Artykuł metodologiczny

Charakterystyka modulatorów receptorów aktywowanych proteazą za pomocą testu mobilizacji wapnia za pomocą czytnika płytek

DOI:

10.3791/66507

⸱

24 maja 2024

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano ulepszony protokół testu mobilizacji wapnia z komórkami śródbłonka, używanego do identyfikacji ligandów receptorów aktywowanych proteazą (PAR). Nowy protokół skraca całkowity czas oznaczania o 90-120 minut i pozwala uzyskać powtarzalne krzywe stężenie-odpowiedź.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmiany w stężeniu wapnia w komórkach są szybko monitorowane w sposób wysokoprzepustowy za pomocą wewnątrzkomórkowych, fluorescencyjnych, wiążących wapń barwników i przyrządów do obrazowania, które mogą mierzyć emisje fluorescencyjne z maksymalnie 1 536 odwiertów jednocześnie. Jednak instrumenty te są znacznie droższe i mogą być trudne w utrzymaniu w porównaniu z powszechnie dostępnymi czytnikami płytek, które skanują studnie indywidualnie. Opisano tutaj zoptymalizowany test czytnika płytek do stosowania z linią komórek śródbłonka (EA.hy926) w celu pomiaru aktywacji sygnalizacji Gαq za pomocą receptora aktywowanego proteazą (PAR) i późniejszej mobilizacji wapnia przy użyciu barwnika wiążącego wapń Fluo-4. Test ten został wykorzystany do scharakteryzowania szeregu ligandów PAR, w tym allosterycznych ligandów przeciwzapalnych "parmoduliny" ukierunkowanych na PAR1, zidentyfikowanych w laboratorium Dockendorffa. Protokół ten eliminuje potrzebę stosowania zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy i umożliwia średnioprzepustowe badania przesiewowe ligandów PAR w 96-dołkowych płytkach i powinien mieć zastosowanie do badania innych receptorów, które inicjują mobilizację wapnia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptory aktywowane proteazą (PAR)1,2,3 są podrodziną receptorów sprzężonych z białkiem G klasy A (GPCR), które ulegają ekspresji w różnych typach komórek, w tym w płytkach krwi i komórkach śródbłonka4,5,6,7. W przeciwieństwie do większości GPCR, PAR mają unikalny wewnątrzcząsteczkowy tryb aktywacji. Większość GPCR jest aktywowana przez rozpuszczalne ligandy oddziałujące z wyraźną kieszenią wiążącą, ale PAR są aktywowane przez proteolityczne rozszczepienie N-końca, co skutkuje nowym ligandem na uwięzi, który może wchodzić w interakcje z domeną pętli zewnątrzkomórkowej 2 na powierzchni komórki6,8,9. Ta interakcja aktywuje receptor i może zainicjować kilka szlaków sygnałowych, promując takie efekty, jak stan zapalny i aktywacja płytek krwi4,10,11,12. Różne proteazy mogą aktywować PAR poprzez rozszczepienie w unikalnych miejscach na N-końcu, ujawniając różne ligandy na uwięzi (TL), które stabilizują konformacje receptorów, które inicjują różne szlaki sygnałowe9,13,14,15. Na przykład u najlepiej zbadanego członka podrodziny, PAR1, rozszczepienie przez trombinę jest wykorzystywane do wspierania wielu procesów biologicznych, w tym aktywacji płytek krwi i rekrutacji leukocytów do śródbłonka, ale może prowadzić do szkodliwych skutków, gdy receptor jest nadmiernie eksprymowany lub nadmiernie aktywowany4,16,17,18,19,20,21. I odwrotnie, rozszczepienie przez aktywowane białko C (aPC) może sprzyjać działaniu przeciwzapalnemu i utrzymaniu barier śródbłonka15,22,23,24,25,26,27,28,29. PAR mogą być również aktywowane przez analogi peptydowe TL w sposób międzycząsteczkowy13,30,31. Peptydy te są rutynowo stosowane do pomiaru hamowania (modulacji) PAR zamiast proteaz ukierunkowanych na PAR i są stosowane w tym protokole.

Liczne zaburzenia są związane z patologiczną sygnalizacją PAR1, w tym sepsa22,32, choroby sercowo-naczyniowe33,34,35,36,37,38, choroba nerek39, 40,41,42, niedokrwistość sierpowatokrwinkowa43, zwłóknienie44, osteoporoza i choroba zwyrodnieniowa stawów45,46, neurodegeneracja47,48,49,50, 51, and cancer52,53,54,55,56,57,58,59. Antagoniści PAR1 są badani od lat 90. XX wieku jako leki przeciwpłytkowe w chorobach sercowo-naczyniowych, a rosnąca lista chorób związanych z receptorem wymaga identyfikacji nowych ligandów do stosowania jako sondy biologiczne (związki narzędziowe) lub jako potencjalne środki terapeutyczne. Obecnie istnieje tylko jeden zatwierdzony przez FDA antagonista PAR1, worapaksar, który jest stosowany w leczeniu choroby wieńcowej u pacjentów wysokiego ryzyka34,36,37,60. Alternatywny antagonista PAR1, pepducyna PZ-128, zakończył udane badanie II fazy mające na celu zapobieganie zakrzepicy u pacjentów po cewnikowaniu serca38. Grupa Dockendorffa skupiła się na chemii medycznej i farmakologii odrębnej klasy małych cząsteczek, ligandów PAR1 znanych jako parmoduliny61,62. W przeciwieństwie do zgłaszanych antagonistów PAR1, takich jak worapaksar, parmoduliny są allosterycznymi, stronniczymi modulatorami PAR1, które selektywnie blokują szlak Gαq, jednocześnie promując działanie cytoprotekcyjne podobne do aPC. W przeciwieństwie do silnych ortosterycznych antagonistów PAR1, takich jak worapaksar, opublikowane parmoduliny są również odwracalne63,64,65.

Początkowo, parmoduliny zostały zidentyfikowane przez Flaumenhafta i współpracowników ze względu na ich zdolność do hamowania ekspresji selektoryny P lub wydzielania granulek w płytkach krwi61,66. Potrzebna była jednak alternatywna metoda, aby zbadać wpływ parmodulin na komórki śródbłonka. Jedną z powszechnych metod monitorowania sygnalizacji związanej z GPCR jest pomiar wewnątrzkomórkowej mobilizacji Ca2 +, ważnego wtórnego przekaźnika, który można zmierzyć za pomocą odpowiedniego wewnątrzkomórkowego barwnika wiążącego wapń 67,68. Dostarczono istotnych dowodów wskazujących, że mobilizacja wapnia indukowana przez PAR1 odbywa się poprzez aktywację Gαq69,70. Po aktywacji przez swój ligand na uwięzi (lub odpowiedni ligand egzogenny), PAR1 ulega zmianie konformacyjnej, która powoduje, że difosforan guanozyny (GDP) związany z podjednostką Gαq jest zastępowany trifosforanem guanozyny (GTP)68. Podjednostka Gαq następnie aktywuje fosfolipazę Cβ (PLC-β), która katalizuje hydrolizę 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu (PIP2), tworząc trifosforan 1,4,5-inozytolu (IP3) i diacyloglicerol (DAG). Wreszcie, IP3 wiąże się z wrażliwymi na IP3 kanałami Ca2 + w błonie retikulum endoplazmatycznego, umożliwiając uwolnienie Ca2 + do cytoplazmy, gdzie może wiązać się z zależnymi od Ca2 + barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak Fluo-4, które są dodawane do komórek71. Proces ten zachodzi w ciągu kilku sekund i może zwiększyć stężenie Ca2+ 100-krotnie, co prowadzi do drastycznej zmiany ilości barwnika związanego z wapniem i silnego sygnału fluorescencji.

W 2018 roku grupa Dockendorffa ujawniła test mobilizacji Ca2+ o średniej przepustowości, który może być wykorzystany do identyfikacji antagonistów szlaku Gαq klasy PAR172. W teście wykorzystano EA.hy92673, hybrydową linię komórek ludzkiego śródbłonka, która może być używana do wielu pasaży bez zauważalnej zmiany ekspresji PAR1 i jest przeznaczona do pomiarów in vitro efektów cytoprotekcyjnych.

Oryginalny protokół używał komórek EA.hy926 w 96-dołkowych płytkach i załadowanych barwnikiem Fluo-4/AM, który został wybrany ze względu na jego intensywną fluorescencję przy 488 nm i wysoką przepuszczalność komórek. Po załadowaniu barwnika do komórek przeprowadzano długie etapy mycia za pomocą zautomatyzowanego 8-kanałowego urządzenia do obsługi cieczy (szybsze metody obsługi cieczy, takie jak myjka 96-kanałowa, były niedostępne). Powtarzalność tego testu była lepsza niż w przypadku braku starannej, zautomatyzowanej zmiany pożywek za pomocą robota. Antagoniści byli następnie inkubowani z komórkami, PAR1 był aktywowany poprzez sekwencyjne dodawanie selektywnego agonisty (16 dołków na raz), a zmiany fluorescencji wynikające z mobilizacji wapnia i wiązania barwnika mierzono w celu określenia aktywności.

Chociaż ten protokół pozwala na pomiar mobilizacji wapnia za pośrednictwem PAR1, jest on ograniczony przez czas potrzebny do zbadania każdej płytki 96-dołkowej. Długi czas eksperymentu jest problematyczny nie tylko dlatego, że liczba związków, które można badać przesiewowo każdego dnia, jest ograniczona, ale także dlatego, że wypływ barwnika następuje z czasem, zawężając okno testowe poprzez zwiększenie podstawowej fluorescencji. Jednym z czynników przyczyniających się do długiego czasu eksperymentu jest użycie 8-kanałowego płynu do mycia płyt, co wydłuża każdy eksperyment o ponad 30 minut. Wymagane napiwki stały się również trudne do uzyskania ze względu na problemy z łańcuchem dostaw. W tym miejscu przedstawiono zaktualizowany protokół testu mobilizacji wapnia za pośrednictwem PAR, który nie wymaga obsługi cieczy, a zatem może być uruchamiany z większą przepustowością. Protokół ten powinien być również odpowiedni do pomiaru sygnalizacji za pomocą innych GPCR, które prowadzą do wewnątrzkomórkowej mobilizacji wapnia. Ten zaktualizowany protokół czytnika płytek jest idealny dla laboratoriów akademickich i małych laboratoriów przemysłowych, które nie mają zasobów na drogie instrumenty do obrazowania komórek, ale mają potrzebę szybkiego badania przesiewowego wielu związków. Przykład testu mobilizacji wapnia przy użyciu obrazowania płytkowego można znaleźć w Caers et al.74.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie wymiany/dodatki mediów wykonane w krokach 1 i 2 poniższego protokołu są wykonywane w sterylnym kapturze. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie plastikowe naczynia używane w sterylnym kapturze muszą być zakupione, wysterylizowane i zapieczętowane lub odpowiednio wysterylizowane w autoklawie.

1. Inicjacja linii komórkowej EA.hy926

  1. Zdobądź komórki EA.hy926.
  2. Przechowywać fiolkę (fiolki) komórek w fazie gazowej zbiornika z ciekłym azotem.
  3. Przygotuj kompletną pożywkę DMEM, najpierw podgrzewając DMEM, FBS i wstrzykiwacz/paciorkowca (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15-30 minut. Dodaj 50 ml FBS i 1 ml wstrzykiwacza/paciorkowca do 500 ml DMEM. Delikatnie wymieszaj roztwór przez inwersję.
    UWAGA: Zbyt energiczne mieszanie powoduje nadmierną ilość pęcherzyków.
  4. Wyjąć jedną fiolkę z komórkami z ciekłego azotu i ogrzewać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  5. Wysterylizuj fiolkę z komórkami i butelkę kompletnego podłoża DMEM, spryskując je alkoholem, a następnie przenieś do sterylnego kaptura.
  6. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl ostrożnie przenieś komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 1 ml DMEM do fiolki w celu przepłukania i dodania do probówki wirówkowej.
  7. Przygotować osad komórek za pomocą wirówki (150 × g, 5 min, 22 °C). Usunąć pożywkę z probówki wirówkowej przez aspirację; Uważaj, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  8. Dodać 3 ml kompletnej pożywki DMEM do probówki wirówkowej i delikatnie rozbić osad, mieszając zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
    UWAGA: Należy unikać powodowania pęcherzyków poprzez zbyt energiczne mieszanie, ponieważ może to aktywować lub uszkodzić komórki.
  9. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego w probówce mikrowirówkowej za pomocą pipety z końcówkami o pojemności 20 μl lub 200 μl. Dodać 10 μl mieszaniny zawiesiny komórkowej i błękitu trypanowego do hemocytometru i policzyć komórki.
    UWAGA: Użycie końcówek do pipet o pojemności 0,1-10 μl może spowodować ścinanie komórek. Końcówki tego rozmiaru nie powinny być używane podczas obchodzenia się z zawiesiną ogniw.
  10. Dodać kompletną pożywkę DMEM do zawiesiny komórek, aby uzyskać gęstość 66 000 komórek/ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 lub 25 ml. Odpipetować 15 ml zawiesiny komórek do kolby(-i) hodowlanej(-ych) T-75. Zapewnić równomierne rozproszenie zawiesiny komórek, przesuwając kolbę z północy na południe i ze wschodu na zachód.
  11. Inkubuj komórki, aż osiągną zbieg (zwykle po 4-6 dniach), zgodnie z oszacowaniem badania pod mikroskopem. W tym momencie należy użyć komórek w eksperymencie (zaczynając od sekcji 2) lub zasiać je w nowych kolbach w celu rozprężenia w celu przygotowania zamrożonych wywarów (przy zalecanej gęstości wysiewu 1 000 000 komórek w 15 ml kompletnej pożywki na kolbę T-75).
    UWAGA: Komórki można hodować w kolbach hodowlanych nawet przez 3 tygodnie bez zauważalnej różnicy w kształcie, zdrowiu lub wydajności testu. Kompletne podłoże należy wymieniać co 3-4 dni.

2. Dodanie komórek EA.hy926 do płytek 96-dołkowych

UWAGA: Komórki z jednej zlewającej się kolby hodowlanej T-75 mogą być użyte do przygotowania dwóch lub trzech płytek testowych lub opcjonalnie rozszerzone do aż 15 świeżych kolb T-75. Co najmniej pięć płytek testowych można przebadać przy użyciu protokołu w sekcjach 4 i 5 w normalnym dniu roboczym. Poniższe instrukcje opisują przygotowanie i testowanie jednej płytki testowej, ale dodatkowe płytki można przygotować, powtarzając kroki 2.2, 2.7, 2.12 i 3.2 w celu przygotowania żądanej liczby płytek testowych. Najczęściej przygotowuje się cztery płytki testowe dziennie w celu pomiaru stężenia-odpowiedzi z maksymalnie 16 związkami, co wymaga dwóch kolb T-75 z zlewającymi się komórkami.

  1. Ciepłe kompletne podłoże DMEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15-30 min. Wysterylizuj butelkę kompletnej pożywki DMEM, spryskując ją alkoholem, a następnie przenieś do sterylnego kaptura.
  2. Dodać 100 μl wysterylizowanego 0,4% roztworu żelatyny do wszystkich studzienek czarnościennej, 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem z pokrywką. Inkubować płytkę z roztworem żelatyny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) przez 30 minut.
  3. Potwierdź, że komórki w kolbie hodowlanej T-75 są w 80-100% zlewające się za pomocą odwróconego mikroskopu. Usunąć kompletną pożywkę DMEM z kolby T-75 przez aspirację.
  4. Przemyć komórki w kolbie 10 ml PBS i delikatnie przesunąć kolbę z północy na południe i ze wschodu na zachód. Wyjąć PBS z kolby przez aspirację.
  5. Dodać 5 ml roztworu do dysocjacji komórek do kolby i inkubować kolbę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez ~12 min. Postukać w kolbę po 6 minutach, aby ułatwić dysocjację.
    UWAGA: Inkubacja komórek przez okres dłuższy niż 15 minut z referencyjnym środkiem dysocjacji komórek powoduje, że komórki zaczynają się zlepiać, co utrudnia uzyskanie dokładnej liczby komórek i może zakłócać test.
  6. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM do kolby i delikatnie wymieszać z roztworem dysocjacyjnym/zawiesiną komórkową. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodać zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przygotować osad z komórek za pomocą wirówki (150 × g, 5 min, 22 °C).
  7. Podczas formowania się osadu należy usunąć roztwór żelatyny z płytki 96-dołkowej poprzez aspirację za pomocą pipety Pasteura podłączonej do próżni. Zdjąć pokrywkę płytki od momentu wyjęcia żelatyny do momentu, gdy roztwór będzie gotowy do powlekania.
    UWAGA: Opcjonalnie można użyć pipety wielokanałowej lub sterylnego kolektora podłączonego do próżni.
  8. Usunąć pożywkę z probówki wirówkowej przez aspirację za pomocą pipety Pasteura podłączonej do próżni lub pipety serologicznej; należy uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  9. Dodać świeżą kompletną pożywkę DMEM do probówki wirówkowej za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 lub 10 ml. Delikatnie rozdrobnić osad komórkowy, mieszając kompletną pożywkę DMEM z pipetą 1 000 μl lub pipetą serologiczną 5 ml.
    UWAGA: Zwykle stosuje się osiem mililitrów DMEM, ale można dodać większe objętości, aby ułatwić liczenie komórek.
  10. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego w probówce mikrowirówkowej za pomocą pipety z końcówkami o pojemności 20 μl lub 200 μl. Dodać 10 μl mieszaniny zawiesiny komórkowej i błękitu trypanowego do hemocytometru i policzyć komórki.
  11. Dodaj kompletną pożywkę DMEM do zawiesiny komórek, aby uzyskać gęstość 600 000 komórek/ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 lub 25 ml. Da to końcową gęstość 60 000 komórek/basenik na 96-dołkowej płytce (określonej jako optymalna gęstość przez eksperymenty).
    UWAGA: Normalna, udana hodowla komórkowa da od 12 000 000 do 15 000 000 komórek, które mogą zasiać od dwóch do trzech 96-dołkowych płytek.
  12. Wymieszaj zawiesinę komórkową, delikatnie odwracając probówkę wirówkową i dodaj ją do zbiornika na pipety wielokanałowej o pojemności 50 ml. Mieszając zawiesinę w zbiorniku co 30 s, delikatnie kołysząc zbiornikiem na boki, dodaj 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Załóż przezroczystą pokrywę płytki i delikatnie potrząśnij płytką, przesuwając ją po powierzchni sterylnego kaptura z północy na południe i ze wschodu na zachód, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubować płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez 16-24 h.
    UWAGA: Do przygotowania dodatkowych płytek można użyć dodatkowej zawiesiny komórek lub powtórzyć kroki 1.10-1.11, aby kontynuować linię komórkową.

3. Przygotowanie testu mobilizacji wapnia

  1. Przygotować odczynniki do oznaczania.
    1. Przygotować roztwór probenecydu (250 mM, roztwór wodny), dodając 36 mg probenecydu do probówki mikrowirówkowej i rozpuszczając go w 0,6 M NaOH (500 μl). Odwiruj roztwór.
      UWAGA: Probenecyd poprawia retencję barwnika w komórce poprzez hamowanie transporterów jonów organicznych75,76,77.
    2. Aby przygotować bufor testowy HBSS-HEPES, dodaj HEPES (1,19 g) do 500 ml butelki HBSS bez czerwieni Ca/Mg/fenolu (tworząc 10 mM roztwór HEPES). Uzupełnić bufor MgCl2 (1 M roztwór wodny, 500 μL) i CaCl2 (1 M roztwór wodny, 500 μL). Wymieszać roztwór i przechowywać w lodówce w temperaturze 5 °C, gdy nie jest używany.
      1. Na każdą 96-dołkową płytkę dodać 50 ml buforu testowego HBSS-HEPES do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, uzupełnić 500 μl roztworu probenecydu i dobrze wymieszać. Przed użyciem podgrzej bufor do temperatury pokojowej.
    3. Przygotować 10% roztwór Pluronic F-127 w DMSO, dodając Pluronic F-127 (20 mg) do probówki do mikrowirówki lub fiolki HPLC i rozpuszczając ją w 200 μl DMSO.
      UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej i wystarcza na około 30 płytek. Pluronic F-127 rozpuszcza się bardzo wolno w temperaturze pokojowej i należy go delikatnie podgrzać, aby ułatwić rozpuszczenie.
    4. Przygotować bufor ładujący barwnik, dodając najpierw 24 μl DMSO do fiolki Fluo-4/AM (50 μg) w celu rozpuszczenia barwnika. W owiniętej folią probówce wirówkowej o pojemności 15 ml dodać 6 ml buforu testowego HBSS-HEPES i uzupełnić 6 μl 10% Pluronic F-127 i 6 μl roztworu Fluo-4/AM. Krótko rozmieszać roztwór i pozostawić w temperaturze pokojowej, z dala od światła, przez 10 min.
      UWAGA: Aby zapobiec fotowybielaniu Fluo-4, należy trzymać barwnik z dala od światła, owijając folią aluminiową probówkę wirówkową zawierającą roztwór barwnika i pokrywkę płytki testowej.
  2. Przygotować płytki testowe.
    1. Wyjąć płytkę testową z inkubatora i potwierdzić zbieżność za pomocą odwróconego mikroskopu. Ręcznie wyjmij kompletny nośnik DMEM, wrzucając go do zlewu i osuszając górną część talerza ręcznikiem papierowym.
      UWAGA: Medium jest wystarczająco usuwane, trzymając płytkę poziomo i przesuwając, a następnie obracając płytkę o 180° i powtarzając.
    2. Dodać bufor do oznaczania HBSS-HEPES oraz roztwór probenecydu do zbiornika rozpuszczalnika do pipet wielokanałowych o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Ten roztwór będzie używany do późniejszych etapów prania i należy go odłożyć na bok i przykryć folią aluminiową do czasu, aż będzie potrzebny.
    3. Dodać 100 μl buforu do oznaczania HBSS-HEPES wraz z roztworem probenecydu do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej i pozostawić komórki w obecności probenecydu na 5 minut. Usunąć bufor testowy HBSS-HEPES, wrzucając go do zlewu w taki sam sposób, jak w kroku 3.2.1.
    4. Dodać bufor do ładowania barwnika do oddzielnego zbiornika rozpuszczalnika do pipet wielokanałowych o pojemności 50 ml. Dodać 50 μl buforu ładującego barwnik do każdego dołka na płytce testowej za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę przez 45 minut (37 °C, 5% CO2 ).
    5. Gdy płytka znajduje się w inkubatorze, należy przygotować roztwory agonisty/antagonisty.
      1. Roztwory antagonistów są przechowywane w DMSO jako roztwory o pojemności 31,6 mM. W probówce do PCR rozcieńczyć 2 μl roztworu podstawowego 38 μl 0,1% BSA/wody, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1,58 mM. 2 μl tego roztworu da końcowe stężenie 31,6 μM na płytce testowej. Rozcieńczyć 4 μl 1,58 mM roztworu antagonisty 36 μl 5% DMSO/wody (bez dodatku BSA) i przygotować pozostałe stężenia przez seryjne rozcieńczenia.
      2. Przygotować 108,3 μM (16,7x) roztwór TFLLRN-NH2 w buforze testowym HBSS-HEPES, który da końcowe stężenie 6,5 μM po dodaniu 6 μL do każdego dołka płytki testowej. Na przykład rozpuść 2 mg podwielokrotności TFLLRN-NH2 w 5,244 ml buforu testowego HBSS-HEPES, aby uzyskać 0,5 mM roztworu podstawowego. Zmieszaj 1,083 ml tego roztworu z 3,917 ml buforu testowego HBSS-HEPES, aby uzyskać roztwór 108,3 μM.
        UWAGA: Roztwory TFLLRN-NH2 należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C, gdy nie są używane.
    6. Wyjąć płytkę z inkubatora i upewnić się, że barwnik jest wychwytywany za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w odpowiednim ustawieniu (zazwyczaj dla białka zielonej fluorescencji, patrz Rysunek 1 dla przykładu Fluo-4 pomyślnie załadowanego do komórek). Usuń bufor ładujący barwnik, przesuwając płytkę w taki sam sposób, jak w kroku 3.2.1.
    7. Przemyć komórki 2x 50 μl buforu do oznaczania HBSS-HEPES plus roztwór probenecydu (z kroku 3.2.3) w każdej studzience (usunąć przez wciśnięcie pożywki do zlewu).
    8. Dodaj 92 μl buforu testowego HBSS-HEPES do każdej studzienki i ponownie obejrzyj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że nadmiar barwnika został całkowicie usunięty, a komórki pozostają przylegające.
    9. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 2 μl roztworów antagonistów i nośnika do odpowiednich studzienek (patrz tabela 1 w celu uzyskania reprezentatywnej mapy płytek).

4. Przeprowadzanie testu mobilizacji wapnia

  1. Ustawić czytnik płytek w następujący sposób: temperatura: 37 °C; długość fali wzbudzenia: 485 nm; długość fali emisji: 525 nm; wysokość pomiaru: 7,8 mm (zoptymalizowana); liczba błysków: 100; liczba powtórzeń: 20.
  2. Inkubować płytkę przez 15 minut w czytniku płytek w temperaturze 37 °C. Zmierzyć fluorescencję tła w kolumnach 1 i 2 (pięć skanów na studzienkę).
  3. Wysunąć płytkę z czytnika płytek i szybko dodać 6 μl roztworu agonisty do każdej studzienki w kolumnach 1 i 2 z 8-probówkowego paska PCR za pomocą pipety wielokanałowej.
    UWAGA: Na tym etapie używamy elektronicznej pipety 8-kanałowej z końcówkami do pipet 0,1-10 μl.
  4. Zmierz zmianę fluorescencji, gdy w komórkach zachodzi mobilizacja wapnia. Wykonaj 20 skanów każdej studzienki zgodnie z powyższymi ustawieniami.
    UWAGA: Skanowanie każdej studzienki w dwóch kolumnach po 20x każda zajmuje około 5 minut (tj. ~15 s między skanami każdej studzienki).
  5. Powtórz kroki 4.2-4.4 dla kolumn 3-12 w odstępach co dwie kolumny.

5. Analiza danych

  1. Eksportuj dane z testu jako osobne arkusze kalkulacyjne dla każdej grupy dwukolumnowej.
  2. Znajdź średnią odczytów fluorescencji podstawowej za pomocą funkcji AVG (pierwsze skanowanie: ostatnie skanowanie). Zrób to dla każdego dołka w obu kolumnach.
  3. Znajdź maksymalną fluorescencję po dodaniu agonisty za pomocą funkcji MAX(pierwsze skanowanie: ostatnie skanowanie).
  4. Oblicz zmianę fluorescencji, odejmując fluorescencję podstawową od fluorescencji maksymalnej.
  5. Odjąć zmianę fluorescencji obliczoną dla kontroli ujemnej (dodanie nośnika bez agonisty) od każdej studzienki w tej samej kolumnie.
  6. Znajdź względną (znormalizowaną) zmianę fluorescencji, dzieląc zmianę fluorescencji w każdym basenie przez zmianę fluorescencji w nośniku (0,1% DMSO/woda) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 studzienka.
  7. Skopiuj wartości niekontrolne, jako procenty, do programu statystycznego i do tworzenia wykresów. Jeśli korzystasz z oprogramowania, do którego się odwołuje, wybierz opcję tabeli XY, z liczbami wybranymi jako oś X i replikuj wartości w podkolumnach obok siebie jako oś Y.
  8. Użyj programu, aby wykreślić krzywe stężenie-odpowiedź (CRC) na podstawie danych. W przypadku korzystania z oprogramowania, do którego się odwołuje, należy wybrać opcję logarytmu (inhibitora) a odpowiedzi - Zmienne nachylenie (cztery parametry).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego testu jest zazwyczaj uzyskanie krzywych stężenie-odpowiedź (CRC) dla trzech do czterech nowych parmodulin. Na każdej płytce testowej często generowany jest dodatkowy CRC dla znanego związku, takiego jak NRD-21, który działa jako kontrola jakości eksperymentu ze względu na znany IC50. W celu wygenerowania CRC należy zaplanować mapę tablicową, taką jak ta przedstawiona w tabeli 1. Jeśli zamiast tego pożądane są jednopunktowe reakcje stężenia, związki o końcowych stężeniach 10 μM (lub innych preferowanych stężeniach) należy dodać do co najmniej trzech studzienek.

Podczas wykonywania testu, powinien nastąpić szybki wzrost fluorescencji (wzrost powinien rozpocząć się w ciągu pierwszych 3-4 skanów) wyświetlany przez czytnik płytek (zobacz Rysunek 2A dla przykładowego wyniku w porównaniu do nieudanego wyjścia w Rysunek 2B). Ważne jest, aby pamiętać, że agonista musi zostać dodany szybko (w ciągu 15 sekund), aby czytnik płytek był w stanie dokładnie uchwycić wzrost fluorescencji. W eksperymencie roboczym sygnał fluorescencji dla studzienki nośnika powinien pozostać płaski, podczas gdy sygnał fluorescencji w studzienkach kontroli pozytywnej (nośnik + 6,5 μM TFLLRN-NH2) powinien zacząć rosnąć po trzech lub czterech skanach. Po osiągnięciu wartości maksymalnej (po ~10 skanach) sygnał fluorescencji powinien zacząć powoli spadać. W eksperymentach z wysoce skutecznymi antagonistami, studzienki o najwyższych stężeniach antagonisty powinny mieć sygnał, który pozostaje stosunkowo płaski, podobnie jak w przypadku kontroli negatywnej. Powinna być również niewielka różnica między sygnałem ze studzienek kontroli pozytywnej a tymi z niskimi stężeniami antagonisty (Rysunek 2C). Jeśli najniższe stężenia antagonisty nadal hamują mobilizację wapnia, stężenia przesiewowe należy dostosować tak, aby obejmowały niższe stężenia. Wygenerowane CRC powinny mieć co najmniej jeden punkt danych ~100%, aby w pełni pokazać sigmoidalną naturę krzywej.

Najczęstszym znakiem, że eksperyment nie powiódł się, jest to, że odwiert kontroli pozytywnej (nośnik + 6,5 μM TFLLRN-NH2) nie wykazuje dużego wzrostu fluorescencji (Rysunek 2B). Może się to zdarzyć z różnych powodów: liczba komórek może być niska (jeśli konfluencja nie zostanie potwierdzona), roztwór agonisty może być zagrożony lub komórki mogą pobrać niewystarczające ilości barwnika. Możliwe jest również omyłkowe niedodawanie agonisty do niektórych studzienek.

Za pomocą zaprogramowanej metody, dane są wyprowadzane jako sześć oddzielnych arkuszy kalkulacyjnych, z których każdy zawiera dane dla dwóch kolumn. Pięć skanów podstawowej fluorescencji znajduje się w osobnym rzędzie, z 20 skanami wykonanymi po dodaniu agonisty w rzędzie bezpośrednio poniżej (patrz Rysunek 3 dla reprezentatywnych wyników). Do przykładowego obliczenia zostanie użyta kolumna z eksperymentu z użyciem NRD-21. W wyeksportowanym pliku (Rysunek 3), podstawowa fluorescencja z każdej studzienki jest wyprowadzana do kolumn C do G, a dane po dodaniu agonisty (kolejne 20 skanów) są wyprowadzane do kolumn C do V w następnym wierszu. Wiersze 14–17 w pliku zawierają kontrolę dodatnią dwóch oddzielnych kolumn. Średnia z rzędu podstawowego dla jednej ze studzienek kontroli dodatniej została obliczona za pomocą polecenia "=ŚREDNIA(C16:G16)", co dało wartość 1 039,8. Polecenie to zostało powtórzone dla dodatkowych pomiarów podstawowych w każdej studzience. Maksimum skanów eksperymentalnych zostało obliczone za pomocą polecenia "=MAX(C16:V16)", które dało wartość 2,629. Ponownie polecenie zostało powtórzone dla wszystkich studni. Podstawowa fluorescencja dla każdej studzienki została następnie odjęta od wartości maksymalnej. W tym eksperymencie dane znormalizowano poprzez odjęcie zmiany fluorescencji w kontroli ujemnej od każdego dołka (który wynosił 142,6 w kolumnie przykładu). Wartości te zostały następnie podzielone przez podobnie obliczoną wartość kontroli dodatniej. W tej kolumnie maksymalna wartość wynosiła 2 629, średni pomiar podstawowy wynosił 1 039,8, a wartość odjęta dla ślepej próby wynosiła 142,6. Skorygowana wartość kontroli dodatniej wynosi zatem 1 446,6 (obliczona na podstawie równania). Równanie to powtarza się dla każdej studzienki w kolumnie, a obliczone wartości są dzielone przez 1 446,6, aby uzyskać ich względną zmianę fluorescencji. Wskaźniki zostały następnie przeliczone na procenty i skopiowane do oprogramowania analitycznego. Proces ten został powtórzony dla pozostałych 11 kolumn.

Aby przetworzyć dane za pomocą oprogramowania, do którego się odnosi, należy wybrać tabelę XY z opcją trzech powtarzających się pomiarów w kolumnach obok siebie. Wartości -log każdego stężenia należy wprowadzić do wartości x, a obliczone wartości procentowe dodać do wartości y. Na danych należy przeprowadzić analizę regresji nieliniowej, która powoduje uzyskanie czterech krzywych stężenie-odpowiedź. Program generuje również wartości IC50, ilościowe statystyki błędów i statystyki dobroci dopasowania.

figure-results-1
Rysunek 1: Fluo-4/AM załadowany do komórek EA.hy926. Fluo-4 selektywnie ładowany do komórek EA.hy926, po etapach inkubacji barwnika i mycia. Cała fluorescencja zachodzi w komórkach, bez wycieku barwnika. Obraz uzyskany przy użyciu ustawienia GTP na kamerze komórkowej EVOS i 20-krotnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Potencjalny wynik testu. (A) Reprezentatywny odczyt płytek z testu roboczego. Wiersz A jest kontrolą ujemną i nie ma zmian we fluorescencji. Rząd B jest kontrolą pozytywną i wykazuje szybki wzrost fluorescencji. Rzędy C-H to studnie doświadczalne, w których wyższe stężenia parmoduliny znajdują się niżej w płytce. (B) Przykładowe dane wyjściowe nieudanego eksperymentu. Nie obserwuje się wzrostu fluorescencji w rzędzie B, który jest kontrolą pozytywną. (C) Zmiana fluorescencji w czasie indukowana przez agonistę PAR1 TFLLRN-NH2. Skanowanie dwóch kolumn płytki 96-dołkowej przy użyciu podanych ustawień zajmuje ~5 minut na czytniku płytek PerkinElmer EnSpire (tj. ~15 s pomiędzy skanami każdej studzienki). Różne roztwory NRD-21 są wskazane, "Agonista" to 6,5 μM TFLLRN-NH2, n = 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykładowy wynik Excela dla testu roboczego. Fluorescencja podstawowa jest wyprowadzana do rzędów parzystych, zaczynając od rzędu 10, a wynik z pierwszych 10 skanów po dodaniu agonisty jest wyświetlany w kolejnych wierszach o numerach nieparzystych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Zrobotyzowana obsługa cieczy kontra "migotanie". Wstępne powlekanie płytek testowych żelatyną i ręczne przeprowadzanie wymiany pożywek poprzez przesuwanie płytki i osuszanie jej tworzy krzywe stężenie-odpowiedź o mniejszej zmienności. (A) Krzywe stężenie-odpowiedź parmodulin ML161 i NRD-21 oraz 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (zautomatyzowana obsługa cieczy). (B) Krzywe stężenie-odpowiedź parmodulin ML161 i NRD-21 oraz 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (pokryte żelatyną, potrząsane płytki). Dane są ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Badania temperatury. Przeprowadzenie testu w temperaturze 37 °C pozwala uzyskać bardziej powtarzalne dane niż w temperaturze pokojowej. (A) Krzywe stężenie-odpowiedź ML161 i 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (temperatura pokojowa). (B) Krzywe stężenie-odpowiedź ML161 i 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). Dane są średnimi ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Badania gęstości komórek. Optymalna gęstość komórek wynosi 60 000 komórek/dołek podczas wysiewu 16-24 godziny przed rozpoczęciem testu. (A) Krzywe stężenie-odpowiedź TFLLRN-NH2 przy różnych gęstościach komórek, n = 3. (B) Krzywa stężenie-odpowiedź TFLLRN-NH2 przy optymalnej gęstości komórek 60 000 komórek / studzienkę. Dane są ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Objętość testu. Użycie objętości testu wynoszącej 100 μL pozwala uzyskać bardziej powtarzalne krzywe stężenie-odpowiedź niż testy wykorzystujące końcową objętość 200 μL. (A) Krzywe stężenie-odpowiedź ML161 i 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (200 μL objętości końcowej). (B) Krzywe stężenie-odpowiedź ML161 i 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (100 μL objętości końcowej). Dane są średnimi ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Generowanie czynników Z' w celu określenia zdolności testu do wykrycia trafionego związku. Odpowiedzi mobilizacji wapnia z 6,5 μM TFLLRN-NH2 (kolumna B) plus opcjonalnymi antagonistami PAR1 10 μM NRD-21 (kolumna C) lub 0,316 μM worapaksarem (kolumna D). (A) Test zakończony 16 godzin po wysiewie komórek. (B) Test zakończony 24 godziny po wysiewie komórek. (C) Tabela obliczonych współczynników Z' przy użyciu następującego równania: figure-results-9, gdzie σp jest odchyleniem standardowym kontroli dodatniej, σn jest odchyleniem standardowym dla kontroli ujemnej lub próbki, μp jest średnią kontroli dodatniej, a μn jest średnią z kontroli ujemnej lub próbki. Każdą wartość oblicza się, oznaczając nośnik + 6,5 μM TFLLRN-NH2 jako kontrolę pozytywną i porównując ze wskazanym stanem jako kontrolę ujemną (nośnik) lub próbkę (NRD-21 i worapaksar). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 9: Mobilizacja wapnia przez agonistę PAR2. Zmiana fluorescencji w czasie indukowana przez 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4. Dane są ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przykładowa mapa 96-dołkowa dla badań przesiewowych złożonych. Każde stężenie mierzy się w trzech egzemplarzach. Wiersz A zawiera kontrole ujemne (brak antagonisty, brak agonisty), a wiersz B zawiera kontrole pozytywne (brak antagonisty; agonista). Kolumny od 1 do 3 zawierają sześć stężeń półlogarytmicznych parmoduliny NRD-21, które mogą być opcjonalnie wykorzystane do kontroli jakości. PM-A, PM-B, PM-C są nienazwanymi parmodulinami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Porównanie poprzednio opublikowanego protokołu z nowym, zoptymalizowanym protokołem. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy poprzednio zgłoszony protokół72 był ogólnie niezawodny i pozwolił nam zidentyfikować nową parmodulinę ołowiową, NRD-21,62 pożądany był bardziej wydajny protokół. Test został dodatkowo naruszony w czasie niedoboru dostaw spowodowanego pandemią COVID-19. Zdobycie końcówek do zautomatyzowanej maszyny do obsługi cieczy stało się trudne, a próba umycia, sterylizacji i ponownego użycia końcówek spowodowała powstanie CRC ze znaczną zmiennością. Ułatwiło to przeprowadzenie pilnej serii eksperymentów mających na celu usprawnienie ulepszonego testu mobilizacji wapnia sterowanego przez PAR.

Głównym priorytetem w tym badaniu było zidentyfikowanie odpowiedniej alternatywy dla stosowania automatycznego urządzenia do obsługi cieczy na etapach mycia. Podczas wcześniejszego opracowywania testów zastosowanie zrobotyzowanej maszyny do obsługi cieczy zmniejszyło liczbę błędów spowodowanych ręczną wymianą pożywki. Wydłużyło to jednak czas testu, ponieważ wymiana pożywek z 8-kanałowym urządzeniem do obsługi cieczy wydłużyła całkowity czas każdej płytki testowej o 30-45 minut. Chociaż wcześniej próbowano metody wymiany pożywki "miażdżącej", eksperymenty te przeprowadzono bez powlekania płytek testowych żelatyną przed wysiewem komórek. Dzięki wstępnej obróbce płytek żelatyną, komórki pozostały na swoim miejscu niezależnie od siły użytej do ręcznego usunięcia podłoża. CRC wygenerowane w teście przy użyciu pokrytych żelatyną, potrząsanych płytek miały lepsze wyniki dopasowania i mniejsze słupki błędów w wielu punktach danych niż krzywe, w których zastosowano zautomatyzowaną obsługę cieczy (Rysunek 4). Wartości błędu średniokwadratowego (RMSE) dla płytki przy użyciu automatycznego urządzenia do obsługi cieczy wynosiły 9,687 dla krzywej ML161 i 10,690 dla krzywej NRD-21, podczas gdy wartości RMSE dla płytki z użyciem żelatyny i ręcznej wymiany pożywki wynosiły 7,658 dla krzywej ML161 i 6,408 dla krzywej NRD-21. Niższe wartości RMSE wskazują krzywą, która lepiej pasuje do podanych danych. Ta zmiana również znacznie skraca całkowity czas testu. Alternatywnie można zastosować wielokanałową automatyczną myjkę do płyt.

Dodatkowym badanym czynnikiem była metoda dodawania agonistów. Wykonano to, aby ustalić, czy agonista może być dodany do wszystkich studzienek płytki jednocześnie, a następnie skan całej płytki jednocześnie; Wyeliminowałoby to konieczność pozostawania badaczy w pobliżu czytnika płytek przez cały czas trwania testu wrażliwego na czas dla wielu oddzielnych dodatków agonistów, co mogłoby znacznie zwiększyć przepustowość. Niestety, dodanie agonisty do wszystkich studzienek i przeskanowanie całej płytki było problematyczne, ponieważ odpowiedź jest zbyt szybka, aby wiarygodnie zmierzyć przejściowe maksymalne stężenie wapnia w każdym dołku, co daje bardzo zmienne CRC. Zmniejszenie liczby skanowanych kolumn z 12 do 6 nieznacznie poprawiło wyniki, ale najlepsze wyniki uzyskano skanując tylko dwie kolumny (16 dołków) jednocześnie. Można postawić hipotezę, że obniżenie temperatury testu z 37 °C do temperatury pokojowej może spowolnić zmianę stężenia wapnia na tyle, aby umożliwić wiarygodne pomiary. Chociaż wiele protokołów mobilizacji wapnia z różnymi barwnikami lub liniami komórkowymi zostało zwalidowanych w temperaturze pokojowej78,79, w tym konkretnym teście zaobserwowano poprawę wyników w temperaturze 37 °C. Zmierzone krzywe stężenie-odpowiedź antagonisty w temperaturze pokojowej (~23°C) nie były tak jednolite jak w temperaturze 37 °C (Figura 5A w porównaniu z Figurą 5B). Na podstawie tych wyników stwierdzono, że skanowanie dwóch kolumn jednocześnie w temperaturze 37 °C jest optymalne.

Inną zmienną, która została zbadana w celu skrócenia czasu testu, był czas inkubacji antagonisty. W poprzednim protokole antagoniści byli inkubowani przez 40 minut przed dodaniem agonisty, ale tutaj ustalono, że 15 minut to wystarczający czas, aby parmoduliny oddziaływały z PAR1. Testowano to, dodając roztwory parmoduliny do wielu kolumn w tym samym czasie, a następnie dodając agonistę w różnych punktach czasowych (agonista dodawano w t = 15 min, 30 min i 45 min). Aktywność parmodulin została zachowana, ale nie uległa poprawie, dzięki dłuższej inkubacji antagonistów. W wyniku tego odkrycia, w nowym protokole, roztwory antagonistów są dodawane jednorazowo do całej płytki, a roztwory agonistów są dodawane do pierwszych kolumn po inkubacji trwającej 15 minut. Ta zmiana jeszcze bardziej skraca całkowity czas eksperymentu o 30 minut. Należy zauważyć, że antagoniści o powolnej kinetyce wiązania, tacy jak worapaksar, mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji80,81.

Podczas gdy skrócenie czasu testu i wyeliminowanie polegania na urządzeniu do obsługi płynów były głównymi czynnikami wymagającymi aktualizacji protokołu testu, przetestowano również alternatywną metodę hodowli komórek. Wcześniej talerze wysiewano komórkami bezpośrednio z zamrożonych zapasów i pozostawiano do wzrostu w talerzach przez 40-48 godzin po wysianiu. Jednak wydłużony czas między płytkami wysiewającymi a wykonywaniem testów ograniczał liczbę eksperymentów, które można było przeprowadzić każdego tygodnia. Korzystanie z komórek hodowanych w kolbach hodowlanych drastycznie skraca ten czas. Komórki hodowano w kolbach T-75 poddanych hodowli tkankowej i usunięto z powierzchni kolby za pomocą nieenzymatycznego środka dysocjacji komórek. Może to być ważne, aby uniknąć uszkodzenia niektórych receptorów powierzchniowych komórek, w szczególności PAR2, za pomocą trypsyny. Po dodaniu do płytki testowej komórki potrzebują odpowiedniego czasu, aby się uspokoić i przykleić do żelatyny. Ponieważ metoda usuwania pożywki może również przemieścić komórki, potrzeba wystarczająco dużo czasu, aby komórki mogły zostać osadzone w żelatynie. Eksperyment, w którym komórki mogły się uspokoić przez dwie godziny, spowodował znaczną utratę komórek, co spowodowało, że test nie nadawał się do użytku (dane nie pokazane). Czas osiadania od 2 h do 12 h ogranicza liczbę płytek, które można przeanalizować w ciągu jednego dnia, dlatego preferowana jest dłuższa inkubacja przez noc. Stwierdzono, że inkubacja nowo wyhodowanych komórek w dowolnym miejscu od 16 do 24 godzin pozwoliła komórkom w pełni przykleić się do żelatyny i można uzyskać powtarzalne dane.

Przejście z komórek zamrożonych na komórki wyhodowane w kolbach hodowlanych również zmieniło optymalną gęstość wysiewu komórek. Jak można było przewidzieć, wysiewanie studzienek przy gęstości 25 000 komórek/studzienkę, która była standardem w poprzednim protokole, nie pozwalało komórkom na osiągnięcie konfluencji przy krótszym czasie inkubacji. Agonistyczne CRC zostały wygenerowane z ośmioma oddzielnymi gęstościami komórek w celu określenia optymalnych warunków (Figura 6). Wcześniej TFLLRN-NH2 był stosowany jako agonista PAR1 w dawce 5 μM, ponieważ pozwalało to na rozsądny antagonizm z parmodulinami o niższej rozpuszczalności. Nie ma znaczącej różnicy w tle lub maksymalnym sygnale podczas wysiewu z 45 000-65 000 komórek / studzienkę, ale następuje spadek zmienności przy 5 μM TFLLRN-NH2 po dodaniu 60 000 komórek / studzienkę. Co ciekawe, nie ma znaczącego wzrostu maksymalnej fluorescencji przy większej liczbie komórek, więc 60 000 komórek/studzienkę wybrano jako optymalną gęstość ze względu na zmniejszoną zmienność. Agonistyczne CRC wytwarzały również EC50 o wartości 6,5 μM dla TFLLRN-NH2, więc wybrano je jako nowe standardowe stężenie agonistów.

Kolejnym czynnikiem, który został przeanalizowany, były objętości użyte w teście. W poprzednim protokole do każdej studzienki dodano 2 μl agonisty, aby uzyskać końcową objętość testu 200 μl. Postawiono hipotezę, że dodanie większych objętości roztworu agonisty - ale przy utrzymaniu stałego stężenia końcowego - może pomóc w mieszaniu, powodując szybszy i bardziej wiarygodny sygnał. Aby przetestować tę hipotezę, porównano dodanie 2 μl, 6 μl i 10 μL TFLLRN-NH2 do 100 μl lub 200 μl HEPES-HBSS na płytce testowej zawierającej różne stężenia NRD-21. Wygenerowano CRC NRD-21 z każdego stanu, aby określić, która kombinacja objętości agonisty i końcowej objętości testu dała najbardziej spójne dane. Podczas gdy zarówno dodanie 2 μL, jak i 6 μL spowodowało wygenerowanie CRC o niewielkiej zmienności, tego samego nie można powiedzieć o krzywych uzyskanych z dodania 10 μL TFLLRN-NH2 (dane nie pokazane); wzrost fluorescencji nie był spójny w tych studniach ani pod względem wielkości, ani czasu, co powoduje powstawanie CRC, które powinny być identyczne, ale zamiast tego drastycznie się różnią. Chociaż dodanie 2 μl i 6 μl dało podobne wyniki, zmiana fluorescencji nastąpiła znacznie szybciej po dodaniu 6 μl TFLLRN-NH2, co pozwoliło na zmniejszenie całkowitej liczby skanów w każdym studzience o połowę, z 40 skanów do 20 skanów. Ustalono również, że użycie końcowej objętości 100 μL daje bardziej jednorodne CRC w porównaniu z tymi generowanymi przy końcowej objętości 200 μL (ryc. 7).

Aby określić, czy nowy protokół jest odpowiedni dla testów o wyższej przepustowości, obliczono współczynniki Z' dla testu (ryc. 8). Współczynnik Z' jest metodą statystyczną mierzącą jakość testu przesiewowego i określającą, czy test wiarygodnie rozróżni związki aktywne i nieaktywne82. Współczynniki Z' obliczono dla testów wykonanych między 16 a 24 godzinami po wysiewie płytek i przy różnych przejściach komórkowych. We wszystkich przypadkach - zarówno dla samych trybów agonisty, jak i agonisty plus antagonisty - obliczone współczynniki Z' były większe niż 0,5, co wskazuje na doskonały test82. Obliczone współczynniki Z' były również podobne do tych obliczonych dla poprzedniego testu, co wskazuje, że zmiany wprowadzone do protokołu w celu uzyskania szybszego testu nie wpłynęły negatywnie na jakość.

Protokół mobilizacji wapnia sterowanej przez PAR został zaktualizowany poprzez eksperymenty generujące wartości IC50 z CRC, ale test może być również wykorzystany do pomiaru skuteczności antagonistów PAR1 w pojedynczych stężeniach. Test może być również stosowany do pomiaru aktywności ligandów PAR2; na przykład agonista PAR2 SLIGKV-NH2 może zastąpić TFLLRN-NH2 w zaktualizowanym protokole (ryc. 9); poprzedni protokół był również stosowany z agonistami i antagonistami PAR283. Chociaż nie został tutaj wyraźnie przetestowany, protokół ten powinien mieć również zastosowanie do ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), które były używane w poprzednim protokole, i potencjalnie innych przylegających linii komórkowych. Ograniczeniem w korzystaniu z czytnika płyt skanujących z protokołami takimi jak ten jest to, że nie nadają się one do badania szybkich (subsekundowych) reakcji, a przynajmniej nie równolegle, jak jest to możliwe w przypadku imagera płytowego.

Podsumowując, opisano tutaj szybszy i prostszy protokół testu mobilizacji wapnia sterowanego śródbłonkiem przez PAR przy użyciu czytnika płytek. Eliminując potrzebę stosowania zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy, skracając czas inkubacji antagonistów i zmniejszając liczbę skanów dla każdej studzienki, całkowity czas testu został skrócony o co najmniej 90-120 minut, a koszty testów zostały zmniejszone (w celu porównania między poprzednio zgłoszonymi a obecnymi protokołami, patrz tabela 2). Pozwoli to nie tylko na badanie przesiewowe większej liczby związków każdego dnia, ale także wyeliminuje ryzyko zmniejszenia okna testowego z powodu wypływu barwnika, co może prowadzić do niewiarygodnych wyników. Nowo zoptymalizowany test pozwala na szybsze badanie przesiewowe w komórkach śródbłonka ligandów PAR1 lub PAR2 lub potencjalnie innych ligandów GPCR, które aktywują wewnątrzkomórkową mobilizację wapnia, w laboratoriach ograniczonych do stosowania czytników płytkowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.D. jest wynalazcą patentów dotyczących parmodulin oraz założycielem i udziałowcem firmy Function Therapeutics, Inc., która opracowuje parmoduliny do użytku klinicznego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) i Dr. Leggy Arnold (University of Wisconsin-Milwaukee) za zapewnienie przestrzeni i pośrednie wsparcie dla tego projektu, oraz Dr. Johnowi McCorvy'emu (Medical College of Wisconsin) za odpowiednie porady. Dziękujemy Narodowemu Instytutowi Serca, Płuc i Krwi (R15HL127636), Departamentowi Obrony Stanów Zjednoczonych (W81XWH22101) oraz Narodowej Fundacji Nauki (2223225) za wsparcie w postaci grantów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki do hodowli komórkowych Cell Culture
Adherent EA.hy926 cellsATCC CRL-2922
CellStripper Odczynnik do dysocjacji komórekCorning25-056-CITrypsyna może być opcjonalnie stosowana, ale zdecydowanie należy jej unikać w testach PAR2.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z czerwienią fenolowąCorning10-013-CV
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Avantor97068-091
Żelatyna ze skóry świniMilliporeSigmaG2500Służy do przygotowania wodnego roztworu 0,4% (w/v) z wodą dejonizowaną. Autoklaw przed użyciem do sterylizacji.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Corning21-040-CV
Błękit trypanowy (0,4% w/v)Corning25-900-CI
strong>Odczynniki do mobilizacji wapnia
4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy kwas (HEPES)Thermo172571000
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Avantor97061-420
Chlorek wapnia dwuwodnyThermo42352-0250
DimetylosulfotlenekThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Zrównoważony roztwór soli Hanka (bez Ca/Mg/czerwieni fenolowej)Corning21-022-CV
Chlorek magnezu sześciowodnyMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecydTCI AmericaP1975
Wodorotlenek soduVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (sól TFA)Przygotowane przez Trudy Holyst w Versiti Blood Instytut Badawczy
Materials
96-well z kulturą poddawaną obróbce kulturowej, czarnościenna, przezroczysta dolna płytka testowaCorning3603z przezroczystymi pokrywkami
Probówka wirówkowa, 15 mlAvantor89039-664
Probówka wirówkowa, 50 mlAvantor89039-656
Kolba hodowlana, T-75Corning353136kultura tkankowa poddana działaniu
Jednorazowy zbiornik na odczynniki, 50 mlCorningRES-V-50-S
Czytnik płytek EnspirePerkin ElmerWycofane
Probówka do mikrowirówek, 1,5 mlAvantor20170-038
Pipeta Pasteura, 9"Fisher13-678-6Bmusi być wysterylizowana
Pasek probówki PCR z oddzielnym płaskim Paski z nakrętkamiAvantor76318-802
Końcówki do pipet, 20 i mikro; LBiotix63300042sterylne, filtrowane końcówki
Końcówki do pipet, 200 i mikro; LBiotix63300044sterylne, filtrowane końcówki
Końcówki do pipet, 1250 i mikro; LBiotix63300047sterylne, filtrowane końcówki
PrismGraphPadobjętość 6 używana
pipeta serologiczna, 5 mlTradewinds Direct  07-5005
Pipeta serologiczna, 10 mlTradewinds Direct  07-5010
Pipeta serologiczna, 25 mlTradewinds Direct  Numer katalogowy: 07-5025
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4(2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582(2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, Pt 1 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597(2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062(2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124(2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100(2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23(2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516(2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza z u yciem czytnika p ytekkom rki r db onkamodulatory PAR1barwnik Fluo 4wysokoprzepustowe przesiewaniesygnalizacja Gqp ytka 96 do kowapomiar fluorescencji

Powiązane artykuły