Opisany tutaj protokół heterotopowego pomocniczego przeszczepu wątroby u szczurów stanowi praktyczne narzędzie badawcze do badania mechanizmów odrzucania alloprzeszczepu wątrobowego. Model ten pomaga złagodzić przeszkody chirurgiczne i stres zwierząt związany z ortotopowym przeszczepem wątroby u szczurów.
Artykuł metodologiczny
Heterotopowy pomocniczy model przeszczepu szczura całej wątroby z wykorzystaniem hepaticoureterostomii do badań odrzucenia przeszczepu allogenicznego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele przeszczepów małych zwierząt są niezbędne w badaniach tolerancji narządów badających wykonalne interwencje terapeutyczne w badaniach przedklinicznych. Protokoły przeszczepu wątroby szczura (LTx) zazwyczaj wykorzystują model ortotopowy, w którym natywna wątroba biorcy jest usuwana i zastępowana wątrobą dawcy. Ten wymagający technicznie zabieg chirurgiczny wymaga zaawansowanych umiejętności mikrochirurgicznych i jest dodatkowo skomplikowany przez długi czas niedokrwienia wątroby i dolnej części ciała. Skłoniło to do opracowania mniej skomplikowanej metody heterotopowej, którą można wykonać szybciej, bez czasu znieczulenia wątroby lub niedokrwienia dolnej części ciała, zmniejszając stres pooperacyjny u zwierzęcia biorcy.
Ten heterotopowy protokół LTx obejmuje dwa główne etapy: wycięcie wątroby od szczura dawcy i przeszczepienie całej wątroby szczurowi biorcy. Podczas wycięcia wątroby dawcy chirurg podwiązuje żyłę główną nadwątrobową (SHVC) i tętnicę wątrobową (HA). Po stronie biorcy chirurg usuwa lewą nerkę i ustawia wątrobę dawcy z żyłą wrotną (PV), żyłą podwątrobową (IHVC) i przewodem żółciowym skierowanym w stronę naczyń nerkowych. Ponadto chirurg zespolenia żyły nerkowej biorcy od końca do końca z IHVC wątroby i tętnicze PV z tętnicą nerkową za pomocą stentu. Hepaticoureterostomia jest wykorzystywana do drenażu dróg żółciowych poprzez zespolenie przewodu żółciowego z moczowodem biorcy, co umożliwia odprowadzanie żółci przez pęcherz moczowy.
Średni czas trwania przeszczepu wynosił 130 minut, czas trwania zimnego niedokrwienia wynosił około 35 minut, a czas trwania ciepłego niedokrwienia wynosił mniej niż 25 minut. Histologia hematoksyliny i eozyny wątroby pomocniczej po przeszczepach syngenicznych wykazała prawidłową strukturę hepatocytów bez istotnych zmian miąższowych 30 dni po przeszczepie. W przeciwieństwie do tego, 8-dniowe próbki przeszczepów allogenicznych po przeszczepie wykazały rozległy naciek limfocytarny z wynikiem wskaźnika aktywności odrzucenia schematu Banffa wynoszącym 9. W związku z tym ta metoda LTx ułatwia alternatywny dla orttopowego LTx model odrzucenia o niskiej zachorowalności.
Wprowadzenie
LTx dla małych zwierząt jest nieocenionym modelem do badania mechanizmów odrzucania wątroby. Heterotopowe pomocnicze przeszczepienie wątroby z arterializacją żyły wrotnej (HALT-PVA) u szczurów zostało wprowadzone w 1968 roku przez Lee iEdgingtona 1, kiedy zgłosili użycie żyły nerkowej i tętnicy biorcy do rewaskularyzacji przeszczepionej wątroby pomocniczej. Następnie Hess i wsp.2 udoskonalili protokół, łagodząc funkcjonalną konkurencję między wątrobą natywną i pomocniczą poprzez zmniejszenie rozmiaru wątroby natywnej i wątroby dawcy wraz z rekonstrukcją połączenia dróg żółciowych dawcy, co skutkowało długoterminowym przeżyciem przeszczepu. Dalsze udoskonalenia dokonano wraz z wprowadzeniem zespoleniamankietowego 3,4, a Schleimer i wsp.5 określili optymalną średnicę stentu do regulacji przepływu krwi w celu uzyskania fizjologicznego przepływu wrotnego i uniknięcia hiper- lub hipoperfuzji przeszczepu. Inni badacze opracowali znaczące zmiany w metodzie, wykorzystując tętnicę śledziony6 lub tętnicę biodrową7 wspólną do dostarczania krwi do przeszczepu, podczas gdy niektórzy opracowali modele, które wykorzystywały tylko krew żylną8 lub tylko krew tętniczą przez tętnicę wątrobową9 do dostarczania pomocniczego przeszczepu wątroby.
W niniejszym badaniu postawiono hipotezę, że funkcjonalna konkurencja ze strony natywnej wątroby nie będzie kolidować z odrzuceniem przeszczepu allogenicznego, dlatego opracowaliśmy protokół oparty na modelu Schleimera10 z regulacją przepływu, który nie obejmował żadnego zmniejszenia rozmiaru wątroby natywnej lub pomocniczej. Lewa strona biorcy została wybrana do zlokalizowania przeszczepu, ponieważ zapewniała optymalną orientację między naczyniami nerkowymi i wątrobowymi dawcy. Początkowo próbowaliśmy rekonstrukcji dróg żółciowych za pomocą hepaticoduodenostomii, ale te badania po prostu potwierdziły twierdzenie Schleimera, że "drenaż dróg żółciowych jest piętą achillesową przeszczepu wątroby"10. Skłoniło to do opracowania nowej techniki, w której przewód żółciowy jest zespalany od końca do końca za pomocą stentu z moczowodem biorcy, co umożliwia odprowadzanie żółci przez pęcherz moczowy. Godną uwagi korzyścią płynącą z zastosowania hepaticoureterostomii jest to, że funkcjonalność wątroby przeszczepu może być codziennie monitorowana poprzez obserwację moczu; Przeszczep wątroby wytwarzający żółć zabarwia mocz na jasnożółty kolor. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd metody HALT-PVA.
Ważną zaletą heterotopowego w porównaniu z ortotopowym LTx szczura jest brak czasu znieczulenia lub całkowitego niedokrwienia dolnej części ciała, co pozwala na szybszy i łatwiejszy powrót do zdrowia u biorców heterotopowych. Ponadto badania immunologiczne LTx z wykorzystaniem metod ortotopowych często opierają się na ciężkim odrzuceniu lub śmierci biorcy jako eksperymentalnym punkcie końcowym, co nie ma miejsca w przypadku przeszczepów heterotopowych, w których zwierzę pozostaje zdrowe, nawet jeśli przeszczep allometryczny przestaje funkcjonować z powodu odrzucenia. Obie te cechy metody heterotopowej wspierają zasady międzynarodowej inicjatywy 3R (Replacement, Reduction, and Refinement)11, która promuje ramy minimalizacji bólu, cierpienia i dystresu doświadczanego przez zwierzęta badawcze i poprawy ich dobrostanu.
Opisany tutaj model HALT-PVA jest praktyczną i wiarygodną metodą badania mechanizmów odrzucania przeszczepu allogenicznego w wątrobie w badaniach przedklinicznych. Ta przydatna technika eksperymentalna pomaga przezwyciężyć znaczne wymagania chirurgiczne i stres zwierząt związany z orttopowym LTx u szczurów. W przyszłości zamierzamy wykorzystać tę metodę do zbadania mechanizmów ostrego odrzucenia immunologicznego, jednocześnie badając nowe cele i strategie terapeutyczne w celu zahamowania odrzucenia przeszczepu allogenicznego wątroby.
Protokół
Zwierzęta były hodowane i trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów w placówkach opieki nad zwierzętami w Instytucie Badań Medycznych Uniwersytetu Wisconsin (UW)-Madison zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Protokół badania (nr M006022) został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Szkole Medycyny i Zdrowia Publicznego UW, a wszystkie zwierzęta były traktowane etycznie.
1. Zwierzęta
- Jako szczury dawcy należy użyć dorosłych samic szczurów rasy Lewis o wadze 205-235 g i samców szczurów Lewisa o wadze 250-280 g. Jako biorców należy użyć dorosłych samców szczurów rasy Lewis i Brown Norway o wadze 365-420 g.
- Wykonaj przeszczepy syngeniczne, przeszczepiając dawców Lewisa biorcom Lewisa, podczas gdy przeszczepy allogeniczne wykorzystywały dawców Lewisa przeszczepionych biorcom Brown Norway.
- Wszystkie operacje należy wykonywać w dwie osoby przy użyciu mikroskopu dwugłowicowego.
2. Procedura pozyskiwania pomocniczego dawcy wątroby
- Znieczulić szczura dawcy 5% inhalacją izofluranu w komorze indukcyjnej. Zapisz wagę szczura i ogol brzuch maszynką do strzyżenia elektrycznego.
- Ułóż szczura w pozycji leżącej na rozgrzanej podkładce chirurgicznej z nosem w stożku anestezjologicznym i unieruchamij kończyny taśmą. Zdezynfekować brzuch szczura przy użyciu techniki aeptycznej zatwierdzonej przez lokalną komisję etyki zwierząt i obniżyć poziom izofluranu do 2%.
- Wykonaj podłużne nacięcie skóry i mięśni linii środkowej od łona do mieczykowatego za pomocą nożyczek. W pobliżu środkowego punktu podłużnego nacięcia rozciągnij go na boki w lewo i w prawo, a następnie zainstaluj retraktory po obu stronach ściany brzucha i wyrostka mieczykowatego.
- Za pomocą wilgotnych wacików bawełnianych cofnij jelita na lewą stronę brzucha, używając nożyczek sprężynowych, aby przeciąć więzadła żołądkowe przyczepione do wątroby, a następnie unieruchamić jelita pod zwilżoną gazą. Przykryj wątrobę małym kawałkiem sterylnej gazy zwilżonej ciepłą solą fizjologiczną.
- Użyj wilgotnych wacików, aby cofnąć wątrobę i wypreparować więzadła sierpowate, trójkątne, wątrobowo-żołądkowe i wątrobowo-żuplneczne. Następnie kauteryzuj kleszczami dwubiegunowymi i podziel naczynia przyprzełykowe między lewym bocznym i przednim płatem ogoniastym.
- Za pomocą kleszczy kątowych lub uchwytów do igieł rozetnij za SHVC poniżej przepony, a następnie przełóż jedwabny szew 5-0 pod SHVC i luźno zawiąż podwójny węzeł do późniejszego użycia.
- Cofnij dolny prawy płat boczny do góry, przetnij więzadło i unieruchamij pod zwilżoną gazą. Odizoluj IHVC od tkanki zaotrzewnowej do prawej żyły nerkowej i podwiąż prawą żyłę nadnerczy za pomocą jedwabnego szwu 6-0 jak najbliżej IHVC. Podziel tę żyłę później, gdy przeszczep zostanie usunięty.
- Za pomocą igły do hydrodysekcji 27 G (ryc. 2A) oddzielić PV od otaczającej tkanki łącznej i oddzielić ją od żył odźwiernikowych i śledzionowych, podwiązując je i dzieląc za pomocą jedwabnego szwu 7-0.
- Wyizolować, podwiązać za pomocą jedwabnego szwu 6-0 i podzielić wspólną tętnicę wątrobową w pobliżu miejsca, w którym przechodzi ona pod PV.
- Podwiązać przewód żółciowy jedwabnym szwem 5-0 na rozgałęzieniu tętnicy żołądkowo-dwunastniczej, zachowując w jak największym stopniu tkankę tłuszczową wokół przewodu żółciowego; W szczególności należy unikać oddzielania przewodu żółciowego od właściwej tętnicy wątrobowej, zachowując jednocześnie tak krótką, jak to tylko możliwe.
- Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj małe nacięcie w ścianie przewodu żółciowego proksymalnie do podwiązania. Włóż stent z rurki poliimidowej o średnicy 0,0215 cala i długości 5 mm do światła przewodu żółciowego i zabezpiecz go jedwabnym szwem 6-0, pozostawiając jeden koniec szwu długi do późniejszego użycia. Podziel przewód żółciowy, przecinając między podwiązaniami 5-0 i 6-0.
- Zaznacz górną stronę IHVC i PV za pomocą chirurgicznego pisaka do barwnika, aby pomóc wyrównać naczynia podczas zespolenia, a następnie zacisnąć żyłę wrotną za pomocą zacisku mikronaczynia jak najbardziej dystalnie do wątroby.
- Włożyć strzykawkę o pojemności 20 ml z igłą 26 G do PV proksymalnie do mikrozacisku i przetworzyć wątrobę 10-15 ml lodowatej heparynizowanej soli fizjologicznej; jednocześnie podzielić IHVC za pomocą nożyczek sprężynowych jak najbliżej prawej żyły nerkowej.
- Wytnij wątrobę za pomocą nożyczek sprężynowych, wycinając PV proksymalnie do mikrozacisku, zaciskając szew 5-0 wcześniej umieszczony wokół SHVC i preparując przeponę w celu przecięcia żyły głównej w klatce piersiowej.
- Kontynuuj, przecinając pozostałe więzadła z tyłu wątroby i dzieląc wcześniej podwiązaną żyłę nadnerczy. Wyciętą wątrobę umieścić w zimnej soli fizjologicznej na lodzie.
3. Procedura pomocniczego przeszczepu wątroby
- Znieczulić szczura biorcę 5% inhalacją izofluranu w komorze indukcyjnej. Zapisz wagę szczura i ogol brzuch maszynką do strzyżenia elektrycznego.
- Ułóż szczura w pozycji leżącej na rozgrzanej podkładce chirurgicznej z nosem w stożku anestezjologicznym i unieruchamij kończyny taśmą. Nałóż smar do oczu, zdezynfekuj brzuch przy użyciu techniki aeptycznej zatwierdzonej przez lokalną komisję etyki zwierząt i obniż poziom izofluranu do 2%.
- Za pomocą nożyczek wykonaj podłużne nacięcie skóry i mięśni linii środkowej od łona do mieczykowatego, a następnie zainstaluj retraktory po obu stronach ściany brzucha.
- Za pomocą wilgotnych wacików wycofaj jelita na prawą stronę brzucha i przykryj je zwilżoną gazą. Nałóż kolejną wilgotną gazę, aby przykryć żołądek, śledzionę i wątrobę, odsłaniając lewą nerkę i naczynia nerkowe.
- Za pomocą igły do hydrodysekcji 27 G i kleszczyków z końcówką oddziel lewą żyłę nerkową od tętnicy nerkowej, ostrożnie usuwając tłuszcz i tkankę łączną z obu naczyń.
- Wyizoluj żyły gonadalne i nadnercza i użyj jedwabiu 6-0, aby tymczasowo podwiązać je proksymalnie do żyły nerkowej. Kauterizować, za pomocą kleszczy bipolarnych, wszystkie mikro boczne gałęzie izolujące żyłę nerkową i tętnicę między aortą/VC a nerką.
- Zmobilizuj i podwiąż moczowód za pomocą jedwabnego szwu 6-0 na dolnym biegunie. Oznacz żyłę nerkową i tętnicę za pomocą chirurgicznego pisaka do barwnika, aby pomóc zorientować naczynia podczas zespolenia i upewnić się, że nie ma skrętów.
- Zacisnąć tętnicę nerkową i żyłę nerkową za pomocą zacisku mikronaczyniowego jak najbliżej aorty i VC. Przeciąć tętnicę nerkową nożyczkami sprężynowymi tuż za rozwidleniem naczynia i podzielić żyłę nerkową mniej więcej w połowie drogi między VC a nerką. Zmobilizuj lewą nerkę z otaczającej tkanki łącznej i usuń ją.
- Przepłukać oba naczynia heparynizowaną solą fizjologiczną za pomocą igły do hydrodyspreparacji o sile 27 G, aby usunąć całą pozostałą krew.
- Za pomocą nożyczek sprężynowych wytnij mały otwór w kształcie rybiego otworu w widelcu rozwidlenia tętnicy nerkowej, aby utworzyć otwór w kształcie lejka i wprowadzić stent o średnicy 8 mm wycięty z cewnika 26 G (ryc. 2B). Zabezpiecz stent jedwabnym szwem 6-0, pozostawiając jeden koniec szwu długi do późniejszego użycia.
- Wprowadzić wątrobę dawcy i ustawić ją tak, aby PV, IHVC i przewód żółciowy były skierowane w stronę lewej żyły nerkowej i tętnicy biorcy. Za pomocą nylonowego szwu 9-0 zainstaluj dwa szwy rozciągowe po przeciwnych stronach połączenia IHVC-żyła nerkowa.
- Porównaj szerokość naczyń i wykonaj małe nacięcie ust ryby za pomocą nożyczek sprężynowych w czole żyły nerkowej, aż będzie miała podobną szerokość do IHVC dawcy (ryc. 2C).
- Za pomocą nylonowego szwu 9-0 zespolić wątrobę IHVC od końca do końca do żyły nerkowej za pomocą 9 lub 10 szwów biegnących zarówno przez przednią, jak i tylną ścianę naczynia. Alternatywnie, należy użyć metody mankietowej, aby uzupełnić to zespolenie 3,4.
- Upewnij się, że tętnica nerkowa znajduje się poniżej IHVC (ryc. 2D) i wprowadź stent uprzednio umieszczony w tętnicy nerkowej do żyły wrotnej wątroby i zabezpiecz jedwabnym szwem 6-0, pozostawiając jeden koniec szwu długi, aby przymocować się do przeciwległej nici na tętnicy. Ściągnij końce razem, aby każdy z nich nie zsunął się ze stentu.
- Najpierw usuń mikrozacisk z żyły nerkowej, a następnie usuń mikrozacisk z tętnicy nerkowej.
- Podczas reperfuzji wątroby należy użyć gazy i wacików, aby lekko uciskać obszar zespolenia, aż do uzyskania opatentowanego zespolenia (ryc. 2D). Usuń tymczasowe podwiązania umieszczone wcześniej na żyłach nadnerczy i gonad.
- Ostrożnie zmobilizuj około 10 mm w dół końca lewego moczowodu od otaczającej tkanki łącznej, pozostawiając przyczepioną znaczną ilość tkanki tłuszczowej. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj małe nacięcie w ścianie moczowodu proksymalnie do wcześniej umieszczonego podwiązania 5-0.
- Wprowadzić stent poliimidowy wcześniej przymocowany do przewodu żółciowego do małego nacięcia wykonanego w ścianie moczowodu. Zabezpiecz jedwabnym szwem 6-0 i zwiąż jeden koniec długą nicią po stronie przewodu żółciowego stentu, mocno zbliżając oba końce do siebie.
- Przywróć jelita z powrotem do ich naturalnej pozycji (ryc. 2E), przepłukaj 2-3 ml soli fizjologicznej i zamknij brzuch w dwóch warstwach za pomocą jedwabnych szwów 3-0.
- Należy wstrzyknąć podskórnie 0,1 mg/kg buprenorfiny, umieścić biorcę w czystej, ogrzewanej klatce i monitorować powrót do zdrowia przez 1-2 godziny przed powrotem zwierzęcia do pomieszczenia dla zwierząt.
4. Obserwacja pooperacyjna
- Począwszy od 2 dnia po operacji, biorcom przeszczepu allogenicznego należy wstrzykiwać heparynę (1 j.m./g) podskórnie codziennie.
- Począwszy od 2. dnia po operacji, biorcom przeszczepu syngenicznego należy wstrzykiwać heparynę (1 j.m./2 g) podskórnie co drugi dzień.
Wyniki
Obecnie do opracowania protokołu HALT-PVA wykorzystano 29 par szczurów: 17 w przypadku przeszczepów syngeneicznych oraz 12 w przypadku przeszczepów allogenicznych. Wątroby przeszczepione syngeneicznie przeżyły do wyznaczonego 8- lub 30-dniowego punktu końcowego eksperymentu ze skutecznością wynoszącą 70%, natomiast wątroby przeszczepione allogenicznie przeżyły do wyznaczonych 3- lub 8-dniowych punktów końcowych ze skutecznością na poziomie 50%. Niepowodzenia obejmowały szczury, które padły z powodu powikłań chirurgicznych, oraz wątroby pomocnicze, które nie funkcjonowały mimo przeżycia biorcy.
Średni czas trwania operacji wynosił 130 min, przy czasie zimnego niedokrwienia około 35 min i czasie ciepłego niedokrwienia poniżej 25 min. W przypadku braku powikłań śródoperacyjnych, biorcy budzili się i stawali się aktywni w ciągu 10-20 min, zaczynali pić i poruszać się w ciągu 1 h, a po 24 h zachowywali się jak zdrowe szczury.
Syngeniczne przeszczepy wątroby wykazywały doskonały kolor i drożność przewodów żółciowych 30 dni po transplantacji (Rycina 3), natomiast histologia barwiona hematoksyliną i eozyną (H&E) wykazała prawidłową strukturę hepatocytów bez istotnych zmian miąższowych zarówno w 8. jak i 30. dniu (Rycina 4A,B). Już po 3 dniach histologia przeszczepów allogenicznych wykazała znaczny stan zapalny w obrębie wrot u wątroby (Rycina 4C), natomiast w 8. dniu przeszczepy allogeniczne wykazywały ostre odrzucenie komórkowe z rozległą infiltracją limfocytarną (Rycina 4D).
Reprezentatywne próbki allogenicznych i syngenicznych przeszczepów wątroby (LTx) zostały ocenione przez certyfikowanego patologa wątroby, a stopień odrzucenia określono za pomocą wskaźnika aktywności odrzucania (RAI) zgodnie ze schematem Banff12. Ocena patomorfologiczna nie wykazała odrzucenia, z wynikiem Banff RAI równym 0, zarówno w przypadku 8-dniowych, jak i 30-dniowych przeszczepów syngenicznych, podczas gdy w 8-dniowych alloprzeszczepach stwierdzono silne odrzucenie z wynikiem Banff RAI wynoszącym 9 (Tabela 1).
Rysunek 1: Schemat procedury HALT-PVA u szczura. Żyła wrotna (PV) zostaje utętnionowana przy użyciu lewej tętnicy nerkowej z zastosowaniem stentu, dolna część żyły głównej (IHVC) zostaje anastomozyowana koniec do końca z lewą żyłą nerkową, a przewód żółciowy zostaje połączony z moczowodem za pomocą stentu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Procedura chirurgiczna. (A) Hydrodissekcja żyły wrotnej (PV). Oddzielenie PV od otaczającej tkanki łącznej za pomocą igły do hydrodissekcji 27 G. (B) Wprowadzanie stentu tętniczego. Stent tętniczy jest wprowadzany do niewielkiego otworu w kształcie lejka, wyciętego w rozwidleniu tętnicy nerkowej. (C) Poszerzanie żyły nerkowej. Aby dopasować większą szerokość donora IHVC do anastomozy, po założeniu dwóch szwów kontrolnych, w ścianie żyły nerkowej biorcy wykonuje się niewielkie nacięcie w kształcie otworu rybiej buzi. (D) Przeszczepiona wątroba bezpośrednio po anastomozie. Prawidłowe umiejscowienie połączenia tętnicy nerkowej i PV pod żyłą nerkową i IHVC jest kluczowe dla zapobiegania zakrzepicy przeszczepu. (E) Szczur z HALT-PVA in situ. Pomocnicza wątroba zostaje umieszczona przy lewej ścianie jamy brzusznej przed przywróceniem jelit. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Syngeneiczny HALT-PVA 30 dni po przeszczepie. (A) Po 30 dniach wątroba pomocnicza ma kolor i teksturę zbliżoną do wątroby natywnej, podczas gdy (B) stent przewodu żółciowego i żyły wrotnej pozostaje drożny i niezakneblowany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Histologia pomocniczych przeszczepów wątroby. Barwienie H&E (A) 8. i (B) 30. dnia po transplantacji przeszczepów syngenicznych wykazujących prawidłową strukturę hepatocytów oraz (C) 3. i (D) 8. dnia przeszczepów allogenicznych wykazujących zapalenie w obrębie obszarów wrotnych i naciek limfocytarny. Pasek skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
| Przeszczepy allogeniczne | Zapalenie obszarów wrotnych | Uszkodzenie dróg żółciowych | Zapalenie śródbłonka żylnego | Banff RAI |
| 3 dni (LT-34) | 2 | 2 | 3 | 7 |
| 3 dni (LT-38) | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 8 dni (LT-20) | 3 | 3 | 3 | 9 |
| 8 dni (LT-40) | 3 | 3 | 3 | 9 |
| Przeszczepy syngeniczne | ||||
| 8 dni (LT-13) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 8 dni (LT-19) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 30 dni (LT-28) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 30 dni (LT-32) | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabela 1: Schemat Banff. Indeks aktywności odrzucania (RAI) w przypadku allogenicznych i syngenicznych przeszczepów wątroby (LTx) szczurów.
Dyskusja
Przeszczep wątroby jest jedyną opcją leczenia dla pacjentów ze schyłkową niewydolnością wątroby, z prawie 9 000 LTxs wykonywanych rocznie w USA13. Niestety, odrzucenie immunologiczne obserwuje się nawet u 25% biorców LTx, a odrzucenie to jest szkodliwe dla przeszczepionego narządu i pacjenta14,15. Aby poprawić wyniki po LTx, konieczne jest opracowanie innowacyjnych modeli do badania odrzucenia narządu i wdrożenia strategii zmniejszających odrzucenie.
W porównaniu z ortotopowym przeszczepem wątroby szczura, obecny model heterotopowy jest niezwykle łatwy do ustalenia. Stopień trudności technicznej najlepiej obliczyć, biorąc pod uwagę pojedynczy najtrudniejszy etap procedury, którym są kompleksowe zespolenia IHVC z żyłą nerkową. Naszą osobistą preferencją dla tego połączenia jest wykorzystanie tradycyjnego szycia, podczas gdy inni uważają system mankietów za wygodniejszy 3,4; Tak czy inaczej, każdy, kto czuje się komfortowo z zespoleniem od końca do końca żyły 3 mm jakąkolwiek metodą, posiada wszystkie umiejętności techniczne potrzebne do przeprowadzenia tej procedury. Mając dostęp do mikroskopu dwugłowicowego, wolimy wykonywać te operacje w dwie osoby; Nie jest to jednak wymóg powodzenia w przypadku tego protokołu, ponieważ został on również wykonany samodzielnie.
Podstawowym powikłaniem pooperacyjnym tego modelu jest zakrzepica wątroby po przeszczepie, która jest wywoływana przez trzy rzeczy. Po pierwsze, sam stent tętniczy może wywołać zakrzepicę, jeśli końce stentu mają jakiekolwiek zadziory lub nierówności, które powodują wirowe turbulencje w przepływie krwi. Stent należy przeciąć ostrą brzytwą, a nie nożyczkami, a następnie obejrzeć pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie ma żadnych niedoskonałości. Po drugie, jeśli zespolenie tętnicy nerkowej/stentu PV zostanie umieszczone na szczycie zespolenia żyły nerkowej/IHVC, ograniczy to przepływ krwi i wywoła zakrzepicę. Ostateczne umieszczenie stentu tętniczego powinno znajdować się poniżej IHVC, patrz rysunek 2D. Po trzecie, leczenie pooperacyjne heparyną przeciwzakrzepową jest niezbędne w zapobieganiu zakrzepicy przeszczepów allogenicznych, podczas gdy niższa dawka heparyny jest również pomocna w eliminowaniu ryzyka zakrzepicy w przeszczepach syngenicznych.
Niższy wskaźnik przeżycia w przypadku przeszczepów allogenicznych w porównaniu z opisanymi tutaj przeszczepami syngenicznymi odzwierciedla prozakrzepowy charakter odrzucającej wątroby pomocniczej, która wywołuje zakrzepicę stentu tętniczego. Konieczne było podjęcie kilku prób znalezienia schematu dawkowania heparyny, który mógłby zapobiec zakrzepicy stentu w przeszczepach allogenicznych. Początkowo, z pierwszych 6 biorców przeszczepu allogenicznego, którzy przeżyli operację, 50% pomocniczych wątrób zawiodło z powodu zakrzepicy, ale po zwiększeniu dawki heparyny, kolejne, ostatnie trzy allogeniczne przeszczepy przeżyły bez zakrzepicy. Idąc dalej, po ustaleniu skutecznej dawki heparyny, spodziewamy się, że wskaźnik powodzenia przeszczepów allogenicznych znacznie wzrośnie. Podobnie, większość niepowodzeń syngenicznych wystąpiła na wczesnym etapie rozwoju i spodziewamy się, że wskaźnik powodzenia przeszczepów syngenicznych również się poprawi.
Użyliśmy modelu ostrego odrzucenia szczepu Lewisa do Brown Norway LTx, ponieważ kombinacja szczepu Brown Norway do Lewis nie odrzuca16. Warto zauważyć, że gdy metody przeszczepu ortotopowego są stosowane z tym modelem odrzucenia i dochodzi do odrzucenia wątroby, zwierzęta biorcy cierpią na ciężką chorobowość, ponieważ stają się przygnębione, nieaktywne i przestają jeść przed śmiercią w ciągu 14 dni16. Jednak w przypadku tego heterotopowego modelu LTx śmierć nie jest wykorzystywana jako punkt końcowy, a zachorowalność nie występuje; Zwierzę pozostaje zdrowe i aktywne przez cały czas trwania eksperymentu, nawet gdy wątroba pomocnicza jest całkowicie odrzucona. Niewątpliwie ten heterotopowy model LTx w znacznym stopniu przyczynia się do minimalizacji bólu, cierpienia i dystresu doświadczanego przez zwierzęta biorcze.
Ostatnie postępy w normotermicznej perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP) są ekscytującym postępem w sposobie przechowywania wątroby przed klinicznym przeszczepem 17,18,19. Podczas NEVLP wątroba dawcy wznawia aktywność fizjologiczną, co pozwala na interwencje terapeutyczne przed przeszczepieniem20,21. NEVLP jest również coraz częściej stosowany do oceny żywotności narządów brzeżnych (wątroby od dawców starszych lub otyłych lub wątroby pobrane od dawców po śmierci sercowej)22,23. Chociaż ekscytujące, tylko garstka laboratoriów była w stanie przeszczepić wątroby szczurów po NEVLP24,25. Jest to prawdopodobnie spowodowane stresem chirurgicznym zwierzęcia i wysokimi wymaganiami technicznymi związanymi z przygotowaniem wątroby zarówno do NEVLP, jak i do przeszczepu. W przeciwieństwie do tego, heterotopowa technika operacyjna LTx opisana w tym manuskrypcie jest mniej wymagająca technicznie i powoduje mniejszy stres u zwierzęcia. W związku z tym może to być realna opcja dla małych modeli zwierzęcych NEVLP i późniejszego przeszczepu.
Podsumowując, przedstawiamy alternatywny model przeszczepu wątroby o niskiej zachorowalności, który może być korzystny dla przyszłych badań nad odrzuceniem przeszczepu.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania te były wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia (NIH) K08AI155816, przyznany DA.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-0 Szew jedwabny | Etyka | Zobacz materiał C013D | |
| 5-0 Krawaty jedwabne | Narzędzia naukowe | 18020-50 | |
| 6-0 Krawaty jedwabne | Narzędzia naukowe | 18020-60 | |
| 7-0 Krawaty jedwabne | Teleskop Teleflex | 103-S | |
| 9-0 Szew poliamidowy | AROSurgiczny | T05A09N10-13 | Czarny |
| Kauteryzacja bipolarna | Codman & Shurtleff Inc. | P.H. 234 | |
| Buprenorfina HCL | Hospira | 409201232 | |
| Kleszcze, Adson-Brown | Narzędzia naukowe | 11627-12 | 12,5 cm |
| Kleszcze kątowe Dumont | Narzędzia naukowe | 11253-25 | Medyczny #5/45 11 cm |
| Kleszcze, wiązanie szwów | Narzędzia naukowe | 18025-10 | 10 cm |
| Heparyna sodowa do wstrzykiwań, USB | Fresenius Kabi | 504015 | 10 000 jednostek USP na 10 ml |
| Kaniula hydrodysekcyjna | Ambler Chirurgiczny | Numer katalogowy 1021E | 27 gramów |
| Izofluran | Produkty weterynaryjne Dechra | 17033-091-25 | |
| Cewnik dożylny | Kendall | 2619PUR (wersja angielska) | 26 G x 3/4" |
| Magnetyczny system wciągania | Narzędzia naukowe | 18200-50 | |
| Mikro zaciski | Narzędzia naukowe | 18055-05 | 6 mm |
| Mikro zaciski | Narzędzia naukowe | 18055-06 | Grubość 4 mm |
| Aplikator Micro Clamp | Narzędzia naukowe | 18057-14 | 14 cm |
| Mikro uchwyt na igłę | S& T | Samolot C-14 | 14 cm |
| Mikroskop | Zeiss | Uniwersalny S3 | Podwójna głowica |
| Maść okulistyczna | Puralube (Purałub) | 14590500 | |
| Rurki poliimidowe | Cole'a Parmera | 95820-04 | OD 0.0215", ID 0.0195", ściana 0.0010" |
| Słony | Baxter | 281324 | 0,9% chlorek sodu |
| Chirurgiczne nożyczki sprężynowe | S& T | Zobacz materiał SDC-15 | 14 cm |
| Chirurgiczne nożyczki sprężynowe | Narzędzia naukowe | 15021-15 | Vanny 14 cm |
Bibliografia
- Lee, S., Edgington, T. S. Heterotopic liver transplantation utilizing inbred rat strains. Am J Pathol. 52 (3), 649-669 (1968).
- Hess, F., Jerusalem, C., Van der Heyde, M. N. Advantages of auxiliary liver homotransplantation in rats. Arch Surg. 104, 76-80 (1972).
- Marni, A., Ferrero, M. Heterotopic liver grafting in the rat. A simplified method using cuff techniques. Transplantation. 39 (3), 329-331 (1985).
- Kobayashi, E., et al. Auxiliary heterotopic liver transplantation in the rat: a simplified model using cuff technique and application for congenitally hyperbilirubimemic Gunn rat. Microsurgery. 18 (2), 97-102 (1998).
- Schleimer, K., et al. Auxiliary liver transplantation with flow-regulated portal vein arterialization offers a successful therapeutic option in acute hepatic failure--investigations in heterotopic auxiliary rat liver transplantation. Transpl Int. 19 (7), 581-588 (2006).
- Qiao, J., Han, C., Zhang, J., Wang, Z., Meng, X. A new model of auxiliary partial heterotopic liver transplantation with liver dual artery supply. Exp Ther Med. 9 (2), 367-371 (2015).
- Li, J., Ren, J., Zhang, J., Meng, X. A. Modified kidney-sparing portal vein arterialization model of heterotopic auxiliary liver transplantation increases liver IL-6, TNF-α, and HGF levels and enhances liver regeneration: an animal model. BMC Surg. 2, 281-292 (2022).
- Ono, Y., et al. Regeneration and cell recruitment in an improved heterotopic auxiliary partial liver transplantation (APLT) model in the rat. Transplantation. 101 (1), 92-100 (2017).
- Wang, J., et al. Auxiliary partial liver grafting in rats: effect of host hepatectomy on graft regeneration, and review of literature on surgical technique. Microsurgery. 22 (8), 371-377 (2002).
- Schleimer, K., et al. Heterotopic auxiliary rat liver transplantation with flow-regulated portal vein arterialization in acute hepatic failure. J Vis Exp. (91), e51115(2014).
- Prescott, M. J., Lidster, K. Improving quality of science through better animal welfare: the NC3Rs strategy. Lab Animal. 46 (4), 152-156 (2017).
- Banff schema for grading liver allograft rejection: an international consensus document. Hepatology. 25 (3), 658-663 (1997).
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2020 Annual Data Report: Liver. Am J Transplant. 22, Suppl 2 204-309 (2022).
- Nacif, L. S., et al. Late acute rejection in liver transplant: a systematic review. Arq Bras Cir Dig. 28 (3), 212-215 (2015).
- Levitsky, J., et al. Acute rejection increases risk of graft failure and death in recent liver transplant recipients. Clin Gastroenterol Hepatol. 15 (4), 584-593 (2017).
- Gong, J., Cao, D., Chen, Y., Li, J., Gong, J., Zeng, Z. Role of programmed death ligand 1 and Kupffer cell in immune regulation after orthotopic liver transplantation in rats. Int Immunopharmacol. 48, 8-16 (2017).
- Ceresa, C. D. L., Nasralla, D., Coussios, C. C., Friend, P. J. The case for normothermic machine perfusion in liver transplantation. Liver Transpl. 24 (2), 269-275 (2018).
- Nasralla, D., et al. A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation. Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).
- Markmann, J. F., et al. Impact of portable normothermic blood-based machine perfusion on outcomes of liver transplant: The OCS liver PROTECT randomized clinical trial. JAMA Surg. 157 (3), 189-198 (2022).
- Goldaracena, N., et al. Anti-inflammatory signaling during ex vivo liver perfusion improves the preservation of pig liver grafts before transplantation. Liver Transpl. 22 (11), 1573-1583 (2016).
- Carlson, K. N., et al. Interleukin-10 and transforming growth factor-beta cytokines decrease immune activation during normothermic ex vivo machine perfusion of the rat liver. Liver Transpl. 27 (11), 1577-1591 (2021).
- Ig-Izevbekhai, K., Goldberg, D. S., Karp, S. J., Foley, D. P., Abt, P. L. Immunosuppression in donation after circulatory death liver transplantation: Can induction modify graft survival. Liver Transpl. 26 (9), 1154-1166 (2020).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion Injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890(2019).
- Schlegel, A., Graf, R., Clavien, P. A., Dutkowski, P. Hypothermic oxygenated perfusion (HOPE) protects from biliary injury in a rodent model of DCD liver transplantation. J Hepatol. 59 (5), 984-991 (2013).
Przedruki i uprawnienia
