Artykuł metodologiczny

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66522

⸱

14 czerwca 2024

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Streszczenie

Infekcje wirusowe mogą powodować stres retikulum endoplazmatycznego (ER) z powodu nieprawidłowego nagromadzenia białka, co prowadzi do Unfolded Protein Response (UPR). Wirusy opracowały strategie manipulowania UPR gospodarza, ale w literaturze brakuje szczegółowej wiedzy na temat modulacji UPR i jej funkcjonalnego znaczenia podczas zakażenia HIV-1. W tym kontekście niniejszy artykuł opisuje protokoły stosowane w naszym laboratorium do pomiaru poziomu stresu ER i UPR podczas zakażenia HIV-1 w limfocytach T oraz wpływu UPR na replikację wirusa i zakaźność.

Barwienie tioflawiną T (ThT) jest stosunkowo nową metodą używaną do wykrywania stresu ER w komórkach poprzez wykrywanie agregatów białkowych. W tym miejscu zilustrowaliśmy protokół barwienia ThT w komórkach zakażonych wirusem HIV-1 w celu wykrycia i ilościowego określenia stresu ER. Co więcej, stres ER wykryto również pośrednio, mierząc poziomy markerów UPR, takich jak BiP, fosforylowany IRE1, PERK i eIF2α, splicing XBP1, rozszczepienie ATF6, ATF4, CHUP i GADD34 w komórkach zakażonych HIV-1, przy użyciu konwencjonalnego immunoblottingu i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Odkryliśmy, że fluorescencja ThT koreluje ze wskaźnikami aktywacji UPR. W artykule przedstawiono również protokoły analizy wpływu stresu ER i modulacji UPR na replikację HIV-1 poprzez eksperymenty knockdown, a także zastosowanie cząsteczek farmakologicznych. Wpływ UPR na ekspresję/replikację genu HIV-1 i produkcję wirusa analizowano odpowiednio za pomocą testów reporterowych lucyferazy i ELISA wychwytywania antygenu p24, podczas gdy wpływ na zakaźność wirionu analizowano przez barwienie zakażonych komórek reporterowych. Podsumowując, ten zestaw metod zapewnia kompleksowe zrozumienie szlaków odpowiedzi na niesfałdowane białko podczas infekcji HIV-1, ujawniając jej skomplikowaną dynamikę.

Wprowadzenie

Zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS) charakteryzuje się stopniowym zmniejszaniem liczby limfocytów T CD4+, co prowadzi do postępującego niepowodzenia odpowiedzi immunologicznej. Ludzki wirus niedoboru odporności-1 (HIV-1) jest czynnikiem wywołującym AIDS. Jest to otoczkowy, jednoniciowy wirus RNA z pozytywnym zmysłem z dwiema kopiami RNA na wirion i należy do rodziny retroviridae. Produkcja wysokich stężeń białek wirusowych w komórce gospodarza powoduje nadmierny nacisk na maszynerię fałdowania białek w komórce1. ER jest pierwszym przedziałem w szlaku wydzielniczym komórek eukariotycznych. Jest odpowiedzialny za produkcję, zmianę i dostarczanie białek do szlaku wydzielniczego i miejsc docelowych przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Białka przechodzą liczne zmiany potranslacyjne i zwijają się do swojej naturalnej konformacji w ER, w tym glikozylacji związanej z asparaginą oraz tworzenia wewnątrz- i międzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych2. W związku z tym w świetle ER obecne są wysokie stężenia białek, które są bardzo podatne na agregację i nieprawidłowe fałdowanie. Różne stany fizjologiczne, takie jak szok cieplny, infekcje bakteryjne lub wirusowe, które wymagają zwiększonej syntezy białek lub mutacji białek, prowadzą do stresu ER z powodu zwiększonej akumulacji białka w ER, zaburzając w ten sposób homeostazę światła ER. Stres ER aktywuje sieć wysoce konserwatywnych adaptacyjnych ścieżek transdukcji sygnału, Unfolded Protein Response (UPR)3. UPR stosuje się w celu przywrócenia normalnego stanu fizjologicznego ER poprzez dostosowanie jego ciężaru rozłożonego białka i zdolności fałdowania. Jest to spowodowane zwiększeniem rozmiaru ER oraz molekularnych białek opiekuńczych i fałdowatych rezydujących w ER, co skutkuje zwiększeniem zdolności fałdowania ER. UPR zmniejsza również obciążenie białkowe ER poprzez globalne tłumienie syntezy białek na poziomie translacyjnym i zwiększa klirens niesfałdowanych białek z ER poprzez regulację w górę degradacji związanej z ER (ERAD)4,5.

Stres ER jest wykrywany przez trzy białka transbłonowe rezydujące w ER: kinazę retikulum endoplazmatycznego podobną do kinazy białkowej R (PKR), aktywujący czynnik transkrypcyjny 6 (ATF6) i enzym wymagający inozytolu typu 1 (IRE1). Wszystkie te efektory są utrzymywane w stanie nieaktywnym przez wiązanie się z rodziną białek szoku cieplnego A (Hsp70) należących do 5 (HSPA5), znanych również jako białko wiążące (BiP) / białko regulowane glukozą 78-kDa (GRP78). Po stresie ER i akumulacji niesfałdowanych/nieprawidłowo sfałdowanych białek, HSPA5 dysocjuje i prowadzi do aktywacji tych efektorów, które następnie aktywują szereg dalszych celów, które pomagają w rozwiązaniu stresu ER i, w ekstremalnych warunkach, spromują śmierć komórki6. Po dysocjacji od HSPA5 PERK ulega autofosforylacji, a jego aktywność kinazy jest aktywowana7. Jego aktywność kinazy fosforyluje eIF2α, co prowadzi do tłumienia translacyjnego, obniżając obciążenie białkami klasy ER8. Jednak w obecności fosfo-eukariotycznego czynnika inicjacji 2α (eIF2α), nieulegające translacji otwarte ramki odczytu na określonych mRNA ulegają preferencyjnej translacji, takiej jak ATF4, regulującej geny wywołane stresem. Homologiczne białko ATF4 i C/EBP (CHOP) to czynniki transkrypcyjne, które regulują geny wywołane stresem oraz regulują apoptozę i szlaki śmierci komórki9,10. Jednym z celów ATF4 i CHOP jest białko indukowane zatrzymaniem wzrostu i uszkodzeniem DNA (GADD34), które wraz z fosfatazą białkową 1 defosforyluje peIF2α i działa jako regulator sprzężenia zwrotnego dla tłumienia translacyjnego11. Pod wpływem stresu ER ATF6 dysocjuje od HSPA5, a jego sygnał lokalizacji Golgiego jest eksponowany, co prowadzi do jego translokacji do aparatu Golgiego. W aparacie Golgiego ATF6 jest rozszczepiany przez proteazę miejsca 1 (S1P) i proteazę miejsca 2 (S2P) w celu uwolnienia rozszczepionej formy ATF6 (ATF6 P50). ATF6 p50 jest następnie przemieszczany do jądra, gdzie indukuje ekspresję genów zaangażowanych w fałdowanie, dojrzewanie i wydzielanie białek, a także degradację białek12,13. Podczas stresu ER IRE1 dysocjuje od HSPA5, multimeryzuje i ulega autofosforylacji14. Fosforylacja IRE1 aktywuje jego domenę RNazy, w szczególności pośrednicząc w splicingu 26 nukleotydów z centralnej części mRNA białka wiążącego X-box 1 (XBP1)15,16. W ten sposób powstaje nowy C-koniec nadający funkcję transaktywacji, generujący funkcjonalne białko XBP1s, silny czynnik transkrypcyjny kontrolujący kilka genów wywołanych stresem ER17,18. Połączona aktywność tych czynników transkrypcyjnych włącza programy genetyczne mające na celu przywrócenie homeostazy ER.

Istnieją różne metody wykrywania stresu ER i UPR. Należą do nich konwencjonalne metody analizy markerów UPR: 19,20. Różne niekonwencjonalne metody obejmują pomiar stanu redoks UPR i rozkładu wapnia w świetle ER, a także ocenę struktury ER. Mikroskopia elektronowa może być wykorzystana do sprawdzenia, jak bardzo zwiększa się światło ER w odpowiedzi na stres ER w komórkach i tkankach. Metoda ta jest jednak czasochłonna i zależy od dostępności mikroskopu elektronowego, który może nie być dostępny dla każdej grupy badawczej. Ponadto pomiar strumienia wapnia i stanu redoks ER jest trudny ze względu na dostępność odczynników. Co więcej, odczyt z tych eksperymentów jest bardzo czuły i mogą mieć na niego wpływ inne czynniki metabolizmu komórkowego.

Potężna i prosta technika monitorowania wyjścia UPR polega na pomiarze aktywacji różnych ścieżek sygnałowych UPR i jest stosowana od dziesięcioleci w różnych scenariuszach stresu. Te konwencjonalne metody pomiaru aktywacji UPR są ekonomiczne, wykonalne i dostarczają informacji w krótszym czasie w porównaniu z innymi znanymi metodami. Obejmują one immunoblotting w celu pomiaru ekspresji markerów UPR na poziomie białka, takich jak fosforylacja IRE1, PERK i eIF2α oraz rozszczepienie ATF6 poprzez pomiar formy P50 ATF6 i ekspresji białka innych markerów, takich jak HSPA5, spliced XBP1, ATF4, CHOP i GADD34, a także RT-PCR w celu określenia poziomów mRNA, a także splicing mRNA XBP1.

Ten artykuł opisuje sprawdzony i niezawodny zestaw protokołów do monitorowania stresu ER i aktywacji UPR w komórkach zakażonych HIV-1 oraz do określenia funkcjonalnego znaczenia UPR w replikacji i zakaźności HIV-1. Protokoły wykorzystują łatwo dostępne i ekonomiczne odczynniki i dostarczają przekonujących informacji o wynikach UPR. Stres ER jest wynikiem akumulacji niesfałdowanych/nieprawidłowo sfałdowanych białek, które są podatne na tworzenie agregatów białkowych21. Niniejszym opisujemy metodę wykrywania tych agregatów białkowych w komórkach zakażonych wirusem HIV-1. Barwienie tioflawiną T jest stosunkowo nową metodą stosowaną do wykrywania i ilościowego oznaczania tych agregatów białkowych22. Beriault i Werstuck opisali tę technikę w celu wykrycia i ilościowego określenia agregatów białkowych, a tym samym poziomów stresu ER w żywych komórkach. Wykazano, że mała cząsteczka fluorescencyjna tioflawina T (ThT) wiąże się selektywnie z agregatami białkowymi, zwłaszcza z włókienkami amyloidowymi.

W tym artykule opisujemy użycie ThT do wykrywania i ilościowego określania stresu ER w komórkach zakażonych wirusem HIV-1 i korelujemy go z konwencjonalną metodą monitorowania UPR poprzez pomiar aktywacji różnych szlaków sygnałowych UPR.

Ponieważ brakuje również wyczerpujących informacji na temat roli UPR podczas infekcji HIV-1, udostępniamy zestaw protokołów, aby zrozumieć rolę UPR w replikacji HIV-1 i zakaźności wirionów. Protokoły te obejmują knockdown markerów UPR za pośrednictwem lentiwirusa, a także leczenie farmakologicznymi induktorami stresu ER. W artykule przedstawiono również rodzaje odczytu, które można wykorzystać do pomiaru ekspresji genu HIV-1, produkcji wirusa, a także zakaźności wytworzonych wirionów, takich jak odpowiednio test lucyferazy oparty na długich powtórzeniach końcowych (LTR), test immunoenzymatyczny sprzężony z enzymem p24 (ELISA) i test barwienia reporterowego β-gal.

Korzystając z większości tych protokołów, niedawno opisaliśmy funkcjonalną implikację infekcji HIV-1 dla UPR w limfocytach T23, a wyniki tego artykułu sugerują niezawodność opisanych tutaj metod. W związku z tym artykuł ten zawiera zestaw metod wyczerpujących informacji dotyczących interakcji HIV-1 ze stresem ER i aktywacją UPR.

Protokół

UWAGA: Użyte tutaj linie komórkowe to HEK-293T i Jurkat J6 (linia komórkowa CD4+T), które zostały uzyskane z Repozytorium Komórek, NCCS, Pune, Indie; TZM-bl, linia komórkowa pochodząca z HeLa, która ma zintegrowane kopie genów β-galaktozydazy i lucyferazy w ramach promotora HIV-1 długich powtórzeń końcowych (LTR) 24 i CEM-GFP (inna linia komórkowa reporterowa T CD4 +) < klasa sup = "xref">25 zostały uzyskane z NIH AIDS Repository, USA.

1. Przygotowanie i przechowywanie zapasów wirusa HIV-1

  1. Preparat wyjściowy wirusa HIV-1
    UWAGA: Zaleca się stosowanie międzynarodowych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa biologicznego, dostępnych w podręczniku Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) lub Centrów Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) we wszystkich eksperymentach z udziałem HIV-1. Obchodzenie się z wirusem i wszelkie eksperymenty z żywym wirusem powinny odbywać się wyłącznie w odpowiedniej komorze bezpieczeństwa biologicznego mieszczącej się w laboratorium zabezpieczającym na poziomie co najmniej BSL2. Produkcja zakaźnych cząstek HIV-1 przy użyciu zestawu do transfekcji ssaków z fosforanem wapnia jest opisana w tym segmencie protokołu.
    1. Wysiewać komórki HEK-293T na szalkach 90 mm z 10 ml kompletnego (uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną) DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A2 i przechowywać przez około 12 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, tak aby zbieg komórek wynosił od 50% do 60%.
    2. Następnego dnia przygotuj mieszankę do transfekcji: Przygotuj roztwór A zawierający 25 μg plazmidowego DNA pNL4.3 (molekularny klon HIV-1) w sterylnym buforze, 86,8 μl 2 M CaCl2 i pozostałą sterylną wodę, aby uzyskać końcową objętość 700 μl na każdą płytkę. Przygotować roztwór B zawierający 700 μl 2x soli fizjologicznej buforowanej HEPS (HBS) na 1 płytkę. Następnie dostosuj obliczenia dla całkowitej liczby płyt.
    3. Teraz dodaj roztwór B do roztworu A w sposób kroplowy, ciągle wirując roztwór A. Całkowita objętość mieszanki do transfekcji wynosi teraz 1,4 ml na jedną płytkę.
      UWAGA: Precyzyjne dodawanie kroplami roztworu B do roztworu A podczas ciągłego wirowania prowadzi do powstania doskonałych kompleksów transfekcyjnych.
    4. Inkubować tę mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) przez około 20 minut. Następnie powoli dodawać mieszaninę kroplami do każdej płytki zawierającej świeże 9 ml kompletnego DMEM i przenieść płytki do inkubatora CO2 . Po 8-10 godzinach należy wymienić istniejące podłoża na świeże 10 ml kompletnego DMEM.
    5. Po 24 godzinach po zmianie podłoża zebrać supernatant (zawierający cząsteczki wirusa) ze wszystkich płytek w stożkowych probówkach. Wirować przy 600 x g przez 5 minut za pomocą wolnoobrotowej wirówki stołowej (tabela materiałów) w celu usunięcia resztek komórek.
    6. Przenieść supernatant do probówek ultrawirówek polialomerowych i umieścić je w odchylanym wirniku ultrawirówki (tabela materiałów). Sprawdź wagę uchwytów probówek pod kątem wyważenia i w razie potrzeby wyreguluj za pomocą sterylnego podłoża.
    7. Ultrawirować przy 1 41 000 x g przez 2,5 h w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie wyjmij probówki i powoli zdekantuj supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    8. Do osadu (który jest teraz skoncentrowanym wirusem) w każdej probówce dodaj 1 ml niekompletnego podłoża RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 i energicznie pipetuj w celu usunięcia osadu.
      UWAGA: Osad po ultrawirówce jest prawie niewidoczny gołym okiem. Dlatego należy upewnić się, że dodałeś RPMI 1640 na środku rurki, aby granulat został prawidłowo usunięty.
    9. Następnie dodać 25 μl 1 M HEPES pH 7,4 do 1 ml zawiesiny wirusa. Podzielić 50 μl zawiesiny na 1,5 ml probówek wirówkowych i natychmiast przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Kwantyfikacja stężenia wirusa i zakaźności wirionu
    UWAGA: Aby obliczyć zakaźność wirusa, konieczne jest najpierw ilościowe określenie jego stężenia, co odbywa się za pomocą testu ELISA wychwytywania antygenu p24 (zgodnie z instrukcjami producenta, a zatem nie jest tutaj opisany; patrz Tabela materiałów). Proces ten daje stężenie wirusa w nanogramach na mikrolitr (ng/μl) zapasu, które jest następnie wykorzystywane do identyfikacji zakaźnej liczby wirionów w zapasie za pomocą następującego eksperymentu w komórkach reporterowych TZM-bl26.
    1. Policz i wysiewaj 0,1 x 106 komórek TZM-bl na 24-dołkowej płytce, używając 500 μl kompletnego DMEM dla każdej studzienki i trzymaj ją w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 10-12 godzin.
    2. Upewnij się, że komórki zlewają się w 50%-60% przed rozpoczęciem infekcji w celu ilościowego określenia ilości wirusa. Zmień istniejące podłoża z 250 μl świeżego kompletnego DMEM do każdego dołka.
      UWAGA: Zachowaj dołek kontroli dodatniej, aby wykluczyć jakąkolwiek wadę eksperymentalną.
    3. Oblicz ilość wirusa zapasowego potrzebną do infekcji 1 ng, 0,1 ng i 0,01 ng w dwóch egzemplarzach. Dodać odpowiednią ilość wirusa do studzienek i utrzymywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
    4. Przemyć komórki dwukrotnie 500 μl niekompletnego DMEM, a następnie dodać 500 μl kompletnego DMEM.
    5. Kontynuuj procedurę barwienia β-galonami po 36 godzinach wymiany podłoża.
      1. Wyrzucić istniejącą pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie 1 ml PBS. Utrwalić komórki, dodając 500 μl roztworu utrwalającego (0,25% aldehydu glutarowego w PBS) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 5-7 minut.
      2. Przygotować roztwór barwiący zgodnie z tabelą 1. Trzymaj go z dala od światła, ponieważ X-gal jest wrażliwy na światło.
      3. Umyj komórki raz 1 ml PBS. Na komórki nałożyć 500 μl świeżo przygotowanego roztworu barwiącego i inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 2-18 godzin.
      4. Aby później zatrzymać reakcję, przepłucz komórki dwukrotnie 500 μl 3% dimetylosulfotlenku (DMSO) w PBS, a następnie trzymaj komórki w 500 μl świeżego PBS.
      5. Policz niebieskie zainfekowane komórki (jak pokazano na Rysunek 1A) pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu dla 5 losowych pól. Weź średnią liczbę 5 pól i pomnóż ją przez współczynnik pola i współczynnik rozcieńczenia. Pozwala to na ilościowe określenie zakaźnych cząstek wirionu w zapasie wirusa.
        UWAGA: W przypadku płytki 24-dołkowej współczynnik pola wynosi 75.
SkładnikiPrzygotowanieWymagana objętość
PbsPrzygotuj 1x PBS z zapasu 10x PBS14 ml
Żelazo-cyjanek potasuRozpuść 0,82 g żelazocyjanku potasu i 1,06 g żelazocyjanku potasu w 25 ml 1x PBS0,75 ml
Chlorek magnezu1 M w 1 ml 1x PBS15 μL
Procesor X-galRozpuść 30 mg w 0,6 ml N,N-dimetyloformamidu (w ciemności)0,3 ml
Razem = 15 ml

Tabela 1: Lista składników wymaganych do barwienia β-gal w komórkach TZM-bl.

2. Zakażenie HIV-1 linii komórek T

  1. Rozmrozić i wyhodować unieśmiertelnioną linię komórek T. W badaniu wykorzystano linię komórkową CEM-GFP wyhodowaną w kompletnym pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną-streptomycyną i 500 μg/ml G418.
  2. Policz i pobierz 2 miliony komórek dla każdego punktu czasowego (niezainfekowane, 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny i 96 godzin). Niezakażone komórki należy natychmiast zebrać przez wirowanie przy 100 x g przez 5 minut i dodać bufor do lizy komórek (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5 mM NaF, 1 mM DTT), uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy, 0,5 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 1x inhibitorem fosfatazy (50 μl dla 1-3 milionów komórek) lub lizą w odczynniku Trizol (1 ml dla 1-3 milionów komórek) w celu izolacji RNA (patrz tabela Materiałów).
  3. Umyj komórki raz 1 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 zawierającej polibren (5 μg/ml) w stężeniu 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki.
    UWAGA: Polibren jest polimerem kationowym, który jest stosowany do wzmacniania infekcji retrowirusowej w komórkach ssaków.
  4. Ponownie zawiesić 8 milionów komórek w 1 ml kompletnego podłoża zawierającego polibren. Teraz oblicz objętość wirusa wymaganą dla 4 milionów cząstek wirionu, dodaj zapas wirusa i uzupełnij całkowitą objętość do 2 ml, dodając całe podłoże. To sprawia, że MOI wynosi 0,5.
  5. Utrzymuj komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, z przerywanym stukaniem co 30–45 minut.
  6. Po 4 godzinach odwirować komórki i ostrożnie wyrzucić supernatant do komory bezpieczeństwa biologicznego, stosując odpowiednie metody usuwania.
    UWAGA: Począwszy od tego etapu, odwirować komórki przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Umyj komórki dwukrotnie 1 ml niekompletnego podłoża. Ponownie zawieś komórki w 8 ml kompletnego podłoża, co daje 1 milion komórek/ml.
  8. Na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej należy wysiać równą liczbę komórek w wymaganej liczbie studzienek i przechowywać płytkę w inkubatorze CO2 utrzymywanym w temperaturze 37 °C.
  9. Przez następne 4 dni zbieraj komórki co 24 godziny, dodając bufor do lizy komórek. Zebrać również supernatant i natychmiast przenieść go do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
  10. Aby sprawdzić, czy doszło do infekcji, przejdź do testu ELISA wychwytywania antygenu p24 dla wszystkich punktów czasowych. Dokonaj odpowiednich rozcieńczeń dla punktów czasowych, tj. mniejsze rozcieńczenie dla początkowych punktów czasowych i wyższe dla późniejszych w zakresie od 1:50 do 1:500. Wykreśl odczyty na wykresie, który przedstawia postęp infekcji (Rysunek 1B).

3. Barwienie tioflawiną T w celu określenia stresu ER

  1. Napraw 1 milion każdych niezakażonych i 0,5 zakażonych MOI komórek CEM-GFP (pobranych 72 zainfekowanych komórek) za pomocą 200 μl 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut w RT.
  2. Osadzać komórki w ilości 100 x g przez 5 minut i traktować 500 μl 0,1 M glicyny przez 5 minut, a następnie dwukrotnie przemyć 500 μl PBS. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS.
  3. Zmontuj szkiełka podstawowe, karty filtracyjne i komory na próbki. Dodać 100 μl zawieszonych komórek do komór na próbki i wirować komórki w temperaturze 1000 x g przez 4 minuty, aby przykleić komórki do szkiełek w cytowirówce (tabela materiałów).
    UWAGA: Nie będzie wystarczającej liczby komórek unieruchomionych na szkiełku po wirowaniu cytowirówki, jeśli zawiesina komórek jest zbyt rozcieńczona. Komórki prawdopodobnie zbrylą się i będą słabo rozmieszczone po cytocentrifuge, jeśli zawiesina komórkowa jest bardzo skoncentrowana.
  4. Przepuszczalność komórek przez 10 minut za pomocą kropli 0,1% Triton-X-100 w PBS (wystarczająca do pokrycia obszaru, w którym komórki przylegały) i dwukrotne przemycie komórek, nakładając PBS kroplą i wycierając PBS chusteczką, przechylając szkiełko.
  5. Inkubować komórki z 10 μl 5 μM tioflawiny T przez 30 min.
    UWAGA: Nie myć po inkubacji z ThT.
  6. Zamontuj szkiełka za pomocą 5 μl podłoża montażowego (80% glicerolu v/v, 20% PBS v/v i 8 mg/ml 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu [DABCO]), nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia.
    UWAGA: Na wszystkich tych krokach upewnij się, że komórki nie wyschną.
  7. Wykonaj obrazy konfokalne komórek stałych za pomocą soczewki zanurzeniowej z glicerolem 63x w mikroskopie konfokalnym (patrz Tabela materiałów). Dostosuj następujące ustawienia wzbudzenia i emisji: GFP (np. 494 nm, Em. 519 nm) i ThT (np. 458 nm, em. 480-520 nm).
    UWAGA: Każdy kanał fluorescencyjny powinien być obrazowany sekwencyjnie, a nie równocześnie, aby uniknąć nakładania się kanałów. GFP uznano za wskazanie zakażenia HIV-1, ponieważ komórki CEM-GFP mają GFP pod regulacją promotora LTR, który uruchamia się po zakażeniu HIV-125.
  8. Przekonwertuj obrazy fluorescencyjne na 8-bitowe przed określeniem ilościowym za pomocą analizy progowej. Określ ilościowo intensywność każdej komórki ręcznie za pomocą oprogramowania takiego jak Image J (~50 komórek)27. Wykreśl wykres z intensywnością każdej komórki jako punktami na osi Y w odniesieniu do kryteriów niezakażonych i zainfekowanych.
  9. Aby zademonstrować skuteczność tego protokołu, weź kontrolę pozytywną, na przykład leczenie Thapsigargin (znany induktor stresu ER) w tym przypadku28. Traktuj 1 milion komórek CEM-GFP, z których każda zawiera 1 μl DMSO (kontrola nośnika) i 100 nM Thapsigargin przez 12 godzin.
  10. Zebrać komórki i przeprowadzić proces barwienia ThT, jak wspomniano dla zakażonych próbek (kroki 3.1-3.8).
    UWAGA: W przypadku tych próbek fluorescencja GFP nie jest wymagana. W związku z tym w mikroskopii konfokalnej wychwytywana jest tylko fluorescencja ThT.

4. Określanie aktywacji i ekspresji różnych markerów UPR

UWAGA: Aby określić ekspresję markerów UPR, stosuje się dwie metody: Immunoblotting i RT-PCR. W celu immunoblottingu należy pobrać 0,5 MOI komórek CEM-GFP zakażonych wirusem HIV-1 w różnych punktach czasowych po zakażeniu (24 godziny, 48 godzin, 72 godziny i 96 godzin po zakażeniu) i ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze do lizy (jak wspomniano w kroku 2.2). Alternatywnie, w przypadku RT-PCR, granulki komórek są poddawane lizie w odczynniku Trizol (1 ml na 1-3 miliony komórek) (patrz tabela materiałów). Komórki zawieszone w buforze do lizy i odczynniku Trizol mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.

  1. Immunoblotting do analizy markerów UPR.
    1. Zawiesiny komórek należy przechowywać w buforze do lizy na lodzie przez 45 minut z przerywanym mieszaniem za pomocą wiru.
    2. Granulować komórki przy 18000 x g przez 15 minut za pomocą stołowej wirówki wysokoobrotowej (patrz Tabela materiałów). Zebrać supernatant do świeżej probówki.
    3. Określić ilościowo stężenie białka w każdej próbce za pomocą odczynnika Bradforda lub podobnego odczynnika.
    4. Pobrać równe stężenie białka dla każdej próbki i przygotować próbki białka w buforze Laemmli (6x bufor: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 10% SDS, 30% glicerolu i 0,02% błękitu bromofenolowego; 5% β-merkaptoetanolu).
      UWAGA: Do immunoblottingu dla każdego markera UPR użyto minimum 60-80 μg białka.
    5. Gotować próbki białka w temperaturze 96 °C przez 5 minut i krótko odwirować.
    6. Rozpuść próbki białek na 10%-12% żelu SDS-PAGE i przenieś białka do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (patrz tabela materiałów).
    7. Blokować 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku lub albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1-2 godziny, przemyć dwukrotnie TBST (20 mM Tris pH7,4 i 0,137 M NaCl; 0,1% Tween 20) i zbadać swoistymi dla białka przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko markerom UPR (patrz tabela materiałów) w bujaku, przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia po dwukrotnym przemyciu bleksów TBST, sonduj odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 1,5 godziny.
    8. Ponownie przemyć bloty TBST i uwidocznić prążki białkowe za pomocą substratu wykrywającego chemiluminescencję (patrz Tabela materiałów) w przyrządzie do obrazowania western blot.
  2. Testowany test PCR
    1. Wyizolować całkowity RNA z komórek za pomocą odczynnika Trizol (patrz tabela materiałów).
    2. Przygotuj cDNA z równego stężenia RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki mysiej Moloneya (MMLV-RT) (patrz tabela materiałów).
    3. Przeanalizuj modulację ekspresji mRNA HSPA5, spliced XBP1, ATF4, CHOP i GADD34 za pomocą qRT-PCR ze starterami specyficznymi dla genu (Tabela 2). Krótko przygotować, aby przygotować 10 μl mieszanin reakcyjnych zawierających matrycę cDNA (100 ng), 5 μl zielonego barwnika SYBR (patrz tabela materiałów) i 10 pmol każdej pary starterów oligonukleotydowych specyficznych dla genu. Wyreguluj objętość za pomocą sterylnego H2O.
    4. Uruchom mieszaniny na maszynie do PCR w czasie rzeczywistym za pomocą następującego programu: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty i 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, a następnie analiza krzywej topnienia. Oblicz zmianę krotności ekspresji genu docelowego w stosunku do genu porządkowego (na przykład β-aktyny) jako:
      Zmiana zagięcia = 2-Δ(ΔCT)
      Gdzie ΔCT = CT (cel) − CT (gen porządkowy)
      i Δ(ΔCT) = ΔCT (poddane obróbce) -ΔCT (kontrola)
    5. Aby dodatkowo potwierdzić splicing XBP1, wykonaj półilościowy RT-PCR z niezakażonymi i zakażonymi próbkami po 72 godzinach.
      UWAGA: Splicing mRNA XBP-1 bada się za pomocą RT-PCR w poprzek miejsca splicingu.
    6. Amplifikować cDNA starterami XBP1 (Tabela 2) przy użyciu wzorcowej mieszanki PCR o wysokiej wierności (patrz Tabela materiałów) w następujących warunkach: 1 cykl 98 °C przez 30 s, następnie 5 cykli 98 °C przez 15 s, 65*Δ-5 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, następnie 30 cykli w temperaturze 98 °C przez 15 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, a następnie końcowe przedłużenie temperatury 72 °C przez 10 minut i utrzymanie w temperaturze 4 °C.
    7. Oddziel amplikony na 2,5% żelu agarozowym zawierającym 50 ng bromku etydyny / ml i wizualizuj w żelowym instrumencie doc. Splicywane pasmo XBP1 jest mniejsze o 26 nukleotydów.

5. Eliminacja markerów UPR i analiza ekspresji genów HIV-1 LTR i produkcji wirusa

  1. Przygotowanie konstruktów shRNA do knockdown markerów UPR
    1. Twórz konstrukty shRNA przy użyciu szkieletu wektora pLKO.1-TRC (wektor klonowania lentiwirusa)29.
    2. Skonstruuj dwa konstrukty shRNA dla każdego genu (IRE1, PERK, ATF6 i HSPA5). Oligonukleotydy sensowne i antysensowne ukierunkowane na mRNA danego genu zostały zaprojektowane przez RNAi Consortium (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (Tabela 3).
      UWAGA: W podobny sposób można tworzyć konstrukty shRNA dla innych markerów UPR.
    3. Wyżarzać startery (po 100 nM do przodu i do tyłu) w temperaturze 95 °C, a następnie stopniowo schładzać do temperatury cieplnej.
    4. Następnie podwiązuje go do miejsc Age1 i EcoRI wektora pLKO.1 za pomocą ligazy DNA T4 (patrz tabela materiałów). Potwierdź sekwencję przez sekwencjonowanie DNA.
      UWAGA: Konstrukt shRNA ukierunkowany na gen LacZ jest używany jako kontrola nieukierunkowana.
  2. Nokaut PERK, ATF6, IRE1 i HSPA5 w komórkach HEK-293T, test lucyferazy i test ELISA p24
    1. Przygotować mieszaninę konstruktu shRNA (0,9 μg) i odczynnika do transfekcji, takiego jak polietylenina (PEI) (3 μl PEI na 1 μg DNA) (patrz tabela materiałów) w 50 μl pożywki wolnej od surowicy przez wirowanie i inkubować przez 20 min.
    2. Z konfluentnych komórek HEK-293T zawierających kolbę, trypsynizuj i wysiewaj ~0,25 x 106 komórek wraz z transfekcją mieszaj na 24-dołkowej płytce, uzyskując całkowitą objętość 125 μL i inkubuj przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 . Ta metoda nazywa się transfekcją odwrotną, w której komórki są wysiewane wraz z mieszaniną transfekcji.
    3. Po 6 godzinach dodać 125 μl kompletnej pożywki do studzienek i ponownie zawiesić komórki w celu równomiernego wysiewu.
      UWAGA: W przypadku eksperymentów z knockdownem, odwrotna transfekcja (kroki 5.2.1-5.2.3) zapewnia lepszą wydajność zarówno w przypadku shRNA, jak i siRNA.
    4. Po 24 godzinach wykonaj drugą transfekcję. Przygotować mieszaninę konstruktów pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) i pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0,5) z PEI (3 μl PEI na 1 μg DNA) w 50 μl niekompletnych pożywek przez wirowanie. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zmienić istniejącą pożywkę na 250 μl świeżej, niekompletnej pożywki i dodać mieszaninę do komórek.
      UWAGA: Wektor reporterowy dla LTR HIV-1 został opracowany przez subklonowanie LTR z pU3RIII30,31 do pGL3basic w laboratorium wcześniej32. Wyrażenie GFP przy użyciu pEGFP-N1 wykorzystano do normalizacji wydajności transfekcji32.
    5. Zmienić pożywkę po 6 godzinach po transfekcji za pomocą 500 μL kompletnego DMEM. Zbierz komórki po 36 godzinach w celu przeprowadzenia testu immunoblottingu i lucyferazy.
    6. W przypadku testu lucyferazy należy zawiesić komórki i ponownie zawiesić w komercyjnie pozyskanym substracie lucyferazy (50 μl) (patrz tabela materiałów). Dodać zawieszony lizat komórkowy do nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej i inkubować przez 10-15 minut. Uzyskaj odczyt lucyferazy w luminometrze. Zmierz również fluorescencję GFP w tych samych próbkach, aby znormalizować odczyt lucyferazy w czytniku mikromodowym mikropłytki (np. 494 nm, Em: 519 nm).
    7. Wykreśl wykres jako jednostkę lucyferazy/GFP na osi Y.
      UWAGA: Należy sprawdzić knockdown odpowiednich markerów UPR i można to zrobić za pomocą immunoblottingu lub qRT-PCR przy użyciu odpowiednio przeciwciał specyficznych dla genu lub starterów.
    8. Zebrać supernatanty do przetworzenia testu ELISA p24, jak wspomniano powyżej.
  3. Tworzenie stabilnych komórek z knockdownem markerów UPR i zakażeniem HIV-1.
    1. Przygotuj cząstki lentiwirusa przez transfekcję komórek HEK-293T wysianych na płytce 6-dołkowej, z odpowiednimi konstruktami shRNA (1 μg) wraz z pMD2.G (wektor otoczki VSV-G) (0,75 μg) i psPAX2 (plazmid opakowania lentiwirusowego) (0,25 μg) (patrz tabela materiałów) przy użyciu PEI w stosunku 1 μg DNA: 3 μL PEI. Przygotować mieszaninę w 100 μl niekompletnego DMEM i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Dodać mieszaninę do 1,8 ml kompletnej pożywki w wysiewanych komórkach HEK-293T.
      UWAGA: Komórki HEK-293T należy wysiewać na płytce 6-dołkowej co najmniej 12 godzin przed transfekcją, aż uzyskają morfologię i będą zlewać się w około 60-70%.
    2. Po 24 godzinach transfekcji dodać 1 ml kompletnego DMEM do każdego dołka.
    3. Zebrać supernatanty po 48 godzinach, przechowywać w temperaturze -80 °C w zamrażarce i wykonać test ELISA p24 w celu potwierdzenia obecności wirusa w tych supernatantach. Użyj tego surowego supernatantu lentiwirusowego do transdukcji komórek J6.
    4. Inkubować 2 miliony komórek na 6-dołkowej płytce z równą objętością supernatantu lentiwirusowego (500 μl) dla każdego kontrolnego i specyficznego dla genu lentiwirusa knockdown i dodać świeżą, kompletną pożywkę RPMI 1640 w obecności polibrenu (5 μg/ml) w celu uzupełnienia objętości do 2 ml.
    5. Po 24 godzinach dodaj Puromycynę (1 μg/ml) do każdego dołka, aby wybrać stabilne komórki. Po dodaniu Puromycyny należy granulować komórki co 24 godziny i dodać 2 ml świeżej pożywki z Puromycyną.
    6. Rób to, aż nie nastąpi śmierć komórki (~1 tydzień). Komórki, które przeżyły, to stabilne komórki z pożądanym knockdownem genu.
      UWAGA: Knockdown odpowiednich genów można sprawdzać w regularnych odstępach czasu i wreszcie, gdy tylko komórki, które przeżyły, są widoczne w pożywkach zawierających Puromycynę, za pomocą immunoblottingu lub qRT-PCR.
    7. Zainfekuj LacZ i specyficzne dla genu komórki knockdown 0,5 MOI HIV-1, jak opisano w sekcji 2 i zbierz komórki 48 godzin po zakażeniu.
    8. Zebrać supernatant z każdej próbki i przeprowadzić proces na p24-ELISA zgodnie z wcześniejszym opisem i przetworzyć komórki w celu sprawdzenia poziomu knockdown za pomocą immunoblottingu.

6. Leczenie induktorem stresu ER i analiza jego wpływu na replikację HIV-1

UWAGA: Aby określić efekt nadmiernej stymulacji UPR podczas replikacji HIV-1, można użyć cząsteczki induktora farmakologicznego, Thapsigargin.

  1. Określanie procentowej żywotności komórek po leczeniu Thapsigarginem.
    UWAGA: Cytotoksyczność Thapsigarginy określa się za pomocą odczynnika MTT (patrz Tabela Materiałów).
    1. Wysiewaj 25 000-30 000 komórek CEM-GFP na studzienkę w 96-dołkowej płytce zawierającej 100 μL kompletnego RPMI 1640. Dodać 100 nM Thapsigargin do pożywki i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
      UWAGA: Komórki potraktowane 1 μl DMSO pobrano jako kontrolę nośnika.
    2. Po 48 godzinach dodać 10 μl MTT (5 mg/ml) do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 4 godziny w celu wytworzenia kryształów formazanu w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    3. Po 4 godzinach rozpuścić kryształy za pomocą 100 μl izopropanolu do uzyskania fioletowego koloru i zmierzyć absorbancję przy 570 nm za pomocą spektrofotometru.
    4. Obliczyć procentową żywotność komórki na podstawie równania podanego poniżej
      % żywotności komórek = (KontrolaOD570 - LeczenieOD570)/ KontrolaOD570 x 100
  2. Wstępne leczenie Thapsigargin i analiza progresji zakażenia HIV-1 za pomocą testu p24 ELISA.
    1. Umieścić 1 milion komórek CEM-GFP na 12-dołkowej płytce zawierającej 1 ml kompletnego RPMI 1640 i poddać komórki działaniu 100 nM Thapsigargin lub 1 μL DMSO (kontrola nośnika) przez 12 godzin w inkubatorze CO2 utrzymywanym w temperaturze 37 °C. Po 12 godzinach umyj komórki kompletnym RPMI 1640 i zainfekuj 0,5 MOI HIV-1, jak opisano wcześniej.
    2. Zbierz komórki w różnych punktach czasowych, takich jak 24 godziny, 48 godzin i 72 godziny po zakażeniu, w celu immunoblottingu.
    3. Zebrać supernatanty z każdej próbki i przeprowadzić test ELISA p24 zgodnie z wcześniejszym opisem.
    4. Wykreślić wykres ze stężeniem p24 w próbce jako osią Y i odpowiednimi punktami czasowymi jako osią X.
    5. Korzystając z immunoblottingu, przeanalizuj indukcję stresu ER spowodowaną leczeniem Thapsigarginem, mierząc poziom dowolnych markerów UPR. W badaniu tym wykorzystano HSPA5 jako marker.

7. Test zakaźności β-gal TZM-bl w celu określenia wpływu UPR na zakaźność wirionu

UWAGA: Aby zrozumieć rolę UPR w zakaźności wirionu, supernatant z knockdownu, jak również leczenie Thapsigarginem, może być użyty do testu zakaźności TZM-bl β-gal, jak opisano w sekcji 1.2, w oparciu o stężenie p24 określone przez p24 ELISA.

  1. Zainfekuj komórki TZM-bl równym stężeniem p24 z każdej próbki i wykonaj barwienie β-gal. Policz niebieskie zainfekowane komórki pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu dla 5 losowych pól.
  2. Proszę uśrednić liczbę 5 pól dla każdej próbki z powyższych kroków.
  3. Oblicz zmianę zagięcia, jak wspomniano poniżej:
    Zmiana krotności = Średnia liczba niebieskich komórek w próbkach testowych/Średnia liczba niebieskich komórek w próbie kontrolnej.

Wyniki

W niniejszej pracy opisaliśmy szczegółowy protokół badania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) in vitro oraz aktywacji odpowiedzi białkowej nieprawidłowo sfałdowanych białek (UPR) po zakażeniu limfocytów T wirusem HIV-1 (Rycina 2). Niniejsze badanie opisuje również metody analizy funkcjonalnego znaczenia UPR w replikacji HIV-1 oraz zakaźności wirionów (Rycina 3).

W tym celu przeanalizowano stres retikulum endoplazmatycznego (ER) wywołany zakażeniem HIV-1 poprzez obserwację agregatów białkowych wewnątrz komórek przy użyciu barwienia tioflawiną T. Jak pokazano na Rysunku 4A, intensywność ThT reprezentuje agregaty białkowe w komórkach niezakażonych i zakażonych. Podobnie, jako kontrolę pozytywną, Rysunek 4B przedstawia barwienie ThT w komórkach traktowanych tapsygarginą. Zwiększona intensywność ThT sugeruje obecność większej liczby agregatów białkowych, co koreluje ze zwiększonym stresem ER.

Ponadto, aby potwierdzić tę obserwację, zastosowano bardziej konwencjonalną metodę, polegającą na analizie markerów UPR. Aktywację UPR analizowano początkowo poprzez badanie aktywacji głównych efektorów – IRE1, ATF6 i PERK. Aktywację IRE1 mierzono poprzez analizę poziomów phospho-IRE1 za pomocą immunoblottingu lizatów komórek niezakażonych i zakażonych, pobranych w różnych punktach czasowych po infekcji, co przedstawiono na Rysunku 5A. Wzrost stosunku pIRE1/całkowite IRE1 sugeruje aktywację IRE1. Podobnie aktywację PERK mierzono poziomami phospho-PERK w komórkach niezakażonych i zakażonych (Rysunek 5B). Aktywację ATF6 ilościowo określono na podstawie poziomu ekspresji formy ATF6 P50 za pomocą immunoblottingu (Rysunek 5C). Innym ważnym markerem UPR jest główny regulator i chaperon ER, HSPA5. Poziom HSPA5 analizowano również metodą immunoblottingu, jak pokazano na Rysunku 5D. Analogiczny protokół zastosowano dla innych markerów UPR, takich jak sXBP1, peIF2α, ATF4, CHOP i GADD34, wykorzystując przeciwciała specyficzne dla tych białek (Rysunek uzupełniający 1). Splicing mRNA XBP1 można analizować zarówno za pomocą ilościowego RT-PCR (Rys. 5E), jak i półilościowego RT-PCR. Ponieważ ilościowy RT-PCR nie mógł specyficznie zidentyfikować splicingu, zestawiono go z testem splicingu z wykorzystaniem półilościowego RT-PCR (Rysunek 5F). Stosując powyższy protokół, zaobserwowaliśmy, że dane z qRT-PCR są zgodne z danymi z semi-qRT-PCR. Podobnie jak w przypadku qRT-PCR wykonanego dla sXBP1, protokół ten wykorzystano do analizy innych markerów UPR, takich jak HSPA5, ATF4, CHOP i GADD34 na poziomie mRNA (Rysunek uzupełniający 2)

Następnie, aby zbadać rolę UPR w replikacji HIV-1 i zakaźności wirionów, przeprowadziliśmy wyciszenie (knockdown) wybranych markerów UPR: PERK oraz HSPA5. Stosując wspomniane protokoły, osiągnęliśmy znaczący poziom wyciszenia tych markerów zarówno w komórkach HEK-293T (Rycina 6A), jak i w komórkach J6 (Rycina 6B). Wykorzystując te komórki z wyciszonymi genami, zbadaliśmy wpływ wyciszenia na aktywność genu sterowanego przez LTR HIV-1 (Rycina 6A), przedstawioną jako stosunek ekspresji Luc/GFP w odpowiednich próbkach. Produkcję wirusa zmierzono za pomocą testu ELISA p24 w naddatku, co przedstawiono na Rycynie 6B. Zakaźność produkowanych wirionów można również przeanalizować za pomocą protokołu barwienia β-gal w ten sam sposób, jak pokazano na Rycynie 1A.

Ponadto, wykorzystując chemiczny induktor stresu ER, tapsygargin, można zbadać wpływ nadmiernej stymulacji UPR na replikację HIV-1, produkcję wirusa oraz zakaźność wirionów. Cytotoksyczność tapsygarginy przy zastosowanym stężeniu przeanalizowano za pomocą testu MTT (Rycina 7A), który wykazał, że cytotoksyczność przy pożądanym stężeniu jest nieistotna. W celu analizy wpływu leku na stres ER wykonano immunoblotting dla HSPA5 (Rycina 7B). Wyniki wskazują, że 12-godzinna inkubacja wstępna z 100 nM tapsygarginy indukowala ekspresję HSPA5 we wszystkich punktach czasowych. Test p24 ELISA pokazuje wpływ na produkcję wirusa oraz zakaźność wytworzonych wirionów, co można przeanalizować zgodnie z wcześniejszym opisem.

Analiza infekcji komórek; mikroskopia i wykres słupkowy przedstawiający poziomy p24 w czasie w badaniu nad infekcją wirusową.
Rycina 1: Ilościowe oznaczenie zakaźności wirionów i analiza postępu infekcji. (A) Ilościowe oznaczenie zakaźności wirionów za pomocą testu β-gal na komórkach TZM-bl. Zakaźność wirusa określono poprzez dodanie 1 ng, 0.1 ng i 0.01 ng wirusa do komórek TZM-bl, a następnie wykonanie barwienia β-gal i przeliczenie liczby niebieskich komórek. Powiększenie: 10x. (B) Analiza postępu infekcji w komórkach CEM-GFP zainfekowanych HIV-1 z MOI 0.5, oparta na testie ELISA z wychwytywaniem antygenu p24 z supernatantów hodowli. Komórki CEM-GFP zainfekowano HIV-1 z MOI 0.5, a supernatanty poddano analizie p24 ELISA. Słupki błędów przedstawiono jako wartości średnia ± S.E. Gwiazdki oznaczają poziom istotności, określony na rycinach jako ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 oraz ****=p ≤ 0.0001, analizowane za pomocą testu t Studenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu ilościowego oznaczania wirusa; test ELISA p24, komórki CEM-GFP, profilowanie markerów UPR.
Rycina 2: Schematyczne przedstawienie kroków niezbędnych do analizy wpływu infekcji HIV-1 na stres ER oraz UPR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyciszanie markerów UPR, proces infekcji HIV-1; konstrukty shRNA, lucyferaza, schemat testu ELISA p24.
Rysunek 3: Schemat blokowy etapów analizy wpływu UPR na replikację HIV-1, produkcję wirusa oraz zakaźność wirionów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazowanie komórkowe w kontraście fazowym, z użyciem GFP i tioflawiny T; wykres intensywności fluorescencji; mikroskopia.
Rysunek 4: Analiza poziomu stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) w limfocytach T wywołanego zakażeniem HIV-1 z wykorzystaniem barwienia ThT. (A) Komórki CEM-GFP zainfekowano HIV-1 z MOI 0.5 i zebrano 72 h po zakażeniu. Komórki utrwalono i zabarwiono tioflawiną T. Ekspresja GFP wskazuje zainfekowane komórki CEM-GFP. Wykres przedstawia intensywność tioflawiny T w przypadku komórek niezinfekowanych i zainfekowanych HIV-1. Na wykresie przedstawiono dane z około 50 komórek z n = 3 powtórzeń biologicznych. (B) Komórki CEM-GFP traktowano DMSO oraz TG przez 12 h. Komórki utrwalono i zabarwiono tioflawiną T. Wykres przedstawia intensywność tioflawiny T w przypadku komórek traktowanych DMSO i TG. Na wykresie przedstawiono dane z około 50 komórek z n = 3 powtórzeń biologicznych. Słupki błędów przedstawiono jako wartości średnia ± S.E. Gwiazdki oznaczają poziom istotności, który na rysunkach wskazano jako ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 oraz **** = p ≤ 0.0001, przeanalizowane za pomocą testu t Studenta. UN: niezinfekowane; IN: zainfekowane; TG: tapsigargin. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza Western blot wykazująca ekspresję białek po infekcji; obejmuje wykresy i elektroforezę w żelu.
Rycina 5: Analiza ekspresji różnych markerów UPR w limfocytach T zainfekowanych HIV-1. (A-E) Komórki CEM-GFP zainfekowane HIV-1 (0,5 MOI) zbierano co 24 h aż do 4. dnia i poddawano różnym analizom opisanym poniżej. (A) Aktywację IRE1 analizowano poprzez immunoblotting pIRE1. (B) Aktywację PERK analizowano poprzez immunoblotting pPERK. (C) Aktywację ATF6 analizowano poprzez immunoblotting formy ATF6 P50. (D) Ekspresję chaperonu ER HSPA5 analizowano poprzez immunoblotting HSPA5. (E) Splicing XBP1 analizowano za pomocą qRT-PCR sXBP1 z użyciem specyficznych starterów do PCR w czasie rzeczywistym. (F) W celu analizy splicingu XBP1 metodą semi-qRT-PCR, mRNA XBP-1 amplifikowano za pomocą RT-PCR w obrębie miejsca splicingu, a następnie wizualizowano prążki. Słupki błędów przedstawiono jako średnia ± S.E. UN: niezinfekowane. IN: zainfekowane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza Western blot i wykresy słupkowe pokazujące wpływ ekspresji PERK i HSPA5 na markery infekcji HIV-1.
Rycina 6: Analiza roli UPR w replikacji HIV-1 i produkcji wirusa. (A) Wyciszono PERK (panel lewy) i HSPA5 (panel prawy) w komórkach HEK-293T, a następnie przeprowadzono test lucyferazowy w celu analizy aktywności genu sterowanego przez LTR HIV-1. Immunobloty przedstawiają stopień wyciszenia odpowiednich białek. (B) Wyciszono PERK (panel lewy) i HSPA5 (panel prawy) w komórkach J6, a następnie przeprowadzono test ELISA p24 w zebranym supernatancie w celu analizy produkcji wirusa. Immunobloty przedstawiają stopień wyciszenia odpowiednich białek. Słupki błędów przedstawiono jako wartości średnia ± S.E. Gwiazdki wskazują poziom istotności, określony na rycinach jako ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 oraz **** = p ≤ 0.0001, analizowane testem t Studenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza żywotności komórek i ekspresji białek; wykresy słupkowe i Western blot dla badania infekcji HIV-1.
Rysunek 7: Analiza wpływu chemicznego induktora stresu ER, tapsygargyny, na progresję infekcji HIV-1. (A) Żywotność komórek CEM-GFP po traktowaniu 100 nM tapsygargyny. Żywotność komórek analizowano za pomocą testu MTT. (B) Komórki CEM-GFP poddane wstępnej inkubacji z 100 nM TG przez 12 h zainfekowano HIV-1 z MOI 0.5 i zebrano w punktach czasowych 24 h, 48 h oraz 72 h po infekcji. Immunoblot obrazuje wpływ TG na ekspresję HSPA5, natomiast wykres przedstawia produkcję wirusa analizowaną za pomocą testu ELISA p24. Słupki błędów przedstawiono jako wartości średnia ± S.E. Gwiazdki oznaczają poziom istotności, który w figurach określono jako ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 oraz ****= p ≤ 0.0001 w analizie za pomocą testu t Studenta. TG: tapsygargyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Analiza ekspresji różnych markerów efektorowych UPR. Ekspresja (A) sXBP1, (B) fosforylacja eIF2α, (C) ATF4, (D) CHOP oraz (E) GADD34 analizowana za pomocą immunoblottingu. (A-E) Komórki CEM-GFP zainfekowane HIV-1 z MOI 0.5 zostały zebrane po 24 h, 48 h, 72 h i 96 h od infekcji i wykorzystane do immunoblottingu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Analiza różnych markerów UPR na poziomie mRNA metodą qRT-PCR. (A-D) Komórki CEM-GFP zainfekowane HIV-1 z MOI 0,5 były zbierane co 24 h aż do 4. dnia i wykorzystane do qRT-PCR dla (A) HSPA5, (B) ATF4, (C) CHOP oraz (D) GADD34. Słupki błędów przedstawiają wartości średnia ± S.E. Gwiazdki oznaczają poziom istotności, który w figurach wskazano jako ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 oraz **** = p ≤ 0,0001 w analizie przeprowadzonej testem t Studenta. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

KonstruktSekwencja startera 5’ do 3’
XBP1 SPLICING ASSAY FTTACGAGAGAAAACTCATGGCC
XBP1 SPLICING ASSAY RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
SPLICED XBP1 FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
SPLICED XBP1 RATCCATGGGGAGATGTTCTGG
HSPA5 FCACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RTGATTGTCTTTTGTCAGGGGT
ATF4 FAGTCCCTCCAACAACAGCAA
ATF4 RGAAGGTCATCTGGCATGGTT
CHOP FCAGTGTCCCGAAGGAGAAAG
CHOP RCAGAGCTGGAACCTGAGGAG
GADD34 FATGGACAGTGACCTTCTCGG
GADD34 RCTGGGCTCCTCCTAGGCT
ACTIN FAGAAAATCTGGCACCACACC
ACTIN RGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

Tabela 2: Lista starterów użytych do analizy RT-PCR. F: Forward (przedni); R: Reverse (odwrotny)

Konstrukt shRNASekwencja startera 5’ do 3’
PERK SH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG
PERK SH1 RAATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCG
PERK SH2 FCCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG
PERK SH2 RAATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC
ATF6 SH1 FCCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGGTTTTTG
ATF6 SH1 RAATTCAAAAACCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG
ATF6 SH2 FCCGGCCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGGTTTTTG
ATF6 SH2 RAATTCAAAAACCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGG
IRE1 SH1 FCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGGTTTTTG
IRE1 SH1 RAATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGG
IRE1 SH2 FCCGGCCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGGTTTTTG
IRE1 SH2 RAATTCAAAAACCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGG
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCTTTTTG
HSPA5 SH1 RAATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG
HSPA5 SH2 RAATTCAAAAAGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC
LacZ FCCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG
LacZ RAATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGA

Tabela 3: Lista starterów użytych do generowania konstruktów shRNA. F: Forward (przedni); R: Reverse (odwrotny)

Dyskusja

Zakres niniejszego protokołu obejmuje (i) postępowanie z zapasami wirusa HIV-1 oraz pomiar stężenia wirusa i zakaźności wirionu, (ii) zakażenie limfocytów T wirusem HIV-1 i ocenę jego wpływu na stres ER i różne markery UPR, (iii) wpływ knockdown markerów UPR i ich wpływ na aktywność genu HIV-1 LTR, produkcja wirusa i zakaźność wirionu oraz (iv) nadmierna stymulacja UPR za pomocą cząsteczki farmakologicznej i analiza jej wpływu na replikację HIV-1. Korzystając z obecnego zestawu protokołów, można uzyskać wyczerpujące informacje na temat wzajemnych zależności między HIV-1 a UPR. Protokoły wymienione w tym badaniu są łatwe do wykonania, opłacalne i wysoce niezawodne.

Ponieważ UPR jest szlakiem sygnałowym wrażliwym na stres, praca nad nim obejmuje dość delikatne kroki. We wszystkich eksperymentach zalecamy unikanie długo pasażowanych komórek, aby uzyskać spójność wyników. Ważne jest również utrzymanie sterylnych warunków we wszystkich technikach hodowli komórkowych, aby uniknąć skażenia bakteryjnego i drożdżowego, ponieważ mogą one utrudnić eksperymenty i odpowiednie wyniki. Co więcej, podczas obchodzenia się z komórkami podczas eksperymentów, w tym ich późniejszej hodowli, należy unikać ostrych lub długotrwałych zmian temperatury i upewnić się, że komórki są zdrowe i nie są zestresowane. W przeciwnym razie zmiany mogą spowodować dodatkowe obciążenie komórek, co może zmienić wyniki. Staraj się, aby punkty czasowe były tak stałe, jak to możliwe, ponieważ UPR jest czułą ścieżką sygnałową, a niewielka zmiana punktów czasowych może zmienić wyniki.

Metoda barwienia ThT, która wykrywa agregaty białkowe i jest stosowana do określania stresu ER22, bardzo wyraźnie pokazuje poziom stresu ER w komórkach zakażonych wirusem HIV-1. Barwienie ThT opiera się na wykrywaniu agregatów białkowych, które są skorelowane ze stresem ER. Należy jednak zauważyć, że aktywacja UPR nie zawsze może być skorelowana z agregatami białkowymi, ponieważ poszczególne szlaki sygnałowe UPR mogą być aktywowane bezpośrednio, bez udziału agregatów białkowych. Tak więc, mimo że ta metoda barwienia ThT daje wyobrażenie o poziomach stresu ER, w celu dogłębnej analizy aktywacji UPR zawsze należy ją zweryfikować z dalszą analizą markerów UPR. Ponadto, aby dokładniej określić subkomórkową lokalizację barwienia ThT, można użyć markerów, takich jak KDEL w przypadku oznaczania ER. Co więcej, w wielu przypadkach stres ER powoduje zmianę wielkości i kształtu komórki, więc można również wziąć pod uwagę obszar komórek podczas ilościowego określania intensywności ThT. Dostępność wysoce czułych, niezawodnych i opłacalnych komercyjnych przeciwciał specyficznych dla genów zrewolucjonizowała wiele aspektów nauk przyrodniczych, umożliwiając łatwiejszą analizę poziomów białek w komórkach. Ponadto obecnie dostępne są bardzo czułe rodzaje sprzętu do wizualizacji prążków białkowych na blotach i sprawiające, że kwantyfikacja jest szybka i łatwiejsza. W ten sposób aktywacja markerów UPR może być łatwo analizowana za pomocą immunoblottingu. Ponieważ jednak ekspresja białek markerowych UPR jest stosunkowo niska, do analizy ich ekspresji należy użyć znacznego stężenia białka. Co więcej, rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych powinno być odpowiednio zoptymalizowane w oparciu o ekspresję białka w użytych komórkach, aby uniknąć niespecyficznego wiązania i szumu tła w plamach. Ponadto, jak pokazano na rysunku 4C, przeciwciało ATF6 jest poliklonalne i daje szereg niespecyficznych prążków. Konieczna jest właściwa optymalizacja płukania i stężenia przeciwciał, aby do pewnego stopnia zredukować te niespecyficzne prążki. Skrzepy należy odpowiednio umyć po inkubacji w roztworze blokującym, przeciwciałie pierwszorzędowym i przeciwciałie drugorzędowym w celu zmniejszenia tła i prążków niespecyficznych. Podczas tworzenia plam należy unikać przesycenia prążków, aby uzyskać właściwą wizualizację wzoru w uzyskanych wynikach. Patrząc na szeroki zakres tego artykułu dotyczącego metody, nie skupiliśmy się na szczegółowych metodach i rozwiązywaniu problemów dla ogólnych technik immunoblottingu; jednak można zapoznać się z artykułami metodycznymi Mahmooda i Yanga33 , a także Ghosha i wsp.34 w tym samym celu. Ponieważ obecnie RT-PCR jest bardzo powszechnie stosowaną metodą, łatwo dostępne startery i maszyny RT-PCR dostarczają danych do analizy niektórych markerów UPR. Należy jednak zachować środki ostrożności podczas przygotowywania RNA i cDNA do RT-PCR, ponieważ jest to bardzo czuła metoda, a niewielkie różnice w jakości próbek i pipetowania mogą prowadzić do ogromnych różnic w odczycie. Wszelkie zanieczyszczenia DNA lub białkami należy usunąć z próbek RNA. Ponadto próbki należy zawsze pobierać w trzech egzemplarzach do qRT-PCR, aby zmniejszyć błąd pipetowania. Stężenie DNA używanego do qRT-PCR powinno być zoptymalizowane w taki sposób, aby wartość CT dla każdej próbki była niższa niż 30, ponieważ wszystko powyżej 30 nie jest uważane za idealne. W przypadku qRT-PCR należy zawsze zachować kontrolę ujemną, aby uniknąć fałszywie dodatniego odczytu. Splicing XBP1 można analizować zarówno za pomocą qRT-PCR, jak i semi-qRT-PCR. Ponieważ qRT-PCR nie pokazuje dokładnie splicingu, semi-qRT-PCR powinien być zawsze wykonywany oddzielnie od qRT-PCR w celu walidacji danych i określenia względnego stosunku XBP1 spliced do nonspliced. Ponieważ różnica między rozmiarem sklejonego i niesplecionego XBP1 wynosi zaledwie 26 nt, do rozwiązania żelu należy użyć większego procentu żelu agarozowego. Ponadto pasma powinny być rozdzielone przy niskim napięciu i dłuższym czasie trwania, aby zapewnić lepszą separację. Inną metodą, która jest obecnie bardziej popularna do obserwacji splicingu XBP1, jest test splicingu, który wykorzystuje trawienie enzymu restrykcyjnego Pst1 w cDNA i zapewnia lepszą wizualizację splicingu XBP135. Metoda ta może być również stosowana w celu wizualizacji splicingu XBP1 w próbkach zakażonych wirusem HIV-1. Wyniki uzyskane z immunoblottingu i RT-PCR można wykorzystać do walidacji wyników barwienia ThT.

Reprezentatywne wyniki pokazane na rycinie 5 sugerują, że aktywacja UPR po zakażeniu HIV-1 koreluje ze zwiększonym barwieniem ThT pokazanym na rysunku 4. Jednak ograniczenia stosowania immunoblottingu i RT-PCR do analizy UPR polegają na tym, że są one rygorystyczne i należy monitorować wiele produktów genowych, ponieważ poszczególne geny UPR mogą być modyfikowane niezależnie przez czynniki stresowe inne niż ER. Ponadto metody te pośrednio mierzą stres ER, patrząc na różne markery UPR. Dlatego barwienie ThT i analiza markerów UPR za pomocą immunoblottingu i RT-PCR mogą być stosowane razem do analizy wpływu zakażenia HIV-1 na stres ER i aktywację UPR w limfocytach T.

Druga część tego artykułu dotyczy protokołów związanych ze zrozumieniem wpływu UPR na replikację HIV-1. Stwierdzono, że metoda odwrotnej transfekcji zastosowana do knockdown markerów UPR opisana w tym artykule powoduje znaczne zmniejszenie ekspresji markerów UPR. Jak wspomniano w protokole, fluorescencja GFP została użyta do normalizacji odczytu lucyferazy do testu lucyferazy. Jednak w wielu przypadkach odczyt GFP może być również zakłócony ze względu na specyficzną transfekcję genu36, więc w takim przypadku można użyć innych markerów fluorescencyjnych, takich jak RFP, YFP lub całkowite stężenie białka, aby znormalizować odczyt lucyferazy. Ponadto w niektórych przypadkach, gdy komórki są trudne do lizy, takich jak komórki TZM-bl, przed dodaniem substratu lucyferazy można dodać dodatkowy odczynnik do lizy. Jak przedstawiono w wynikach, wyniki lucyferazy (lewy panel 6A) są zgodne z wynikami testu ELISA p24 w przypadku PERK (Figura 6B Lewy panel), gdzie knockdown PERK znacznie zmniejsza aktywność genu HIV-1 i produkcję wirusa. Natomiast w przypadku HSPA5 knockdown HSPA5 nie wpływa na aktywność genu sterowaną przez LTR (Figura 6A prawy panel), zgodnie z wynikami testu lucyferazy, podczas gdy wpływa na produkcję wirusa zgodnie z testem ELISA p24 (Figura 6B Prawy panel). W ten sposób wyniki te sugerują, że różne markery UPR mogą mieć różny wpływ na aktywność genu LTR napędzanego przez HIV-1 i produkcję wirusa. Antygen p24 mierzony w supernatancie metodą ELISA wskazuje przede wszystkim na stężenie cząstek wirusa uwolnionych w supernatancie hodowli. W związku z tym rutynowo naukowcy wykorzystywali wyniki ELISA wychwytywania antygenu p24 jako pośrednie wskazanie produkcji wirusa w supernatancie komórki37. W związku z tym test lucyferazy w komórkach i test p24 ELISA supernatantu mogą być używane razem w celu określenia wpływu na aktywność genu HIV-1 LTR i produkcję wirusa. Protokół ten może być również wykorzystany do analizy wpływu innych markerów UPR na aktywność genów HIV-1 LTR i produkcję wirusa przy użyciu specyficznych dla genu shRNA. W przypadku wszystkich tych eksperymentów obejmujących odczyty testu p24 ELISA i lucyferazy ważne jest, aby upewnić się, że utrzymane są odpowiednie rozcieńczenia i czas inkubacji, a wartości należące do kategorii wartości odstających nie powinny być brane pod uwagę. Na przykład podczas wykonywania testu ELISA p24 wartość OD450 z zakresu 0,1-2 jest uważana za idealną. Drugim podejściem do zbadania roli UPR w replikacji HIV-1 jest zastosowanie cząsteczek farmakologicznych, takich jak Thapsigargin, induktor stresu ER lub TUDCA, inhibitor stresu ER. Leki te są bardzo często stosowane do badania UPR w różnych kontekstach 38,39,40,41. W tym artykule przedstawiliśmy protokół leczenia Thapsigargin i przeanalizowaliśmy jego wpływ na postęp zakażenia HIV-1 w limfocytach T. Przed użyciem leku w jakimkolwiek eksperymencie zdecydowanie zaleca się przetestowanie żywotności komórek dla zakresu dawek leku w linii komórkowej, która ma być użyta. Należy unikać stężenia, które daje mniej niż ~80% żywotności komórek w danej linii komórkowej. Ponadto do testów żywotności komórek należy zawsze pobierać zdrowe komórki, ponieważ komórki, które są już zestresowane, nie pokażą prawidłowego odczytu, a resztki komórek mogą powodować zmętnienie i dawać fałszywe odczyty. Protokół wspomniany w tym badaniu pokazuje wpływ Thapsigargin na replikację wirusa w ciągu 72 godzin po zakażeniu, co zapewnia lepsze zrozumienie wpływu leku na replikację wirusa w czasie. Można również stosować krótsze odstępy czasu, takie jak 12 godzin, 24 godziny, 36 godzin, 48 godzin, 60 godzin i 72 godziny po zakażeniu, aby dokładniej przeanalizować najwcześniejszy punkt czasowy, w którym lek zaczyna wykazywać swój wpływ na replikację wirusa.

Ponieważ UPR jest również zaangażowany w degradację białek i dynamikę błony42,43, możliwe jest, że UPR może odgrywać rolę w zakaźności wirionów. Zakaźność wirionów wytwarzanych przez komórki może być również analizowana przy użyciu podanego protokołu. Wyżej wymienione protokoły można również wykorzystać do określenia wpływu zakażenia HIV-1 na stres ER i UPR oraz jego funkcjonalnego znaczenia w ludzkich PBMC dla bardziej istotnych biologicznie badań. Zrozumienie funkcji ER-UPR w zakażeniu HIV-1 jest niezbędne ze względu na rosnącą świadomość jego udziału w rozwoju wielu poważnych chorób. Informacje uzyskane przy użyciu tego zestawu metod wzbogacą tę niezbadaną dziedzinę, oferując ważne zrozumienie interakcji między HIV-1 a UPR.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Narodowemu Centrum Nauki o Komórkach, Departamentowi Biotechnologii, Rządowi Indii, za wsparcie wewnętrzne. AT i AD są wdzięczne za wsparcie badań doktoranckich otrzymane od National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of India. DM jest wdzięczny za stypendium JC Bose National Fellowship od SERB, rządu Indii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AkrylamidBiorad, Stany Zjednoczone1610107
AgarozaG-Biosciences, Stany ZjednoczoneRC1013
Nadsiarczan amonuSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneA3678
przeciwciało anty-ATF4Technologia sygnalizacji komórkowej, USA11815Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000
przeciwciało anty-ATF6Abcam, Wielka Brytaniaab122897Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000
przeciwciało anty-CHOPTechnologia sygnalizacji komórkowej, USA2897Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000
przeciwciało anty-eIF2 i alfaSanta Cruz Biotechnology, USAsc-11386Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:2000 
przeciwciało anty-GADD34Abcam, Wielka Brytaniaab236516Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000
przeciwciało anty-GAPDHSanta Cruz Biotechnology, USAsc-32233Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:3000 
anty-HSPA5Technologia sygnalizacji komórkowej, USA3177Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000
przeciwciało anty-IRE1Technologia sygnalizacji komórkowej, USA3294Detekcja Western blot Rozcieńczenie-1:2000
Przeciwciało koniugatywne anty-mysie HRP Biorad, Stany Zjednoczone1706516Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie- 1:4000
przeciwciało anty-peIF2&alfaInvitrogen, USA44-728GWykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000
przeciwciało anty-PERKTechnologia sygnalizacji komórkowej, USA5683Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:2000
przeciwciało anty-pIRE1Abcam, Wielka Brytaniaab243665Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000
przeciwciało anty-pPERKInvitrogen, USAPA5-40294Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:2000
Przeciwciało koniugowane przeciw królikowi HRPBiorad, USA1706515Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie- 1:4000
przeciwciało anty-XBP1Abcam, Wielka Brytaniaab37152Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000
Wirówka stołowa szybkoobrotowaEppendorf, USA5804RWirnik- F-45-30-11
Wolnoobrotowa wirówka stołowaEppendorf, USA5702RRotor-A-4-38
Bis-AkrylamidBiorad, USA1610201
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)MP biomedicals, USA160069
Odczynnik BradfordBiorad, USA5000006
Zestaw do transfekcji ssaków CalPhosClontech, Takara Bio, USA631312Zapas wirusa przygotowanie
CEM-GFPNIH, Repozytorium AIDS, USA3655
Klarowność Podłoże ECLBiorad, USA1705061substrat do wykrywania chemiluminescencji
Clarity max PodłożeECL Biorad, USA1705062substrat do wykrywania chemiluminescencji
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyOlympus, JaponiaModel: FV3000
Wirówka cytospinowaThermo Fisher Scientific, StanyZjednoczone ASHA78300003
DMEMInvitrogen, Stany Zjednoczone11995073
DMSOSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneD2650
dNTPsPromega, Stany ZjednoczoneU1515
DTTInvitrogen, Stany ZjednoczoneR0861
EDTAInvitrogen, StanyZjednoczone 12635
EtBrInvitrogen,USA'15585011
Płodowa surowica bydlęcaInvitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
Aldehyd glutarowy 25%Sigma-Aldrich, USAG6257Test zakaźności
GlycineThermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, Indie
Zakaźny klon molekularny HIV-1 pNL4-3NIH, repozytorium AIDS, USA114
Mikroskop odwróconyNikon, JaponiaModel: Eclipse Ti2
iTaq Uniwersalny SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, Indie
Chlorek magnezuSigma-Aldrich, USAM8266Zakaźność test
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
Odczynnik MTTSigma-Aldrich, USAM5655Test żywotności komórek
N,N-dimetyloformamidFluka Chemika40255Test zakaźności
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, Stany Zjednoczone201154
NP40Invitrogen, Stany Zjednoczone85124
Zestaw ELISA do wychwytywania antygenu P24ABL, Stany Zjednoczone5421
PageRuler wstępnie wybarwiona drabinka białkowaSci-fi Biologicals, IndiePGPMT078
ParaformaldehydSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneP6148
pEGFP-N1Clontech, Stany Zjednoczone632515
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen, Stany Zjednoczone151140122
Inhibitor fosfatazySigma-Aldrich, Stany Zjednoczone4906837001
Phusion Mastermix do PCR o wysokiej wierności z buforem GCNEB, USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Wektor klonowania lentiwirusa
pMD2.GAddgene, USA12259Wektor obwiedni VSV-G
PMSFSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneP7626
Polietylenina (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
Żelazocyjanek potasuSigma-Aldrich, USA244023Test zakaźności
Żelazocyjanek potasuSigma-Aldrich, USAP3289Test zakaźności
Inhibitor proteazySigma-Aldrich, USA 
psPAX2Addgene, Stany Zjednoczone12260Plazmid do pakowania lentiwirusowego
PuromycinSigma-Aldrich, USAP8833Wybór stabilnych komórek
Membrana PVDFBiorad, USA1620177
Startery losoweInvitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, Stany Zjednoczone22400105
SDSSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneL3771
Substrat Steady-GloPromega, Stany ZjednoczoneE2510Test lucyferazy
Ligaza DNA T4Invitrogen, Stany Zjednoczone15224017
TEMED Invitrogen, Stany Zjednoczone17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneT9033
Tioflawina TSigma-Aldrich, Stany Zjednoczone596200
TrisThermo Fisher Scientific, Stany ZjednoczoneQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneT8787
TrizolInvitrogen, Stany Zjednoczone15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneP1379
TZM-blNIH, Repozytorium AIDS, USA8129
UltrawirówkaBeckman Optima L90K, USA330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018Test zakaźności
przeciwciało 5056489001

Bibliografia

  1. Levy, J. A. HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , ASM Press. (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855(1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374(2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Infekcja limfocyt w Tbarwienie tioflawin Tmarkery UPRimmunoblottingRT PCRtest reporterowy lucyferazytest ELISA p24
Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.