Tutaj opisany jest protokół do generowania regulowanych światłem i odwracalnych wzorców białkowych z wysoką precyzją czasoprzestrzenną na sztucznych błonach lipidowych. Metoda polega na zlokalizowanej fotoaktywacji białka iLID (ulepszonego dimeru indukowanego światłem) unieruchomionego na błonach modelowych, które w świetle niebieskim wiąże się ze swoim białkiem partnerskim Nano (SspB typu dzikiego).
Artykuł metodologiczny
Dynamiczne wzorce białek indukowane światłem na błonach modelowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Precyzyjna lokalizacja i aktywacja białek na błonie komórkowej w określonym czasie powoduje wiele procesów komórkowych, w tym polaryzację komórek, migrację i podział. W związku z tym metody rekrutacji białek do modelowania błon o rozdzielczości subkomórkowej i wysokiej kontroli czasowej są niezbędne do rozmnażania i kontrolowania takich procesów w komórkach syntetycznych. W tym miejscu opisano metodę wytwarzania regulowanych światłem odwracalnych wzorców białkowych na błonach lipidowych z wysoką precyzją czasoprzestrzenną. W tym celu unieruchamiamy fotoprzełączalne białko iLID (ulepszony dimer indukowany światłem) na podpartych dwuwarstwach lipidowych (SLB) oraz na zewnętrznej błonie gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV). Po miejscowym naświetleniu światłem niebieskim iLID wiąże się ze swoim partnerem Nano (SspB typu dzikiego) i umożliwia rekrutację dowolnego białka zainteresowania (POI) połączonego z Nano z roztworu do oświetlonego obszaru na membranie. Wiązanie to jest odwracalne w ciemności, co zapewnia dynamiczne wiązanie i zwalnianie punktu POI. Ogólnie rzecz biorąc, jest to elastyczna i wszechstronna metoda regulacji lokalizacji białek z dużą precyzją w przestrzeni i czasie za pomocą światła niebieskiego.
Wprowadzenie
Tworzenie wzorów białkowych na błonach komórkowych w regionach subkomórkowych powoduje liczne procesy biologiczne, w tym migrację, podział i zlokalizowaną komunikację między komórkami1,2. Te wzorce białek są regulowane w czasie i przestrzeni i są bardzo dynamiczne. Replikacja takich wzorców białkowych w komórkach syntetycznych jest niezbędna do naśladowania procesów komórkowych, które z nich wynikają, oraz do lepszego zrozumienia, jak taka regulacja działa na poziomie molekularnym. Analogicznie do tego, co obserwuje się w przypadku błon w żywych komórkach, metody generowania wzorów białek na sztucznych błonach muszą uchwycić ich dynamikę i zapewnić precyzyjną kontrolę czasoprzestrzenną.
Wśród różnych bodźców, światło wyróżnia się tym, że zapewnia najwyższą kontrolę czasoprzestrzenną i kilka dodatkowych zalet3. Dzięki regulacji za pomocą światła można łatwo oświetlić żądany obszar w dowolnym momencie z niezrównaną precyzją. Ponadto światło zapewnia wysoką dostrajalność, ponieważ można regulować zarówno intensywność światła, jak i czas trwania impulsów. Co więcej, światło widzialne jest nieszkodliwe dla biomolekuł, w tym białek, a nawet możliwe jest zajęcie się wieloma funkcjami o różnych długościach fal. W związku z tym podejścia reagujące na światło oparte na świetle widzialnym jawią się jako obiecujące drogi kontrolowanej i biortopalnej regulacji wzorców białek w przestrzeni i czasie4,5,6. Wykorzystanie fotoprzełączalnych par białek z optogenetyki, działających jako dimeryzatory indukowane światłem, zapewnia prostą metodę rekrutacji określonych białek do błon. W szczególności udało się stworzyć wzorce białkowe na sztucznych błonach przy użyciu interakcji wyzwalanej niebieskim światłem między iLID (ulepszonym dimerem indukowanym światłem, opartym na fotoprzełączalnej domenie LOV2 z Avena sativa) i Nano (SspB typu dzikiego)7,8, systemem SpyTag indukowanym niebieskim światłem (BLISS)9, zielonym tetramerem białkowym reagującym na światło CarH10 oraz indukowana światłem czerwonym interakcja między PhyB a PIF611.
Wykazano, że fotoprzełączalna interakcja między iLID i Nano5 może być używana do fotowzorcowania białek na błonach modelowych za pomocą światła niebieskiego7. Interakcja iLID/Nano jest odwracalna w ciemności, wysoce specyficzna i działa w warunkach fizjologicznych. Zakotwiczenie iLID w modelach błon lipidowych, takich jak gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) lub podparte dwuwarstwy lipidowe (SLB), umożliwia regulowaną światłem rekrutację Nano do tych błon, co jest odwracalne w ciemności. W szczególności zaobserwowaliśmy, że wprowadzenie nieuporządkowanej domeny do N-końca iLID (w wyniku czego powstaje białko o nazwie disiLID) jako więź z modelową błoną lipidową zwiększa efektywność rekrutacji Nano i dynamikę rewersji8.
Wykorzystując interakcję disiLID/Nano, opracowaliśmy metodę generowania wysoce kontrastowych wzorów interesujących nas nano-połączonych białek (POI) na SLB i zewnętrznych błonach GUV. Metoda ta pozwala na tworzenie wzorów białkowych o niezwykłej rozdzielczości przestrzennej i czasowej oraz wysokiej odwracalności w ciągu kilku minut. Szczegółowy protokół przedstawia proces lokalnej rekrutacji białek do sztucznych błon. W szczególności osiąga się to poprzez unieruchomienie biotynylowanej wersji disiLID na SLB i GUV poprzez interakcję biotyna-streptawidyna (SAv). Następnie, znakowany fluorescencyjnie Nano (mOrange-Nano) jest rekrutowany do tych funkcjonalizowanych membran disiLID w oświetleniu światłem niebieskim. Nasz protokół eksperymentalny oferuje proste i elastyczne podejście do osiągnięcia zlokalizowanej rekrutacji białek do błon. Co ważne, metodologia ta nie ogranicza się do zgłaszanych interfejsów SLB i GUV ani mOrange-Nano; można go rozszerzyć na inne materiały i białka funkcjonalizowane za pomocą disiLID, połączone z Nano.
Protokół
1. Przygotowanie eksperymentalne
- Odciągaj i oczyszczaj biotinylated-disiLID (b-disiLID) i mOrange-Nano (patrz Tabela Materiałów), postępując zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami7,8.
- Przygotować mieszaniny lipidowe w szklanych fiolkach o wybranym składzie lipidowym i stężeniach. Najpierw rozpuść lipidy w chloroformie, aby uzyskać końcowy roztwór lipidów o stężeniu 1 mg/ml.
- Wymieszać lipidy w celu otrzymania kompozycji 94,9% mol% 2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC), 5% mol% soli sodowej 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy N-(kap biotynylo) (DOPE-biotyna) i 0,1% mol% 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametylolindodikarbocyjaniny (DiD) (patrz tabela materiałów).
UWAGA: Mieszaninę lipidów można regulować za pomocą różnych proporcji i stężenia DOPE-biotyny i/lub różnych barwników błonowych. Zalecane stężenie DOPE-biotyny (5 mol%) pozwala na utworzenie warstwy streptawidyny (SAv) o dużej gęstości w następujących etapach.
- Wymieszać lipidy w celu otrzymania kompozycji 94,9% mol% 2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC), 5% mol% soli sodowej 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy N-(kap biotynylo) (DOPE-biotyna) i 0,1% mol% 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametylolindodikarbocyjaniny (DiD) (patrz tabela materiałów).
- Przygotuj małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV) zgodnie z wcześniej opisanymi metodami7,8,12. Do tego kroku zaleca się przygotowanie SUV-ów o średnicy ≤100 nm.
- W tym badaniu stosuje się metodę sonikacji. Najpierw odparować roztwór chloroformu w szklanej fiolce ze strumieniem azotu, obracając fiolki w celu utworzenia cienkiego filmu lipidowego. Następnie usuń resztki chloroformu przez co najmniej 1 godzinę w próżni.
- Ponownie uwodnić wysuszoną folię w ultraczystej wodzie o końcowym stężeniu 1 mg/ml lipidów poprzez wirowanie. Na koniec należy sonikować otrzymany roztwór przez 10 minut, aż nieprzezroczysty roztwór stanie się klarowny.
UWAGA: Mieszaninę lipidów należy przechowywać w probówce do mikrowirówki w lodówce maksymalnie przez 2 tygodnie. Można również stosować różne metody przygotowania SUV-ów (np. metodę ekstruzji), o ile rozmiar końcowych SUV-ów wynosi ≤ 100 nm.
- Ponownie uwodnić wysuszoną folię w ultraczystej wodzie o końcowym stężeniu 1 mg/ml lipidów poprzez wirowanie. Na koniec należy sonikować otrzymany roztwór przez 10 minut, aż nieprzezroczysty roztwór stanie się klarowny.
2. Rekrutacja mOrange-Nano do funkcjonalizowanych SLB disiLID
- Dodać 150 μl 2 M NaOH do każdej studzienki w komorze ze szklanym dnem μ-szkiełkowym 18-dołkowym (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń NaOH i umyj studzienki 3-5 razy, najpierw 150 μl ultraczystej wody, a następnie 3 razy 150 μl buforu (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) zawierającego 10 mM CaCl2.
- Dodać 15 μl świeżo przygotowanych SUV (stężenie podstawowe 1 mg/ml w wodzie) do studzienek zawierających 150 μl buforu z 10 mM CaCl2 w celu uzyskania w buforze rozcieńczenia SUV o współczynniku około 10. Pozwól SUV-om inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po czasie inkubacji powstaną biotynylowane SLB.
- Przemyć SLB co najmniej 7 razy buforem (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) bez CaCl2, najpierw usuwając roztwór, a następnie dodając świeży bufor w każdym kroku. Zaleca się stosowanie 80 μl buforu na każdym etapie prania.
UWAGA: Optymalne mycie SLB uzyskuje się poprzez kilkakrotne pipetowanie świeżego roztworu w górę i w dół bez dotykania powierzchni. Pipetowanie roztworu w studzienkach zawierających nowo powstałe SLB powinno być delikatne, aby ograniczyć tworzenie się małych pęcherzyków powietrza, które mogłyby uszkodzić powstałe SLB. Od tego momentu studzienki powinny zawierać wystarczającą ilość bufora, aby zapobiec wysychaniu SLB. - W celu dalszej funkcjonalizacji biotynylowanych SLB za pomocą SAv, dodać roztwór SAv do końcowego stężenia 250 nM i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć nadmiar SAv, przemłukując go buforem (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) co najmniej 5 razy.
- Od tego momentu należy przechowywać próbki pod czerwonym światłem ochronnym, aby uniknąć niepożądanej fotoaktywacji białek fotoprzełączalnych. Dodać b-disiILD (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 1 μM w studzience. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej usunąć nadmiar białka, przemłukując buforem co najmniej 5 razy.
- Dodać mOrange-Nano (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 200 nM i utrzymywać próbkę w ciemności, przykrywając ją folią aluminiową.
- Umieść szkiełko μ pod mikroskopem fluorescencyjnym i dostosuj ustawienia obrazowania. Ustaw laser 552 nm na wzbudzenie mOrange-Nano. Dostosuj zakres emisji, aby zoptymalizować sygnał mOrange. Fotoaktywacja disiLID odbywa się za pomocą lasera o długości fali 488 nm, za pomocą impulsów świetlnych w odstępach 2,58 s.
3. Przygotowanie GUV
- Przygotować 5% (w/v) roztwór alkoholu poliwinylowego (PVA, patrz tabela materiałów) (MW: 145 000 g/mol) ze 100 mM sacharozy w ultraczystej wodzie, mieszając przez noc w temperaturze 80 °C przy 400 obr./min.
- Przygotować roztwór lipidowy w chloroformie o pożądanym składzie (stężenie końcowe 10 mg/ml). Do tej metody zaleca się kompozycję składającą się z 10 mg/ml POPC, 10% mol% 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (POPG), 2 mol DOPE-biotyny i 1 mol% DiD (patrz tabela materiałów).
- Przygotuj GUV za pomocą techniki hydracji7,8. Najpierw rozprowadzić 40 μl przygotowanego roztworu PVA jako jednorodną cienką warstwę na szkiełku podstawowym o wymiarach 60 mm x 24 mm, najlepiej za pomocą końcówki do pipety. Następnie suszyć cienką warstwę w temperaturze 50 °C przez 30 minut.
- Rozprowadzić 5 μl roztworu lipidowego za pomocą igły na warstwie PVA i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę.
- Zamontuj komorę na funkcjonalizowanym szkiełku za pomocą przekładki (~40 mm × 24 mm × 2 mm, patrz Tabela Materiałów) i drugiego szkiełka podstawowego.
- Dodaj 1 ml buforu nawadniającego (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) do komory na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby utworzyć GUV. Po 1 godzinie odwróć komorę i delikatnie postukaj w szklane powierzchnie końcówką pipety.
- Ostrożnie zdejmij szklane szkiełko z jednej strony, aby otworzyć wbudowaną komorę i zebrać GUV za pomocą pipety.
- Umieść roztwór w plastikowej tubie i pozwól GUV osiąść na 2 godziny.
4. mOrange-Nano Rekrutacja do funkcjonalizowanych GUV disiLID
- Dodać roztwór SAv do świeżo zebranych GUV i odstawić na 30 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Poniższe czynności należy wykonywać przy czerwonym świetle ochronnym, aby uniknąć fotoaktywacji disiLID. - Dodać 1 μM b-disiLID do roztworu GUVs i umieścić próbkę na 30 minut w ciemności, przykrywając ją folią aluminiową.
- Wstępnie przygotować μ-szkiełkową 18-dołkową szklaną komorę dolną 150 μl roztworu BSA (3% w/v w wodzie) przez 10 minut. Następnie usuń roztwór BSA i umyj studzienki 150 μl ultraczystą wodą 3 razy.
- Dodać 145 μl 200 nM mOrange-Nano w buforze (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) do studzienki.
- Następnie dodaj 5 μL GUV ozdobionych b-disiLID do roztworu i odczekaj ~15 minut, aż GUV opadną.
- Umieść szkiełko μ pod mikroskopem konfokalnym. Wzbudzić próbkę przy 552 nm, aby uwidocznić fluorescencję mOrange (λex = 557 nm; λem = 576 nm) i przy 638 nm, aby uwidocznić DiD (λex = 644 nm; λem = 665 nm) w membranach GUV. Rekrutacja mOrange-Nano jest wyzwalana impulsami światła niebieskiego (488 nm, intensywność 1%) co 5,3 s w celu zminimalizowania niepożądanych efektów fotowybielania.
UWAGA: Długości fal wzbudzenia można dostosować w zależności od typu używanego mikroskopu. Inne popularne długości fal wzbudzenia dostępne dla mikroskopów to również lasery 532 nm lub 561 nm i 633 nm, 647 nm, 639 nm lub 640 nm.
Wyniki
Opisane procedury umożliwiają tworzenie SLB w celu rekrutacji mOrange-Nano na membranach syntetycznych. Formowanie zdefiniowanych wzorów mOrange-Nano na SLB funkcjonalizowanych b-disiLID przedstawiono na Rysunku 1A. Podczas naświetlania kwadratowego obszaru zainteresowania (ROI) o wymiarach 24 µm × 24 µm na SLB niebieskim światłem o długości fali 488 nm, w ciągu 200 s w kanale mOrange (zaznaczonym na czerwono) obserwuje się gwałtowny wzrost sygnału fluorescencji w ROI. Wzór charakteryzuje się bardzo wyraźnymi i ostrymi krawędziami (Rysunek 1B), co wskazuje na wysoką kontrolę przestrzenną nad obszarem fotoaktywowanym. Oddziaływanie jest szybkie i w pełni odwracalne po przerwaniu naświetlania niebieskim światłem. Metoda ta pozwala również na tworzenie wzorów w ramach kilku cykli naświetlania (Rysunek 2). Naprzemienne cykle ~200 s światła niebieskiego i 200 s ciemności prowadzą do wielokrotnej odwracalnej rekrutacji mOrange-Nano w wybranym obszarze, przy porównywalnych wartościach Δ intensywności fluorescencji we wzorach.
Rysunek 3 przedstawia schematyczną reprezentację przygotowania GUVs. Rekrutację mOrange-Nano zaobserwowano również na GUVs. Wykazano, że GUVs umieszczone w ciemności nie wykazują fluorescencji mOrange (Rysunek 4A). Po globalnym naświetleniu GUVs światłem niebieskim obserwuje się fluorescencję mOrange, która kolokalizuje z barwnikiem błony GUV (DiD). Oddziaływanie to jest wysoce odwracalne po zaprzestaniu naświetlania. Ilościowa analiza intensywności mOrange w błonie GUV w czasie wykazuje szybką i skuteczną rekrutację białek, a także pełną odwracalność procesu (Rysunek 4B).
Rycina 1: Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej SLB funkcjonalizowanych b-disiLID. Obrazy fluorescencji w obecności mOrange-Nano przed (A) i podczas (B) lokalnego naświetlania światłem niebieskim (488 nm) w ROI. Pasek skali = 20 µm. (C) Intensywność fluorescencji mOrange zmierzona w ROI dla SLB funkcjonalizowanych b-disiLID (at = 200 s). Rycina została zaadaptowana z Di Iorio et al.8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Intensywność fluorescencji mOrange rekrutowanego w ROI na SLB dekorowanych b-disiLID podczas trzech cykli rekrutacji. Po każdym etapie fotoaktywacji fluorescencja mOrange-Nano w obszarze ROI wzrastała. Wzór osiąga nasycenie w ciągu 120 s, a fluorescencja spada w ciągu 120 s, niemal do poziomu tła. Nie zaobserwowano utraty jakości wzoru podczas różnych cykli światła niebieskiego/ciemności. Rycina została opracowana na podstawie pracy Di Iorio et al.8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić rycinę w powiększeniu.
Rycina 3: Schematyczne przedstawienie przygotowania GUV za pomocą metody łagodnej hydratacji. Schemat oferuje wizualną reprezentację kilku etapów oraz komory zbudowanej z dwóch szkiełek przedmiotowych i dystansera. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Pomiary mikroskopii fluorescencyjnej dotyczące zależnej od światła rekrutacji mOrange-Nano na błonach GUV. (A) Obrazy fluorescencyjne GUV funkcjonalizowanego disiLID w obecności mOrange-Nano. Kolor zielony oznacza barwnik błony GUV, a kolor czerwony fluorescencję mOrange przed, w trakcie i po naświetlaniu światłem niebieskim. Paski skali = 10 µm. (B) Intensywność fluorescencji mOrange zlokalizowanego na GUV w funkcji czasu. Po naświetleniu fluorescencja mOrange (zaznaczona na czerwono) na błonie lipidowej osiąga maksymalną intensywność w ciągu 60 s, wykazując 5,9-krotny wzrost intensywności fluorescencji. Po zaprzestaniu naświetlania fluorescencja mOrange spada do wartości niemal identycznych z tymi sprzed naświetlania w ciągu 60 s (z 90% regeneracją). Rysunek został zaadaptowany z Di Iorio i wsp.8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Opisaliśmy metodę miejscowej rekrutacji białek mOrange-Nano na błonach modelowych, takich jak podparta dwuwarstwa lipidowa i gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe za pomocą fotoprzełączalnego białka disiLID8. Aspekty, które przyczyniają się do jakości wzoru, obejmują jakość białek, a także dobrą jakość SLB i GUV.
Aby zapewnić dobrą jakość białka po ekspresji i oczyszczeniu, ważne jest, aby najpierw ocenić właściwości fotoprzełączalne disiLID. W tym celu należy zmierzyć absorpcję kofaktora FMN w ciemności i po oświetleniu światłem niebieskim. Oczekuje się, że widma UV-VIS disiLID pokażą charakterystyczny potrójny pik kofaktora FMN w ciemności, który znacznie zmniejsza się po oświetleniu światłem niebieskim i powraca w ciemności13. To fotoprzełączalne zachowanie ma kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnej i odwracalnej rekrutacji w kolejnych krokach. Praca z czerwonym światłem ochronnym i wystawienie disiLID na minimalne oświetlenie zewnętrzne podczas przygotowywania próbek zwiększa wydajność eksperymentów.
Kolejnym krytycznym krokiem, i być może najważniejszym, jest tworzenie odpowiednich SLB. Defekty w błonach i/lub tworzenie się niejednorodnych SLB (tj. obecność wielowarstwowych lub łatanych SLB) wpłynie na jakość wzorca białka. Dlatego dla niedoświadczonych użytkowników zaleca się odtworzenie protokołu poprzez oznakowanie SUV-ów niektórymi barwnikami membranowymi, takimi jak DiD i DiO, w celu utworzenia fluorescencyjnie znakowanych SLB. W ten sposób właściwości i jakość SLB można dobrze scharakteryzować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pomiary FRAP stanowią typowe podejście do oceny jakości SLB poprzez ocenę płynności membran. Alternatywnie, w przypadku biotynylowanych SLB, takich jak te opisane w niniejszym protokole, do wizualizacji i oceny jakości SLB można użyć znakowanego fluorescencyjnie SAv (np. Atto 488-SAv).
Pierwsza część protokołu opisuje tworzenie się wzorców na SLB. Aby zapewnić optymalny wynik, ważne jest, aby dodać mOrange-Nano do SLB i pozostawić próbkę do inkubacji w ciemności przez 15 minut. Podczas fotoaktywacji wybór ROI nie jest ograniczony do określonego rozmiaru. Jednak intensywność lasera i czas ekspozycji muszą być regulowane, aby zmniejszyć niepożądane fotowybielanie białek fluorescencyjnych.
Metoda ta nie jest ograniczona do białek biotynylowanych, a inne podejścia mogą być stosowane do zakotwiczenia disiLID w SLB. Na przykład, disiLID ze znacznikiem Hisa może być wyrażany i zakotwiczony na SLB zawierających Ni-NTA. Jednak bardzo ważne jest, aby ekspresja Nano i disiLID za pomocą różnych znaczników, aby uniknąć wymiany białek na SLB. Metoda ta daje również możliwość odwrócenia kolejności białek, funkcjonalizując w ten sposób SLB za pomocą Nano i rekrutując disiLID (lub białka połączone z disiLID) po podświetleniu światłem niebieskim.
W celu dynamicznej kontroli lokalizacji białka, odwracalna lokalizacja białka w wybranym regionie powinna być możliwa wielokrotnie. Aby to osiągnąć, stężenie Nano (200 nM) w roztworze jest krytycznym parametrem pozwalającym uzyskać wysoką odwracalność.
Kolejnym problemem jest rekrutacja Nano do funkcjonalizowanej przez disiLID powierzchni GUV. Podobnie jak w przypadku wzorcowania białek na SLB, metodę tę można rozszerzyć na różne strategie funkcjonalizacji błony. W tym protokole cały GUV został oświetlony niebieskim światłem w celu rekrutacji mOrange-Nano na całej powierzchni GUV. Jednak wybór małych ROI zlokalizowanych na błonie GUV powinien prowadzić do precyzyjnej lokalizacji białek w bardziej ograniczonym obszarze.
Metoda ta stanowi jedynie ograniczenie związane z wyborem fluoroforu stosowanego do obrazowania rekrutacji Nano na błonie SUV-ów lub GUV. W szczególności należy unikać fluoroforów o widmie wzbudzenia w zakresie światła niebieskiego, ponieważ ich stosowanie będzie zakłócać fotoaktywację (dis)iLID. Dlatego do tego typu eksperymentów zaleca się wybór fluoroforów w zakresie światła zielonego lub czerwonego (np. mOrange lub Cy5).
Konstrukcja disiLID oferuje prosty i elastyczny sposób na poprawę lokalnej rekrutacji białek do błon i poszerza zakres dynamiczny iLID i Nano z optogenetyki4. Metody te koncentrują się na rekrutacji Nano na błony mimiczne, takie jak dwuwarstwy lipidowe i GUV. Niemniej jednak podejście to można rozszerzyć na liczne narzędzia optogenetyczne w komórkach, w których (dis)iLID lub Nano są połączone z błoną.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych ERC Starting Grant ARTIST (# 757593 S.V.W.). DDI dziękuje Fundacji Alexandra von Humboldta za stypendium podoktorskie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| µ-Slide 18 Well | Ibidi | 81817 | Do preparatu SLB |
| 25 µ L Strzykawka mikrolitrowa | Hamilton | Model 702 N | Do przygotowania mieszaniny lipidów i rozprowadzania roztworu lipidowego na warstwie PVA |
| Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) (sól sodowa) | Avanti Polar Lipids | 870273C | Do przygotowania SUV-ów |
| CaCl2 (chlorek wapnia) | Sigma-Aldrich | C5670 | Do formowania SLB |
| Szkiełka nakrywkowe 24 mm x 60 mm | Engelbrecht | K12460 | Do tworzenia GUV |
| DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'- Tetramethylindodicarbocyanine) | Thermo Fisher Scientific | D7757 | Sekwencja barwnika |
| : MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSG GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF | |||
| DOPC (1,2-di-(9Z-oktadecenoilo)-sn-glicero-3-fosfocholina) | Avanti Polar Lipids | 850375P | Do SUV-ów Skład lipidowy |
| Eppendorf Protein LoBind mikroprobówki wirówkowe | Merk | EP0030108116-100EA | Do zbierania świeżo przygotowanych GUV |
| mOrange-Nano | Sekwencja: MRGSHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP PKTWEEIPALDKELKAKG ksalm FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQTAKLK vtkgg PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG | ||
| NaCl (chlorek sodu) | Sigma-Aldrich | S9888 | Do buforu |
| NaOH (wodorotlenek sodu) | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Do aktywacji powierzchniowej w tworzeniu SLB |
| POPC (1-Palmitoilo-2- oleoilofosfatydylocholina) | Avanti Polar Lipids | 850457C | Do kompozycji lipidowej GUV |
| PVA (alkohol poliwinylowy) w pełni hydrolizowany | Sigma-Aldrich | 8148940101 | Do tworzenia GUV |
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy SP8 | Leica | ||
| Streptavidin | TermoFisher | 434301 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | 84097 | Do tworzenia GUV |
| Chlorowodorek Tris | Sigma-Aldrich 10812846001 | Do bufora |
Bibliografia
- Kretschmer, S., Schwille, P. Pattern formation on membranes and its role in bacterial cell division. Curr Opin Cell Biol. 38, 52-59 (2016).
- Yang, H. W., Collins, S. R., Meyer, T. Locally excitable Cdc42 signals steer cells during chemotaxis. Nat Cell Biol. 18 (2), 191-201 (2016).
- Caldwell, R. M., et al. Optochemical control of protein localization and activity within cell-like compartments. Biochem. 57 (18), 2590-2596 (2018).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci. 112 (1), 112-117 (2015).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Bartelt, S. M., et al. Dynamic blue light-switchable protein patterns on giant unilamellar vesicles. Chem Commun. 54 (8), 948-951 (2018).
- Di Iorio, D., Bergmann, J., Higashi, S. L., Hoffmann, A., Wegner, S. V. A disordered tether to iLID improves photoswitchable protein patterning on model membranes. Chem. Commun. 59 (29), 4380-4383 (2023).
- Hartzell, E. J., Terr, J., Chen, W. Engineering a blue light inducible Spytag system (BLISS). J Am Chem Soc. 143 (23), 8572-8577 (2021).
- Xu, D., Bartelt, S. M., Rasoulinejad, S., Chen, F., Wegner, S. V. Green light lithography: a general strategy to create active protein and cell micropatterns. Mater Horiz. 6 (6), 1222-1229 (2019).
- Jia, H., et al. Light-induced printing of protein structures on membranes in vitro. Nano Lett. 18 (11), 7133-7140 (2018).
- Di Iorio, D., Verheijden, M. L., vander Vries, E., Jonkheijm, P., Huskens, J. Weak Multivalent Binding of influenza hemagglutinin nanoparticles at a sialoglycan-functionalized supported lipid bilayer. ACS Nano. 13 (3), 3413-3423 (2019).
- Kasahara, M., Torii, M., Fujita, A., Tainaka, K. FMN binding and photochemical properties of plant putative photoreceptors containing two LOV domains, LOV/LOV proteins. J Biol Chem. 285 (45), 34765-34772 (2010).
Przedruki i uprawnienia
