Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Streszczenie

Funkcjonalna charakterystyka białek wymaga ich ekspresji i oczyszczania w znacznych ilościach o wysokiej czystości do przeprowadzania testów biochemicznych. System szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) umożliwia separację złożonych mieszanin białkowych w wysokiej rozdzielczości. Dostosowując różne parametry w FPLC, takie jak wybór odpowiedniej matrycy oczyszczania, regulacja temperatury próbki białka oraz zarządzanie natężeniem przepływu próbki do matrycy i szybkością elucji, możliwe jest zapewnienie stabilności i funkcjonalności białka. W tym protokole zademonstrujemy wszechstronność systemu FPLC do oczyszczania białka endonukleazy płatowej 1 (FEN1) znakowanego 6X-His, wytwarzanego w kulturach bakteryjnych. Aby poprawić wydajność oczyszczania białek, skupimy się na wielu kwestiach, w tym na prawidłowym pakowaniu i przygotowaniu kolumny, wstrzykiwaniu próbki za pomocą pętli próbki, natężeniu przepływu próbki do kolumny oraz parametrach elucji próbki. Na koniec chromatogram zostanie przeanalizowany w celu zidentyfikowania frakcji zawierających wysoką wydajność białka oraz rozważań na temat prawidłowego długoterminowego przechowywania białka rekombinowanego. Optymalizacja metod oczyszczania białek ma kluczowe znaczenie dla poprawy precyzji i wiarygodności analizy białek.

Wprowadzenie

Dostępne są liczne strategie dla zrozumienia biologii komórkowej. Jedno z podejść obejmuje strategię odgórną, w której mutacje genetyczne są wprowadzane do genu, a następnie ocena wynikających z nich zmian fenotypowych w organizmie modelowym. I odwrotnie, podejście redukcjonistyczne pociąga za sobą wstępne wyjaśnienie mechanizmów molekularnych i funkcji enzymatycznych danego białka, któremu towarzyszy charakterystyka jego interakcji z innymi składnikami komórkowymi. Następnie ocenia się wpływ tego białka na szlak biologiczny. Chociaż każde podejście badawcze ma swoje nieodłączne zalety i ograniczenia, osiągnięcie kompleksowego zrozumienia szlaku biologicznego wymaga badań interdyscyplinarnych.

Ponieważ DNA jest genetycznym wzorcem życia, zrozumienie mechanizmów duplikacji DNA i utrzymania genomu było przedmiotem aktywnego zainteresowania od ponad siedmiu dekad. Badania w dziedzinie replikacji DNA dostarczyły wielu danych dotyczących poszczególnych struktur i funkcji wielu białek replikacyjnych. Badania te, które obejmują aspekty mechanistyczne i testy aktywności biochemicznej, stały się możliwe dzięki oczyszczeniu tych białek, umożliwiając ich skrupulatne zbadanie w środowisku in vitro. W związku z tym oczyszczanie białek staje się nieodzowną i wszechobecną techniką w większości przedsięwzięć badawczych mających na celu rozwikłanie mechanistycznych spostrzeżeń na temat replikacji DNA.

Ten artykuł przedstawia metodologię izolowania białka replikacji DNA oznaczonego 6X-histydyną, które uległo nadekspresji w komórkach bakteryjnych. Interesującym białkiem jest ludzka endonukleaza płatowa 1 (FEN1), nukleaza specyficzna dla struktury, która odgrywa kluczową rolę w replikacji opóźnionej nici, a także jest krytycznym uczestnikiem szlaków naprawy DNA, takich jak naprawa przez wycinanie zasady (BER)^1,2,3. Podstawową funkcją FEN1 jest rozszczepienie u podstawy struktury płata z przemieszczeniem 5', produktu pośredniego, który powstaje podczas replikacji DNA lub BER. Początkowo, badania biochemiczne oceniające aktywność enzymatyczną FEN1 sugerowały mechanizm "śledzenia", w którym nukleaza rozpoznawałaby wolny koniec 5'-fosforanu struktury płatowej, a następnie podążałaby wzdłuż klapki do jej podstawy przed jej rozszczepieniem⁴. Późniejsze badania wykazały, że FEN1 działa poprzez mechanizm "nawlekania", w którym najpierw wiąże się z podstawą klapy, a następnie przewleka wolny koniec 5' przez jej aktywne miejsce przed rozszczepieniem (Rysunek 1) ⁵. Zdolność do nadekspresji i izolacji rekombinowanego FEN1 ułatwiła te przełomowe odkrycia, umożliwiając naukowcom zastosowanie jej w badaniach biochemicznych i strukturalnych.

Chromatografia powinowactwa jest powszechnie stosowaną metodą separacji do oczyszczania DNA. Technika ta wykorzystuje odwracalne powinowactwo wiązania białek docelowych do ligandów unieruchomionych na żywicy w celu specyficznego uwięzienia białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jednym z najczęściej stosowanych biopowinowactwa jest silne oddziaływanie między aminokwasem, histydyną i jonami metali, takimi jak nikiel i kobalt, a zatem może być wychwytywane na żywicy naładowanej Ni²⁺ lub Co²⁺.

Sekwencja DNA kodująca ciąg 6-9 reszt histydyny (His) jest często włączana do konstruktu plazmidowego, który koduje interesujące białko (na N-końcu lub C), oznaczając białko znacznikiem 6X-His-tag lub znacznikiem poly-His. Białko znakowane Hisem można następnie łatwo oczyścić za pomocą immobilizowanej chromatografii powinowactwa do metalu (IMAC), podtypu chromatografii powinowactwa, w której jony metali na żywicy wychwytują białka ze znacznikiem powinowactwa, które można później eluować za pomocą odpowiednich środków elucyjnych. Jony metali przejściowych, takie jak Ni²⁺ i Co²⁺, mogą być unieruchomione na matrycach agarozy lub żelu krzemionkowego pochodzących z grup N,N,N'-tris-(karboksymetylo)-etylenodiaminy lub kwasu nitrylotrioctowego (NTA)⁶.

Ligandy metali są znane z tego, że są odporne na degradację przez czynniki fizyczne, chemiczne i biologiczne i mają tę przewagę nad innymi typami ligandów^6,7. Dodatkowo, znacznik His-tag jest stosunkowo mały i nie wpływa znacząco na strukturę ani funkcję białka⁷. Jednak w bakteryjnym systemie ekspresji wiele białek ulegających ekspresji chromosomalnej ma powinowactwo do jonów metali i może współoczyszczać się z białkiem docelowym. Nikiel i kobalt to typowe jony metali stosowane w matrycach IMAC. Żywica Ni-NTA i żywica na bazie kobaltu TALON są powszechnie stosowane do oczyszczania białek znakowanych przez Hisa.

Ni-NTA kontra TALON
Odpowiednie jony metali zarówno Ni-NTA, jak i TALON są unieruchamiane na żywicy za pomocą ligandów NTA. Uważa się, że Ni-NTA ma wyższą zdolność wiązania, wiążąc do 100 mg / ml białka. Może to skutkować wyższą wydajnością białka, z zastrzeżeniem, że białka zanieczyszczające mogą być jednocześnie oczyszczane. W przeciwieństwie do tego, żywica ma wyższą specyficzność wiązania w stosunku do białek znakowanych His i może być w stanie wytwarzać frakcje o wyższej czystości. W tym badaniu zamierzamy porównać skuteczność oczyszczania obu żywic przy użyciu referencyjnego zautomatyzowanego systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek, systemu NGC (patrz tabela materiałów).

i kompatybilność
są wymagane podczas oczyszczania białek do lizy komórek, przygotowania próbki, równoważenia żywicy i elucji wychwyconego białka z żywicy. Tris, MOPS i HEPES o stężeniu do 100 mM są znanymi kompatybilnymi dla żywicy Ni-NTA. często zawierają środki redukujące, które zapobiegają utlenianiu białka i agregacji białek. Jednak powyżej limitu progowego środki redukujące mogą pozbawić żywicę jonów metali. Zalecane stężenie środków redukujących, takich jak beta-merkaptoetanol (BME) lub ditiotreitol (DTT) wynosi poniżej 1 mM dla wyżej wymienionych żywic na bazie niklu i kobaltu.

do oczyszczania hFEN1 to Tris zawierające NaCl, BME, fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), EDTA i glicerol. NaCl utrzymuje białko w postaci rozpuszczalnej i zakłóca interakcje molekularne, takie jak wiązanie DNA. BME redukuje utlenione białka, a tym samym zapobiega agregacji białek. PMSF) jest inhibitorem proteazy, który zapobiega degradacji białka docelowego za pośrednictwem proteazy. EDTA eliminuje kationy dwuwartościowe z próbki, uniemożliwiając im dostęp do nukleaz i proteaz. Glicerol zwiększa stabilność białka w postaci wodnej. Dodatkowo bufor do lizy zawiera kompletne tabletki z inhibitorem proteazy, aby zapewnić maksymalną ochronę białka docelowego przed degradacją proteaz podczas lizy komórek. Bufor równowagowy i elucyjny zawiera imidazol, przy czym bufor elucyjny zawiera większe ilości imidazolu do wypierania związanego białka z żywicy podczas elucji.

System chromatografii nowej generacji (NGC)
Ten zautomatyzowany, średniociśnieniowy system chromatograficzny przeznaczony do szybkiej przepływowej chromatografii cieczowej białek (FPLC) wykorzystuje dwie pompy do jednoczesnego pompowania dwóch różnych i jest w stanie wstrzykiwać szeroki zakres objętości próbek od 250 μl do 100 ml. Pętla próbki (znana w tym systemie jako Dynaloop) umożliwia wstrzykiwanie większych objętości próbek. System może być obsługiwany za pomocą oprogramowania Chromlab, które ułatwia tworzenie niestandardowych metod, manipulowanie przebiegami oczyszczania oraz analizę pików UV i frakcji białkowych.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Aby oczyścić rekombinowany FEN1, należy wyrazić konstrukt (pET-FCH-FEN1) w komórkach BL21(DE3), jak wcześniej opisano przez Ononye et al.⁸.
   1. Zaszczepić pożywkę LB (Tabela 1) 1% hodowlą przez noc i hodować komórki w temperaturze 37 °C, aż OD osiągnie 0,6.
   2. Indukować 0,4 M izopropylo-beta-D-tiogalaktozydem (IPTG) i hodować kulturę przez dodatkowe 3 godziny.
   3. Zebrać komórki, odwirowując kulturę w temperaturze 5 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przechowuj granulki w zamrażarce o temperaturze -80°C.
   4. W dniu oczyszczania wyjąć osad komórkowy z zamrażarki o temperaturze -80 °C, pozostawić do rozmrożenia na lodzie i ponownie zawiesić osad w 100 ml buforu do lizy (Tabela 1).
      UWAGA: Lizat komórkowy należy zawsze umieszczać na lodzie podczas przenoszenia, aby zapobiec proteolizie. Po rozmrożeniu cały proces oczyszczania musi zostać zakończony tego samego dnia. Lizatu komórkowego nie należy przechowywać w lodówce przez noc.
2. Przenieść zawiesinę do zlewki o pojemności 250 ml i poddać sonikacji na lodzie przez 30 s ON i 30 s OFF przy amplitudzie 35% przez 15 min.
   UWAGA: Zapoznaj się z ustawieniami producenta, aby określić amplituda.
3. Przenieść sonifikowaną próbkę do probówki wirówkowej i wirować pod ciśnieniem 27 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania klarownego lizatu. Umieścić lizat komórkowy na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C do momentu wstrzyknięcia próbki.

2. Przygotowanie kolumn pokrewieństwa

1. Dopasuj kolumny (jedną dla żywicy Ni-NTA i jedną dla żywicy na bazie kobaltu) do stojaka zaciskowego tak, aby kolumny były trzymane tak prosto, jak to możliwe, unikając pochylenia kolumn. Upewnij się, że spód kolumn jest zatyczony korkiem i dodaj 1-2 ml buforu startowego na dno każdej kolumny, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas pakowania kolumny.
2. Delikatnie potrząśnij butelkami z żywicą, aż żywica zostanie całkowicie zawieszona. Otwórz górną część kolumn i wlewaj 10 ml każdej zawiesiny w sposób ciągły, aby uniknąć wtrącania się pęcherzyków powietrza. Wlej żywicę na metalową szpatułkę lub szklany pręt trzymany na krawędzi kolumny, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w kolumnie.

3. Upakowanie kolumn za pomocą adaptera przepływu

1. Odłącz korek od kolumny i podłącz spód do jednego końca rurki. Podłącz drugi koniec rurki do portu UV systemu FPLC.
2. Upewnij się, że obudowa wspornika łóżka została wciągnięta do korpusu adaptera przepływu i wsuń korpus adaptera przepływu na górę kolumny (Rysunek 2A). Trzymając zatrzask krzywki w pozycji 1, opuść adapter przepływu, uważając, aby nie włożyć go do bufora (Rysunek 2B). Przełącz zatrzask krzywki w pozycję 2 (Rysunek 2B). Podłącz rurkę do systemu i uruchom przepływ bufora rozruchowego na 1-2 minuty, aby usunąć rurkę z powietrza i zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas pakowania.
3. Przełącz zatrzask z powrotem do pozycji 1 i jednym płynnym ruchem opuść adapter przepływu do bufora, unikając wtrącania pęcherzyków powietrza, a następnie przełącz zatrzask z powrotem do pozycji 2. Pozwala to na przedostanie się pewnego bufora do adaptera przepływu i usunięcie wszelkich pozostałych pęcherzyków.
4. Ustaw zatrzask w pozycji 3 i dokręć podstawę krzywki i pierścień blokujący ( Rysunek 2B).
5. Rozpocznij przepływ buforu z prędkością 10 ml/min, aby upakować kolumnę. Kontynuuj ten krok przez 3 minuty lub do momentu, gdy żywica zostanie dobrze zapakowana.

4. Gruntowanie pętli próbki systemu FPLC

1. Podłącz rurkę od góry pętli próbki do pętli E w systemie FPLC (Rysunek 3).
2. Podłącz rurkę od dołu sample pętli do Waste 2 w systemie FPLC.
3. Włóż jeden koniec rurki do portu kolumny systemu FPLC, a drugi koniec umieść w butelce na odpady.
4. Włóż rurkę z pompy A do przefiltrowanej wody podwójnie destylowanej (ddH₂O).
5. Kliknij dwukrotnie ustawienia pompy za pomocą oprogramowania (Rysunek 4A, oznaczony 2) i wybierz pętlę wtrysku pompy systemowej (Rysunek 4C).
6. Kliknij ustawienia natężenia przepływu (Rysunek 4A, oznaczony 1) i zmień natężenie przepływu na 10 ml/min. Wprowadź 0% w polu %B (Rysunek 4B).
7. Uruchom przepływ, aby przepłukać pętlę próbki wodą, co spowoduje popchnięcie uszczelki przesuwnej w dół.
8. Gdy uszczelka przesuwna dotrze do dna pętli próbki, zatrzymaj przepływ. Przełączyć pompę A z ddH₂O na bufor rozruchowy. Podłącz rurkę od góry sample pętli do odpadu 2, a tę od dołu do pętli E. Pozostaw rurkę z portu kolumny w odpływie.
9. Rozpocznij przepływ od 10 ml/min. Gdy uszczelka ślizgowa wypchnięta do góry przez napływający bufor rozruchowy dotrze do górnej części pętli próbki, zatrzymaj przepływ. Pętla próbki jest teraz gotowa do wstrzyknięcia próbki.

5. Wstrzyknięcie próbki

1. Kliknij dwukrotnie ustawienia pompy i wybierz Ręczna pętla obciążenia (Rysunek 4C).
2. Odkręć rurkę od pętli E i umieść ją w pojemniku na odpady.
3. Podłącz rurkę z portu kolumny do rurki na górze adaptera przepływu.
4. Pobrać próbkę za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml, a następnie podłączyć strzykawkę do adaptera portu do wstrzykiwań.
5. Wkręcić strzykawkę w port iniekcji i wstrzyknąć próbkę, upewniając się, że jest ona w widoczny sposób wstrzyknięta do pętli próbki. Przechowywać 100 μl próbki (lizat wejściowy z etykiety) w probówce do mikrowirówki w temperaturze -20 °C do analizy SDS-PAGE
   UWAGA: W zależności od całkowitej objętości próbki mogą być wymagane 2-3 wstrzyknięcia.
6. Zatkać port wtryskowy z nasadką kolumny.
7. Podłącz rurkę od dołu sample pętli z powrotem do portu pętli E.
8. Umieścić rurkę z pompy B w buforze elucyjnym.

6. Tworzenie i analiza metod za pomocą oprogramowania połączonego z systemem FPLC

1. Przejdź do karty Narzędzia główne i wybierz pozycję Nowa metoda.
2. Wybierz kartę Ustawienia metody w lewej kolumnie, przejdź do menu rozwijanego Typ kolumny i wybierz opcję Niestandardowe (Rysunek 5).
3. Wprowadź objętość kolumny (5 ml).
4. Wprowadź wymagane natężenie przepływu dla przebiegu (1 ml/min).
5. Przejdź do opcji Wybór jednostek i wybierz CV (objętości kolumn) jako jednostkę podstawową metody.
6. Upewnij się, że wlot A jest ustawiony na Bufor A, a wlot B jest ustawiony na Bufor B (ustawienie domyślne).
7. Wybierz kartę Konspekt metody w menu po lewej stronie. Dodaj etapy oczyszczania w następującej kolejności: równowaga, aplikacja próbki, płukanie kolumny i elucja.
   1. W obszarze równowagi ustaw objętość równowagi na 10 CV. Upewnij się, że ustawienie bufora jest utrzymywane na poziomie 0% B.
   2. Na karcie przykładowej aplikacji ustaw objętość próbki, obserwując pętlę próbki. Położenie uszczelki przesuwnej wskazuje objętość próbki.
   3. Pod myciem kolumnowym ustaw objętość prania na 5 CV. Wyłącz zbieranie ułamków dla tego kroku; Zbierz płukanie w całości do zlewki podczas biegu, zamiast zbierać jako frakcje.
   4. W przypadku elucji ustaw objętość gradientu na 14 CV, zaczynając od 0% bufora B do 100% buforu B.
8. Zapisz metodę i rozpocznij przebieg.
9. Upewnij się, że kolektor frakcji zaczyna się w pozycji pierwszej frakcji.
10. Wprowadź nazwę uruchomienia i kliknij przycisk Start.
11. W fazie równowagi monitoruj krzywą UV w czasie rzeczywistym. Upewnij się, że wszystkie połączenia są bezpieczne i nie ma wycieków; Potwierdź pełny obwód, szukając bufora wpływającego do pojemnika na odpady. Jeśli krzywa UV nie ustabilizowała się w ostatnich minutach równowagi, wydłuż krok równowagi do momentu osiągnięcia stabilizacji (Rysunek 6) .
12. W momencie pobierania próbki należy przestawić probówki wkładane do pojemnika na odpady do czystej zlewki. Na tym etapie należy zebrać niezwiązane białka wypływające z rurek odpływowych jako przepływowe (oznaczone jako FT).
13. Zwróć uwagę na gwałtowny wzrost krzywej UV, która prawdopodobnie osiągnie maksymalny możliwy odczyt 3,000 maU (Rysunek 6).
    UWAGA: Typowa krzywa utrzymuje się na poziomie 3,000 maU przez większość etapu aplikacji próbki.
14. Podczas płukania kolumny, gdy resztki niezwiązanych białek są wypłukiwane, a na żywicy pozostają tylko związane białka, należy zwrócić uwagę na gwałtowny spadek krzywej UV (Rysunek 6). Jeśli krzywa UV nie spadła do końca etapu prania, przedłuż krok, klikając krok wstrzymania, aż UV wystarczająco spadnie. Na początku tego etapu przenieś rurki odpływowe ze zlewki FT do innej czystej zlewki oznaczonej jako Wash.
15. Po rozpoczęciu etapu elucji upewnij się, że kolektor frakcji przesunął się na miejsce i rozpoczął zbieranie frakcji. Wizualizuj elucję białka, szukając pików na krzywej UV (Rysunek 6).
16. Po zakończeniu uruchamiania przejdź do karty Narzędzia główne i wybierz pozycję Otwórz bieg. Otwórz przebieg, aby wyświetlić chromatogram i wybierz integrację pików w górnym menu, aby zaznaczyć piki uzyskane podczas przebiegu.
17. Wybierz zakładkę Ułamki, aby wyświetlić frakcje zawierające eluowane białko.

7. Analiza strony SDS

1. Zmieszać 15 μl każdej frakcji zawierającej białko z 5 μl buforu ładującego próbkę SDS (tabela 1). Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
2. Załaduj próbki do prefabrykowanych żeli i pracuj pod napięciem 160 V przez 45 minut wraz ze wstępnie wybarwionym markerem białkowym.
3. Zabarwić żele w roztworze barwiącym Coomassie na błękit brylantowy przez 30 minut (Tabela 1).
4. Umyj żel w ddH₂O (powtórzyć 3x).
5. Odbarwić żel w roztworze odbarwiającym przez 1 godzinę (Tabela 1).
6. Obserwować prążki białkowe; wykryć FEN1 na znaku 42 kDa.
7. Frakcje basenowe zawierające FEN1 i zagęścić basen za pomocą filtra odśrodkowego o sile 10 kDa. Porcję i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80°°C.

Wyniki

BL21 (DE3) lizaty komórkowe wyrażające hFEN1 zostały przepuszczone przez zrównoważone żywice Ni-NTA i TALON. Żywica Ni-NTA jest naładowana jonami Ni²⁺ i ma wysoką zdolność wiązania. Wyniki pokazują, że żywica Ni-NTA daje większą ilość FEN1 w porównaniu z żywicą TALON (Rysunek 7). Żywica Ni-NTA jest również znana z niespecyficznego wiązania się z innymi białkami o ekspresji chromosomalnej. Lizat komórkowy przeszedł przez żywicę na bazie kobaltu, został oczyszczony z wysoką czystością, ale niższą wydajnością w porównaniu z Ni-NTA. Podobnie jak wiele innych białek wiążących DNA, FEN1 został następnie przepuszczony przez żywicę wykluczającą rozmiar w celu usunięcia zanieczyszczeń. hFEN1 można zidentyfikować na znaku 43 kDa.

Rysunek 1: Mechanizm łupania klap przez hFEN1: śledzenie kontra gwintowanie. Początkowo sądzono, że FEN1 (przedstawiony na żółto) wiąże się z końcem 5' struktury klapy i przechodzi przez nią do podstawy klapy (po lewej). Późniejsze badania wykazały, że FEN1 najpierw wiąże się z podstawą klapy i przewleka płatek 5' przez jego aktywne miejsce (po prawej). Skrót: hFEN1 = ludzka endonukleaza płatowa 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Adapter przepływu. (A) Elementy adaptera przepływu używane do procesu napełniania kolumn i oczyszczania; (B) trzy pozycje zatrzasku krzywki używane do dokręcania/luzowania pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym i mocowania adaptera na miejscu. Powiększony obraz pokazuje stan O-ringu (luźny/ciasny) w pozycjach 1,2 i 3 od góry do dołu. Zdjęcia zostały zrobione za zgodą ⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Moduł iniekcyjny systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek. Różne porty modułu iniekcyjnego łączą system szybkiej chromatografii cieczowej białek z kolumną, pętlą próbki i odpadami. Zdjęcie zostało zrobione za zgodą ¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Kontrola systemu. (A) Zakładka sterowania systemem, w której można manipulować ustawieniami przepływu i zobaczyć ścieżkę przepływu; (B) okno ustawień natężenia przepływu; (C) okno ustawień pompy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Okno ustawień metody. Okno do wprowadzania szczegółów oczyszczania, takich jak typ kolumny, objętość kolumny, jednostka podstawowa metody i natężenie przepływu dla przebiegu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Schemat krzywej UV podczas FPLC: Krzywa UV wzrasta i opada zgodnie z fazą oczyszczania. Na początku równowagi krzywa UV może zostać zniekształcona z powodu obecności pęcherzyków powietrza lub zanieczyszczeń w rurce. W miarę utrzymywania się równowagi krzywa powinna ustabilizować się jako płaska linia; Podczas wstrzykiwania próbki, gdy białka niezwiązane z żywicą wypływają, krzywa UV wzrasta, aż do osiągnięcia maksymalnego progu. Etap mycia, który wypłukuje resztki niezwiązanych białek, wykazuje stopniowy spadek pomiarów UV. Wreszcie, podczas fazy elucji, gdy białko docelowe jest eluowane, na krzywej UV widoczny jest pik. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Obraz żelu SDS PAGE. Tor 1-Marker masy cząsteczkowej; Pas 2-1% wejście Ni-NTA (lizat komórkowy); Pas przepływu 3-1% z żywicy Ni-NTA; Tor 4-hFEN1 oczyszczony z żywicy Ni-NTA; Pas 5-1% Wejście (lizat komórkowy); Pas przepływu 6-1% z żywicy na bazie kobaltu; Lane 7-hFEN1 oczyszczony z żywicy na bazie kobaltu; strzałka reprezentuje FEN1 przy 42,5 kDa. Skróty: SDS-PAGE = dodecylosiarczan sodu; MW = masa cząsteczkowa; hFEN1 = ludzka endonukleaza płatowa 1; NTA = kwas nitrylotroctowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

i roztwory	Składniki
Bufor do lizy	50 mM Tris–HCl [pH 8,0]
	500 mM NaCl
	1 mM beta merkaptoetanol (BME)
	1 mM fluorek fenylosulfonylu (PMSF)
	1 mM EDTA
	1 tabletka kompletnego inhibitora proteazy
	10 mM imidazol
	10% glicerolu
Bufor równoważący/myjący	50 mM Tris–HCl [pH 8,0]
	500 mM NaCl
	1 mM BME
	1 mM PMSF
	10 mM imidazol
	10% glicerolu
Bufor elucji	50 mM Tris–HCl [pH 8,0]
	500 mM NaCl
	1 mM BME
	1 mM PMSF
	1 M imidazol
	10% glicerolu
bufor ładowania próbki SDS	900 μL 4x Laemmli bufor do próbek
	100 μL BME
Roztwór do barwienia Coomassie brilliant blue	50% ddH2O
	40% metanolu
	10% Kwas octowy
	0,1% Coomassie błękit brylantowy R-250
Roztwór odbarwiający	50% ddH2O
	40% metanolu
	10% Kwas octowy

Tabela 1: Skład bufora.

Dyskusja

Chromatografia powinowactwa jest szeroko stosowaną techniką oczyszczania białek wiążących DNA. Chromatografia powinowactwa do metali immobilizowanych (IMAC) to specyficzny rodzaj chromatografii powinowactwa, która wykorzystuje jony metali do wychwytywania reszt histydyny sekwencji peptydowej. Z tego powodu "znacznik 6X-his" lub "znacznik poli-his" jest przyłączony do N-końca lub C-końca białek, które mają być oczyszczone. Nikiel i kobalt są najczęściej stosowanymi jonami metali i różnią się kompatybilnością z odczynnikami takimi jak BME i DTT, zwykle stosowanymi w oczyszczaniu. Chociaż oczyszczanie przeprowadzono w stężeniach 1 mM BME lub DTT, stosowanie tych odczynników może być nadal zawodne. Podczas równoważenia można zaobserwować niezgodność. Jeśli bufor przepływający przez żywicę ma brązowy kolor, oznacza to utlenianie jonów metalu i może usunąć jony metalu z żywicy. Może to drastycznie zmniejszyć zdolność wiązania żywicy.

Aby zapewnić wysoką czystość i wydajność białka, oddziaływania powinowactwa między jonami metali a znacznikiem Hisa powinny być faworyzowane w stosunku do innych możliwych oddziaływań opartych na ładunku. Zapewni to, że całe białko zostanie eluowane jednocześnie, zamiast eluować w różnych fazach elucji. Aby to osiągnąć, białko powinno mieć bardzo niski ładunek podczas oczyszczania. Jeśli wartości pH są bliższe punktowi izoelektrycznemu białka docelowego, ładunek białka może być utrzymywany na niskim poziomie. Ponieważ punkt izoelektryczny FEN1 wynosi około 8,8, nasze są utrzymywane na poziomie pH 8.

Uważa się, że żywica Ni-NTA, naładowana jonami Ni, ma większą zdolność wiązania białek i oczekuje się, że dostarczy większą ilość białka w porównaniu z żywicą TALON, opartą na kobalcie. Oznacza to również, że istnieje większy potencjał wiązania białek niespecyficznych, a tym samym niższa czystość. Niższa zdolność wiązania TALON jest uzupełniana przez wyższe wiązanie swoiste i wydajność białka o wysokiej czystości. Jest to zgodne z naszymi wynikami wskazującymi na wyższą wydajność białka oczyszczonego z Ni-NTA w porównaniu z TALON.

Niezależnie od żywicy, na czystość i wydajność znaczący wpływ ma wypełnienie kolumny. Wydajne pakowanie można osiągnąć za pomocą adaptera przepływu podłączonego do automatycznego systemu chromatograficznego NGC⁹. Przy wystarczająco wysokich natężeniach przepływu adapter przepływu może skutecznie pakować żywicę i zapobiegać gromadzeniu się buforu w kolumnie. Adapter przepływu wraz z NGC pozwala na dokładne porównanie obu żywic dzięki regulacji natężenia przepływu, ciśnienia i gradientu elucji, a także wydajnemu zbieraniu frakcji białkowych.

Dzięki oprogramowaniu Chromlab można monitorować warunki pracy w czasie rzeczywistym¹⁰. Natężenie przepływu można zmienić w dowolnym momencie podczas cyklu. Podczas aplikacji próbki ciśnienie w układzie może przekroczyć próg (600 psi). W takim przypadku zmniejszenie natężenia przepływu na etapie aplikacji próbki może zmniejszyć ciśnienie. Oprogramowanie posiada również funkcję Hold step , dzięki której każdy krok można rozszerzyć w razie potrzeby. Funkcja ta jest szczególnie przydatna na etapach mycia kolumny i elucji. Oczekuje się, że podczas mycia kolumny wykres UV spadnie i prawie osiągnie 0 - oznacza to, że większość niezwiązanych białek została wypłukana z żywicy. W przypadku, gdy linia UV nadal się podnosi lub nie spada, etap mycia można przedłużyć, aż pojawi się oczekiwany wykres. Podobnie, podczas elucji, elucja białka docelowego może być wizualizowana za pomocą pików na wykresie UV. Jeżeli nieoczekiwanie nie są widoczne żadne piki, etap elucji można przedłużyć do momentu zaobserwowania przewidywanych pików.

Porady i wskazówki
Podczas etapu równoważenia bufor musi zostać wstrzyknięty do kolumny, a bufor odpadowy powinien być w sposób ciągły uwalniany do butelki na odpady; Dzięki temu wszystkie połączenia są szczelne i szczelne. W przypadku jakiegokolwiek wycieku z któregokolwiek miejsca NGC, wszystkie porty otaczające obszar muszą zostać sprawdzone, ponieważ źródło wycieku może być inne niż miejsce, w którym wyciek został zauważony. Jeśli przepływ został rozpoczęty, ale żaden bufor nie dostaje się do kolumny, prawdopodobnie powietrze jest uwięzione w przewodach. Wyczyść system, zanim przejdziesz dalej.

Podczas wstrzykiwania próbki, jeżeli ciśnienie wsteczne z systemu opiera się wstrzyknięciu, rurkę należy odkręcić od pętli E i umieścić w pojemniku na odpady na czas wstrzyknięcia. Ważne jest, aby przed uruchomieniem programu wkręcić go z powrotem w pętlę E. W przypadku gdy bufor równowagowy lub próbka zostanie nagromadzona w kolumnie podczas przebiegu, przebieg musi zostać wstrzymany, a adapter przepływu usunięty. Rurkę należy odkręcić od dna kolumny, a bufor lub próbkę pozostawić do przepływu. Jeśli próbka przepływa, należy ją zebrać jako przepływ.

Jeśli frakcje przebiegnięte na żelu SDS PAGE wykazują wysoki poziom białek zanieczyszczających, frakcje mogą być prowadzone po obu stronach pików widocznych na chromatogramie. Często w przypadku białek o niskiej ekspresji czyste frakcje nie wykazują znaczących pików promieniowania UV.

Zrozumienie różnic między właściwościami żywicy na bazie niklu i żywicy na bazie kobaltu pozwala na wybór żywicy najlepiej nadającej się do przyszłych zastosowań oczyszczonego białka. Na przykład oczekuje się, że białka stosowane w testach biochemicznych in vitro będą miały najwyższą możliwą czystość, w sytuacji, w której żywica na bazie kobaltu jest odpowiednia. Jeśli jednak białko jest wykorzystywane do produkcji przeciwciał, do procesu wymagana jest znaczna wydajność oczyszczonego białka. Żywica Ni-NTA może w tym przypadku służyć jako lepsza opcja. Niniejszy artykuł miał na celu uwypuklenie różnic w tych żywicach poprzez oczyszczanie FEN1.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4x Laemmli bufor do próbek	BioRad	1610747
Kwas octowy	Merck	UN2789
Beta-merkaptoetanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab wersja oprogramowania 6.1.27.0	BioRad		obsługuje system NGC
Kompletna tabletka inhibitora proteazy	MINI Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene dimine tetraoctowy (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Adapter przepływu	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Metanol	Fisher Scientific	A412
Mini żele PROTEAN TGX	chromatograficzny BioRad	4561084
NGC	Zautomatyzowany system chromatografii cieczowej BioRad
Ni-NTA Agaroza	Qiagen	1018244
fluorek fenylo-metylosulfonylowy	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Chlorek sodu	Dot Scientific	DSS23020
TALON żywica o powinowactwie do metali	Takara	635502
Tris Base		DST60040

DSG22020 System