Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Summary

Ten protokół demonstruje aktywność białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). Komórki E. coli dnaK756 służą jako model dla testu, ponieważ zawierają natywny, funkcjonalnie upośledzony Hsp70, co czyni je podatnymi na stres cieplny. Heterologiczne wprowadzenie funkcjonalnego Hsp70 ratuje niedobór wzrostu komórek.

Abstract

Białko szoku cieplnego 70 (Hsp70) jest konserwatywnym białkiem, które ułatwia fałdowanie innych białek w komórce, czyniąc je molekularnym opiekuńczym. Podczas gdy Hsp70 nie jest niezbędny do wzrostu komórek E. coli w normalnych warunkach, ten opiekun staje się niezbędny do wzrostu w podwyższonych temperaturach. Ponieważ Hsp70 jest wysoce konserwatywny, jednym ze sposobów badania funkcji opiekuńczej genów Hsp70 z różnych gatunków jest ich heterologiczna ekspresja w szczepach E. coli, które mają albo niedobór Hsp70, albo wyrażają natywną Hsp70, która jest funkcjonalnie upośledzona. Komórki dnaK756 E. coli nie są w stanie wspierać DNA bakteriofaga λ. Co więcej, ich natywny Hsp70 (DnaK) wykazuje podwyższoną aktywność ATPazy, wykazując jednocześnie zmniejszone powinowactwo do GrpE (czynnika wymiany nukleotydów Hsp70). W rezultacie komórki E. coli dnaK756 rosną odpowiednio w temperaturach od 30 °C do 37 °C, ale giną w podwyższonych temperaturach (>40 °C). Z tego powodu komórki te służą jako model do badania aktywności opiekuńczej Hsp70. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół zastosowania tych komórek do przeprowadzenia testu komplementacji, umożliwiającego badanie funkcji białka opiekuńczego Hsp70 w celulonu.

Introduction

Białka szoku cieplnego odgrywają ważną rolę jako molekularne białka opiekuńcze, ułatwiając fałdowanie białek, zapobiegając agregacji białek i odwracając błędne fałdowanie białek1^,2. Białko szoku cieplnego 70 (Hsp70) jest jednym z najbardziej znanych molekularnych białek opiekuńczych, odgrywającym kluczową rolę w homeostazie białek^3,4. DnaK jest homologiem E. coli Hsp70 class<="xref">5.

Różne testy biofizyczne, biochemiczne i oparte na komórkach zostały opracowane w celu zbadania aktywności opiekuńczej Hsp70 i wykrycia inhibitorów skierowanych do tego białka opiekuńczego^6,7^,8. Hsp70 jest wysoce konserwatywnym białkiem. Z tego powodu doniesiono, że kilka Hsp70 organizmów eukariotycznych, takich jak Plasmodium falciparum (główny czynnik wywołujący malarię), zastępuje funkcję DnaK w E. coli^6,9. W ten sposób opracowano test komplementacji oparty na E. coli, obejmujący heterologiczną ekspresję Hsp70 w E. coli, aby zbadać ich funkcję cytoprotekcyjną. Zazwyczaj test ten obejmuje wykorzystanie komórek E. coli, które mają niedobór DnaK lub wyrażają natywny DnaK, który jest funkcjonalnie upośledzony. Chociaż DnaK nie jest niezbędny do wzrostu E. coli w normalnych warunkach, staje się niezbędny, gdy komórki są hodowane w stresujących warunkach, takich jak podwyższone temperatury lub inne formy stresu^10,11.

Szczepy E. coli, które zostały opracowane do badania funkcji Hsp70 za pomocą testu komplementacji, obejmują E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) i E. coli dnaK756. Komórki E. coli dnaK103 wytwarzają obcięty DnaK, który nie działa, i jako takie, komórki rosną odpowiednio w temperaturze 30 °C, podczas gdy szczep jest wrażliwy na stres zimna i cieplny^12,13. Podobnie, szczep E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) nie rośnie powyżej 40 °C^14,15. Szczep E. coli dnaK756 wykazuje ekspresję zmutowanego natywnego DnaK (DnaK756) charakteryzującego się trzema podstawieniami glicyny do asparaginianu w pozycjach 32, 455 i 468, co prowadzi do upośledzonych wyników proteostatycznych. W związku z tym szczep ten jest odporny na bakteriofagi λ DNA¹⁴. Dodatkowo E. coli dnaK756 wykazuje podwyższoną aktywność ATPazy, a jego powinowactwo do czynnika wymiany nukleotydów, GrpE, jest zmniejszone¹⁶. Bakteria E. coli Zmutowane szczepy DnaK służą jako idealne modele do badania aktywności opiekuńczej Hsp70 poprzez podejście komplementacyjne. Ponieważ DnaK jest niezbędny tylko w warunkach stresowych, test komplementacji jest zwykle przeprowadzany w podwyższonych temperaturach (Rysunek 1). Niektóre zalety wykorzystania E. coli w tym badaniu obejmują dobrze scharakteryzowany genom, szybki wzrost oraz niskie koszty hodowli i utrzymania¹⁷.

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół polegający na wykorzystaniu komórek E. coli dnaK756 do badania funkcji Hsp70. Hsp70, które zastosowaliśmy w teście, to DnaK typu dzikiego i jego chimeryczna pochodna, KPf (składająca się z domeny ATPazy DnaK połączonej z C-końcową domeną wiążącą substrat Plasmodium falciparum Hsp70-1^6,18). KPf-V436F był heterologicznie wyrażany jako kontrola ujemna, ponieważ mutacja zasadniczo blokuje go przed wiązaniem substratów, znosząc w ten sposób jego aktywność opiekuńczą⁹.

Protocol

1. Transformacja

UWAGA: Używaj sterylnych naczyń szklanych do hodowli, końcówek pipet oraz świeżo przygotowanych i autoklawowanych pożyw. Przygotować kultury komórek E. coli w 2x tryptonie drożdżowym (YT) [1,6% tryptonu (w/v), 1% ekstraktu drożdżowego (w/v), 0,5% NaCl (w/v), 1,5% agaru (w/v)] agary. Ogólne odczynniki użyte w protokole oraz ich źródła znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Oznaczyć 2,0 ml probówek do mikrowirówek i podwielokrotność 50 μl kompetentnych komórek E. coli dnaK756, utrzymując komórki na lodzie.
2. Do probówek mikrowirówek o pojemności 2,0 ml z właściwymi komórkami, podwielokrotność 10-50 ng plazmidu pQE60/DnaK, pQE60/KPf i pQE60/KPf-V436F plazmidu DNA⁹ do oddzielnych probówek.
3. Probówki do mikrowirówek o pojemności 2,0 ml zawierające właściwe komórki i plazmidowe DNA należy przechowywać na lodzie przez 30 minut.
4. Szok termiczny kompetentne komórki i DNA mieszają się przez 60 s w temperaturze 42 °C i włóż probówki do mikrowirówki z powrotem na lód na 10 minut.
5. Dodać 950 μl świeżego bulionu 2x YT (wstępnie inkubowanego w temperaturze 37 °C) i inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 150 obrotów/min przez 1 godzinę. Pozostaw komórki do wzrostu znacznie dłużej, aby w razie potrzeby przyspieszyć ich regenerację.
   UWAGA: Unikaj energicznego potrząsania komórkami.
6. Odpipetować 100 μl komórek i rozprowadzić je na 2 płytkach agarowych YT zawierających 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml tetracykliny dla odpowiedniego szczepu i 100 μg/ml ampicyliny (patrz tabela materiałów) w celu wyboru plazmidu.
7. Odwirować pozostałe komórki (których objętość wynosi obecnie około 900 μl) przez 1 minutę w temperaturze 5000 x g (w temperaturze 4 °C) za pomocą mikrowirówki stołowej.
8. Zdekantować około 800 μl bulionu i użyć pozostałej pożywki do ponownego zaparcia granulowanych komórek.
9. Umieść odzyskane komórki na płytce agarowej 2x YT.
10. Inkubować obie płytki agarowe przez noc (lub około 17 godzin) w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Komórki te rosną bardzo wolno i mogą wymagać znacznie dłuższej inkubacji. Uważaj, aby dostrzec kolonie, które mogą zaczynać się od bardzo małych. Płytka zawierająca komórki zawieszone ponownie po odwirowaniu (etap 1.7) służy jako zapas w przypadku, gdy wydajność przemiany komórek jest niska, w którym to przypadku granulowane komórki mogą poprawić odzysk wszelkich przekształconych komórek. Jednakże, jeśli wydajność przemiany jest doskonała, płytka agarowa, na której posiano skoncentrowane komórki, może charakteryzować się przerośniętą kulturą podczas inkubacji, co utrudnia identyfikację pojedynczych kolonii. W takim przypadku druga płytka agarowa może być tą, na której rosną dobrze rozmieszczone kolonie.

2. Poszycie komórek

1. Weź pojedynczą kolonię z transformantów i zaszczep ją w 10 ml bulionu 2x YT uzupełnionego 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml tetracykliny do selekcji komórek E. coli dnaK756 i 100 μg/ml ampicyliny do selekcji plazmidu.
   UWAGA: Użyj kolb (≥50 ml), aby zapewnić napowietrzenie podczas mieszania kultury. Inkubować inokulum przez noc (17 godzin) w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 150 obrotów/min.
2. Następnego ranka wykonaj odczyt absorbancji przy OD₆₀₀.
3. Oczyść powierzchnię stołu warsztatowego za pomocą 75% etanolu do przetarcia powierzchni w ramach przygotowań do plamienia komórek.
4. Używając probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml, ustandaryzuj kulturę do odczytu OD₆₀₀ wynoszącego 2,0 przy użyciu bulionu 2x YT.
   UWAGA: Upewnij się, że odczyty OD są wykonywane prawidłowo, ponieważ ten krok jest ważny dla standaryzacji gęstości komórek w różnych próbkach.
5. Używając probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml, przygotuj seryjne rozcieńczenia komórek od 10⁰ do ^10-5.
6. Inkubować płytki agarowe, które mają być użyte do namierzenia komórek, w piecu ustawionym na 40 °C, aby umożliwić wyschnięcie płytek z częściowo otwartymi pokrywkami, aby zapewnić ucieczkę pary wodnej.
   UWAGA: Aby upewnić się, że komórki są widoczne w jednakowo oddalonych odległościach, narysuj linie na kartce papieru, na której wydrukowany jest szablon miejsc wykrywania.
7. Umieścić 2 μl seryjnie rozcieńczonych komórek na płytkach agarowych uzupełnionych 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml tetracykliny, 100 μg/ml ampicyliny i 0,5 mM IPTG (do indukcji ekspresji rekombinowanych białek) (patrz tabela materiałów).
8. Umieścić każdą próbkę na dwóch oddzielnych płytkach (jedna do inkubacji w temperaturze 37 °C, a druga w temperaturze 43,5 °C).
   UWAGA: Unikaj przekłuwania płytki agarowej.
9. Umieść próbki kontrolne na tej samej płytce, co próbki eksperymentalne, aby zminimalizować wpływ na środowisko.
10. Przeprowadź szybkie plamienie, aby upewnić się, że proces został zakończony, zanim komórki zaczną rosnąć, ponieważ może to spowodować wypaczone wzorce wzrostu.
    UWAGA: Ważne jest, aby unikać aerozoli podczas plamienia, ponieważ mogą one zanieczyścić płytki. Ważne jest również, aby płytki były zamknięte między plamkami, aby uniknąć zanieczyszczenia.
11. Inkubować jedną płytkę w temperaturze 37 °C (dopuszczalna temperatura wzrostu), a drugą w niedozwolonej temperaturze wzrostu 43,5 °C.
    UWAGA: Inkubuj płytki do góry nogami, aby uniknąć gromadzenia się pary na pokrywie, ponieważ skondensowana woda zmyłaby nakrapiane kolonie z ich pozycji.
12. Umieść wszystkie płytki w inkubatorach w tym samym czasie i unikaj otwierania inkubatora do następnego ranka.
    UWAGA: Odradza się kilkukrotne otwieranie drzwi inkubatora podczas inkubacji płytek. Dzieje się tak, ponieważ dostęp powietrza do inkubatora może powodować wahania temperatury, które niekorzystnie wpływają na wzrost komórek.

3. Potwierdzenie ekspresji białek rekombinowanych

1. Za pomocą sterylnej pętli pobierz część pozostałych komórek z tej samej kolonii przekształconych komórek E. coli dnaK756.
2. Zaszczep komórki w 10 ml bulionu YT uzupełnionego 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml tetracykliny i 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować przez noc (17 h) w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 150 obrotów/min.
3. Przenieś kulturę do 90 ml sterylnego bulionu 2x YT zawierającego niezbędne antybiotyki, jak wspomniano w kroku 3.2. Pozwól komórkom urosnąć do środkowej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ = 0,4-0,6).
4. Pobrać 2 ml próbki kultury przed indukcją (0 h indukcji próbki).
5. Dodać IPTG do końcowego stężenia 1 mM w celu indukcji produkcji białka i ponownie inkubować komórki w temperaturze 37 °C.
6. Pobrać drugą próbkę o objętości 2 ml 6 godzin po indukcji.
7. Zebrać komórki, odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut. Utrzymuj temperaturę wirówki na poziomie 4 °C.
8. Odrzucić supernatant.
9. Zawiesić osad w buforze PBS (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄) i przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. SDS-PAGE i analizy western blot

1. Przygotuj 2x 10% żele SDS zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁹.
2. Zachowaj jeden z żeli SDS-PAGE do późniejszego barwienia za pomocą barwnika Coomassie, aby wyświetlić pasma białkowe. Użyj drugiego żelu SDS-PAGE do przeprowadzenia analizy western blot.
3. Pobrać 80 μl zawieszonych próbek i wymieszać z 20 μl 4 ładujących Laemmli SDS.
4. Gotować zawiesinę w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Następnie załadować 10 μl każdej próbki na prefabrykowany żel SDS (patrz tabela materiałów).
5. Wykonuj elektroforezę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przy napięciu 120 V w 1x roztworze bufora do pracy SDS (25 mm Tris, 250 mm glicyna, 0,1% (w/v) SDS).
6. Barwić żel barwnikiem Coomassie (patrz Tabela Materiałów) przez 1 godzinę, a następnie odbarwiać za pomocą buforu odbarwiającego (50% (v/v) metanolu, 10% (v/v) kwasu octowego w wodzie destylowanej) przez 2 godziny.
7. Wizualizację prążków białkowych obecnych w żelu za pomocą systemu obrazowania żelu (patrz tabela materiałów). Uruchom ponownie kolejny żel SDS-PAGE z tymi samymi próbkami, postępując zgodnie z wyżej wymienionym protokołem.
8. Po zakończeniu cyklu elektroforetycznego weź żele SDS-PAGE, aby przeprowadzić analizę western blot, jak opisano wcześniej¹⁹.
9. Przemyć membranę nitrocelulozową, na którą przeniesiono białka trzykrotnie, w buforze do przemywania (TBS-Tween, pH 7,4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).
10. Użyj α-DnaK (patrz Tabela materiałów), aby wykryć odpowiednio DnaK i α-PfHsp70-1⁷, aby wykryć KPf i jego mutanta, KPf-V436F).
11. Stosować przeciwciała w rozcieńczeniu 1:2000 w 5% mleku beztłuszczowym. Inkubować w temperaturze 4 °C, wytrząsając z prędkością 60 obrotów/min przez 1 godzinę.
12. Usunąć niespecyficznie związane przeciwciało, przemłukując membranę nitrocelulozową w TBS-Tween 3 razy w ciągu 15 minut.
13. Inkubować błonę w przeciwciałie drugorzędowym (α-króliku, patrz tabela materiałów) w takich samych warunkach, jak w poprzednim kroku. Po tym następuje kolejne płukanie w tych samych warunkach, co przeciwciało pierwszorzędowe.
14. Rozwiąż prążki za pomocą odczynnika do wykrywania wzmocnionej chemiluminescencji (ECL).
15. Wizualizacja pasm za pomocą obrazowania żelowego.

Results

Rysunek 2 przedstawia obraz zeskanowanego agaru zawierającego komórki, które zostały wykryte i wyhodowane w dopuszczalnej temperaturze wzrostu odpowiednio 37 °C i 43,5 °C. Po prawej stronie Rysunek 2, wycięte składniki western blot reprezentują ekspresję DnaK, KPf i KPf-V436F w komórkach E. coli dnaK756. Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie komórki dnaK756 E. coli hodowane w dopuszczalnej temperaturze wzrostu 37 °C zdołały wzrosnąć. Jednak w niedopuszczalnych warunkach wzrostu wynoszących 43,5 °C tylko komórki heterologicznie wyrażające DnaK i KPf zdołały wzrosnąć, jak wcześniej informowano^6,9,20(Rysunek 2). Z drugiej strony, komórki wykazujące ekspresję KPf-V436F rosły tylko w temperaturze 37 °C, ale nie rosły w temperaturze 43,5 °C. Pokazuje to, że DnaK i KPf były w stanie przywrócić defekt wzrostu komórek E. coli dnaK756 w warunkach stresu cieplnego. Niezdolność komórek do heterologicznej ekspresji KPf-V436F we wspieraniu wzrostu komórek w temperaturze 43,5 °C świadczy o braku funkcji białka opiekuńczego tego białka. Pod tym względem KPf-V436F służy jako idealne białko kontroli negatywnej.

Rysunek 1: Zasada testu komplementacji z wykorzystaniem komórek E. coli dnaK756 do badania funkcji opiekuńczej białek o ekspresji heterologicznej. E. coli dnaK756 ulega ekspresji natywnego białka DnaK756, które nie jest w stanie chronić komórek przed stresem cieplnym. Wprowadzenie funkcjonalnego heterologicznego Hsp70 ratuje komórki przed śmiercią pod wpływem stresu cieplnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Test płytki komplementacyjnej demonstrujący możliwości DnaK i KPf do ochrony komórek E. coli dnaK756 przed stresem cieplnym. Przekształcone komórki hodowano w temperaturze 37 °C (dopuszczalna temperatura wzrostu) i 43,5 °C (niedopuszczalna temperatura wzrostu). Ogniwa zostały znormalizowane i posiane jako seryjne rozcieńczenia. "N" symbolizuje "schludny", reprezentujący pierwszą plamkę złożoną z nierozcieńczonych komórek. Po skrajnej prawej stronie znajdują się wycięcia western blot reprezentujące ekspresję trzech białek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Protokół demonstruje użyteczność komórek E. coli dnaK756w badaniu funkcji opiekuńczej heterologicznie wyrażonego Hsp70. Test ten można zastosować do badań przesiewowych inhibitorów ukierunkowanych na funkcję Hsp70 w celulo. Jednak jednym z ograniczeń tej metody jest to, że Hsp70, które nie są w stanie zastąpić DnaK w E. coli , nie są kompatybilne z tym testem. Brak modyfikacji potranslacyjnej²¹ niektórych nienatywnych Hsp70 może tłumaczyć ich brak funkcji w systemie E. coli . Test komplementacji oparty na drożdżach²² może wyeliminować niektóre niedociągnięcia testu opartego na E. coli.

Do zapewnienia powtarzalnych wyników ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia kilku kluczowych kroków. Obejmują one zapewnienie, że podczas posiewu używane są tylko komórki przekształcone przez odpowiedni konstrukt plazmidowy. Ponadto ważne jest, aby unikać zanieczyszczenia kultury na wszystkich etapach. Ponadto, ponieważ zestresowane komórki DnaK E. coli są podatne na nadmierną filamentację¹⁰, ważne jest, aby unikać energicznego wstrząsania podczas hodowli, ponieważ ten fizyczny szczep sprzyja intensywnemu filamentowaniu. Nadmiernie włóknione komórki dają wyższe fałszywe odczyty pozornego wzrostu przy OD₆₀₀, co prowadzi do przeszacowania wzrostu hodowli i niekorzystnie wpływa na standaryzację komórek przed posiewem. Chociaż Hsp70 nie jest niezbędny do wzrostu E. coli w normalnych warunkach, komórki pozbawione tego białka są podatne na stres¹⁰. Z tego powodu komórki E. coli dnaK756 rosną znacznie wolniej po transformacji lub podczas odzyskiwania z zapasów glicerolu. Dodatkowo są niezwykle wrażliwe na wahania temperatury. Dlatego ważne jest, aby unikać otwierania drzwi inkubatora po umieszczeniu w środku platerowanych płytek agarowych, dopóki nie nadejdzie czas na obejrzenie płytek.

Dane Western blot są ważne dla potwierdzenia ekspresji odpowiednich rekombinowanych białek Hsp70 w komórkach E. coli dnaK756. Brak ekspresji odpowiedniego białka prowadzi do fałszywie ujemnego wyniku dla komórek rosnących w nieakceptowalnej temperaturze wzrostu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Składnik do ładowania próbki Barwnik
Kwas octowy	Labchem	101005125	Składnik destainera
Akrylamid	Sigma-Aldrich	8008300100	Składnik SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Składnik pożywki i cieczy do oznaczania wzrostu
Agaroza	Clever Scientific	14131031	Certyfikowana biologia molekularna agaroza
Nadsiarczan amonu	Sigma-Aldrich	101875295	Składnik żelu SDS-PAGE
Ampicylina	VWR International	0339—EU— 25G	Selektywny antybiotyk
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Składnik SDS
Bromofenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Składnik do ładowania próbki barwnika
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	Do właściwego przygotowania komórek
Błękit brylantowy Coomassie	Barwnik VWR International	443293X	SDS-PAGE
Dwuzasadowy fosforan sodu	Sigma-Aldrich	RB10368	Składnik buforu PBS
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Odczynnik do wykrywania Western blot
Bromek etydyny	Thermofischer Scientific	17898	Barwnik interkalacyjny DNA
Glicerol	Merck	SAAR2676520L	Składnik do ładowania próbki
barwnik Glicyna	VWR International	10119CU	Składnik karty charakterystyki
IPTG	Glentham nauki przyrodnicze	162IL	induktor
Kanamycyna	Melford	K0126	Selektywny antybiotyk
Chlorek magnezu	Merck	SAAR4123000EM	Składnik pożywki i płynnego testu wzrostu
Metanol	Labchem	113140129	Składnik odbarwiacza
Jednozasadowy fosforan potasu	Merck	1,04,87,30,250	Składnik buforu PBS
Pepton	Merck	HG000BX4.250	Składnik pożywki i płynnego testu wzrostu
Chlorek potasu	Merck	SAAR5042020EM	Składnik buforu PBS
Membrana PVDF	Thermofischer scientific	PB7320	Membrana Western blot
Chlorek sodu	Merck	SAAR5822320EM	Składnik pożywki i cieczy do oznaczania wzrostu
Dodecylosiarczan sodu	VWR International	108073	Do rozdzielania białek eksprymowanych
Spectramax iD3	Separacje	373705019	Automatyczny czytnik płytek
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Składnik żelu SDS
Tetracyklina	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Selektywny antybiotyk
Tris	VWR International	19A094101	Składnik żelu SDS
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Składnik zachodniego buforu do płukania
Zachodnia komora transferowa	Thermofisher Scientific	PB0112	Przenoszenie białka do membrany nitrocelulozowej
Ekstrakt drożdżowy	Merck	HG000BX6.500	Składnik pożywki i płynnego testu wzrostu
&przeciwciało alfa;-DnaK	Inqaba	BK CAC09317	Przeciwciało pierwszorzędowe
i przeciwciało alfa;-królika	Thermofischer scientific	31460	Przeciwciało drugorzędowe