczbę przekrojów nieobliczanych (np. γ = 10, jeśli liczony jest co 10ty przekrój), α to współczynnik korekcji obliczony w punkcie 4.1, N to liczba policzonych przekrojów, a n i całkowita liczba mieszyków w policzonych przekrojach.
    1. Całkowitą objętość kory (V) należy wyekstrapolować z policzonych obszarów za pomocą następującego wzoru33:
      Wzór matematyczny, V = γ * Σ(Ai * ti) od i=1 do N, do obliczania zmiennych w równaniach.
      ​UWAGA: Tutaj Ai to pole powierzchni przekroju, a ti grubość tkanki. Wartości γ i N należy sprawdzić w punkcie 4.2.
    2. Aby obliczyć gęstość mieszyków, należy użyć następującego wzoru33:
      Wzór na gęstość mieszyków, FD = n_follicles/V, równanie do analizy badawczej.
  4. Należy określić, czy występuje zmniejszona rezerwa jajnikowa (<-1,7 Z-score), obliczając wynik Z za pomocą wzoru33:
    Schemat równania Z-score, analiza statystyczna, wyświetlająca wzór obliczeniowy z=(x-M)/SD.
    UWAGA: Wynik Z jest obliczany automatycznie w arkuszu „Z-score (follicle per mm³)” w kalkulatorze Excel (patrz Supplementary File 1) na podstawie informacji podanych w sekcji 3 (Liczenie mieszyków) (Rycina 2B). W tym wzorze Z reprezentuje Z-score, x to obliczona gęstość mieszyków (mieszyki/cm3) badanej próbki (punkt 4.4), M to średnia gęstość mieszyków dla odpowiedniej grupy wiekowej, a SD to odchylenie standardowe dla odpowiedniej grupy wiekowej. Wartości referencyjne dla kobiet w wieku 0–25 lat zostały ustalone przez Hassana i wsp.33. Średnie i odchylenia standardowe gęstości mieszyków dla odpowiednich grup wiekowych znajdują się w pliku Excel „Follicle Z-score calculator” (Supplementary File 1) i mogą być wykorzystane do obliczeń Z-score.

Wyniki

Pęcherzyki jajnikowe są kwantyfikowane po pomyślnym wykonaniu skrawków, barwieniu i skanowaniu slajdów. Różne stadia i stan zdrowia pęcherzyków są rozróżniane i poddawane dalszej analizie. Na Rysunku 4A przedstawiono barwiony HE przekrój poprzeczny jajnika dorosłego osobnika utrwalonego w płynie Bouina, wraz z przykładami tkanki kory i rdzenia. Rysunek 4B pokazuje reprezentacyjny obraz jajnika dziecka z przykładem nabłonka powierzchniowego. Rezerwa jajnikowa (tj. pula pęcherzyków nierosnących) oraz małe pęcherzyki rosnące znajdują się w korze. Przy użyciu mikroskopu wirtualnego pęcherzyki są powiększane i klasyfikowane, aby zapewnić uwzględnienie wyłącznie rezerwy jajnikowej. Rysunek 5 przedstawia stadia pęcherzyków znalezionych i policzonych w tkankach kory jajnika utrwalonych w płynie Bouina (Rysunek 5A) oraz w formaldehydzie (Rysunek 5B): (1) pęcherzyki pierwotne (o średnicy około 40 µm), (2) przejściowe oraz (3) jednokomorowe. Pęcherzyki 4-6 są przykładami pęcherzyków, które należy wykluczyć z liczenia ze względu na brak możliwości prawidłowego przypisania im stadium dojrzewania. Rysunek 6 przedstawia reprezentacyjne obrazy tkanek kory jajnika z brakiem lub niską liczbą pęcherzyków (Rysunek 6A) oraz tkanek jajnika ze średnią lub wysoką liczbą pęcherzyków (Rysunek 6B). Rysunek 7 przedstawia reprezentacyjne obrazy skrawków tkanki, które należy wykluczyć ze względu na obecność wyłącznie tkanki rdzenia (Rysunek 7A) lub słabą jakość tkanki (Rysunek 7B). Rysunek 2 pokazuje zrzuty ekranu z pliku Excel kalkulatora Z-score dla pęcherzyków. Obliczone wartości i powiązane wyniki Z-score są automatycznie wyliczane z wprowadzonych danych. Wynik Z-score <1,7 wskazuje na zmniejszoną rezerwę jajnikową na podstawie krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (AUC-ROC) pacjentek z zespołem Turnera16.

Proces analizy obrazów histologicznych, cyfrowe preparaty, interfejs oprogramowania, interpretacja danych patomorfologicznych.
Rysunek 1: Zrzuty ekranu z użycia oprogramowania QuPath. (A) Prezentacja procesu otwierania pliku obrazu w QuPath i ustawiania typu obrazu. (B) Adnotowanie mieszków jajnikowych przy użyciu narzędzia elipsy w oprogramowaniu. (C,D) Pomiar średnicy średniej oocytów na adnotowanych obrazach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela analizy liczby pęcherzyków z danymi, obliczeniami i wartościami referencyjnymi do badania biologicznego.
Rycina 2Zrzuty ekranu z pliku Excel kalkulatora Z-score dla pęcherzyków. (AArkusz „Follicles in mm³” zawiera pola, w których wprowadzane będą dane (komórki zielone) dla identyfikatora próbki, wieku oraz Nth przekrój, końcowa liczba pęcherzyków, pole powierzchni, średnica pęcherzyka, grubość przekroju oraz numer co n-tego policzonego przekroju. Gęstość pęcherzyków (pęcherzyki/mm³) jest obliczana automatycznie po wprowadzeniu wszystkich niezbędnych danych; pole pozostaje puste w przypadku braku jakichkolwiek danych. (BArkusz „Z-score (Follicles per mm³)” łączy dane dotyczące ID, wieku oraz liczby mieszyczków/mm³ z arkusza „Follicles in mm³” i automatycznie oblicza wynik Z (Z-score) dla próbki. Odpowiadające im wartości referencyjne znajdują się w tabeli po prawej stronie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Proces segmentacji obrazów histologicznych, kroki A-F w interfejsie oprogramowania, analiza struktury tkanki.
Rysunek 3: Zrzuty ekranu z użytkowania oprogramowania ImageJ. (A) Przenoszenie obrazu z QuPath do ImageJ. (B) Ustawianie typu obrazu w programie ImageJ. (C) Ustalanie skali pomiarowej. (D,E) Automatyczna regulacja jasności/kontrastu oraz progu obrazu. (F) Pomiar pola powierzchni w skorygowanym obrazie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat histologiczny; przekroje tkanki kory i rdzenia nerki; mikroskopia; analiza struktury nerek.
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy tkanki jajnika. (A) Obraz jajnika osoby dorosłej poddawanej operacji korekty płci. Widoczna jest kora, która charakteryzuje się wyższą gęstością komórek somatycznych i zawiera rezerwę jajnikową, oraz tkanka rdzenia, która cechuje się niższą gęstością, większymi komórkami somatycznymi i często zawiera więcej naczyń. (B) Obraz jajnika dziecka poddawanego procedurze zabezpieczenia płodności. Korę wyznacza się poprzez pomiar 1 mm od nabłonka powierzchniowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie histologiczne: roztwór Bouina i 4% formaldehyd, obrazy mikroskopowe, utrwalanie tkanek.
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy mieszków jajnikowych utrwalonych różnymi roztworami. (A) Mieszki utrwalone roztworem Bouina oraz (B) 4% formaldehydem w różnych stadiach: (1) mieszek w stadium primordialnym, (2) mieszek w stadium pośrednim, (3) mieszek w stadium pierwotnym. Mieszki od (4) do (6) zostały wykluczone ze względu na brak widocznej cytoplazmy. Artefakty powszechne przy utrwalaniu formaldehydem obejmują oddzielenie błony podstawnej od tkanki (wskazane zielonymi strzałkami) oraz pyknotyczne komórki ziarniste (wskazane żółtymi kropkami). Paski skali reprezentują 50 µm. Rycina została opracowana na podstawie pracy Björvang i wsp.39. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie preparatów histologicznych; schemat przekrojów tkanki A i B; obraz mikroskopowy; analiza patomorfologiczna.
Rycina 6: Reprezentatywne obrazy biopsji kory jajnika dziecka. (A) Biopsja wykazująca brak lub niską liczbę pęcherzyków oraz (B) biopsja wykazująca średnią lub wysoką liczbę pęcherzyków. Pęcherzyki oznaczono gwiazdką (*). Niebieska przerywana linia wskazuje odległość 1 mm od nabłonka powierzchniowego, natomiast czarna linia wyznacza nabłonek powierzchniowy. Paski skali reprezentują 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie histologiczne tkanek; obraz mikroskopowy; powiększone wstawki; analiza struktury tkanki.
Rycina 7: Reprezentatywny obraz przekrojów tkankowych do wykluczenia. (A) Fragment jajnika, w którym pobrano rdzeń zamiast kory. Przekrój ten jest określany jako rdzeń ze względu na brak nabłonka powierzchniowego i niską gęstość komórek. (B) Przekrój tkanki słabej jakości, zidentyfikowany na podstawie otarć w tkance. Paski skali reprezentują 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Kalkulator Z-score dla mieszków.Plik ten ułatwia obliczanie wartości Z-score dla mieszków. Należy wprowadzić dane (identyfikator próbki, wiek, liczbę mieszków na preparacie, grubość przekroju, numer policzonego przekroju Nth oraz powierzchnię) do arkusza „Follicles in mm³”. Wartość Z-score zostanie następnie automatycznie obliczona i podsumowana w arkuszu „Z-Score (Follicles per mm³)”. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Kobiety rodzą się ze skończoną pulą oocytów, których nie można uzupełnić. Rezerwa jajnikowa jest kluczowym wyznacznikiem potencjału rozrodczego kobiety. W artykule przedstawiono metodę histologicznej kwantyfikacji gęstości pęcherzyków jajnikowych i jej porównanie ze wzorcami referencyjnymi z wykorzystaniem Z-score gęstości pęcherzyków w korze jajnikowej u młodych pacjentek i kobiet do 25 roku życia.

W tym protokole tkanka jajnika jest pozyskiwana od dziewcząt i kobiet o wysokim lub bardzo wysokim ryzyku niepłodności poddanych OTC w celu zachowania płodności lub od pacjentek poddawanych operacji zmiany płci. Do oceny kriokonserwowanego materiału wykorzystuje się niewielki fragment tkanki jajnikowej. Ponieważ rezerwa jajnikowa zmienia się wraz z wiekiem, przeliczenie gęstości pęcherzyków na wskaźniki Z umożliwia porównanie z wartościami referencyjnymi znormalizowanymi dla wieku od urodzenia do dojrzałości płciowej (Hassan i wsp.33). Zastosowanie wskaźników Z zapewnia standaryzowaną, niezależną od kohorty metodę szacowania normalności próbki rezerwy jajnikowej. Ustalana jest średnia grupy referencyjnej na podstawie wieku, która jest następnie wykorzystywana do obliczenia wskaźnika Z dla pojedynczej próby. Takie podejście pozwala na ocenę normalności niezależnie od rozkładu wieku w badanej populacji. Standaryzowana pod względem wieku ocena rezerwy jajnikowej umożliwia połączenie danych od pacjentek o podobnym pochodzeniu genetycznym lub ekspozycji na chemioterapię w różnych badanych populacjach, ułatwiając metaanalizy na dużą skalę.

Ta metoda ma ograniczenia. Liczba pęcherzyków jajnikowych w tkankach jajnika u pacjentek, u których nie stwierdzono patologii jajników, jest ograniczona. Ustalone normy referencyjne opierają się na niewielkiej liczbie próbek, w szczególności biorąc pod uwagę różne grupy wiekowe, i mają zastosowanie wyłącznie do kobiet do 25 roku życia poddawanych leczeniu bez recepty. W związku z tym narzędzie to nie ma zastosowania do kobiet w wieku powyżej 25 lat. Ponadto możliwe jest, że mały fragment tkanki korowej może nie zawierać żadnych pęcherzyków, nawet u kobiet w wieku rozrodczym, ze względu na nierównomierne rozmieszczenie pęcherzyków w korze32. Co więcej, orientacja tkanki podczas procesu osadzania może utrudniać prawidłową identyfikację kory. Biopsje są często bardzo małe, a metoda pobierania biopsji nie jest ustandaryzowana, co prowadzi do możliwości otrzymania tkanki jajnika, która jest głównie rdzeniowa, co sprawiłoby, że nie nadawałaby się ona do oceny Z-score.

Co więcej, badania nie potwierdziły jeszcze zastosowania biopsji jajnika do diagnozowania pozostałej płodności40. Ważne jest, aby pamiętać, że ta metoda uwzględnia tylko gęstość mieszków włosowych, a nie zdrowie mieszków włosowych. Użycie tkanki utrwalonej formaldehydem, o której wiadomo, że powoduje artefakty tkankowe (jak pokazano na rysunku 5B), komplikuje ustalenie, czy nieprawidłowa morfologia wynika z atrezji mieszków włosowych, czy z procedury utrwalania. Problem ten może zostać rozwiązany w przyszłości przy użyciu bezznacznikowych technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takich jak ilościowa mikroskopia fazowa41 lub alternatywne utrwalacze37. Ponadto cały proces, od pobrania biopsji po ręczne liczenie pęcherzyków, jest inwazyjny, czasochłonny i pracochłonny, co sprawia, że ocena gęstości pęcherzyków za pomocą histologii jest niepraktyczna dla niektórych grup pacjentów.

Ponadto nie jest jasne, które pęcherzyki są przeznaczone do dojrzewania i jak chemioterapia wpływa na wielkość i funkcjonalność rezerwy jajnikowej. Potrzebne są dalsze badania z wykorzystaniem tej metody na większą skalę i w dłuższym okresie, zanim będzie można ustalić jakąkolwiek korelację z sukcesem przeszczepu tkanki jajnikowej.

Niemniej jednak metoda ta ma znaczącą wartość zarówno w badaniach nad biologią jajników, jak i w klinicznym poradnictwie dotyczącym płodności. Zastosowanie wskaźników Z-score poprawia interpretację indywidualnej rezerwy jajnikowej poprzez porównanie jej ze wzorcem referencyjnym. Ułatwia to kompleksowe badanie wielkości i normalności rezerwy jajnikowej w różnych grupach pacjentek i badanych populacjach. Na przykład metoda ta może być stosowana do oceny powiązań między rezerwą jajnikową a różnymi ekspozycjami, takimi jak chemikalia środowiskowe lub leczenie gonadotoksyczne39. Kilka klinik rutynowo wykonuje małe biopsje do oceny histologicznej podczas przygotowania tkanek do krioprezerwacji. W takich przypadkach metoda ta może okazać się przydatna w określaniu normalności rezerwy jajnikowej przed krioprezerwacją. Podsumowując, gęstość pęcherzyków jajnikowych może być wykorzystana do oszacowania wielkości rezerwy jajnikowej na poziomie populacji39, co czyni tę metodę cennym narzędziem w badaniach epidemiologicznych, a także w poradnictwie dotyczącym płodności.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować pracownikom służby zdrowia, którzy pomogli nam w rekrutacji uczestników i pobraniu tkanek oraz wszystkim pacjentkom, które oddały swoją tkankę jajnikową. Wyrażamy również uznanie dla Funduszu na rzecz Walki z Rakiem u Dzieci (PR2020-0096) oraz Karolinska Institutet PhD finansującego KID, których finansowanie umożliwiło tę pracę. Serdecznie dziękujemy również Zakładowi Analizy Fenotypów Morfologicznych za przygotowanie preparatów histologicznych. Dziękujemy Nicoli Byers za redakcję językową tego manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco,Thermo Fisher14190144
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glukozy, 36 mg/L pirogronianu Thermo Fisher14287-080
37% Kwas solnySigma-Aldrich1.09057.1000
70% etanolHistolabs01370.01L
95%Fisher scientific10572143
Etanol absolutnyHistolabs01399.01L
Roztwór BouinaSigma-AldrichHT10132-1L
Eozyna Y Wolny kwasSigma-AldrichE4009-5G 
FormaldehydThermo Fisher28908
Roztwór hematyoksyliny według DelafieldSigma-Aldrich03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtome 
Rozwiązanie montażowe Pertex Histolabs00840-05
PropofolBaxter Holding BVN01AX10kod ATC podany zamiast numeru katalogowego
QuPathhttps://qupath.github.io/
bromek rokuronium B. Braun Melsungen AG M03AC09Kod ATC podany zamiast numeru katalogowego
Koncentrat substytutu wody z kranu Scott'sSigma-AldrichS5134-6x100ml
SevofluraneBaxter Medical AB N01AB08Kod ATC podany zamiast numeru katalogowego
Skaner slajdów 
SufentanylHameln Pharma gmbhN01AH03kod ATC podany zamiast numeru katalogowego
SugammadexBaxter Holding B.V.V03AB35Kod ATC podany zamiast numeru katalogowego
SuperFrost plus biały Histolabs  Numer katalogowy: 06400 
Preparaty mikroskopowe SuperFrost Plus WhiteHistolabs  Numer katalogowy: 06400 
XyleneSaveen Werner131769.1611
etanol

Bibliografia

  1. Richards, J. A. S. The ovarian cycle. Vitam Horm. 107, 1-25 (2018).
  2. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 1-9 (2010).
  3. Monniaux, D., et al. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: What is the link. Biol Reprod. 90 (4), 1-11 (2014).
  4. Gougeon, A. The early stages of follicular growth in biology and pathology of the oocyte. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Cambridge University Press. 50-61 (2013).
  5. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Ann Endocrinol. 71 (3), 132-143 (2010).
  6. Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and non-growing follicle counts according to the stages of reproductive aging workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
  7. Gold, E. B. The timing of the age at which natural menopause occurs. Obstet Gynecol Clin North Am. 38 (3), 425-440 (2011).
  8. Alberico, H., et al. Workflow optimization for identification of female germline or oogonial stem cells in human ovarian cortex using single-cell RNA sequence analysis. Stem Cells. 40, 523-536 (2022).
  9. White, Y. A. R., et al. Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women. Nat Med. 18 (3), 413-422 (2012).
  10. Wagner, M., et al. Single-cell analysis of human ovarian cortex identifies distinct cell populations but no oogonial stem cells. Nat Commun. 11, 1147(2020).
  11. Yoshihara, M., et al. In reply: Revisiting claims of the continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41 (2), 205-206 (2023).
  12. Yoshihara, M., et al. The continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41, 105-110 (2023).
  13. Van Kasteren, Y. M., Schoemaker, J. Premature ovarian failure: A systematic review on therapeutic interventions to restore ovarian function and achieve pregnancy. Hum Reprod Update. 5 (5), 483-492 (1999).
  14. McGlacken-Byrne, S. M., Conway, G. S. Premature ovarian insufficiency. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 81, 98-110 (2022).
  15. Viuff, M., Gravholt, C. H. Turner syndrome and fertility. Ann Endocrinol. 83 (4), 244-249 (2022).
  16. Poirot, C., et al. Ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in 418 girls and adolescents up to 15 years of age facing highly gonadotoxic treatment: Twenty years of experience at a single center. Acta Obstet Gynecol Scand. 98 (5), 630-637 (2019).
  17. Jensen, A. K., et al. Cryopreservation of ovarian tissue for fertility preservation in a large cohort of young girls: Focus on pubertal development. Hum Reprod. 32 (1), 154-164 (2017).
  18. The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Fertility preservation in patients undergoing gonadotoxic therapy or gonadectomy: A committee opinion. Fertil Steril. 112 (6), 1022-1033 (2019).
  19. ART Fact Sheet. , European Society of Human Reproduction and Embryology. https://www.eshre.eu/Press-Room/Resources (2020).
  20. Antonouli, S., et al. A comprehensive review and update on human fertility cryopreservation methods and tools. Front Vet Sci. 10, 1151254(2023).
  21. Nordic Society of Pediatric Hematology and Oncology (NOPHO). , http://www.nopho.net (2013).
  22. Bahroudi, Z., et al. Review of ovarian tissue cryopreservation techniques for fertility preservation. J Gynecol Obstet Hum Reprod. 51 (2), 102290(2022).
  23. Jensen, A. K., et al. 86 successful births and 9 ongoing pregnancies worldwide in women transplanted with frozen-thawed ovarian tissue: Focus on birth and perinatal outcome in 40 of these children. J Assist Reprod Genet. 34 (3), 325-336 (2017).
  24. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  25. Dolmans, M. M., Falcone, T., Patrizio, P. Importance of patient selection to analyze in vitro fertilization outcome with transplanted cryopreserved ovarian tissue. Fertil Steril. 114 (2), 279-280 (2020).
  26. Demeestere, I., et al. Live birth after autograft of ovarian tissue cryopreserved during childhood. Hum Reprod. 30 (9), 2107-2109 (2015).
  27. Ernst, E., Kjærsgaard, M., Birkebæk, N. H., Clausen, N., Andersen, C. Y. Case report: Stimulation of puberty in a girl with chemo- and radiation therapy-induced ovarian failure by transplantation of a small part of her frozen/thawed ovarian tissue. Eur J Cancer. 49 (4), 911-914 (2013).
  28. Rodriguez-Wallberg, K. A., et al. Successful pregnancies after transplantation of ovarian tissue retrieved and cryopreserved at time of childhood acute lymphoblastic leukemia - a case report. Haematologica. 106 (10), 2783-2787 (2021).
  29. Matthews, S. J., Picton, H., Ernst, E., Andersen, C. Y. Successful pregnancy in a woman previously suffering from β-thalassemia following transplantation of ovarian tissue cryopreserved before puberty. Minerva Ginecol. 70 (4), 432-435 (2018).
  30. Kristensen, S. G., et al. Use of cryopreserved ovarian tissue in the Danish fertility preservation cohort. Fertil Steril. 116 (4), 1098-1106 (2021).
  31. Donfack, N. J., et al. Expectations and limitations of ovarian tissue transplantation. Zygote. 25 (4), 391-403 (2017).
  32. Schmidt, K. L. T., Byskov, A. G., Andersen, A. N., Müller, J., Andersen, C. Y. Density and distribution of primordial follicles in single pieces of cortex from 21 patients and in individual pieces of cortex from three entire human ovaries. Hum Reprod. 18 (6), 1158-1164 (2003).
  33. Hassan, J., et al. Reference standards for follicular density in ovarian cortex from birth to sexual maturity. Reprod Biomed Online. 47, 103287(2023).
  34. Vilela, J. deM. V., Dolmans, M. M., Amorim, C. A. Ovarian tissue transportation: A systematic review. Reprod Biomed Online. 42 (2), 351-365 (2021).
  35. Gibson, E., Mahdy, H. Anatomy, abdomen and pelvis, ovary. , StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK545187/ (2023).
  36. Nagaraj, A. S., et al. Establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing. J Vis Exp. (141), e58569(2018).
  37. Adeniran, B. V., Bjarkadottir, B. D., Appeltant, R., Lane, S., Williams, S. A. Improved preservation of ovarian tissue morphology that is compatible with antigen detection using a fixative mixture of formalin and acetic acid. Hum Reprod. 36 (7), 1871-1890 (2021).
  38. Bankhead, P., et al. QuPath: Open-source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 1-7 (2017).
  39. Björvang, R. D., et al. Persistent organic pollutants and the size of ovarian reserve in reproductive-aged women. Environ Int. 155, 106589(2021).
  40. Kwok, R., Johnson, N. P. Ovarian biopsy has no role as a routine diagnostic test of ovarian reserve: A systematic review. Reprod Biomed Online. 24, 492-495 (2012).
  41. Ahmad, A., et al. High-throughput spatial sensitive, quantitative phase microscopy using low spatial and high temporal coherent illumination. Sci Rep. 11 (1), 1-13 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena Z-scorekriokonserwacja tkanki jajnikagęstość pęcherzykówkwantyfikacja histologicznapęcherzyki pierwotnekriokonserwacja oocytówkriokonserwacja embrionówznormalizowany względem wieku punkt odniesienia
Z-score do oceny rezerwy jajnikowej u młodych pacjentek poddawanych zabiegowi zachowania płodności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.