Artykuł metodologiczny

Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66530

⸱

17 maja 2024

 ,  ,  ,  , 
1CIC bioGUNE, Basque Research and Technology Alliance (BRTA), 2lkerbasque, Basque Foundation for Science, 3Centro de Investigacion Biomedica En Red de Enfermedades Respiratorias

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół szczegółowo opisujący pozyskiwanie, przetwarzanie i analizę serii eksperymentów NMR mających na celu scharakteryzowanie interakcji białko-glikan w roztworze. Przedstawiono najpopularniejsze metodologie oparte na ligandach i białkach, które niewątpliwie przyczyniają się do rozwoju glikobiologii strukturalnej i badań nad rozpoznawaniem molekularnym.

Streszczenie

Interakcje glikanów z białkami modulują wiele zdarzeń związanych ze zdrowiem i chorobą. W rzeczywistości ustalenie tych zdarzeń rozpoznawania i ich biologiczne konsekwencje są ściśle związane z trójwymiarowymi strukturami obu partnerów, a także z ich cechami dynamicznymi i prezentacją w odpowiednich przedziałach komórkowych. Techniki NMR są unikalne w rozplątywaniu tych cech i rzeczywiście, opracowano i zastosowano różne metodologie oparte na NMR do monitorowania zdarzeń wiązania glikanów z powiązanymi z nimi receptorami. Protokół ten przedstawia procedury pozyskiwania, przetwarzania i analizy dwóch najpotężniejszych metodologii NMR stosowanych w dziedzinie glikobiologii NMR, eksperymentów miareczkowania 1H-Saturation transfer difference (STD) i 1 H,15N-heteronuclear single quantum coherence (HSQC), które komplementarnie oferują informacje odpowiednio z perspektywy glikanów i białek. Rzeczywiście, w połączeniu stanowią one potężny zestaw narzędzi do wyjaśniania zarówno strukturalnych, jak i dynamicznych aspektów procesów rozpoznawania molekularnego. To kompleksowe podejście poszerza naszą wiedzę na temat interakcji glikan-białko i przyczynia się do postępu badań w dziedzinie glikobiologii chemicznej.

Wprowadzenie

Molekularne rozpoznawanie glikanów jest niezbędne dla wielu procesów związanych ze zdrowiem i chorobą. Specyficzność i selektywność receptorów biologicznych (lektyn, przeciwciał, enzymów) dla glikanów w dużym stopniu zależy od dostosowania niepewnej równowagi między różnymi składnikami entalpii (CH-π i van der Waalsa, wiązania wodorowe, elektrostatyka) i entropii (hydrofobowość, dynamika, solwatacja-desolwatacja)1.

Biorąc pod uwagę dużą różnorodność chemiczną i dynamiczną naturę glikanów, metody NMR są szeroko stosowane do analizy interakcji glikanów od ponad 25 lat2, ponieważ te metodologie dostarczają doskonałych informacji na temat zdarzeń rozpoznawania molekularnego z precyzyjnymi szczegółami, w rozdzielczości atomowej3,4, nawet jeśli nie można uzyskać wymaganych dowodów interakcji przy użyciu innych metodologii. Co najważniejsze, NMR jest wszechstronny i umożliwia badanie zdarzeń dynamicznych na poziomie atomowym, w różnych skalach czasowych, stanowiąc zdecydowanie najlepszą technikę do badania struktury, konformacji i dynamiki glikanów w roztworze. Niemniej jednak, rozwikłanie tych informacji może być dość złożonym procesem, który wymaga zastosowania dobrze zdefiniowanych strategii wraz ze staranną analizą danych5.

Techniki NMR są różnorodne, a w rzeczywistości istnieje wiele metodologii, które można zastosować do rozwikłania interakcji glikan-białko6. Opisujemy tutaj dwa podstawowe podejścia NMR, które są obecnie stosowane do rozszyfrowywania interakcji glikan-receptor7,8, kładąc nacisk na to, jak rozplątać prezentację kluczowego epitopu glikanu, a także miejsca wiązania białka9.

W każdym zdarzeniu rozpoznawania molekularnego, gdy receptor wiąże się z danym ligandem, zachodzi proces wymiany chemicznej, który wpływa na wiele parametrów NMR uczestników w binding10. W związku z tym, z perspektywy NMR, interakcja może być monitorowana albo z punktu widzenia liganda glikanów, albo z punktu widzenia receptora białkowego11. Ogólnie rzecz biorąc, receptor białkowy jest dużą biomolekułą (powolny ruch rotacyjny, z szybkościami w skali czasowej ns, a zatem szybką relaksacją poprzeczną), podczas gdy oddziałujący glikan można uznać za cząsteczkę o małym-średnim rozmiarze (szybki ruch rotacyjny, z szybkościami w skali czasu ps i powolną relaksacją poprzeczną)12. Z perspektywy standardowej sygnały NMR glikanu są wąskie, podczas gdy sygnały receptora są szerokie13.

Metody NMR oparte na liganach polegają na dramatycznej zmianie, jakiej doświadcza wiele parametrów NMR glikanów podczas przechodzenia ze stanu wolnego do związanego14. STD-NMR jest najczęściej stosowaną eksperymentalną techniką NMR do oceny różnych cech wiązania glikanów15, od wydedukowania istnienia wiązania w stanie roztworu do określenia epitopu wiążącego glikan; Oznacza to, że atomy liganda, które mają kontakt z receptorem białka16.

Alternatywnie, metody NMR oparte na receptorach monitorują zmiany, które zachodzą w sygnałach receptora białkowego w obecności glikanu w stosunku do tych zarejestrowanych dla stanu apo17. Koncentrują się one głównie na badaniach przesiewowych zaburzeń przesunięć chemicznych sygnałów białkowych między oboma stanami. Najczęściej stosowanym eksperymentem jest 1 H-15N HSQC, lub jego alternatywy TROSY 18.

Połączenie obu podejść pozwala na zastosowanie NMR do wielu różnych systemów, które wykazują szeroki zakres pokrewieństw. Jednak w przypadku metod NMR opartych na receptorach, w przeciwieństwie do metod opartych na ligandzie, musi być dostępna stosunkowo duża ilość rozpuszczalnego, niezagregowanego, stabilnego białka znakowanego izotopowo (15N).

Opisujemy tutaj obie metody, podkreślając ich mocne i słabe strony. Należy pamiętać, że podstawowe kroki opisane w protokole służą jako przykłady użycia spektrometrów firmy Bruker. W związku z tym nazwy poleceń i parametrów są zgodne z tymi używanymi w TopSpin (oprogramowaniu sterującym spektrometrami firmy Bruker).

Protokół

1. NMR z różnicą transferu nasycenia (STD-NMR)

UWAGA: Następujące sekcje opisują podstawowe procedury pozyskiwania, przetwarzania i analizy eksperymentów STD-NMR. Kroki te służą jako przykład zastosowania tej techniki w wykrywaniu wiązania ligandów oraz w wyznaczaniu epitopu wiązania ligandu. W celu dokładniejszego zapoznania się z projektowaniem i akwizycją eksperymentów NMR należy odnieść się do odpowiedniego podręcznika producenta dostarczonego wraz z aparaturą NMR.

  1. Akwizycja
    1. Przygotować próbkę z kompleksem białko-ligand. Zastosować molowe stosunki glikan:lektyna w zakresie od 10:1 do 10:1, przy stężeniach białka od 0,01 do 0,2 mM. Dla oddziaływania hGalektyna-7 z LacNAc, stosunek białka do liganda 50:1 w deuterowanym roztworze soli fosforanowej o pH 7,4.
      UWAGA: Receptor białkowy powinien być czysty i rozpuszczalny w wybranym buforze (w przypadku eksperymentów STD-NMR preferowane są deuterowane wersje odpowiedniego buforu w celu zmniejszenia możliwego 1zakłócenia sygnału H NMR). Stężenie białka sprawdza się wcześniej za pomocą spektrofotometru, mierząc absorbancję przy 280 nm.
    2. Z przygotowanego roztworu przenieś za pomocą pipety łącznie 0,6 ml do probówki NMR o średnicy 5 mm.
    3. Przygotuj instrument NMR w wymaganej temperaturze (typowe temperatury eksperymentalne mieszczą się w zakresie między 10 °C i 45 °C). Otwórz monitor kontroli temperatury za pomocą EDTA wprowadzić polecenie i ustawić żądaną temperaturę. Dla hW badaniu nad galektyną-7/LacNAc temperaturę ustawiono na 25 °C.
    4. Wygeneruj nowy zestaw danych zawierający zg sekwencja impulsów
      1. Aby przeprowadzić prostą operację, otwórz istniejący eksperyment i wpisz edc polecenie. Pojawi się okno dialogowe, w którym należy zdefiniować tytuł, charakterystykę (specyfikację próbki, rozpuszczalnik) oraz niektóre parametry eksperymentu.
      2. Jeśli wymagana jest zmiana w oryginalnej sekwencji impulsów, należy przejść przez ased (parametry) i AcquPars (parametry akwizycji) okna. W tym momencie należy wybrać pożądany program impulsów z biblioteki spektrometru.
      3. Dla standardowego 1widmo H NMR, wybrać Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. sekwencję impulsów z dostępnej listy.
        UWAGA: W przypadku próbek o zwiększonej zawartości wody może być konieczne zastosowanie schematów supresji wody w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu. Zaleca się stosowanie sekwencji impulsów takich jak zgesgp, które wykorzystują moduły sculpting excitation, zapewniające doskonałą supresję przy jednoczesnej kontroli fazy pozostałych sygnałów. Dodatkowe informacje na temat rodzajów schematów supresji wody i ich głównych charakterystyk znajdują się w podręczniku NMR producenta.
    5. Wprowadzić próbkę NMR do głowicy, aktywując dopływ powietrza do windy próbek. Użyć ej polecenie, umieścić próbkę na górnej części magnesu i dezaktywować windę do próbek za pomocą ij Polecenie.
      UWAGA: Aby wstrzyknąć próbkę do magnesu za pomocą autopróbnika, należy użyć polecenia sx następnie podaje się numer pozycji n, odpowiadający położeniu probówki NMR w tacy autosamplera.
    6. Zablokuj sygnał rozpuszczalnika, wpisując polecenie blokada a następnie wybranie odpowiedniego rozpuszczalnika z menu.
    7. Po wprowadzeniu próbki do sondy należy zakończyć proces strojenia i dopasowania, korzystając z modułu automatycznego. atma lub moduł manualny atmm.
    8. Uruchom automatyczne shimowanie za pomocą interfejs graficzny użytkownika topshim polecenie. Otworzy to interfejs graficzny, w którym należy wybrać i uruchomić kalibrację shim 1D.
      UWAGA: Aby zminimalizować niestabilności shimowania wynikające z subtelnych zmian pola lub temperatury, autoshim można aktywować w celu przeprowadzenia pomiaru eksperymentalnego. Można to zrobić, przechodząc do BSMS okno sterowania i kliknięcie w autoshimZmiana koloru na zielony wskazuje, że autoshim został aktywowany. Należy pamiętać, że podczas korzystania z autoshim, potencjalne problemy z niestabilnością próbek muszą pozostać niezauważone. Dlatego zaleca się ostrożność podczas autoshim jest stosowany.
    9. Wyznacz(cie) 1H 90° tętno. Może to być wykonane automatycznie poprzez pulsecal Polecenie.
    10. Modyfikuj poszczególne parametry w AcquPars okno. Dla regularnego 1widmo H NMR, ustaw liczbę skanów (NS) na 32 oraz pożądaną szerokość okna widmowego (SW) na Wapń12 ppm.
      UWAGA: zgesgp sekwencja impulsów zawiera moduł tłumienia sygnału rozpuszczalnika w celu wyeliminowania resztkowego sygnału HDO, który powinien znajdować się w centrum widma. W tym celu należy precyzyjnie zdefiniować parametr O1 w AcquPars.
    11. Ustaw wzmocnienie odbiornika za pomocą automatycznej komendy, aby uniknąć przepełnienia. rga.
    12. Teraz należy pozyskać standard 1widmo H NMR przy użyciu zg polecenie
    13. Po zakończeniu akwizycji należy przetworzyć widmo za pomocą efp polecenie. Należy zastosować korekcję linii bazowej i fazy przy użyciu TopSpin pasek menu
      UWAGA: 1obserwuje się sygnały H NMR pochodzące z glikanu i białka (Rysunek 1). W celu przeprowadzenia eksperymentu STD NMR zaleca się szczegółową analizę uzyskanego widma NMR, zgodnie z opisem w sekcji 1.1.14.
    14. Utwórz nowy zestaw danych i prześlij sekwencję impulsów STD NMR, która zostanie zastosowana w ten sam sposób, co opisano dla 1eksperyment H NMR w sekcji 1.1.4. W instrumentach firmy Bruker w katalogu programów impulsowych dostępne są różne sekwencje impulsów, wszystkie nazwane stddiffXXXNajprostszy z nich (odchylenie standardowe różnicy) nie obejmuje żadnego systemu tłumienia wody ani filtra do usuwania białek.
      1. W przypadku próbek z wysoką zawartością H2O treści, wybierz albo stddiffgp19 lub stddiffesgp sekwencje, które zawierają moduł watergate lub moduł sculptingu wzbudzenia. W przypadku widma z intensywnymi sygnałami NMR białek w tle należy wybrać stddiffXXX.3 sekwencje. W każdym przypadku należy zoptymalizować odpowiednie parametry specyficzne dla każdego modułu tłumienia wody (tzn. d19 w schematach watergate).
    15. Zdefiniuj częstotliwości poza- i wewnątrzrezonansowe (off- and on-resonance) dla eksperymentu STD NMR. Listę częstotliwości znajdziesz w parametrach AcquPars. ased okno pod FQ2LIST wpis. Zdefiniowane częstotliwości rezonansowe i poza rezonansem w hercach należy ręcznie wpisać na listę i zapisać ją pod nową nazwą. Ta nowa lista zostanie wykorzystana w eksperymencie STD-NMR.
      1. Wybierz częstotliwość rezonansową w obszarze widma pozbawionym sygnałów glikanów, zazwyczaj w okolicy δ(1H) 0 lub 6,6 ppm dla typowych glikanów (Rysunek 1). Ustaw częstotliwość poza rezonansem w obszarze, w którym nie występują sygnały protonów ligandu ani białka. Można ją bezpiecznie ustawić na +18 0 lub -18 0 Hz.
    16. Zdefiniuj kształt impulsu, który zostanie zastosowany w czasie nasycenia w AcquPars parametry ased okno
      UWAGA: Istnieje wiele możliwości. Można bezpiecznie stosować kształty Gaussa lub Eburp, z 90° szerokość impulsu selektywnego wynosząca 50 ms.
    17. Ustaw odpowiednie parametry w AcquPars sekcja
      1. Ustaw 1H 90° długość impulsu.
      2. Ustaw wartość mocy dla impulsu kształtowanego (oszacowaną za pomocą kształt narzędzie).
      3. Ustaw całkowity czas nasycenia. Można regularnie stosować wartości z zakresu od 1 s do 4 s.
      4. Ustaw opóźnienie relaksacyjne na 3 s.
      5. Ustaw liczbę skanów (NS) na wielokrotność 8. Zazwyczaj ustawia się ją na 256, 512 lub 1024, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu w zestawach po 2 dla każdej częstotliwości.
      6. Ustaw liczbę skanów pustych (DS) na 8.
      7. Ustaw liczbę punktów w F2 na 16k, 32k lub 64k.
        UWAGA: Zwiększenie liczby punktów w F2 pozwoli na uzyskanie lepszej rozdzielczości oraz stosunku sygnału do szumu. Z tego powodu zdecydowanie zaleca się stosowanie minimum 16 tys. punktów danych.
      8. Ustaw liczbę punktów w F1. Jest to liczba częstotliwości, które zostaną wykorzystane; w tym przypadku są to 2 (częstotliwość rezonansowa oraz poza rezonansem).
        UWAGA: Zgodnie z konwencją F2 odnosi się do wymiaru bezpośredniego, czyli wymiaru, w którym bezpośrednio próbkowany jest sygnał zaniku indukcji swobodnej (FID), natomiast F1 oznacza wymiar pośredni.
      9. Ustaw wzmocnienie odbiornika (RG), aby zapobiec przepełnieniu, korzystając z automatycznego polecenia rga.
    18. Oblicz czas trwania całego eksperymentu za pomocą polecenia eksperyment.
    19. Prześlij eksperyment do akwizycji za pomocą zg Polecenie.
    20. Po kilku minutach należy zawsze sprawdzić, czy eksperyment przebiega prawidłowo.
  2. Przetwarzanie
    UWAGA: Po zastosowaniu opisanego powyżej protokołu uzyskuje się widmo pseudo-2D. Liczba wierszy odpowiada liczbie zastosowanych częstotliwości, zazwyczaj dwóch: rezonansowej i poza rezonansem.
    1. Przetwórz sygnał FID dla pierwszego eksperymentu.
      1. Wykonaj transformację Fouriera dla sygnału FID nr 1 (poprzez efp polecenie) i wybierz miejsce docelowe przetworzonych widm (wybierz numer procno). Alternatywnie, użyj użytkownik 1 polecenie do odczytu pierwszego sygnału FID.
      2. Następnie należy dostosować czynnik poszerzenia linii poprzez lb komenda (zazwyczaj 3-5 Hz) oraz faza. Aby ręcznie ustawić fazę, należy kliknąć w Proces zakładka, a następnie regulacja fazy podmenu. Wykonaj korekcję zerowego i pierwszego rzędu, klikając i przeciągając odpowiedni przycisk. Zapisz wyniki fazowania. Dodatkowo wykonaj korekcję linii bazowej za pomocą polecenia abstrakt.
    2. Odczytaj sygnał FID dla drugiego eksperymentu i wykonaj transformatę Fouriera (poprzez efp (polecenie) z tym samym współczynnikiem poszerzenia linii. Dostosuj fazę, stosując te same parametry fazowe oraz korekcję linii bazowej, a następnie zapisz przetworzone widmo pod innym kodem.
    3. Odczytaj dwa przetworzone widma za pomocą funkcji multiple (polecenie: .md) i odjąć je od siebie (poza rezonansem minus w rezonansie), korzystając z przycisku dostępnego w wizualizacji wielokrotnej (Δ). Nowym widmem jest widmo STD NMR, które zostaje zapisane pod innym kodem.
    4. Wykonaj nałożenie widma STD NMR na widmo off-resonance.
      1. Otwórz widmo poza rezonansem (fid 1) i wpisz .md polecenie otwierające okno wielu wyświetlaczy. Następnie należy wgrać widmo STD.
      2. Porównaj częstotliwości i intensywności (wyświetlane automatycznie w prawym górnym rogu) sygnałów w widmie STD NMR. Pozwala to uzyskać pożądane informacje o protonach znajdujących się w pobliżu białka oraz o ich względnej odległości. Im wyższa względna intensywność, tym bliżej białka się one znajdują (Rysunek 2).
    5. Zmierz intensywności (całki) w eksperymencie poza rezonansem (off-resonance), korzystając z odpowiedniego oprogramowania. W programie TopSpin przejdź do Analiza > ZintegrowaćZdefiniuj obszary i zapisz całki w pliku (I0).
    6. Zmierzyć intensywności (całki) w eksperymencie STD NMR, stosując te same parametry, i zapisać je w pliku (IChoroby przenoszone drogą płciową (STD)).
    7. Oblicz wartość STD dla każdego sygnału protonowego, korzystając z następującego równania:
      STD = (Ichoroby przenoszone drogą płciową (STD))/I0.
      UWAGA: Wykorzystanie integracji sygnału do obliczania wartości STD wymaga, aby sygnały protonowe były odpowiednio rozdzielone. W przypadku wystąpienia nakładania się sygnałów, np. w przypadku oligosacharydów, wartości STD można określić poprzez ocenę stosunku intensywności sygnałów pomiędzy widmem STD a widmem poza rezonansem (off-resonance).
    8. Oblicz względne STD jako wartość procentową. W tym celu przyjmij wartość 100% dla protonu, który wykazuje maksymalną różnicę między intensywnościami w widmie NMR poza rezonansem a widmie STD. W analogiczny sposób oblicz względne intensywności STD dla pozostałych protonów.
      UWAGA: Prawidłowa analiza danych STD, zwłaszcza w celu wyznaczenia epitopu wiązania ligandu, wymaga pełnego przypisania sygnałów 1sygnały H ligandu. Dlatego zdecydowanie zaleca się wykonanie tego zadania przed akwizycją widm STD.

2. Eksperymenty 1H-15N HSQC

UWAGA: Poniższe linie szczegółowo opisują zastosowanie eksperymentów 1H-15N HSQC do monitorowania zmian przesunięć chemicznych rezonansów NMR 1H i 15N receptora (lektyny) w odpowiedzi na obecność zwiększających się ilości ligandu (oligosacharydu)19. Analiza zaburzeń przesunięcia chemicznego (CSP) oparta na wyekstrahowanych danych jest niezwykle cenna dla identyfikacji partnerów wiążących, a także dla mapowania interfejsu wiązania białka i wyznaczania powinowactwa wiązania. W celu głębszego zrozumienia projektowania i akwizycji eksperymentów NMR należy zapoznać się z odpowiednim podręcznikiem producenta dostarczonym wraz z instrumentem NMR.

  1. Pozyskiwanie i przetwarzanie
    1. Przygotuj próbkę z interesującą lektyną. Upewnij się, że receptor jest w pełni 15Znakowane azotem (N) w każdym reszcie aminokwasowej, zarówno w szkielecie, jak i w łańcuchach bocznych. Zazwyczaj w celu wykrycia w widmie sygnałów krosowych HN podlegających wymianie z wodą stosuje się mieszaninę H2O i D2O w stosunku 90:10.2O: D2Aby przygotować roztwór buforowy. Wymagane stężenia lektyny mieszczą się w zakresie od 0,05 do 0,2 mM, w zależności od dostępności 15Receptor znakowany azotem oraz niezbędny stosunek sygnału do szumu.
      UWAGA: Białko powinno pozostać stabilne przez cały czas trwania eksperymentu, bez widocznego powstawania osadu w probówce NMR. Ponadto powinno być czyste i rozpuszczalne w wybranym buforze. Pełny 1H i 15Przypisanie sygnałów w widmie HSQC powinno zostać przeprowadzone wcześniej, tak aby każdy sygnał w widmie HSQC był zidentyfikowany etykietą odpowiadającą konkretnemu pozostałości aminokwasowej.
    2. Z tak przygotowanej mieszaniny przenieś objętość całkowitą 0,6 ml do probówki NMR o średnicy 5 mm.
    3. Ustaw instrument NMR w wymaganej temperaturze. Patrz krok 1.1.3 i wykonaj te same czynności.
    4. Utwórz nowy zestaw danych. Zobacz krok 1.1.4 i powtórz operacje.
    5. Wprowadź próbkę NMR do głowicy zgodnie z opisem w kroku 1.1.5.
    6. Zablokuj sygnał rozpuszczalnika. Aby rozpocząć procedurę blokowania, użyj polecenia blokada następnie należy wybrać odpowiedni rozpuszczalnik z menu. Sygnał blokady można śledzić w oknie blokady. Należy ustawić wzmocnienie blokady w taki sposób, aby sygnał blokady był widoczny w oknie blokady.
    7. Automatycznie wykonaj proces strojenia i dopasowania (za pomocą polecenia atma) lub ręcznie (te atmm polecenie otworzy okno sterowania ATM w celu dostrojenia krzywej wobble.
    8. Ustaw optymalne podkładki (shims), korzystając z narzędzia TopShim. Użyj polecenia interfejs graficzny topshimPatrz instrukcje w kroku 1.1.8.
    9. Wyznaczyć 1H 90° długość impulsu (opisana w kroku 1.1.9) oraz częstotliwość przesunięcia (polecenie o1calib wykona interaktywną procedurę kalibracji O1 (wyznaczając częstotliwość przesunięcia). Ten drugi parametr jest niezwykle istotny w przypadku zastosowania eksperymentów z układami tłumienia sygnału rozpuszczalnika.
    10. Utwórz nowy zestaw danych zgodnie z opisem w sekcji 1.1.4. Aby zredukować lub wyeliminować interferencję sygnału H2O, zastosuj następującą sekwencję impulsów zgesgp.
    11. Przygotuj eksperyment, modyfikując poszczególne parametry w AcquPars okno
      1. Przedstawiamy 1H 90° długość impulsu i przesunięcie (o1) zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, a liczbę skanów (NS) ustawić na 32 i okno spektralne (SW) na około 12 ppm.
      2. Wyznacz poziom mocy uformowanego impulsu za pomocą Kształt narzędzie dostępne w pasku menu Topspin.
      3. Ustaw wzmocnienie odbiornika za pomocą polecenia automatycznego rga.
    12. Przeprowadź eksperyment, wykorzystując zg wydać polecenie i przetworzyć wynikowy sygnał FID w celu uzyskania 1Widmo H NMR.
    13. Utwórz nowy zestaw danych, który zostanie wykorzystany do pozyskania 1H-15eksperyment NMR HSQC. W AcquPars zakładka, wybierz program impulsacji hsqcetfpf3gp dostępne w katalogu programu Pulse.
    14. Przygotuj eksperyment. Wczytaj domyślne kształty, moce i czasy, używając polecenia getprosolNastępnie należy zaktualizować wartości 1H 90° długość impulsu i przesunięcie.
    15. Zdefiniuj następujące parametry.
      1. Ustaw opóźnienie relaksacyjne na 1-5 s.
      2. Ustaw liczbę skanów jako wielokrotność liczby 4. Zazwyczaj ustawia się ją na 8, 16, 32 lub 64, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu.
      3. Ustaw liczbę skanów pozornych (dummy scans) na 128.
      4. Ustaw liczbę punktów w F2 na 1k, 2k lub 4k.
      5. Ustaw liczbę punktów w F1: liczbę t1 przyrosty do wykorzystania. W zależności od okna widmowego wartość ta wynosi od 128 do 256.
      6. Dostosuj środek okna widmowego w 15do N wymiarów δ 17 ppm i ustaw odpowiednią szerokość widma na 36 ppm. Wartości te muszą zostać zoptymalizowane dla każdego konkretnego układu.
      7. Ustaw wzmocnienie odbiornika, aby uniknąć przepełnienia (poprzez użycie rga polecenie
    16. Oblicz całkowity czas trwania eksperymentu. Typowy czas trwania eksperymentu wynosi około 1 h.
    17. Typ zg do przesłania eksperymentu do akwizycji.
      UWAGA: Po kilku minutach zawsze należy sprawdzić, czy eksperyment przebiega prawidłowo.
    18. Przetwórz sygnał FID za pomocą polecenia xfbPrzeprowadź korekcję linii bazowej, używając polecenia abs2 or korekcje fazy w Proces zakładka. Aby przeprowadzić ręczne fazowanie, kliknij w regulacja fazy z podmenu, a następnie wybrać kilka sygnałów korelacyjnych (cross-peaks) widm 2D. Następnie należy sekwencyjnie zastosować korekcję rzędu zerowego i pierwszego zarówno dla wierszy, jak i kolumn, klikając i przeciągając odpowiedni przycisk. Wyniki fazowania należy zapisać.
    19. Zapisz otrzymane widmo 2D.
    20. Przygotuj wysoko skoncentrowany roztwór zapasowy ligandu. Typowe wartości wynoszą 50–10 mM.
    21. Z wysoce stężonego roztworu zapasowego glikanu przenieś odpowiednią objętość (kilka mikrolitrów) do probówki NMR zawierającej receptor, aby uzyskać pożądany stosunek molowy białka do liganda, a następnie zarejestruj widma.
      UWAGA: Ten etap rozpoczyna serię miareczkowania, w której ligand jest miareczkowany do próbki białka. Odpowiednie stosunki białka do liganda muszą zostać określone dla każdego konkretnego przypadku. Jeśli powinowactwo wiązania jest całkowicie nieznane, zaleca się zastosowanie subsztochiometrycznych ilości liganda w punktach początkowych.
    22. Wykonaj kroki od 2.1.1 do 2.1.19 dla nowo przygotowanej próbki.
    23. Powtórz kroki 2.1.21 i 2.1.2 dla próbek z coraz wyższymi stosunkami białka do ligandu.
      UWAGA: Dokładne dopasowanie danych z serii miareczkowania wymaga pozyskania wielu 1H-15Eksperymenty N-HSQC obejmujące szeroki zakres stosunków białka do ligandu, w tym wartości niezbędne do osiągnięcia nasycenia białka.
  2. Analiza
    1. Zwizualizuj przetworzone widmo 2D HSQC dla formy apo, korzystając z odpowiedniego oprogramowania: TopSpin, MestReNova oraz CCPNMR to programy odpowiednie do analizy danych NMR.
      UWAGA: Jest to widmo odciskowe białka. Zaobserwowane 1H i 15Przesunięcia chemiczne N zależą od odpowiadającego im otoczenia chemicznego każdego aminokwasu, co w dużym stopniu zależy od struktury 3D białka. Widmo to nazywa się widmem odcisku palca białka. Dobrze rozproszone 2D 1H-15Widmo $^{1}\text{H-HSQC}$, w którym wszystkie piki korelacyjne wykazują jednolitą intensywność, silnie sugeruje obecność prawidłowo sfałdowanego białka19.
    2. Wygeneruj listę 1H i 15częstotliwości N dla wszystkich pików korelacyjnych. Zastosowanie dodatkowego oprogramowania, takiego jak program CCPNMR20może pomóc w tym procesie.
    3. Nałóż widmo dla pierwszego lub drugiego punktu miareczkowania na widmo białka apo.
      1. Aby to zrobić, należy otworzyć widmo 2D odpowiadające stanowi apo, a następnie kliknąć w Wielokrotny wyświetlacz zakładkę, a następnie dodaj drugie widmo 2D. Wizualna inspekcja obu widm dostarcza informacji o istnieniu oddziaływania między ligandem a białkiem.
        ​UWAGA: Z perspektywy białka wiązanie powoduje zmiany w środowisku chemicznym aminokwasów bezpośrednio zaangażowanych w proces rozpoznawania, co wiąże się z towarzyszącymi perturbacjami przesunięć chemicznych (CSP).
    4. Powtórz kroki 2.2.2 i 2.2.3 dla każdego punktu miareczkowania, generując listy 1H i 15Częstotliwości N dla wszystkich pików korelacyjnych w różnych widmach, odpowiadających różnym stosunkom molowym białka do ligandu.
      UWAGA: Przesunięcia chemiczne w każdym punkcie miareczkowania można mierzyć bez konieczności przeprowadzania nowych przypisań sygnałów krosowych. W przypadku reżimu szybkiej wymiany, powszechnie obserwowanego w oddziaływaniach lektyna:glikan, można po prostu śledzić progresywne przesuwanie się pików w trakcie miareczkowania.
    5. Należy sprawdzić, czy w przypadku ostatniego punktu miareczkowania nie występują w zasadzie żadne perturbacje przesunięcia chemicznego w stosunku do poprzedniego dodatku. Fakt ten wskazuje, że miejsce wiązania białka zostało nasycone ligandem, który znajduje się w dużym nadmiarze.
    6. Oblicz maksymalne perturbacje przesunięcia chemicznego (maxCSP), korzystając z poniższego równania:
      figure-protocol-1
      ΔH i ΔδN czy różnice w przesunięciach chemicznych w 1H i 15częstości N odpowiednio dla stanu apo oraz ostatniego punktu mianowania.
    7. Nanieś maksymalne perturbacje przesunięcia chemicznego (maxCSP) na oś pionową y wykresu 2D w relacji do odpowiadającego im resztowego aminokwasu (na poziomej osi x).
    8. Przeprowadź inspekcję wizualną reszt aminokwasowych wykazujących maksymalne CSP pomiędzy stanem związanym a apo białka. Z dużym prawdopodobieństwem należą one do miejsca wiązania lub znajdują się w jego bezpośrednim sąsiedztwie.
    9. Jeśli dostępna jest struktura 3D białka, należy otworzyć odpowiedni plik PDB w odpowiednim oprogramowaniu, takim jak PyMOL lub BIOVIA Discovery Studio. Te programy do wizualizacji cząsteczkowej są powszechnie stosowane w zastosowaniach z zakresu biologii strukturalnej. Aby zlokalizować przypuszczalne miejsce wiązania, należy zaznaczyć konkretnym kolorem reszty wykazujące najwyższe wartości maxCSP (powyżej dwukrotności odchylenia standardowego).
    10. W przypadku reżimu szybkiej wymiany należy oszacować stałą dysocjacji (KD) z nieliniowego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów zaobserwowanego przesunięcia sygnału chemicznego (CSP) dla 1H-15piki korelacyjne N-HSQC w każdym punkcie (Δδobs) kontra stężenie konkretnego białka [P] i liganda [L] w tym punkcie:
      figure-protocol-2
      UWAGA: Równanie to można zastosować do tych sygnałów korelacyjnych, które wykazują wyraźne, odizolowane sygnały. Uzyskane wartości są uśredniane w celu oszacowania K.D.

Wyniki

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół wykorzystania eksperymentów 1H-STD NMR oraz 1H-15N HSQC w celu szczegółowego zbadania oddziaływań wiązania między lektynami a małymi oligosacharydami. Do celów ilustracyjnych, aby zaprezentować pomyślną implementację protokołu oraz skuteczność tych metod NMR w badaniu szczegółów procesu rozpoznawania molekularnego, przedstawiono wyniki analizy rozpoznawania LacNAc przez hGalektynę-7 (hGal-7). Rysunek 3 przedstawia widmo 1H-STD NMR dla oddziaływania LacNAc z hGal-7. Obecność sygnałów STD NMR wskazuje na zachodzenie wiązania (Rysunek 3A). Ponadto pojawiają się jedynie te sygnały, które należą do protonów w bezpośrednim kontakcie z białkiem, co pozwala na wyznaczenie epitopu wiązania (Rysunek 3B). Rysunek 4 podkreśla, w jaki sposób widmo  1H-15N HSQC białka może służyć jako jego „odcisk palca” (fingerprint), a Rysunek 5 ilustruje zastosowanie eksperymentów miareczkowania z wykorzystaniem heteronuklearnej pojedynczej spójności kwantowej (1H-15N HSQC) w celu określenia perturbacji przesunięć chemicznych grup amidowych szkieletu hGalektyny-7 po związaniu LacNAc. Dane te nie tylko potwierdzają istnienie oddziaływania, ale także pozwalają wyznaczyć powierzchnię wiązania lektyny. Rysunek 6 demonstruje, jak analiza danych miareczkowania umożliwia oszacowanie powinowactwa wiązania LacNAc przez hGalektynę-7, które mieści się w wysokim zakresie mikromolarnym. Wynik ten jest zgodny z rezultatami uzyskanymi przy użyciu alternatywnych technik.

figure-results-1
Rysunek 1Wybór częstotliwości rezonansowej. 1Widmo H-NMR LacNAc:hPrzedstawiono stosunek Gal-7 50:1 w deuterowanym roztworze soli fosforanowej o pH 7,4. Sygnały liganda (LacNAc) ograniczają się do obszaru między 2,0 a 5,2 ppm. Częstotliwość saturacji została starannie dobrana tak, aby zapewnić brak protonów liganda w zakresie 1–2 ppm, co umożliwia selektywne naświetlanie protonów białka. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

figure-results-2
Rycina 2Eksperyment STD NMR. Schematyczny przebieg eksperymentu STD: pierwsze widmo (poza rezonansem) służy jako referencyjne, natomiast w drugim (w rezonansie) przeprowadza się nasycenie białka. Nasycenie jest efektywnie propagowane w obrębie całego białka i przenoszone na protony ligandu znajdujące się w bliskim kontakcie z białkiem. Wynikowe widmo różnicowe (widmo STD) wykazuje jedynie te rezonanse, które uległy nasyceniu. Analiza eksperymentu STD pozwala na mapowanie epitopów wiążącego się cukru. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

figure-results-3
Rysunek 3Analiza wiązania z perspektywy liganda. (A) Nałożenie sygnałów poza rezonansem i 1Widma H STD-NMR dla oddziaływania LacNAc z hGal-7. W widmie STD pojawiają się jedynie sygnały pochodzące od protonów w bliskim kontakcie z białkiem. Adnotacja 1Sygnały rezonansowe protonów liganda są widoczne w widmie poza rezonansem.BWzględne intensywności sygnałów STD zostały naniesione w formie mapy kolorystycznej na strukturę chemiczną LacNAc. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4The 1H-15Widmo N HSQC białka stanowi jego odcisk palca. (A) 1H-15widmo N-HSQC 100 µM z hGal-7 w formie apo. Widmo zarejestrowano przy 25 °CNiektóre sygnały krosowe NH zostały opisane etykietami odpowiadających im aminokwasów.B) Każda para NH wykazuje unikalny przesunięcie chemiczne, które zależy od otoczenia chemicznego, a w konsekwencji od struktury 3D białka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5Analiza wiązania z perspektywy białka. (A) Superpozycja 1H-15Widma N HSQC zarejestrowane podczas miareczkowania LacNAc do hPrzedstawiono roztwór Gal-7. Analiza widm, w których kilka sygnałów korelacyjnych wykazuje zmiany przesunięcia chemicznego, jednoznacznie wskazuje na oddziaływanie.BWykres maksymalnych perturbacji przesunięcia chemicznego (maxCSP) sygnałów amidowych szkieletu białkowego, wyznaczony na podstawie miareczkowania LacNAc (15 równoważników) z hGal-7. (C) Najbardziej zaburzone aminokwasy w hZgodnie z analizą CSP, Gal-7 został zmapowany na strukturę PDB 5gal. W modelu 3D kolor czerwony oznacza wartość CSP powyżej 2.σ, natomiast różowe do wartości między 1σ i 2σKolorowy obszar prawdopodobnie reprezentuje miejsce wiązania. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

figure-results-6
Rysunek 6KD oznaczenie na podstawie 1H-15Eksperymenty miareczkowania N-HSQC. (A) Przedstawienie wzoru 1H-15Miareczkowanie oparte na HSQC, w zależności od szybkości wymiany chemicznej w skali czasowej NMR badanego układu (szybkiej, pośredniej lub wolnej). W przypadku LacNAc zaobserwowano reżim szybkiej wymiany.hInterakcja Gal-7. (B) Dopasowanie krzywej i KD estymacja uzyskana z analizy CSP przy różnych stężeniach ligandu dla systemu modelowego hGal-7 i disacharyd LacNAc. Szacowana wartość KD podaje się wraz z odpowiadającym błędem jako średnią z danych dla 20 różnych aminokwasów; (CFragmenty z 1H,15Widma N-HSQC wykazujące przesunięcie wybranych sygnałów krosowych podczas miareczkowania. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Różnica transferu nasycenia NMR (STD-NMR) stała się najczęściej stosowaną i wszechstronną metodą NMR do badania oddziaływań ligand-białko. Jak pokazano powyżej, opiera się on na zjawisku transferu nasycenia, a układ eksperymentalny obejmuje akwizycję dwóch jednowymiarowych (1D) widm 1H: widma rezonansowego i widma rezonansowego poza nim. Podczas eksperymentu rezonansowego nasycenie określonych protonów białka uzyskuje się poprzez zastosowanie ciągu impulsów o częstotliwości radiowej małej mocy w określonym czasie (czas nasycenia zwykle waha się od 1 do 3 s). Aby uniknąć bezpośredniego nasycenia liganda, częstotliwość i długość impulsów nasycenia są zoptymalizowane pod kątem selektywnego napromieniania określonych protonów białka; tj. muszą być stosowane przy częstotliwości wolnej od jakichkolwiek sygnałów ligandowych i o odpowiedniej długości (rysunek 1). Z reguły w przypadku impulsów nasycenia 50 ms należy zachować różnicę 1 ppm od obszaru nasycenia do najbliższych sygnałów liganda. Ogólnie rzecz biorąc, selektywne impulsy nasycenia stosowane na alifatyczny region białka zapewniają zwiększone efekty nasycenia. Alternatywnie, protony aromatyczne (6-7 ppm) mogą być również napromieniane, jeśli cząsteczka liganda nie zawiera żadnych sygnałów aromatycznych. Jest to bardzo przydatne w przypadku naturalnie występujących glikanów, ponieważ nie zawierają one grup aromatycznych. Gdy pewien region białka zostanie selektywnie napromieniowany, nasycenie rozchodzi się wzdłuż białka poprzez dipolarną relaksację krzyżową 1 H-1H (dyfuzja spinowa). Ostatecznie nasycenie dociera do protonów białkowych w miejscu wiązania, które są następnie przenoszone do protonów cukrowych, które są w bliskim kontakcie (r < 5 A) z receptorem za pośrednictwem międzycząsteczkowych 1 H-1H NOE. Oczywiście intensywność sygnałów nasyconych protonów ligandów maleje. Po otrzymaniu nasycenia, ze względu na kinetykę wiązania, przejściowo związane ligandy (wymagana jest szybka wymiana) dysocjują, a informacja o nasyceniu jest gromadzona w stanie swobodnym. Ze względu na ten proces, widma rezonansowe NMR prezentują zmniejszone sygnały (ryc. 2).

Aby wyraźnie pokazać tę intensywność zaburzeń jąder 1H wiążącego glikanu, uzyskuje się kontrolne widmo NMR protonów (off-resonance), w którym nasycenie jest stosowane z dala od jakiegokolwiek sygnału receptora lub węglowodanów (zwykle między 40-100 ppm), w tych samych warunkach. Odjęte widmo 1D między rezonansem a rezonansem pokazuje wyłącznie sygnały jąder 1H liganda, które mają zmodyfikowaną intensywność: te, które były wystarczająco blisko miejsca wiązania receptora, aby otrzymać namagnesowanie (ryc. 2).

Niemniej jednak nie wszystkie jądra 1H związanego węglowodanu otrzymują taką samą ilość nasycenia. Teoretycznie przeniesienie namagnesowania z receptora do związanego liganda jest zależne od odległości (1/r6). Oznacza to, że intensywności przenoszonego nasycenia między jądrami glikanu 1H zawierają informacje o bliskości przestrzennych między protonami liganda a protonami receptora, a intensywności STD NMR są większe dla tych protonów, które znajdują się bliżej receptora. W związku z tym eksperyment STD NMR pozwala również określić epitop wiążący węglowodan (ryc. 2 i ryc. 3), ponieważ protony liganda znajdujące się bliżej powierzchni białka wykazują wyższą intensywność niż te, które nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu.

Eksperyment może być zastosowany do układów o słabym powinowactwie do średniego, rzadziej do układów o silnym powinowactwie w niskim zakresie μM lub nM. Rzeczywiście, wymaga to, aby tempo dysocjacji było szybkie w skali czasu relaksacji. W przeciwnym razie informacja o transferze nasycenia jest tracona przez relaksację, zanim ligand się rozłączy.

Z drugiej strony, eksperymenty NMR oparte na białkach są unikalne w rozwikłaniu interakcji ligand-białko z dokładnością na poziomie aminokwasów bez rozwiązywania struktur rozdzielczości atomowej. Bezpośrednio bada zjawiska rozpoznawania molekularnego w roztworze bez konieczności kokrystalizacji. Mapowanie analizy CSP jest wyjątkowo skuteczne w odkrywaniu ligandów i mapowaniu miejsca wiązania białek (Figura 4 i Figura 5). Metoda ta ma zastosowanie do dowolnego zakresu powinowactwa między zakresem mM i nM, nawet w przypadku układów, w których kurs wymiany jest niski w skali czasu przesunięcia chemicznego21.

Niemniej jednak takie podejście prawdopodobnie nie zadziała w przypadku białek o masie cząsteczkowej powyżej 30-40 kDa ze względu na problemy z relaksacją. Następnie można zastosować alternatywę TROSY18 , która jest szczególnie skuteczna w połączeniu z deuteracją białek. Co więcej, białko powinno być równomiernie znakowane 15N (a inna próbka podwójnie znakowana 13C i 15N, aby móc wykonać wymagane przypisanie szkieletu). W związku z tym warunki ekspresji białka, w tym odpowiadający im system ekspresji, powinny być zoptymalizowane, aby móc uzyskać miligramowe ilości białka. Białka, które wykazują tendencję do oligomeryzacji lub agregacji, również nie nadają się do tej analizy. Przyrządem używanym w niniejszym dokumencie do rejestracji danych NMR jest spektrometr Bruker 800 MHz wyposażony w kriosondę TCI. Zastosowanie tej metodologii przy użyciu instrumentów pracujących poniżej 600 MHz lub bez sondy kriogenicznej byłoby dużym wyzwaniem.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Agencia Estatal de Investigación z Hiszpanii za akredytację Centrum Doskonałości Severo Ochoa CEX2021-001136-S, ufundowaną przez MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, oraz CIBERES, inicjatywę Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madryt, Hiszpania). Dziękujemy również Komisji Europejskiej za projekt GLYCOTWINNING.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw mikroprobówek 5 mm Shigemi MatCortecNet SASS30BMS-005B
Alfa-Laktoza-AgarozaSigma-Aldrich Quìiacute; mika S.L.7634-5ML
Chlorek amonu (15 N, 99%)LC-0179-N-50GTracer Tecnologí jako Anal í ticas S.L
Ampicylina (sól sodowa) Melford Laboratories LTDA40040
BIOVIA Discovery studio BIOVIA, Dassault Systè mes
BL21(DE3) Kompetentne chemicznie komórki Merck Life Science, S.L.U.CMC0014-40X40UL
WirówkaBeckman CoulterAllegra X-22R
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-1000
InkubatorEppendorfInnova 42
IPTG (Isopropyl ß-D-1-tiogalactopyranoside)VWR International Eurolab S.L.
LacNAcElicitylGLY008
Luria Bertani (LB) BulionMerck Life Science, S.L.U.3397-1KG
Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC VWR International Eurolab S.L.214-1137
PBS 10xBio-Rad1610780
PyMOLSystem grafiki molekularnej PyMOLwersja 2.0 Schrö dinger
SonicatorSonics & Materiały, Inc.VC 505
Nadprzewodzący magnes NMRBruker600 MHz AVANCE III
Nadprzewodzący magnes NMRBruker800 MHz AVANCE III
VW437144N

Bibliografia

  1. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  2. Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution. Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).
  3. Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).
  4. Widmalm, G. Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy. JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).
  5. Marchetti, R., et al. 34;Rules of Engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).
  6. Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy. Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).
  7. Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).
  8. Cañada, F. J., et al. Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR. Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).
  9. Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans. ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).
  10. Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. Free and protein-bound carbohydrate structures. Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).
  11. Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
  12. Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR. Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).
  13. Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions. Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).
  14. del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).
  15. Angulo, J., Nieto, P. M. STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach. Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).
  16. Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
  17. Williamson, M. P. Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).
  18. Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).
  19. Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. Solution NMR in structural genomics. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).
  20. Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis. J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).
  21. Gimeno, A., et al. Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spektroskopia NMRr nica transferu nasyceniaperturbacja przesuni cia chemicznegokompleks bia ko ligandrozpoznawanie molekularneglikobiologiamiareczkowanie HSQCwi zanie galektynydynamika strukturalna
Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.