Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wraz z rozwojem immunoterapii, istnieje ciągła potrzeba opracowania modeli, które mogłyby podsumować mikrośrodowisko guzów rodzimych. Podczas gdy tradycyjne dwu- i trójwymiarowe modele mogą dostarczyć informacji na temat rozwoju i progresji raka, brakuje im kluczowych aspektów, które utrudniają wierne naśladowanie rodzimych nowotworów. Alternatywnym modelem, który zyskał wiele uwagi, jest organoid pochodzący od pacjenta. Rozwój tych organoidów podsumowuje złożoną komunikację międzykomórkową, mikrośrodowisko guza i histoarchitekturę guzów. W artykule opisano protokół tworzenia modeli organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem (MPDO). Aby zweryfikować te modele, oceniliśmy skład komórek odpornościowych, w tym poziomy ekspresji markerów aktywacji komórek T, aby potwierdzić niejednorodność komórkową organoidów. Dodatkowo, aby opisać potencjalną użyteczność MPDO w terapiach komórkowych, oceniliśmy cytotoksyczne możliwości leczenia organoidów limfocytami T γδ. Podsumowując, modele MPDO oferują obiecujące możliwości zrozumienia złożoności guza, walidacji strategii terapeutycznych i potencjalnego postępu w spersonalizowanym leczeniu.
Wprowadzenie
Konwencjonalne modele hodowli komórkowych 2D są niezbędnymi narzędziami w badaniach nad rakiem do badania progresji i terapii raka1. Modele te nie tylko pozwalają na kontrolowanie warunków eksperymentalnych w celu zbadania mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw rozwoju i progresji raka, ale także zapewniają opłacalne i stosunkowo szybkie wyniki eksperymentalne. Ich zastosowanie jest jednak ograniczone ze względu na ograniczoną różnorodność komórkową w mikrośrodowisku guza (TME), której nie można podsumować w współpłaszczyznowej naturze modeli monokulturowych2. Dodatkowo, modele hodowli komórkowych ofe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ludzkie tkanki czerniaka zostały pobrane od pacjentów leczonych na Uniwersytecie Pensylwanii przy użyciu protokołu pobierania tkanek (UPCC08607), który został zatwierdzony przez Institutional Review Board of the University of Pennsylvania. Wszyscy pacjenci podpisali świadomą zgodę. Po wycięciu tkanek ludzkiego czerniaka, tkankę nowotworową umieszcza się w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco i utrzymuje w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia (w ciągu 6 godzin). Organoidy pochodzące od pacjentów z czerniakiem (MPDO) pochodziły ze świeżego guza, jak pokazano na Rysunek 1.
1. Izolacja....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kształt i rozmiar MPDO monitorowano w czasie, aby zbadać dynamikę ich wzrostu. Jak pokazano na rysunku 2, w początkowym okresie wzrostu rozmiar organoidów znacząco zwiększył się w ciągu przedstawionych 7 dni. Po zaobserwowaniu dynamiki wzrostu MPDO, skupiono się na ocenie składu komórek odpornościowych, aby zweryfikować, czy organoidy wiernie odtwarzają cechy pierwotnych guzów. Ocena ta, koncentrująca się głównie na liczebności limfocytów T αβ, pozwoliła określić stopień podobieństwa między .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pojawienie się ChNP rozwiązało wiele ograniczeń związanych z innymi wcześniej ustalonymi metodami badań nad rakiem, wprowadzając jednocześnie potencjalne zastosowania w tej dziedzinie. Ta technologia organoidów została po raz pierwszy zaproponowana w 2009 roku przez Hansa Cleversa i współpracowników, którzy byli w stanie z powodzeniem ustanowić system hodowli organoidów jelitowych poprzez hodowlę komórek macierzystych Lgr5 + pochodzących z jelita myszy w żelu matrycowym 3D zawierającym czynniki R-sponsin, EGF .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie zostało częściowo sfinansowane z grantów od R01(CA258113), SPORE (CA261608) i P01 (CA114046). Rysunek 1 został przygotowany w BioRender.com.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2 ml czerwona nakrętka Fiolka kriogeniczna z polipropylenu z gwintem wewnętrznym | Corning | 431420 | |
| 50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa | Corning | 352070 | |
| 100 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TC | Corning | 353003 | |
| 105 mm Kleszcze polistyrenowe Sterylne | zatyczki Evergreen | 222-1121-B1I | |
| 150 cm2 Kolba do hodowli komórkowych | Corning | CLS430825 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 (1x) Zredukowana pożywka surowicy (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
| Suplement B-27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Fiolet brylantowy 510 przeciwciało anty-ludzkiej perforyny | BioLegend | 308120 | |
| Brilliant Violet 605 przeciwciało anty-ludzkie Ki-67 | BioLegend | 350522 | |
| Brilliant Violet 650 antyludzkie przeciwciało CD366 (Tim-3) | BioLegend | 345028 | |
| Brilliant Violet 711 antyludzkie przeciwciało CD45 | BioLegend | 304050 | |
| Wkładki do hodowli komórkowych 0,4 i mikro; m, Średnica 30 mm | Millipore Sigma | PIHP03050 | |
| Bufor do barwienia komórek | BioLegend | 420201 | |
| Sitko do komórek 40 µ m Nylon Corning | 352340 | ||
| Sitko do komórek 70 i mikro; m Nylon Corning | 352350 | ||
| Kolagenaza, Typ IV, proszek | Gibco | 17104019 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Płytka hodowlana, PS, 48 dołków, TC traktowana pokrywką, sterylna | Max Scientific | 07-6048 | |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM - wysoka zawartość glukozy 4,5 mg/ml | Corning | MT10-0130CV | |
| Dnaza I - | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
| Surowica bydlęca płodu, FBS | Corning | MT35-010-CV | |
| FITC Zestaw do wykrywania apoptozy Aneksyna V I | BD Biosciences | ||
| Forskolina | Tocris | 1099 | |
| Selektywny antybiotyk Geneticin (siarczan G418) (50 mg/ml) | Suplement ThermoFisher | 10131035 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | |
| Mieszanka odżywcza szynki F12 | ThermoFisher | 11765054 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Hygromycyna B (50 mg / ml) | ThermoFisher | 10687010 | |
| L-glutamina 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Komórka L-WRN | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel Bez fenolu i Fakt wzrostu. Zredukowany | |||
| Millex PVDF, 0,22 i mu; M | Millipore Sigma | SLGVR33RB | |
| N-acetylocysteina | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nikotynamid | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Nunc TripleFlask Kolba do hodowli komórkowych | ThermoFisher | 132867 | |
| PE/Cyjanine5 anty-ludzkie przeciwciało CD8a | BioLegend | 301010 | |
| PE-Cy 7 Mysz anty-ludzka CD279 (PD-1) | BD Nauki biologiczne | ||
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Rekombinowany ludzki EGF | Peprotech | AF-100-15-1MG | |
| Rekombinowany ludzki FGF-kwaśny | Peprotech | 100-17A | |
| (NaHCO3) (7,5%) | Jakość Biologiczna | 118-085-721 | |
| Ostrza chirurgiczne ze stali nierdzewnej nr 22 | Integra | 4-322 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 |
Bibliografia
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research. Cancers (Basel). 11 (8), 1098(2019).
- Shannon, A. E., Boos, C. E., Hummon, A. B. Co-culturing multicellular tumor models: Modeling the tumor ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
