Artykuł metodologiczny

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

DOI:

10.3791/66532

⸱

26 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Regeneration of Sensorimotor Systems, Netherlands Institute for Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), 2Centre for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory wirusowe (AAV) związane z adenowirusem są niezwykłym narzędziem do badania ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Innowacyjne kapsydy, takie jak AAV. PHP.eB, wykazują rozległą transdukcję OUN przez wstrzyknięcie dożylne u myszy. Aby osiągnąć porównywalną transdukcję, potrzebne jest 100-krotnie wyższe miano (minimalnie 1 x10 11 kopii genomu/mysz) w porównaniu z bezpośrednim wstrzyknięciem do miąższu OUN. W naszej grupie produkcja AAV, w tym AAV. PHP.eB opiera się na przylegających komórkach HEK293T i metodzie potrójnej transfekcji. Osiągnięcie wysokiej wydajności AAV z przylegającymi komórkami pociąga za sobą pracochłonny i materiałochłonny proces. To ograniczenie skłoniło do opracowania protokołu hodowli komórek na bazie zawiesiny w stożkowych probówkach. AAV generowane w przylegających komórkach porównano z metodą produkcji zawiesiny. Porównano hodowle w zawiesinie przy użyciu odczynników do transfekcji Polietyleniminy lub TransIt. Wektory AAV oczyszczono przez ultrawirowanie w gradionym jodiksanolu, a następnie wymianę buforu i zagęszczenie za pomocą filtra odśrodkowego. Dzięki metodzie adherentnej uzyskaliśmy średnio 2,6 x 1012 kopii genomu (GC), podczas gdy metoda zawiesinowa i polietylenina dały łącznie 7,7 x 1012 GC, a TransIt łącznie 2,4 x 1013 GC. Nie ma różnicy w skuteczności transdukcji in vivo między wektorami wytwarzanymi z adherentem w porównaniu z systemem komórek zawiesinowych. Podsumowując, wprowadzono protokół produkcji AAV oparty na komórkach zawiesinowych HEK293, co skutkuje zmniejszeniem ilości czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy jednoczesnym osiągnięciu od 3 do 9 razy wyższych plonów przy użyciu komponentów dostępnych u komercyjnych dostawców do celów badawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus związany z adenowirusem (AAV) został odkryty w 1965 roku i od tego czasu jest używany w niezliczonych aplikacjach1. AAV zostały zastosowane w badaniach neurobiologicznych do badania funkcji genów i neuronów, mapowania obwodów neurologicznych lub tworzenia modeli zwierzęcych dla choroby2. Tradycyjnie odbywa się to poprzez wstrzyknięcie bezpośrednio w miejsce zainteresowania, ponieważ większość naturalnych serotypów nie przekracza bariery krew-mózg lub potrzebuje do tego dużej dawki1,2,3.

Wraz z odkryciem AAV. PHP. B4 i kapsydy nowej generacji, takie jak AAV. PHP.eB5 oraz AAV. CAP-B106, możliwe jest celowanie w ośrodkowy układ nerwowy (OUN) za pomocą prostego wstrzyknięcia ogólnoustrojowego. Mapowanie przestrzenne ujawnia komórki, na które atakuje AAV. PHP.eB na poziomie komórkowym6,7. W połączeniu ze specyficznymi promotorami/wzmacniaczami, kapsydy te oferują neurobiologom szerokie możliwości badania genów i funkcji mózgu poprzez nieinwazyjne dostarczanie AAV4,8.

Podczas gdy do AAV potrzebna jest niższa dawka. PHP.eB (zazwyczaj 1 do 5 x 1011 kopii genomu (GC)/mysz) w porównaniu do AAV9 (4 x 1012 GC/mysz)7, nadal trzeba wyprodukować więcej wektorów w porównaniu ze strategiami bezpośredniego wstrzykiwania (zwykle 1 x 109 GC/μL iniekcji). Większość naturalnych serotypów można wytworzyć przy użyciu klasycznego systemu hodowli komórek adherentnych w połączeniu z oczyszczaniem jodiksanolu9,10,11,12. Dla AAV. PHP.eB Wiąże się to z pracochłonnym procesem hodowli i transfekcji komórek w celu uzyskania wystarczającej liczby wektorów dla jednego eksperymentu8. W związku z tym opracowano produkcję AAV w hodowli komórek zawiesinowych w probówkach stożkowych. Rurki stożkowe o pojemności do 300 ml są kompaktowe, co pozwala zaoszczędzić zarówno miejsce w inkubatorze, jak i tworzywa sztuczne. Komórki zawiesinowe są znacznie łatwiejsze do hodowli i obróbki w dużych ilościach niż komórki przylegające na płytkach 15 cm. Elementy transfekcji protokołu pozostają takie same. Dlatego plazmidy używane wcześniej z systemem adherent mogą być łatwo wykorzystane w tym protokole opartym na produkcji w komórkach zawiesinowych. Protokół został z powodzeniem przekazany innym badaczom w laboratorium i z powodzeniem wykorzystany do różnych kapsydów i konstruktów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania Królewskiej Holenderskiej Akademii Nauk (KNAW) i były zgodne z holenderskim prawem o doświadczeniach na zwierzętach w ramach projektu numer AVD8010020199126. W Rysunek 1 znajduje się schematyczny przegląd całego protokołu. Od wysiewu komórek do oczyszczenia AAV, protokół trwa 6 dni.

1. Przygotowanie odczynnika

  1. Oczyszczanie plazmidu
    1. Przeprowadzić ekstrakcję plazmidu zgodnie z opisem producenta z kilkoma regulacjami, aby zapewnić sterylność plazmidów.
    2. Przygotuj 70% etanolu, używając sterylnej wody destylowanej i absolutnego etanolu.
    3. Po etapie wirowania izopropanolu wysusz plazmidy w pokrywie komory przepływowej i dodaj sterylny 70% etanol do probówek. Po wytrąceniu etanolu wysuszyć plazmidy w okapie komory przepływowej i ponownie zawiesić plazmid w sterylnej wodzie destylowanej. Uważaj, aby używać wysterylizowanych probówek do mikrowirówek.
    4. Pobrać podwielokrotność do oznaczania ilościowego, analizy ograniczeń i, w razie potrzeby, sekwencjonowania. Zaleca się sprawdzenie integralności powtórzeń odwróconego zakończenia (ITR), ponieważ mutacje mogą mieć negatywny wpływ na wydajność. Dostosować stężenie próbki do 1 μg/μl.
  2. Przygotowanie 10x buforu do lizy Tween
    1. Rozpuścić 30,3 g buforu Tris i 2,033 g MgCl2,6H 2O w 400 ml sterylnej wody destylowanej, ustawić pH na 8,0 i zwiększyć całkowitą objętość do 450 ml.
    2. Utrzymuj Tween 20 w sterylnej formie, dodaj 50 ml Tween 20 do roztworu buforowego w okapie i sterylizuj filtr za pomocą filtra próżniowego 0,2 μM.
  3. Rozcieńczenia jodiksanolu
    1. Roztwór jodiksanolu jest dostarczany w stężeniu 60%. Użyj roztworu początkowego, aby przygotować roztwory 15%, 25% i 40%.
    2. Aby uzyskać 15% roztwór, rozcieńczyć 60 ml 60% roztworu 48 ml 5 M NaCl i 48 ml PBS-MK (5x PBS z 5 mM MgCl2 i 12,5 mM KCl) i dodać wodę destylowaną do 240 ml.
    3. Aby uzyskać 25% roztwór, rozcieńczyć 67 ml 60% roztworu i 32 ml PBS-MK. Dodaj wodę destylowaną do 160 ml. Dobrze wymieszaj i dodaj 1,6 ml roztworu czerwieni fenolowej.
    4. Aby uzyskać 40% roztwór, rozcieńczyć 160 ml 60% roztworu z 48 ml PBS-MK i dodać wodę destylowaną do 240 ml. Aby uzyskać 60% roztwór, dodaj 1 ml czerwieni fenolowej do 100 ml 60% roztworu.
  4. PBS 5% roztwór sacharozy
    1. Dodaj 25 g sacharozy do 500 ml butelki DPBS bez wapnia i magnezu. Dobrze wstrząsnąć i przefiltrować za pomocą filtra próżniowego do butelek 0,2 μM.
  5. Roztwór glikolu polietylenowego (PEG) 8000
    1. Rozpuścić 400 g PEG 8000 i 24 g NaCl w sterylnej wodzie destylowanej i dostosować do końcowej objętości 1000 ml. Mieszać z ogrzewaniem, aż do całkowitego rozpuszczenia. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą papieru pH.
    2. Filtruj sterylizację za pomocą filtra próżniowego do butelek 0,2 μM, aby uzyskać 40% roztwór PEG 8000. Należy pamiętać, że filtracja zajmie trochę czasu ze względu na lepkość roztworu - przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Hodowla komórek zawiesinowych HEK293

  1. Do czyszczenia używaj chusteczek nasączonych 70% etanolem. Wyczyść kaptur bezpieczeństwa biologicznego, przygotuj i wyczyść wszystkie materiały potrzebne do hodowli komórek.
  2. Rozgrzej 30 ml pożywki z komórek zawiesinowych do temperatury 37 °C w stożkowej probówce do hodowli o pojemności 50 ml. Odzyskaj komórki produkcyjne wirusa z ciekłego azotu. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Tuż przed całkowitym rozmrożeniem fiolki należy ją oczyścić chusteczką nasączoną 70% etanolem i przenieść fiolkę do kaptura bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat użytych tutaj komórek do produkcji wirusa znajdują się w Tabeli materiałów.
  3. Szybko przenieś komórki do wstępnie podgrzanej stożkowej probówki hodowlanej o pojemności 50 ml. Hodowla komórek w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C, wilgotności 80%, 8%CO2, 200 obrotów na minutę (RPM) i średnicy wytrząsania 50 mm. Komórki pasażowe, gdy żywotność przekracza 90%, a gęstość komórek przekracza 1-3 x 106 komórek/ml.
    UWAGA: Zastosowany inkubator ma średnicę wytrząsania 50 mm; Warunki hodowli należy dostosować do innej średnicy wytrząsania.
  4. Komórki pasażowe 3-4 dni po rozmrożeniu. Sprawdź probówki hodowlane, aby upewnić się, że nie ma oznak zanieczyszczenia; Na przykład grzyb pojawi się jako odbarwiony (lub zielony) pierścień.
  5. Przygotować 400 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego na próbkę, używając 1 ml paski.
  6. Szybkie pobieranie komórek zawiesinowych z inkubatora. Natychmiast pobrać 500 μl z probówki za pomocą 1 ml stripette. Delikatnie pipetować w górę i w dół.
  7. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do przygotowanej probówki z błękitem trypanowym. Delikatnie odwróć rurkę, aby wymieszać; Nie pipetować w celu wymieszania, ponieważ doprowadzi to do śmierci komórki. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze.
  8. Pobrać 50 μl zawiesiny komórek poddanej działaniu błękitu trypanowego i nałożyć ją na szkiełko hemocytometru. Policz całkowitą liczbę komórek żywotnych i oblicz ilość zawiesiny komórek i pożywki potrzebnej do przejścia lub transfekcji następnego dnia.
  9. Podgrzewać pożywkę w inkubatorze przez 10-15 minut. Dodać zawiesinę komórkową do podgrzanego podłoża i wrócić do inkubatora. W przypadku pasażowania komórek przez 3 dni (tj. od poniedziałku do czwartku) ustaw na 0,5 x 106 komórek/ml; dla komórek pasażujących przez 4 dni (tj. od czwartku do poniedziałku), ustaw na 0,3 x 106 komórek/ml.
    UWAGA: Według producenta, komórki produkcyjne wirusa podwajają się co 26 godzin i powinny wynosić od 3,5 x 106 do 5,5 x 106 przed pasażem. Komórki mogą być przechowywane do przejścia 20.

3. Transfekcja

  1. Dzień 1
    1. Po 24 godzinach przed transfekcją posadź 1 x 106 komórek na ml w 300 ml pożywki.
  2. Dzień 2
    1. Ciepłe podłoże, plazmidy i odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej. Ilości, które należy przygotować, znajdują się w tabeli 1.
    2. Krótko wirować plazmidy i odczynniki. Dodaj plazmidy do przygotowanego podłoża, wir. Dodaj odczynnik do transfekcji i krótko odwiruj. Nie mieszaj mieszaniny po tym kroku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    3. W międzyczasie policz komórki przygotowane w dniu 1. Komórki powinny mieć od 2 do 2,5 x 10,6 komórek na ml i > 95% żywotności.
    4. Po inkubacji, kroplami, dodaj mieszaninę transfekcji do komórek, delikatnie obracając probówkę. Inkubować przez 72-96 godzin.

4. Zbieranie komórek

  1. Dzień 5
    1. Dodać 33 ml 10x buforu do lizy komórek (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), wymieszać delikatnie wstrząsając i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny z wytrząsaniem.
    2. Wirować przy 3428 x g w temperaturze 4 °C przez 60 min. Przefiltrować przez filtr próżniowy PES 0,45 μM w celu sklarowania lizatu komórkowego, pozostawiając oczyszczony lizat w pojemniku filtra.
      UWAGA: Opcjonalnie po filtracji: pobrać 50 μl próbki do ilościowego PCR (Q-PCR).
    3. Dodać 90 ml 40% roztworu PEG 8000 do 360 ml przefiltrowanego lizatu komórkowego.
    4. Oczyść mieszadło z 70% etanolem i dodaj do próbki. Mieszać na lodzie lub w chłodni przy 300 obr./min przez 1 godzinę. Inkubować w temperaturze 4 °C bez mieszania przez noc.
      UWAGA: Przetestowano czas inkubacji od 1 h do 72 h. Dłuższy czas inkubacji ma negatywny wpływ na ogólne wytrącanie białka.

5. Oczyszczanie jodixanolu

  1. Dzień 6
    1. Przenieść całą próbkę objętości kultury wytrąconej PEG do czystej, dużej stożkowej probówki i odwirować w temperaturze 2820 x g i temperaturze 4°C przez 15 minut.
    2. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad PEG w 15 ml DPBS z wapniem i magnezem. Granulka jest trudna do ponownego zawieszenia; Poświęć trochę czasu, aby zrobić to ostrożnie.
    3. Przenieś zawieszoną część do czystej probówki o pojemności 50 ml. PEG pozostanie po bokach rury bioreaktora. Dodaj dodatkowe 10 ml, uważając, aby zebrać cały osad PEG. Przenieś wszystko do pojemnika o pojemności 50 ml na łączną objętość 25-30 ml.
    4. Dodać 40 μl DNaseI (10 U/μL). Umieścić w inkubatorze na 1 h 37°C.
      UWAGA: Opcjonalnie po inkubacji DNazy: pobrać 50 μl próbki do Q-PCR.
    5. Wyczyść mieszadła, które były używane do wytrącania PEG, dobrze z roztworem chlorku, a następnie 70% etanolem. Pozostaw mieszadła w 70% etanolu do następnego eksperymentu.
    6. Napełnij probówkę polialomerową o wymiarach 25 mm x 89 mm za pomocą szklanej pipety Pasteura 15,5 ml skoncentrowanego lizatu komórkowego w każdej probówce. Po dodaniu lizatu komórkowego wymień szklaną pipetę Pasteura na nową.
    7. Dodaj roztwory jodiksanolu od 15% do 60%: delikatnie wlej 9 ml 15% roztworu jodiksanolu pod lizat komórkowy. Następnie dodaj 5 ml 25% i 40% roztworów jodiksanolu, a na koniec dodaj 5 ml 60% roztworu jodiksanolu.
    8. Uzupełnij rurkę za pomocą strzykawki z DPBS +/+, aby usunąć większość pęcherzyków powietrza, uważając, aby nie naruszyć warstw jodiksanolu. Uszczelnij rurkę za pomocą elektrycznej nakładki na rurkę.
    9. Wirować w wirniku bez obrotu przez 1 h 10 min przy 490 000 x g w temperaturze 16 °C w ultrawirówce. Wyjmij z ultrawirówki, złóż probówki w metalowym zatrzasku i przygotuj probówki zbiorcze. Otwórz wirnik w masce w przypadku rozlania podczas wirowania.
    10. Przygotuj jedną probówkę o pojemności 50 ml (do wyrzucenia probówki rotora), jedną probówkę o pojemności 15 ml (do zbierania wirusa), strzykawkę o pojemności 5 ml oraz igłę 30 g i 19 G na gradient.
    11. Nakłuć otwór w górnej części rurki igłą 30G. Pozostawić igłę na miejscu. Umieścić igłę 19G na strzykawce.
    12. Ostrożnie przebij rurkę tuż pod granicą faz 40%/60%, którą można zobaczyć za pomocą czerwonego wskaźnika fenolowego. Upewnij się, że skos igły jest skierowany w stronę warstwy 40%.
    13. Wyjmij igłę 30G z górnej części tubki za pomocą ręki niedominującej. Z igłą ściętą do góry, powoli wyekstrahuj wirusa/jodiksanol. Celem jest ekstrakcja od 3 ml do 4,5 ml. Mniej więcej w połowie i dobrze w warstwie 40%/przezroczystej, obróć igłę, aby skos był skierowany w dół i kontynuuj ekstrakcję, aby uniknąć zbierania się z warstwy białka.
    14. Przygotować probówkę o pojemności 50 ml ręką niedominującą, ostrożnie wyjąć igłę, umieszczając probówkę w probówce o pojemności 50 ml i wyrzucić. Rozcieńczyć zawiesinę AAV/jodiksanol 5x w DPBS, napełniając do 15 ml.
    15. Przenieść do odśrodkowej rurki filtracyjnej i odwirować w temperaturze 3428 x g, 4 °C przez 10 minut. Odrzucić przepływ; delikatnie wyjąć uchwyt filtra i przelać dolny pojemnik do butelki na odpady. Dodać 15 ml PBS-5% sacharozy do przefiltrowania i ponownego zawieszenia.
    16. Wirować przy 3428 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Powtórzyć wymianę buforu co najmniej 3 razy. Przechowywać wirusa (~150-250 μL) w temperaturze 4 °C (PHP. Warianty B maksymalnie 3 miesiące) lub podwielokrotność do 50 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C przez długi czas.
      UWAGA: PHP. Warianty kapsydu B są wrażliwe na zamrażanie/rozmrażanie, dlatego należy tego unikać.
    17. Miareczkowanie należy przeprowadzić zgodnie z opisem w poprzednim protokole10.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość laboratoriów akademickich używa komórek HEK293T adherentów do produkcji AAV8,9. Chociaż działa to stosunkowo dobrze, gdy do bezpośredniego wstrzyknięcia potrzebne są niewielkie ilości AAV, 100-krotnie wyższe miano (minimalnie 1 x10 11 GC / mysz) jest potrzebne do osiągnięcia podobnej transdukcji z kapsydami układowymi, takimi jak AAV. Plik PHP.eB.

W tym protokole ustalono produkcję AAV przy użyciu zawiesiny komórek HEK293 hodowanych w stożkowych probówkach. Hodowle na małą skalę można przeprowadzić w probówkach o pojemności 50 ml, a na dużą skalę w probówkach o pojemności 600 ml. W przypadku określonych wytrząsarek (patrz Tabela materiałów) można użyć stojaka, w którym można jednocześnie hodować do 16 dużych probówek. Ten stojak jest używany w połączeniu ze specjalnymi wkładkami do probówek 50 ml (Rysunek 2A). System ten oferuje znaczne oszczędności czasu w segmencie hodowli i transfekcji tego protokołu. Początkowa konfiguracja produkcji została wykonana przy użyciu konstruktów reporterowych dla lucyferazy i białka zielonej fluorescencji (GFP)10,11. Równolegle wyprodukowano konstrukcję GFP na 12 płytkach o długości15 cm 2, zgodnie z opisem we wcześniej opublikowanym protokole12. Średnio uzyskano łączną wydajność 7,7 x 1012 GC przy użyciu polietyleneniminy (PEI) i 2,4 x 1013 GC przy użyciu TransIt (Rysunek 2B). W przypadku PEI jest to prawie 3-krotna poprawa; w przypadku TransIt jest to 9,2-krotna poprawa w stosunku do mian uzyskanych przy użyciu hodowli adherentnej (2,6 x 1012). W przypadku stosowania do transfekcji komórek zawiesinowych, TransIt daje około 3-krotną poprawę wydajności w porównaniu z PEI (Rysunek 2B).

Następnie, wydajność wektorów AAV została przetestowana in vivo. Wektory GFP wyprodukowano za pomocą PEI i TransIt i porównano z wektorami GFP wyprodukowanymi przy użyciu klasycznego systemu adherent. Po 4 tygodniach od wstrzyknięcia myszy (6 tygodni C57BL / 6 samic myszy o wadze 20-25 g) zostały uśmiercone, a ekspresję GFP w mózgach myszy oceniono za pomocą histologii (Figura 3A). Analizę porównawczą przeprowadzono na strzałkowych wycinkach mózgu. Nie zaobserwowano różnicy we wzorcu transdukcji wirusa wytworzonego przy użyciu tych metod produkcji (Ryc. 3B). Oceniono również aktywność lucyferazy wektorów wytworzonych przy użyciu obu metod. Transdukcję mierzono in vivo przez 3 tygodnie; wzorzec ekspresji w czasie jest podobny bez względu na to, który odczynnik do transfekcji jest używany (Rysunek 4).

Następnie, protokół został przetestowany i wdrożony przez innych członków zespołu (Tabela 2). Produkcja innych kapsydów z PEI zakończyła się sukcesem, dając średni plon 3,5 x 1012 wektorów GC. W przypadku produkcji kapsydu B10 można osiągnąć 3-krotną poprawę dzięki zastosowaniu TransIt w porównaniu z PEI. W innym projekcie kilka konstruktów zapakowanych w AAv.PHP.eB dało średnią wydajność 3,7 x 1012, co wystarcza do wstrzyknięcia dożylnie 7 myszy w dawce 5 x 1011 GC na mysz. Wyniki te pokazują, że protokół może być z powodzeniem stosowany przez kilku badaczy do różnych kombinacji kapsydów i konstrukcji.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd produkcji. W dniu 1 (D1) komórki hoduje się w probówkach o pojemności 300 ml. W dniu 2 (D2) komórki są transfekowane odpowiednimi plazmidami. W dniu 5 (D5) komórki są zbierane i poddawane lizie przy użyciu 10-krotnego buforu do lizy. Po lizie resztki komórek są usuwane przez odwirowanie. Następnie lizat komórkowy jest filtrowany w celu usunięcia dużych białek, a wirus AAV jest wytrącany za pomocą glikolu polietylenowego (PEG) 8000. W dniu 6 (D6) przeprowadza się oczyszczanie i zatężanie joduksanolu. Koncentrat PEG z poprzedniego dnia poddaje się działaniu DNazy, a następnie umieszcza się go w gradiencie jodiksanolu. Oczyszczone wektory są następnie odsalane i zagęszczane za pomocą filtra odśrodkowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja inkubatora i wydajność AAV. (A) Komórki produkcyjne wirusa są hodowane w inkubatorze z wytrząsaniem o średnicy wstrząsania 50 cm. Inkubator ten wyposażony jest w płytkę adaptera do probówek o pojemności 600 ml oraz specjalne wkłady do probówek o pojemności 50 ml produkowane przez dział mechatroniki. (B) Po wstępnej konfiguracji, konstrukty reporterowe używają albo polietylenoiniminy (PEI; 7,7 x 1012 GC ogółem, n = 5) lub TransIt (2,4 x 1013 GC ogółem, n = 5) jako metody transfekcji i porównuje się z wydajnościami osiągniętymi przy użyciu klasycznej metody adherentnej (2,6 x 1012 GC ogółem, n = 5), jak opisano w Verhaagen et al.12. Dane są prezentowane jako średnia ± odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wzorzec ekspresji GFP po ocenie in vivo. (A) Schematyczny obraz typowego konstruktu wektora AAV zawierającego wszechobecny promotor CMV natychmiast-wczesny wzmacniacz, promotor β-aktyny kurczaka i miejsce akceptora splicingu β-globiny królika (CAG), a następnie białko zielonej fluorescencji (GFP), posttranskrypcyjny element regulatorowy (WPRE) wirusa zapalenia wątroby typu Woodchuck (WHV) i ogon poliadenylacji (pA)13. Tutaj 6-tygodniowe samice myszy (n=3) otrzymały zastrzyk do żyły ogonowej zawierający 5 x 1011 całkowitych kopii genomowych (gc)/mysz. Po 4 tygodniach od wstrzyknięcia myszy uśmiercono, a mózgi analizowano histologicznie. (B) Reprezentatywny obraz wzoru transdukcji w odcinkach strzałkowych, przy użyciu przylegających komórek HEK293T i komórek zawiesinowych z polietylenoiminą (PEI) lub odczynnikiem do transfekcji TransIt, podobny wzór transdukcji obserwuje się niezależnie od zastosowanej metody produkcji. Podziałka liniowa = 1000 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Podobna aktywność lucyferazy niezależnie od metody transfekcji. (A) Schematyczny obraz użytego konstruktu zawierającego wszechobecny promotor CMV natychmiast-wczesny wzmacniacz, promotor β-aktyny kurczaka i lucyferazy (LUC) miejsca akceptora β-globiny królika (CAG) ze znacznikiem V5 i ogonem poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGHpA), 5 x 1011 GC całkowity/mysz (n = 3) wstrzyknięto przez żyłę ogonową, aktywność lucyferazy w okolicy czaszki (zakreślone na czerwono, na przykładowym obrazie), ponieważ obraz bioluminescencyjny był mierzony co tydzień. (B) Aktywność bioluminescencyjna mierzono jako względne jednostki luminescencji (RLU) przedstawione jako niebieski pasek dla produkcji PEI i brązowy pasek dla TransIt. Nie zaobserwowano istotnych różnic w aktywności lucyferazy w wybranym obszarze mózgu między grupami. Dane są prezentowane jako średnia ± odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Parametry transfekcji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Zyski z wdrożonego protokołu. Protokół zawiesiny stosowany przez innych badaczy do produkcji AAV. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemowe podawanie AAV jest potężnym narzędziem do transferu genów do OUN; jednak produkcja AAV jest kosztownym i pracochłonnym procesem. Dzięki zastosowaniu komórek zawiesinowych zmniejsza się nakład pracy i tworzywa sztuczne w porównaniu z przylegającą kulturą HEK293T na płytkach o długości15 cm2 . Co więcej, zastosowane tutaj rurki stożkowe są łatwe w obsłudze i maksymalizują wykorzystanie przestrzeni laboratoryjnej. Protokół został opracowany przez dwóch badaczy, a następnie zastosowany przez innych w laboratorium. Seria produkcji przeprowadzona przez trzech niezależnych badaczy przyniosła średnio wystarczającą liczbę wektorów na partię, aby wstrzyknąć 6-7 myszy.

Zastosowanie ogniw zawiesinowych HEK293 zostało opisane wcześniej13,14. Jednak opisana zawiesinowa linia komórkowa nie jest swobodnie dostępna do celów badawczych. Jest to wąskie gardło dla badaczy akademickich przy stosowaniu opisanych metod. Zawiesinowa linia komórkowa opisana w niniejszym protokole jest swobodnie dostępna do celów badawczych. Hodowla komórek zawiesinowych została przeprowadzona w stożkowych probówkach zamiast w probówkach Erlenmeyera, aby zaoszczędzić miejsce i czas. W przypadku Erlenmeyera można hodować do 4 produkcji jednocześnie, w porównaniu z 12 produkcjami przy użyciu rurek stożkowych. Probówki stożkowe można bezpośrednio przenieść do wirówki w celu zbioru.

Jedną z alternatywnych możliwości systemu hodowli komórek zawiesinowych jest układ bakulowirusowy. Zaletą systemu baculo jest to, że te komórki i pożywki są publicznie dostępne i można je łatwo zastosować. Dla naukowców dostępne są repozytoria, takie jak Addgene, zawierające dużą bibliotekę gotowych do użycia plazmidów transferowych AAV12. Chociaż mogą one również zawierać zastrzeżenia, takie jak wadliwe ITR, służą jako dobre źródło eksperymentów typu plug-and-play. Zdecydowano się zachować system produkcyjny oparty na HEK293, ponieważ dostępne plazmidy mogą być bezpośrednio wykorzystane do produkcji bez przenoszenia konstruktu na bakulowirusa.

Do transfekcji polietylenoimina jest stosunkowo tania i dlatego jest odczynnikiem do transfekcji z wyboru. Jako alternatywę oceniono nowatorską metodę transfekcji (TransIt) w celu zwiększenia wydajności wektorów. Zaobserwowano trzykrotną poprawę przy użyciu o połowę mniejszej ilości plazmidów. To sprawia, że TransIt jest interesującym alternatywnym odczynnikiem do transfekcji, gdy potrzebne są większe zapasy. Ograniczeniem tego jest koszt, co czyni go mniej interesującym dla małych partii.

Podsumowując, przedstawiono tutaj protokół, który można wykorzystać do produkcji wysokowydajnego AAV w komórkach zawiesinowych w warunkach laboratorium akademickiego. Opisano narzędzia, które mogą być używane w laboratorium akademickim do produkcji AAV z wysoką wydajnością.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Darmowa próbka TransIT została dostarczona przez firmę Mirus do wstępnych testów, po których odczynnik został zakupiony do dalszego wykorzystania. Autorzy nie mają żadnych innych konkurencyjnych interesów finansowych, o których mogliby informować.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem z funduszu badawczego Królewskiej Holenderskiej Akademii Sztuk i Nauk (KNAW) oraz grantem z Start2Cure (0-TI-01). Dziękujemy Leishy Kopp za jej wkład i rady w tworzeniu protokołu. Figury zostały stworzone przy użyciu Biorenderu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
39 mL, Rurka polipropylenowa okrągła z szybkozłączką, 25 x 89 mm - 50PkBeckman Coulter342414
Adapter 600 mL probówki stożkowe, do rotora S-4x1000, eppendorf5920701002
Adapter Plate pasuje do 16 bioreaktorów 600 mlInfors HT/ TPP587633
Nasadki aerozolowe, do okrągłych wiader 750 mleppendorf5820747005
5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, z wirnikiem S-4x1000, okrągłymi wiadrami i adapterem 15 mL/50 mL rurki stożkoweeppendorf5948000315
Woda destylowanaGibco
Rekombinowana DNaza I, bez RNazRoche4716728001
Rekombinowana DNaza I, bez RNazRoche4716728001
DPBS, wapń, magnezGibco14040091
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGibco14190144
Fisherbrand Jednorazowe filtry PES 0,2Fisher
Fisherbrand Jednorazowe jednostki filtrujące PES 0,45
Uchwyt na probówki hodowlane 50 ml pasuje również do probówki FalconInfors HT/ TPP31362
Uchwyt do probówki do hodowli komórkowych 600 mlInkubator Infors HT/ TPP66129
Minitron 50 mmInfors HT500043
LV-MAX Medium produkcyjneGibco
N-Tray UniversalInfors HT/ TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - Liniowy chlorowodorek polietyleniminy klasy transfekcyjnej (MW 40,000)Poly-sciences24765-100
Czerwony roztwór fenolowy Sigma-Aldrich72420100
Poli(glikol etylenowy) 8000Sigma-Aldrich89510
TransIT-VirusGENMirusMir 6706
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Gibco5250061
Bioreaktory TubeSpin-50mlTTP87050
Bioreaktory TubeSpin-600mlTTP87600
Komórki do produkcji wirusówGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363
Wirówka 15230147FB12566504 Fisher FB12566505 A3583401

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).
  2. Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).
  3. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  4. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  5. Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
  6. Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
  7. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
  8. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
  9. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960(2019).
  10. Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
  11. Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
  12. Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
  13. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  14. Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Produkcja AAVwektory adeno zale newysokowydajna produkcja AAVpotr jna transfekcjagradient jodiksanolutransfekcja z u yciem polietylenoiminyfiltracja od rodkowao rodkowy uk ad nerwowyoczyszczanie wektor w wirusowych

Powiązane artykuły