Bezkomórkowa matryca śledziony (DSM) ma obiecujące zastosowania w dziedzinie inżynierii tkankowej wątroby. Protokół ten określa procedurę przygotowania DSM dla szczurów, która obejmuje zbieranie śledziony szczurów, ich decellularację poprzez perfuzję i ocenę powstałego DSM w celu potwierdzenia jego cech.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie zdecelularizowanej matrycy śledziony pochodzącej od szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przeszczep wątroby jest podstawowym sposobem leczenia schyłkowej choroby wątroby. Jednak niedobór i nieodpowiednia jakość narządów od dawców wymuszają rozwój alternatywnych terapii. Biosztuczne wątroby (BAL) wykorzystujące bezkomórkową matrycę wątroby (DLM) okazały się obiecującymi rozwiązaniami. Jednak pozyskanie odpowiednich DLM pozostaje wyzwaniem. Zastosowanie bezkomórkowego macierzy śledziony (DSM) zostało zbadane jako podstawa dla BALs, oferując łatwo dostępną alternatywę. W tym badaniu śledziony szczurów zostały zebrane i pozbawione komórek przy użyciu kombinacji cykli zamrażania i rozmrażania oraz perfuzji z odczynnikami do decelularyzacji. W protokole zachowano mikrostruktury i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w DSM. Cały proces decelularyzacji trwał około 11 godzin, w wyniku czego w wyniku uzyskano nienaruszony ECM w DSM. Analiza histologiczna potwierdziła usunięcie składników komórkowych przy zachowaniu struktury i składu ECM. Przedstawiony protokół stanowi kompleksową metodę otrzymywania DSM, oferując potencjalne zastosowania w inżynierii tkankowej wątroby i terapii komórkowej. Odkrycia te przyczyniają się do opracowania alternatywnych podejść do leczenia schyłkowej niewydolności wątroby.
Wprowadzenie
Przeszczep wątroby pozostaje jedynym ostatecznym sposobem leczenia schyłkowej niewydolności wątroby1,2,3. Jednak krytyczny niedobór i pogarszająca się jakość narządów od dawców zwiększyły zapotrzebowanie na alternatywne metody leczenia4. W dziedzinie medycyny regeneracyjnej obiecującymi rozwiązaniami okazały się biosztuczne wątroby (BAL) wykorzystujące bezkomórkową matrycę wątroby (DLM)5,6,7. DLM zachowuje oryginalną strukturę wątroby, w tym jej skomplikowaną sieć mikronaczyniową i elementy ECM, oferując rusztowanie do tworzenia przeszczepialnych BAL, które mogą potencjalnie łagodzić choroby wątroby.
Pomimo obietnic, przyjęcie tej technologii napotyka wyzwania, szczególnie w pozyskiwaniu odpowiednich DLM. DLM pochodzenia ludzkiego jest towarem deficytowym, podczas gdy te pochodzące od zwierząt niosą ze sobą ryzyko przeniesienia choroby i odrzucenia układu immunologicznego. W ramach innowacyjnego podejścia nasze badania dotyczyły wykorzystania decelularizowanej matrycy śledziony (DSM) jako podstawy dla BALs8,9,10,11. Śledziony są łatwiej dostępne w różnych sytuacjach medycznych, takich jak nadciśnienie wrotne, pęknięcie pourazowe, idiopatyczna plamica małopłytkowa i dawstwo po śmierci sercowej. Dlatego śledziony są szerzej dostępne niż wątroba do celów badawczych. Pacjenci, którzy przeszli splenektomię, nie cierpią na ciężkie stany, co dodatkowo potwierdza zbędność śledziony. Mikrośrodowisko śledziony, zwłaszcza macierz zewnątrzkomórkowa i sinusoidy, jest podobne do środowiska wątroby. To sprawia, że śledziona jest odpowiednim narządem do adhezji i proliferacji komórek w badaniach nad przeszczepem hepatocytów. Opierając się na tych odkryciach, nasze poprzednie badania wykazały, że DSM mają porównywalne mikrostruktury i składniki z DLM i mogą wspierać przeżycie i funkcję hepatocytów, w tym produkcję albuminy i mocznika. Ponadto wykazano, że DSM zwiększają różnicowanie wątrobowe mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego, co prowadzi do poprawy i spójnej funkcjonalności.
Stosując DSM traktowane heparyną, opracowaliśmy funkcjonalne BALs, które są w stanie wykazać skuteczne krótkoterminowe przeciwzakrzepowe działanie przeciwzakrzepowe i częściową kompensację funkcji wątroby11. W związku z tym ten trójwymiarowy DSM jest bardzo obiecujący dla postępu w inżynierii tkankowej wątroby i terapii komórkowej. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowe metody pozyskiwania śledziony szczurów i przygotowania DSM, które zachowują mikrostruktury i składniki ECM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Xi'an Jiaotong i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Zbiór śledziony
- Używaj samców szczurów Sprague Dawley o wadze 250-280 g. Trzymaj szczury w pomieszczeniach o kontrolowanej temperaturze i wilgotności oraz dostarczaj im jedzenie i wodę ad libitum, z wyjątkiem postu przed operacją.
- Buprenorfinę (0,05 ml/kg) należy wstrzyknąć podskórnie jako środek przeciwbólowy na 1 godzinę przed operacją. Znieczulić szczura przez inhalację izofluranu. Do znieczulenia indukcyjnego należy użyć natężenia przepływu 1,5 l/min 5% izofluranu w pudełku z pleksi i utrzymywać znieczulenie z natężeniem przepływu 0,6-0,8 l/min 2% izofluranu przez maskę. Potwierdź głębokość znieczulenia, ściskając palce u stóp.
- Użyj golarki elektrycznej, aby ogolić skórę na całym brzuchu. Zabezpiecz szczura w pozycji leżącej na stole operacyjnym. Wstrzyknąć 2 ml heparynizowanej soli fizjologicznej (1,000 j. heparyny) przez żyłę grzbietową prącia, aby uzyskać ogólnoustrojową antykoagulację. Zdezynfekuj ogoloną skórę roztworem jodu powidonu i przykryj sterylną ściereczką.
- Wykonaj nacięcie w kształcie krzyża za pomocą nożyczek chirurgicznych w jamie brzusznej, odsłoń jamę brzuszną, rozciągając się kleszczami hemostatycznymi i odwróć wątrobę w kierunku przepony. Zewnętrz przewód pokarmowy na prawą stronę brzucha i przykryj go wilgotną gazą.
- Ostrożnie oddziel i przetnij więzadło śledzionowo-żołądkowe, aby odsłonić wnękę śledziony.
UWAGA: Śledzionę, która pojawia się jako czerwonawa, wydłużona struktura o wymiarach około 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm, można zidentyfikować w lewej jamie brzusznej. - Stopniowo oddzielaj i odsłaniaj wspólną tętnicę wątrobową, tętnicę żołądka i dwunastnicę oraz tętnicę śledzionową, przeprowadzając sekcję wzdłuż wnęki śledziony. Podwiązać i przeciąć tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i wspólną tętnicę wątrobową, stopniowo dysocjując otaczającą tkankę.
- Odwróć śledzionę w prawą stronę, aby odsłonić aortę brzuszną. Delikatnie wykonaj rozwarstwienie i odsłoń aortę brzuszną i pień trzewny za pomocą bawełnianych wacików. Umieść jedwabny szew 3-0 o długości około 3 cm powyżej i poniżej gałęzi pnia celiakii, a następnie umieść jedwabny szew 6-0 o długości około 10 cm na gałęzi pnia trzewki.
- Podwiąż aortę brzuszną poniżej i powyżej gałęzi pnia trzewnej. Wykonaj małe nacięcie w gałęzi tętnicy. Delikatnie podnieś szew jedwabny 6-0, wprowadź cewnik żylny 24 G do tętnicy śledzionowej wzdłuż pnia trzewnego, a następnie podwiązaj go i zabezpiecz.
- Za pomocą pompy strzykawkowej z szybkością 4 ml/min podać heparynizowany roztwór soli fizjologicznej (25 j./ml) w objętości 50 ml. W tym samym czasie przeciąć żyłę wrotną jako kanał odpływowy, aby umożliwić przepływ podanego płynu ze śledziony. Zwierzę zostaje poddane eutanazji przez wykrwawienie.
- Ostrożnie wypreparuj otaczającą tkankę śledziony, unikając uszkodzenia trzustki, zachowując jednocześnie główne naczynia dodatkowe.
- Sprawdź, czy nie ma wycieków wokół śledziony, a następnie usuń śledzionę i trzustkę i spłucz je w zwykłej soli fizjologicznej.
UWAGA: Śledziona i trzustka szczurów są ściśle połączone, a trzustka owija się wokół tętnicy śledzionowej. Jeśli śledziona jest usuwana oddzielnie, podwiązanie wielu małych naczyń krwionośnych może być trudne. W tej procedurze śledziona jest usuwana wraz z trzustką. Po decelularyzacji śledziona i trzustka stają się przezroczyste i widoczne jest mikrokrążenie, co ułatwia zachowanie śledziony z nienaruszonymi naczyniami krwionośnymi. - Przenieś śledzionę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej solą fizjologiczną i przechowuj ją w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
UWAGA: Śledziona i cewnik żylny wprowadzone do tętnicy śledziony zostaną poddane kriokonserwacji razem w celu wygodnego połączenia podczas eksperymentów perfuzyjnych.
2. Decelularyzacja śledziony
- Powtórz cykl zamrażania i rozmrażania 3x w sterylnym pojemniku, aby zlizować komórki śledziony.
UWAGA: Cykl zamrażania-rozmrażania jest metodą fizyczną stosowaną do decelularyzacji rusztowania. Tkankę śledziony umieszcza się na noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C w celu zamrożenia, a następnie wyjmuje z środowiska o niskiej temperaturze i umieszcza w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej lub 37 °C w celu rozmrożenia. Ten proces zamrażania i rozmrażania powtarza się 3-6 razy, co rozrywa błony komórkowe i prowadzi do lizy komórek. - Ustaw system perfuzyjny na czystym stole składającym się z pompy perystaltycznej, zbiornika o pojemności 2 litrów, silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej 2,4 mm i pułapki bąbelkowej (Rysunek 1).
- Napełnij system perfuzyjny wodą dejonizowaną (ddH2O) i utrzymuj go w ruchu przez 10 minut.
- Ostrożnie przenieś pobraną śledzionę do pojemnika wypełnionego ddH2O.
- Podłącz rurkę silikonową do cewnika żylnego, który został wprowadzony do tętnicy śledzionowej.
- Rozpocznij perfuzję z ddH2O z szybkością 2 ml/min przez 30 min.
- Kontynuować perfuzję z ddH2O z szybkością 4 ml/min przez 30 minut.
- Perfuzja z 0,1% (w/v) roztworem SDS przez 4 godziny.
- Perfuzja z 1% (v/v) roztworem Triton X-100 przez 2 godziny.
- Utymuluj z PBS z szybkością 4 ml/min przez 4 godziny w celu umycia DSM.
UWAGA: Używanie pompy perystaltycznej do jednokierunkowej perfuzji wszystkich cieczy. - Po zakończeniu perfuzji podwiązaj i przetnij gałęzie naczyniowe między trzustką a śledzioną, a następnie usuń trzustkę. Przechowywać DSM w czystej i szczelnie zamkniętej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml nasączonej PBS zawierającym 10% penicyliny-streptomycyny w temperaturze -20 °C, aż będzie gotowy do użycia w przyszłych eksperymentach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym protokole zastosowano kombinację powtarzalnych cykli zamrażania i rozmrażania oraz perfuzji odczynnikami do decelularyzacji w celu decelularyzacji śledziony szczura. Całkowita decelularyzacja śledziony została osiągnięta w ciągu około 11 h (Ryc. 2A). W trakcie procesu decelularyzacji kolor śledziony stopniowo zmieniał się z ciemnoczerwonego na cętkowany, jasnoczerwony, a ostatecznie przybrał biały, półprzezroczysty wygląd (Ryc. 2B). Ogólna morfologi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
BAL stanowią skuteczne podejście do leczenia schyłkowej niewydolności wątroby, szczególnie w przypadkach, gdy przeszczepienie wątroby jest utrudnione przez obecny niedobór narządów od dawców6. Obiecującą opcją do tworzenia BAL jest wykorzystanie DLM, który zachowuje naturalny ECM i strukturę naczyniową wątroby. Jednak niedobór DLM u ludzi oraz potencjalne ryzyko zakażenia i immunogenność związane z DLM u zwierząt stanowią znaczne ograniczenia. Aby sprostać temu wyzwaniu, proponujemy nowatorską str...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82000624), Program Badań Podstawowych Nauk Przyrodniczych Shaanxi (2022JQ-899 i 2021JM-268), Program Wsparcia Zdolności Innowacyjnych Prowincji Shaanxi (2023KJXX-030), Kluczowy Plan Badawczo-Rozwojowy Prowincji Shaanxi Wspólny Projekt-Kluczowy Projekt Projektu (2021GXLH-Z-047), Fundację Instytucjonalną Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Xi'an Jiaotong (2021HL-42 i 2021HL-21).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Maszyna anestezjologiczna | Aparat Harvarda | stołowa | znieczulenia zwierząt |
| Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | średnica porów: 5 μ m | zapobiegać pęcherzykom powietrza | |
| Buprenorfina | TIPR Pharmaceutical Responsible Co., Ltd | przeciwbólowe | |
| kleszcze hemostatyczne | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | narzędzie chirurgiczne |
| Heparynizowana sól fizjologiczna | SPH nr 1 Biochemiczne i Pharmaceutical Co., LTD | zapobiegać powstawaniu zakrzepicy | |
| Izofluran | RWD life science Co. | znieczulenie: do indukcji i podtrzymania znieczulenia | |
| Penicylina-Streptomycyna | Beyotime Biotechnology Co., Sp. z o.o. | C0222 | antybiotyki in vitro w celu zapobiegania skażeniu mikrobiologicznemu |
| Pompa perystaltyczna | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | roztwór soli buforowej kwasu fosforowego |
| Rurka silikonowa | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2,4 razy; 0,8 mm | |
| szew jedwabny | Yangzhou Jinhuan Fabryka instrumentów medycznych | 6-0 i 3-0 | podwiązane naczynia krwionośne |
| Dodecyl siarczan sodu | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | jonowy detergent, rozpuszcza zarówno błony komórkowe, jak i jądrowe Pompa |
| strzykawkowa | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | infuzja dożylna |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | niejonowy detergent, zakłóca interakcje lipidowo-lipidowe, lipidowo-białkowe i DNA-białko |
| Cewnik żylny | B. Braun Company | 24G | wprowadzający tętnicę śledzionową |
Bibliografia
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285(2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972(2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36(2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003(2019).
- Somuncu, Ö Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299(2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786(2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
