Method Article

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

DOI:

10.3791/66533

⸱

May 17th, 2024

 , 
1Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (IRIBHM), Université Libre de Bruxelles (ULB), 2ULB Institute of Neuroscience (UNI), Université Libre de Bruxelles (ULB)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej to bardzo dynamiczne komórki, a ich migracja i kolonizacja miąższu mózgu jest kluczowym krokiem dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu. Zewnętrznie rozwijające się zarodki danio pręgowanego posiadają przezroczystość optyczną, co wraz z dobrze scharakteryzowanymi transgenicznymi liniami reporterowymi, które fluorescencyjnie znakują mikroglej, sprawiają, że danio pręgowany jest idealnym modelem kręgowców do takich badań. W tym artykule wykorzystujemy unikalne cechy modelu danio pręgowanego do wizualizacji dynamiki komórek mikrogleju in vivo i w warunkach fizjologicznych. Używamy mikroskopii konfokalnej do zarejestrowania timelapse komórek mikrogleju w tektum wzrokowym zarodka danio pręgowanego, a następnie wyodrębniamy dane śledzenia za pomocą oprogramowania IMARIS 10.0 w celu uzyskania ścieżki migracji komórek, średniej prędkości i rozmieszczenia w tektum wzrokowym na różnych etapach rozwoju. Protokół ten może być użytecznym narzędziem do wyjaśnienia fizjologicznego znaczenia zachowania mikrogleju w różnych kontekstach, przyczyniając się do głębszej charakterystyki tych wysoce ruchliwych komórek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako makrofagi rezydentne w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), mikroglej reprezentuje odrębną populację nieneuronalną, która stanowi do 15% wszystkich komórek glejowych w dorosłym mózgu. Badanie biologii mikrogleju zyskuje coraz większe zainteresowanie w ostatnich latach ze względu na ich ugruntowane znaczenie w rozwoju, fizjologii i chorobach1. W warunkach fizjologicznych komórki mikrogleju są bardzo dynamiczne, stale badając miąższ mózgu2,3. To zachowanie pozwala mikroglejowi kolonizować mózg i odgrywać kluczowe role w jego rozwoju, takie jak kształtowanie obwodów neuronalnych4, przycinanie synaptyczne5 i waskulogeneza6. Co więcej, ta wrodzona dynamiczna natura pozwala mikroglejowi stale monitorować OUN pod kątem oznak infekcji, urazów lub jakichkolwiek odchyleń od homeostazy7. Aby przeanalizować tę skomplikowaną dynamikę komórek, niezbędne jest obrazowanie mikrogleju na żywo w przestrzeni i czasie. Na szczęście przezroczystość optyczna zewnętrznie rozwijających się zarodków danio pręgowanego, w połączeniu z dostępnością dobrze scharakteryzowanych transgenicznych linii reporterowych, które fluorescencyjnie znakują mikroglej, pozycjonuje danio pręgowanego jako idealny model kręgowców do takich badań. Obrazowanie na żywo w zarodkach danio pręgowanego oferuje nieinwazyjne podejście, które nie wymaga operacji ani rozległej manipulacji tkankami, minimalizując potencjalne zaburzenia stanu OUN. Jest to kluczowa kwestia podczas badania komórek mikrogleju, ponieważ są one bardzo wrażliwe nawet na subtelne zmiany w środowisku zewnątrzkomórkowym8.

Tutaj udostępniamy wytyczne do skutecznego śledzenia ruchów komórek mikrogleju 3D w zarodku danio pręgowanego, co pozwala na bezprecedensowy wgląd w zachowanie mikrogleju w nienaruszonej architekturze rozwijającego się miąższu mózgu (zobacz Rysunek 1 dla graficznego przeglądu protokołu). Ten protokół krok po kroku szczegółowo opisuje, jak skonfigurować i zobrazować mikroglej danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju oraz jak wyodrębnić dane o wysokiej rozdzielczości dotyczące ruchliwości komórek mikrogleju, aby uzyskać cenny wgląd w ich wzorce migracji i reakcje na sygnały środowiskowe. Pokazujemy również, że protokół ten można dostosować do wykonywania wielokolorowego obrazowania na żywo, rozszerzając w ten sposób jego zastosowanie do badania mikrogleju w połączeniu z liniami transgenicznymi, które oznaczają sąsiednie komórki, w tym neurony3, oligodendrocytes9 i endothelial cells10 (jak pokazano w Rysunek 2). Dodając do zestawu narzędzi, który pozwala bezpośrednio obserwować i charakteryzować dynamikę zachowania mikrogleju w czasie rzeczywistym i w ich naturalnym środowisku, protokół ten prawdopodobnie przyczyni się do lepszego wyjaśnienia funkcjonalności mikrogleju we wczesnym okresie rozwoju, zarówno w fizjologii, jak i chorobie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany był utrzymywany w standardowych warunkach, zgodnie z FELASA42 i instytucjonalnymi (Université Libre de Bruxelles, Bruksela, Belgia; ULB) wytycznych i przepisów. Wszystkie procedury doświadczalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Dobrostanu Zwierząt ULB (CEBEA) z ULB.

1. Hodowla danio pręgowanego i przygotowanie zarodków

UWAGA: Transgeniczna linia zebry danio pręgowanego Tg(mpeg1:eGFP)gl22, która wyraża fluorescencyjne białko eGFP w makrofagach, w tym mikrogleju, została użyta do wygenerowania danych śledzenia pokazanych w tym protokole. Inne linie reporterowe makrofagów są dostępne w ZIRC i mogą być również używane. Wybierając linię transgeniczną, należy wziąć pod uwagę, że wysoka intensywność sygnału ułatwi akwizycję obrazu i segmentację komórek.

  1. Utrzymuj danio pręgowanego (Danio rerio) w temperaturze 28 °C i zarządzaj nim zgodnie z ustalonymi protokołami11.
  2. Stymuluj krycie, umieszczając samice i samce ryb razem w zbiorniku hodowlanym, z siatkowym dnem i separatorem, późnym popołudniem przed pożądaną datą narodzin zarodków. Wyjmij separator następnego ranka, aby zmierzyć czas krycia ryb.
  3. Zebrać zapłodnione jaja za pomocą siatki i przenieść je na 100 mm szalkę Petriego zawierającą pożywkę E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4) z 0,01% błękitu metylenowego. W zależności od tła genetycznego użytej linii transgenicznej danio pręgowanego, jeśli tworzenie pigmentu ma zostać zahamowane w celu ułatwienia obrazowania, należy dodać 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU) do buforu E3, w którym rozwijają się zarodki, zaczynając od 6 godzin po zapłodnieniu (hpf) i odświeżając roztwór co 2 dni, aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju.
    UWAGA: Aby uniknąć długotrwałej ekspozycji na PTU, która mogłaby wpływać na rozwój embrionalny12, sugeruje się użycie, jeśli jest dostępna, linii transgenicznej na tle z niedoborem pigmentu, takiej jak Casperw2, która pozwala na wyraźne obrazowanie bez konieczności wystawiania zarodków na PTU przez dłuższy okres czasu13.
  4. Jeśli zarodki, które mają być zobrazowane, są młodsze niż 3 dni po zapłodnieniu (dpf), należy je zdechorionować w temperaturze 24 hpf. Użyć mikroskopu stereoskopowego, aby potwierdzić, że wszystkie zarodki zostały pozbawione naczyniówki i nie zostały uszkodzone przez leczenie enzymatyczne (patrz krok 1.4.2).
    1. W przypadku ograniczonej liczby jaj zrób to ręcznie, używając cienkich kleszczy preparacyjnych, aby uszczypnąć kosmówkę i wyciągnąć na zewnątrz, ostrożnie uwalniając każdy zarodek z kosmówki.
    2. W przypadku większej liczby jaj należy przeprowadzić dechorionację enzymatyczną, inkubując jaja luzem w temperaturze pokojowej (RT) w roztworze pronazy o stężeniu 1 mg/ml w pożywce E3 przez krótki okres (zwykle 5-10 minut, aż kosmówka pęknie pod wpływem delikatnego świszczenia). Następnie roztwór Pronazy jest odrzucany, a zarodki są dokładnie płukane 3x świeżym E3, aby usunąć pozostałą kosmówkę i resztki enzymu.

2. Montaż danio pręgowanego

  1. Przygotować 1% niskotopliwy roztwór agarozy w buforze E3. Schłodzić agarozę do temperatury 37 °C w stacjonarnym bloku grzewczym i dodać świeżo przygotowany roztwór metanosulfonianu trikainy (160 mg/l), który pomoże utrzymać zarodki w stanie znieczulenia podczas obrazowania. Zwiruj roztwór, aby dokładnie go ujednorodnić.
  2. Znieczulić zarodki przez dodanie 160 mg/l metanosulfonianu trikainy do szalki Petriego zawierającej zarodki w buforze E3. Sprawdź, czy ruch został zatrzymany i wybierz zarodki danio pręgowanego o pożądanej fluorescencji. Sprawdź stan zdrowia zarodka, wizualizując bicie jego serca za pomocą mikroskopu stereoskopowego w jasnym polu. Za pomocą pipety transferowej z szeroką końcówką narysuj jeden lub do trzech wybranych zarodków i przenieś je na dolną szklaną płytkę obrazową.
  3. Pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą pipety usunąć jak najwięcej pożywki, uważając, aby nie dotknąć ani nie uszkodzić zarodków; następnie zastąp pożywkę wcześniej przygotowanym 1% niskotopliwym roztworem agarozy. Następnie użyj plastikowej, cienko-zwężającej się końcówki przymocowanej do końca igły do drażnienia, aby delikatnie docisnąć każdy zarodek do dna płytki obrazowej, ustawiając go tak, aby jego grzbietowa strona była skierowana w stronę szkła, aby zapewnić dobry widok na tekturę wzrokową i minimalną ilość niskotopliwej agarozy między zarodkiem a szkłem.
  4. Natychmiast zobrazuj zamontowany zarodek za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w wysokiej jakości obiektyw Plan Apo (10x/0,45 Plan Apo lub 20x/0,75 Plan Apo tutaj). Jeśli timelapse będzie trwał przez dłuższy czas (ponad godzinę), dodaj jedną lub dwie krople buforu E3 z metanosulfonianem trikainy (160 mg/L) do dolnej szklanej płytki obrazowej, aby zapobiec nadmiernemu wysychaniu niskotopliwej agarozy.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby poczekać, aż agaroza całkowicie się zestali przed dodaniem buforu E3 i pożywki z metanosulfonianu trikainy do dysku obrazowania; W przeciwnym razie ryba mogłaby poruszać się powoli na boki i osiowo, powodując w ten sposób dryf próbki w timelapse.
  5. Przejdź do konfiguracji akwizycji timelapse na żądany czas: ustaw rozdzielczość obrazu na 1,024 x 1,024, przy rozmiarze piksela 0,49 μm. Zbieraj warstwy optyczne w odstępach co 2-3 μm, aby zapewnić akceptowalną rozdzielczość na osi z. W zarodku danio pręgowanego należy zamknąć tektum nerwu wzrokowego w stosie z o wielkości 100-150 μm, w zależności od zastosowanego etapu rozwoju. Aby zapewnić pomyślne śledzenie komórek, zachowaj odstęp czasu między klatkami od 30 s do 60 s.

3. Analiza śledzenia i eksport danych

  1. Przekonwertuj plik timelapse do formatu IMS za pomocą oprogramowania do konwersji plików Imaris (patrz Spis materiałów). Po uruchomieniu oprogramowania przeciągnij i upuść pliki do obszaru wprowadzania lub użyj przycisku Dodaj pliki, aby wybrać je ręcznie. W menu Wyjście wyznacz lokalizację przekonwertowanych plików, wybierając ten sam folder, co pliki wejściowe lub określając konkretny folder. Upewnij się, że wymiary wyświetlanego rozmiaru woksela są poprawne, klikając przycisk Ustaw rozmiar woksela, a po zweryfikowaniu rozmiaru woksela naciśnij przycisk Rozpocznij wszystko, aby rozpocząć konwersję pliku (patrz Plik uzupełniający 1, aby uzyskać przewodnik krok po kroku dotyczący analizy wszystkich danych).
    UWAGA: Jeśli timelapse został wykonany na dwóch lub więcej zarodkach równolegle, plik zostanie automatycznie podzielony na pojedyncze pozycje, rozdzielając każdy zarodek na różne pliki. Możliwe jest korzystanie z oprogramowania w trybie wsadowym oraz przesyłanie i konwertowanie wielu plików w tym samym czasie. Pliki IMS zostaną utworzone i zapisane w wybranym folderze docelowym lub folderze, w którym znajdują się pliki wejściowe.
  2. Po uruchomieniu pozwól, aby oprogramowanie analityczne uruchomiło się na Arenie; kliknij Obserwuj folder, aby otworzyć wcześniej przekonwertowany plik. Po załadowaniu pliku do oprogramowania użyj widoku plasterków, aby przewinąć stos z za pomocą suwaka na pasku narzędzi plasterków znajdującym się po lewej stronie obszaru widoku i zmierz średnice niektórych komórek, rysując średnicę wybranych komórek za pomocą wskaźnika. Kliknij i przeciągnij myszą, aby narysować segment obejmujący rdzeń komórki; Zwróć uwagę na długość segmentu narysowanego na pasku narzędzi Miarka, znajdującym się po prawej stronie obszaru obserwacji.
    UWAGA: Korzystając z ustawień obrazowania w kroku 2.5, można oczekiwać, że średnica ciała komórki będzie wynosić od 6 μm do 8 μm.
  3. Aby automatycznie wykryć komórki, wróć do widoku 3D i kliknij ikonę punktu na pasku narzędzi obiektu, aby dodać nowy obiekt Punkty do listy obiektów i otwórz kreatora automatycznego tworzenia punktów. W pierwszym kroku kreatora zaznacz opcję, aby podzielić na segmenty tylko interesujący Cię obszar. Następnie włącz opcję Śledź miejsca (w czasie), aby obliczyć dane śledzenia, a także statystyki obiekt-obiekt, aby umożliwić porównanie spotów i rozszerzyć zakres danych, które będą dostępne w dalszej części analizy. Na koniec kontynuuj w kreatorze, klikając przycisk Dalej w prawym dolnym rogu okna kreatora.
  4. W drugim kroku przejdź do określenia obszaru zainteresowania (ROI), który otacza tektum wzrokowe zarodka. Zmodyfikuj rozmiar ROI, klikając i przeciągając małe białe strzałki znajdujące się na każdej jego powierzchni. Po zdefiniowaniu rozmiaru ROI rozszerz go na wszystkie nagrane klatki, dostosowując przedział czasu.
  5. Następnie wybierz jako Kanał źródłowy kanał używany do wykrywania komórek i ustaw pomiar średnicy komórki, uzyskany wcześniej w kroku 3.2, jako Szacowana średnica XY. Włącz opcję Odejmowanie tła i kliknij Dalej.
  6. Na tym etapie kreatora tworzenia punktów oprogramowanie zawiera krok filtrowania jakości, w którym plamy są filtrowane według natężenia sygnału mierzonego w środku każdego punktu; w kanale, w którym wykryto plamy. Dostosuj próg intensywności, wprowadzając wartość bezpośrednio w polu danych dla dolnego i górnego progu lub przeciągając odpowiednie kolorowe linie na histogramie pokazanym u dołu kreatora tworzenia, tak aby wykryte zostały wszystkie komórki, w tym te zlokalizowane głębiej w tkance, które zwykle wykazują niższą intensywność sygnału. Wszystkie te zmiany są jednocześnie widoczne w obszarze obserwacji.
    UWAGA: W tym momencie można zaobserwować wiele miejsc oznaczających pojedynczą komórkę, ale można to skorygować w dalszej części analizy.
    W dłuższych filmach poklatkowych, jeśli widoczne jest fotowybielanie, sprawdź obszar widoku wielu klatek przed ustawieniem progu, aby upewnić się, że wszystkie komórki są również wykrywane w najnowszych, a tym samym słabszych klatkach.
  7. Po spełnieniu oczekiwań kliknij przycisk Dalej, aby zatwierdzić wybrany próg jakości. Wszystkie miejsca spełniające parametr progowania jakości i mające średnicę zgodną z szacowaną średnicą XY zostaną oznaczone jako spot. Zwizualizuj to jako podgląd w obszarze obserwacji, gdzie plamy spełniające te dwa parametry zostaną nałożone na kanał źródłowy.
  8. W następnym kroku wybierz Ruch autoregresyjny jako algorytm śledzenia do śledzenia komórek, które mają mniej lub bardziej ciągły ruch. Oceń najdłuższą odległość, jaką komórka przemieszcza się między dwoma punktami czasu, uważnie obserwując ruch punktów między dwiema klatkami, a następnie wprowadź szacowaną liczbę w polu Maksymalna odległość. Jest to odległość, na jaką miejsce może odchylić się od przewidywanej przyszłej pozycji.
  9. Ustaw maksymalny rozmiar odstępu na najmniejszą liczbę punktów czasowych, w których punkt może zniknąć bez przerywania ścieżki. Jeśli odstęp między klatkami jest krótszy niż 60 s, użyj rozmiaru 3. Jeśli odstęp czasu między klatkami jest dłuższy, zwiększ maksymalny dozwolony rozmiar odstępu, aby zmniejszyć fragmentację ścieżki.
  10. Włącz opcję Wypełnij luki wszystkimi wykrytymi obiektami, aby obniżyć próg wykrywania w pobliżu oczekiwanej pozycji przewidywanej przez algorytm śledzenia i połączyć ścieżki, które zostały przerwane przez awarię wykrywania punktowego. Na koniec kliknij Dalej i pozwól oprogramowaniu automatycznie wygenerować ścieżki dla wszystkich wcześniej wygenerowanych miejsc.
  11. Jeśli uzyskane ścieżki wydają się być zbyt liczne lub pofragmentowane, wróć do kreatora tworzenia, klikając przycisk Poprzedni i dostosuj wcześniej zdefiniowaną maksymalną odległość, zwiększając lub zmniejszając liczbę, aż większość uzyskanych ścieżek będzie reprezentatywna dla ruchów komórek.
    UWAGA: Liczba śladów powinna w przybliżeniu odpowiadać liczbie komórek mikrogleju, a zatem wahać się od 30 do 50, w zależności od wieku zarodka. Jednak przed zakończeniem analizy spodziewana jest wyższa liczba ze względu na błędne ścieżki.
  12. Po obliczeniu ścieżek oprogramowanie zawiera krok filtrowania, aby odfiltrować wszystkie bardzo krótkie ścieżki, ponieważ często są one niedokładne lub niepouczające. Wyklucz utwory krótsze niż 3-8 minut (min), wprowadzając wartość bezpośrednio w polu danych dla dolnego limitu filtra czasu trwania ścieżki lub przeciągając odpowiednie kolorowe linie na histogramie pokazanym na dole kreatora tworzenia. Kliknij Dalej, aby zatwierdzić filtr i przejść dalej w kreatorze tworzenia.
    UWAGA: Jak wspomniano wcześniej, modyfikując maksymalny (maksymalny) i minimalny (minimalny) próg czasu trwania ścieżki, możliwe jest wyświetlenie podglądu ścieżek, które zostaną przefiltrowane i wykluczone z analizy. Przefiltrowane ścieżki można następnie powielić w nowym obiekcie w celu dalszej analizy. Dokładny próg czasowy filtrowania może się różnić w zależności od wyników poprzedniego kroku kreatora tworzenia. Zalecamy dostosowanie tych ustawień filtrów poprzez przejrzenie podglądu w obszarze widoku w celu uzyskania optymalnych wyników.
  13. Ponieważ linia transgeniczna Tg(mpeg1:eGFP) znakuje wszystkie fagocyty jednojądrzaste, makrofagi skóry oprócz mikrogleju będą również wykrywane w filmach poklatkowych. Ręcznie usuń z analizy ślady wygenerowane przez makrofagi skórne, aby skupić się na mikrogleju miąższowym mózgu (Rysunek 3).
  14. Ręcznie popraw inne potencjalne błędy na ścieżkach w edytorze ścieżek, w którym każdy punkt danych jest wyświetlany jako obiekt na ścieżce. Aktywuj przycisk trybu wyboru okręgu po prawej stronie obszaru widoku i podświetl ścieżki, które wymagają modyfikacji lub regulacji. Po wybraniu problematycznej ścieżki, za pomocą przycisków łączenia i rozłączania, edytuj ją, aby poprawnie reprezentowała ruchy komórki. Użyj edytora ścieżek, aby również zaznaczyć i usunąć zduplikowane pojedyncze punkty lub małe fragmenty ścieżek, które błędnie reprezentują tę samą komórkę, zaznaczając je w trybie zaznaczania okręgu i naciskając Canc lub Delete, aby je wyeliminować.
    UWAGA: Jeśli ustawienia śledzenia są poprawne, ten krok powinien być wymagany tylko dla niewielkiego odsetka śledzonych komórek.
  15. Jeśli linia reporterowa mikrogleju jest używana w połączeniu z fluorescencyjnymi transgenikami znakującymi inne typy komórek w miąższu, wykonaj segmentację jako nowy obiekt powierzchniowy lub obiekt punktowy, aby je uwidocznić. Aby to zrobić, powtórz powyższe kroki (od kroków 3.2 do 3.14), modyfikując wejście kanału źródłowego w kroku 3.5, tak aby było ono używane do obrazowania drugiej populacji komórek, i zadbaj o dostosowanie parametrów opisowych specyficznych dla komórek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak szacowana średnica XY (krok 3.5), maksymalna odległość (krok 3.8) do nowej populacji komórek. Inne kroki można powtórzyć bez zmian.
    UWAGA: W przypadku tworzenia nowej powierzchni, Szacowana średnica XY jest zastępowana opcją progowania opartą na odejmowaniu tła, gdzie dane wejściowe, które należy podać, to średnica największej kuli, która mieści się w obiekcie. Tę wartość można oszacować w widoku przekroju za pomocą paska narzędzi Miarka, jak wyjaśniono w kroku 3.2.
  16. Po uzyskaniu uzyskanych ścieżek wyodrębnij żądane statystyki śledzenia z zakładki Statystyki. Klikając przycisk ustawień, wybierz, które statystyki będą obliczane dla każdego wcześniej utworzonego obiektu punktowego lub obiektu powierzchni. W przypadku, gdy w tej samej analizie utworzono więcej obiektów, dwa obiekty punktowe lub obiekt punktowy i powierzchniowy, statystyki przedstawiające względne położenie jednego obiektu względem drugiego, takie jak najkrótsza odległość między nimi, będą również dostępne do eksportu.
    UWAGA: Wszystkie żądane wartości mogą być wartościami określonymi lub średnimi, a wszystkie nieprzetworzone dane można pobrać jako plik z wartościami oddzielonymi przecinkami (CSV) za pomocą przycisków u dołu karty Statystyki. Pod warunkiem, że analiza obejmuje również inne typy komórek, dostępne będą również dodatkowe statystyki dotyczące względnej odległości jednego obiektu od drugiego.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki mikrogleju wyrażające białko zielonej fluorescencji (eGFP) oraz komórki śródbłonka wyrażające DsRed w Tg(mpeg1:eGFPgl22; KDRL:CRES898; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRedexpress,sd5) potrójne transgeniczne zarodki14 zostały zobrazowane przy 3 dpf, zgodnie z opisanym protokołem. Pojedynczy zarodek danio pręgowanego umieszczono w 1% niskotopliwej agarozie na dolnej szklanej płytce, a proces obrazowania nie utrudniał wzrostu zarodka w czasie pozyskiwania. Timelapse został zarejestrowany za pomocą komercyjnego systemu mikroskopii konfokalnej ze skaningiem punktowym wyposażonego w suchą soczewkę obiektywową 10x 0,45 NA, a do obrazowania odpowiednio komórek mikrogleju i śródbłonka użyto laserów wzbudzających 488 nm i 561 nm. Ponadto interwał czasowy, rozdzielczość obrazu, rozmiar piksela i krok z wynosiły odpowiednio 30 sekund (s), 1024x1024, 0,49 μm i 2,5 μm. Nagranie poklatkowe trwało 3,5 godziny (h).

Uzyskane pole widzenia obejmowało całą głowę embrionu, ale analiza skupiała się szczególnie na tektum wzrokowym, ponieważ w pierwszym tygodniu rozwoju, mikroglej jest głównie ograniczony do warstwy somy neuronalnej w tym rejonie grzbietowego śródmózgowia, co pozwala badaczom na jednoczesną wizualizację całej populacji15. Analiza śledzenia 3D została przeprowadzona przy użyciu Imaris 10.0, jak wyjaśniono powyżej. Jak pokazano na rysunku Rysunek 4, śledzenie zakończyło się sukcesem, co zaowocowało 25 ścieżkami, odpowiadającymi oczekiwanej liczbie komórek mikrogleju obecnych w tektum wzrokowym przy 3 dpf16. Wymagana była minimalna ręczna korekta ścieżek. Rysunek 5 pokazuje przykład danych, które można wydobyć z udanego eksperymentu śledzącego. Jednoczesne znakowanie makrofagów i komórek śródbłonka pozwala na ilościowe określenie położenia mikrogleju względem tego ostatniego, co pozwala naukowcom na wizualizację względnej odległości każdej komórki do najbliższej komórki śródbłonka w czasie oraz zbadanie częstotliwości i liczby potencjalnych interakcji (Rysunek 5).

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd procedury eksperymentalnej. (A) Przygotowanie i znieczulenie zarodków danio pręgowanego. (B) Montaż i pozycjonowanie próbki. (C) Akwizycja obrazu. (D) Przetwarzanie obrazu i ekstrakcja danych dotyczących ruchliwości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Obrazowanie mikrogleju i interakcje ze środowiskiem komórkowym mózgu w zarodku danio pręgowanego. (A) Obraz w jasnym polu embrionalnej głowy i mózgu danio pręgowanego o natężeniu 3 dpf (widok grzbietowy), oznaczający tektum wzrokowe i tyłomózgowie. Mózg embrionalnego danio pręgowanego można na tym etapie zobrazować w całości ze względu na jego niewielki rozmiar i przezroczystość optyczną. (B-D) Lokalizację i zachowanie mikrogleju można zobrazować za pomocą linii transgenicznych, takich jak (B,C) Tg(mpeg1:eGFP)gl22 i (D) Tg(mpeg1:mcherry)gl23, i skupiając się na OT. (B) Neurony i ich ciała komórkowe można zidentyfikować za pomocą linii reporterowej Tg(XlTubb:D sRed)zf148, a interakcje mikrogleju-neuron można zwizualizować poprzez połączenie dwóch kanałów w linie, które współwyrażają oba transgeny. Widoczne jest połączenie sygnałów zielonego (mikroglej) i czerwonego (neurony, w kolorze magenta). (C,D) Linie reporterowe mogą również rzucić światło na interakcje mikrogleju (na zielono) z komórkami śródbłonka, tutaj oznaczonymi na czerwono za pomocą (C) podwójnego Tg(kdrl:cres898; actb2: LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress, sd5) transgeniczne lub z komórkami glejowymi, takimi jak oligodendrocyty i ich prekursory, przy użyciu (D) podwójnej Tg(olig2:EGFP; MPEG1:MCHERRY ) linia transgeniczna. 1: oligodendrocyty i komórki progenitorowe w OT, 2: neurony eurydendroidowe w móżdżku. Podziałka = 50 μm. Skróty: dpf = dni po zapłodnieniu; OT = tectum optyczne; HB = tyłomózgowie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Morfologiczna i przestrzenna rozbieżność między makrofagami skóry a mikroglejem w zarodku danio pręgowanego o wartości 3 dpf. (A,B) Widok grzbietowy zarodka zebry zebry Tg(mpeg1:eGFP)gl22 na 3 dpf, przedstawiający (A) komórki mikrogleju miąższowego (oznaczone amarantowymi gwiazdkami) w porównaniu z makrofagami skóry (białe gwiazdki), zidentyfikowane na podstawie ich względnego położenia wzdłuż osi z, jak widać na (B), który przedstawia monochromatyczny obraz 3D renderowany z kodowaniem kolorami w osi z. (C,D) Widok boczny (C) A i (D) B, pokazujący głębokość z komórek mpeg1: eGFP+ w głowie zarodka i podkreślający powierzchowną lokalizację makrofagów skóry w porównaniu z komórkami mikrogleju. (E-K) Duże powiększenie każdej komórki oznaczone gwiazdką w A i B, zapewniające szczegółową wizualizację odrębnych morfologii między (E-G) ameboidalnym mikroglejem a (H-K) wydłużonymi makrofagami skóry. Podziałka = 30 μm. Skrót: dpf = dni po zapłodnieniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Śledzenie komórek mikrogleju w zarodku danio pręgowanego o wartości 3 dpf. (A) Widok grzbietowy głowy 3 dpf Tg(kdrl:cres898; actb2: LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress,SD5; mpeg1:eGFPgl22) potrójny transgeniczny zarodek, pokazujący mikroglej (zielony) i renderowanie powierzchni naczyń (magenta). (B-D) Reprezentatywne śledzenie ruchów mikrogleju w oknie czasowym (B) 3,5 godziny. Obserwuje się, że poszczególne komórki podążają złożonymi trajektoriami. (C) Szczegół z timelapse, pokazujący powiększony widok obszaru w B zamkniętego przez przerywany kwadrat. Zaprezentowano sześć klatek z filmu (w odstępie 45 minut), dokumentujących nawiązywanie przejściowych kontaktów mikrogleju z komórkami śródbłonka w ich mikrośrodowisku. (D) Trajektorie migracji poszczególnych komórek mikrogleju w obrębie tektum optyki, przy czym osie X, Y i Z reprezentują wymiary przestrzenne. Podziałka = 50 μm. Skrót: dpf = dni po zapłodnieniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Wizualizacja uzyskanych danych. Przykład danych przestrzennych, które można uzyskać za pomocą opisywanego protokołu. Wykresy przedstawiają (A) średnią prędkość komórek mikrogleju, (B) średnią odległość, jaką pokonują w ciągu 1 godziny, (C) ich średnie kwadratowe przemieszczenie oraz (D) ich rozmieszczenie w przestrzeni w różnych momentach. Renderowanie powierzchni naczynia pozwoliło również na zmierzenie najkrótszej odległości między komórkami mikrogleju a komórkami śródbłonka w danym momencie, zarówno na poziomie (E) pojedynczej komórki, jak i jako (F) średnia globalna. W przypadku A, B i D każda kropka reprezentuje pojedynczą komórkę. N = jeden zarodek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół umożliwia obrazowanie in vivo dynamiki mikrogleju w zarodku kręgowców i wizualizację uzyskanych danych dotyczących ruchliwości. Kolonizacja mikrogleju w rozwijającym się mózgu zachodzi bardzo wcześnie podczas embriogenezy i poprzedza krytyczne wydarzenia, takie jak szczyty neurogenezy, astroglejogeneza, oligodendrogeneza i wiele innych procesów komórkowych17. Nie jest zatem zaskakujące, że mikroglej odgrywa ważne funkcje w kształtowaniu określonych aspektów rozwoju mózgu18, na przykład poprzez regulację różnicowania neuronów, migracji i przeżycia 19,20,21, a także przycinanie synaps 5 i mielinizację 22,23,24.

Coraz częściej uznaje się również udział dysfunkcyjnego mikrogleju w patogenezie i/lub progresji zaburzeń neurorozwojowych25. Rzeczywiście, wczesna obecność mikrogleju w tworzącym się mózgu naraża te komórki na różne stany fizjologiczne26 i zmiany środowiskowe. Może to mieć znaczący wpływ, biorąc pod uwagę, że mikroglej jest długowiecznymi komórkami zarówno u gryzoni, jak i u ludzi, utrzymywanymi przez całe życie poprzez samoodnawianie się lokalnych komórek progenitorowych 27,28,29. Uważamy, że protokół ten może służyć jako potężne narzędzie do lepszego scharakteryzowania zachowania mikrogleju w tych odrębnych stanach fizjologicznych, gdy rozwijają się, dojrzewają i ustanawiają swoją sieć podczas kolejnych etapów morfogenezy mózgu.

Korzystając z opisanej tutaj konfiguracji, udało nam się zobrazować i uzyskać dane na temat larw danio pręgowanego w wieku nawet 6 dpf. Rozszerzenie analizy na późniejsze etapy rozwoju prawdopodobnie zakończy się sukcesem, ale będzie wymagało dostosowania konfiguracji obrazowania w celu uwzględnienia zwiększonej wielkości próby, zwłaszcza wzdłuż osi z. Próbując tego dokonać, sugerujemy skupienie się na utrzymaniu niskiego stosunku sygnału do szumu i szybkiego czasu skanowania, ponieważ są to kluczowe parametry udanej analizy.

Sugerujemy minimalny czas obrazowania wynoszący 1 godzinę, aby umożliwić śledzenie mikrogleju; Najdłuższe okno obrazowania, które zostało przetestowane za pomocą tego protokołu, to 8 godzin. Ponadto w analizie śledzenia ważne jest, aby odstęp czasu między klatkami był jak najkrótszy, najlepiej od 30 s do 60 s. Pozwoli to na uzyskanie dokładniejszych i bardziej szczegółowych danych śledzenia w dalszych analizach. Dlatego, zwłaszcza w przypadku wykrywania więcej niż jednego fluoroforu, zasadnicze znaczenie ma unikanie nakładania się widm i zapewnienie wystarczającej separacji między dwoma widmami emisji fluoroforów, aby umożliwić jednoczesną akwizycję, bez wycieku sygnału.

Dostępne są również inne protokoły do wysokiej jakości zapisów poklatkowych mózgu danio pręgowanego, ale ten jest pierwszym, który pokazuje, jak skutecznie śledzić wszystkie ruchy mikrogleju podczas rozwoju embrionalnego przez dłuższy czas. Chociaż przedstawiony tutaj przepływ pracy koncentrował się na śledzeniu mikrogleju w kontekście fizjologicznym, można go łatwo zastosować do analizy mikrogleju w patologii. Rzeczywiście, u danio pręgowanego ustalono kilka modeli zaburzeń neurorozwojowych, takich jak autyzm31, padaczka32 i schizofrenia33, ale także neurodegeneracja34 i rak35, które zapewniają unikalne możliwości określania odpowiedzi i zachowania mikrogleju w stanach chorobowych.

Warto zauważyć, że ten protokół śledzenia jest bardzo wszechstronny i może być również pomocny w rzuceniu światła na wzorce migracji różnych typów komórek w różnych regionach anatomicznych zarodka danio pręgowanego, potencjalnie otwierając w ten sposób możliwości dodatkowych zastosowań, wykraczających poza zakres badań mikrogleju opisany w tym artykule. Co więcej, wykorzystując zdolność do łączenia wielu fluorescencyjnych linii transgenicznych, uzyskujemy możliwość rozpoznania relacji przestrzennych między mikroglejem a innymi typami komórek mikrośrodowiska mózgu, z potencjałem do wizualizacji interakcji komórkowych i przesłuchów podczas nagrań poklatkowych, w nieinwazyjny sposób. Może to mieć zasadnicze znaczenie dla odkrycia fizjologicznego znaczenia zachowania mikrogleju i przyczynić się do głębszej charakterystyki tych wysoce ruchliwych komórek.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną wyrazić szczerą wdzięczność profesorowi Nicolasowi Bayensowi za hojne udostępnienie mikroskopu konfokalnego niezbędnego do przeprowadzenia tego badania. Praca ta została częściowo sfinansowana przez Fundusze na Badania Naukowe (FNRS) w ramach grantów o numerach F451218F i UG03019F, Fundacja Badań nad Alzheimerem (SAO-FRA) (do V.W.), A.M. jest wspierana przez stypendium badawcze FNRS. Rysunek 1 został utworzony na biorender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 L Zbiorniki hodowlaneTecniplastZB10BTE
1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)Sigma-AldrichP7629Rozcieńczony do 0,2 mM w E3 w celu zapobieżenia pigmentacji zarodków
Dolna szklana czasza do obrazowaniaFluoroDishFD3510-100
Jednorazowa pipeta do pomiaru z podziałkąavantor16001-188
Sucha grzałka blokowaNovolabPrzyznaj QBD4Aby utrzymać niskotopliwą agarozę na poziomie 37 & stopni; C
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian (Trikaina)Sigma-AldrichE10521-50G
Imaris 10.0Oxford Instrumentsoprogramowanie analityczne
Imaris Konwerter plikówOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/big-data
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyNikonEclipse Ti2-E
Błękit metylenowySigma-AldrichM9140-25G
Eppendorf5242956003
NuSieve GTG AgaroseLonza  50081
szalki Petriego (90 mm)avantor391-0559
PronaseSigma-Aldrich11459643001
  Kleszczyki ze stali nierdzewnej Dumont nr 5FineScienceTools11254-20
Mikroskop stereoskopowyLeicaLeica M80Do montażu igły do drażnienia zarodków
avantor76549-024
Końcówki do mikroładowarek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. Microglia in physiology and disease. Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).
  2. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Sci Rep. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  3. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  4. Marın-Teva, J. L., et al. Microglia promote the death of developing Purkinje cells. Neuron. 41 (4), 535-547 (2004).
  5. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  6. Hattori, Y. The microglia-blood vessel interactions in the developing brain. Neurosci Res. 187, 58-66 (2023).
  7. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  8. Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
  9. Shin, J., Park, H. -C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25 (1), 7-14 (2003).
  10. Chi, N. C., et al. Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation. Genes Dev. 22 (6), 734-739 (2008).
  11. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  12. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PLoS ONE. 6 (8), e22991(2011).
  13. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), e2093(2010).
  14. Ferrero, G., et al. Embryonic microglia derive from primitive macrophages and are replaced by cmyb-dependent definitive microglia in zebrafish. Cell Rep. 24 (1), 130-141 (2018).
  15. Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia colonization of developing zebrafish midbrain is promoted by apoptotic neuron and lysophosphatidylcholine. Dev Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
  16. Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Dev Neurobiol. 73 (1), 60-71 (2013).
  17. Thion, M. S., Garel, S. Microglial ontogeny, diversity and neurodevelopmental functions. Curr Opin Genet Dev. 65, 186-194 (2020).
  18. Bohlen, C. J., Friedman, B. A., Dejanovic, B., Sheng, M. Microglia in brain development, homeostasis, and neurodegeneration. Annu Rev Genet. 53, 263-288 (2019).
  19. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Rep. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  20. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  21. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  22. Green, L. A., O'Dea, M. R., Hoover, C. A., DeSantis, D. F., Smith, C. J. The embryonic zebrafish brain is seeded by a lymphatic-dependent population of mrc1+ microglia precursors. Nat. Neurosci. 25 (7), 849-864 (2022).
  23. Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nat Neurosci. 23 (9), 1055-1066 (2020).
  24. Yu, Q., et al. C1q is essential for myelination in the central nervous system (CNS). iScience. 26 (12), 108518(2023).
  25. Zengeler, K. E., Lukens, J. R. Innate immunity at the crossroads of healthy brain maturation and neurodevelopmental disorders. Nat Rev Immunol. 21 (7), 454-468 (2021).
  26. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  27. Réu, P., et al. The lifespan and turnover of microglia in the human brain. Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).
  28. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  29. Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat Neurosci. 10 (12), 1544-1553 (2007).
  30. Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the developing brain in living zebrafish using Brainbow and time-lapse confocal imaging. J Vis Exp. (157), e60593(2020).
  31. Tayanloo-Beik, A., et al. Zebrafish modeling of autism spectrum disorders, current status and future prospective. Front Psychiatry. 13, 911770(2022).
  32. D'Amora, M., et al. Zebrafish as an innovative tool for epilepsy modeling: State of the art and potential future directions. Int J Mol Sci. 24 (9), 7702(2023).
  33. Langova, V., Vales, K., Horacek, J. The role of zebrafish and laboratory rodents in schizophrenia research. Front Psychiatry. 11, 549232(2020).
  34. Chia, K., Klingseisen, A., Sieger, D., Priller, J. Zebrafish as a model organism for neurodegenerative disease. Front Mol Neurosci. 15, 940484(2022).
  35. Astell, K. R., Sieger, D. Zebrafish in vivo models of cancer and metastasis. Cold Spring Harb Perspect Med. 10 (8), 037077(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia DynamicsZebrafish EmbryoLive ImagingConfocal MicroscopyMicroglia MigrationBrain ParenchymaCell TrackingTransgenic Reporter LinesOptic TectumMicroglia Morphology

Related Articles