Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca2+ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego pomiaru cytozolu, wolnego wapnia [Ca²⁺]_i i średnicy naczynia w kurczących się naczyniach limfatycznych w czasie rzeczywistym, a następnie obliczania bezwzględnych stężeń Ca²⁺ oraz parametrów kurczliwości/rytmiczności. Protokół ten może być stosowany do badania Ca²⁺ i dynamiki kurczliwości w różnych warunkach eksperymentalnych.

Streszczenie

Układ naczyń limfatycznych, obecnie często określany jako "trzecie krążenie", znajduje się w wielu ważnych układach narządów. Główną funkcją mechaniczną układu limfatycznego jest powrót płynu z przestrzeni zewnątrzkomórkowych z powrotem do centralnych przewodów żylnych. W transporcie limfy pośredniczą spontaniczne rytmiczne skurcze naczyń limfatycznych (LV). Skurcze lewej dawki są w dużej mierze regulowane przez cykliczny wzrost i spadek cytozolowego, wolnego wapnia ([Ca^{2 +} ]_i).

Ten artykuł przedstawia metodę jednoczesnego obliczania zmian w bezwzględnych stężeniach [Ca²⁺]_i i kurczliwości/rytmiczności naczyń w czasie rzeczywistym w izolowanych, ciśnieniowych LV. Używając izolowanych LV krezkowych szczurów, badaliśmy zmiany w [Ca²⁺]_i i kurczliwości/rytmiczności w odpowiedzi na dodanie leku. Izolowane LV zostały załadowane wskaźnikiem ratiometrycznym Ca²⁺-sensoring Fura-2AM, a mikroskopia wideo w połączeniu z oprogramowaniem do wykrywania krawędzi została wykorzystana do uchwycenia [Ca²⁺]_i i pomiary średnicy w sposób ciągły w czasie rzeczywistym.

Sygnał Fura-2AM z każdego LV został skalibrowany do minimalnego i maksymalnego sygnału dla każdego statku i użyty do obliczenia bezwzględnego [Ca²⁺]_i. Pomiary średnicy wykorzystano do obliczenia parametrów kurczliwości (amplituda, średnica końcowa rozkurczowa, średnica końcowa skurczowa, obliczony przepływ) i rytmiczności (częstotliwość, czas skurczu, czas relaksacji) i skorelowano z pomiarami bezwzględnymi [Ca²⁺]_i.

Wprowadzenie

Układ naczyń limfatycznych znajduje się w wielu układach narządów, w tym w mózgu, sercu, płucach, nerkach i krezce^1,2^,3,4,5,6, i działa poprzez wypychanie płynu (limfy) z przestrzeni śródmiąższowych do centralnych przewodów żylnych w celu utrzymania homeostazy płynów^7,8,9,10. Zaczyna się od ślepo zakończonych naczyń włosowatych limfatycznych w łożyskach naczyń włosowatych, które spływają do naczyń limfatycznych (LV). Komórki LV do zbierania składają się z dwóch warstw komórek: warstwy komórek śródbłonka otoczonej warstwą komórek mięśni limfatycznych (LMC)^10,11. Transport płynu limfatycznego odbywa się zarówno poprzez siły zewnętrzne (np. tworzenie się nowej limfy, pulsacje tętnicze, wahania ciśnienia w żyłach centralnych), jak i siły wewnętrzne¹².

Wewnętrzną siłą transportu limfy jest spontaniczny, rytmiczny skurcz zbierających się LV, na którym skupia się większość badań nad funkcjonowaniem układu limfatycznego. Ta wewnętrzna pompa limfatyczna jest zasadniczo regulowana przez cykliczne wznoszenie się i opadanie cytozolowego, wolnego Ca^{2 +} ([Ca^{2 +} ]_i). Spontaniczna depolaryzacja błony plazmatycznej w LMC aktywuje bramkowane napięciem kanały Ca²⁺ typu "L" (Ca_v1.x), wywołując napływ Ca²⁺ i późniejszy rytmiczny skurcz LV^8,9,10. Rola ta została zademonstrowana poprzez blokowanie Ca_v1.x za pomocą specyficznych środków, takich jak nifedypina, która hamowała skurcze LV i powodowała rozszerzenie naczyń krwionośnych^13,14. Przejściowy wzrost [Ca^{2 +} ]_i lub "skok Ca^{2 +}" w LMC, w którym pośredniczą kanały Ca_v1.x, może również mobilizować wewnątrzkomórkowe zapasy Ca²⁺ poprzez aktywację receptorów trifosforanu inozytolu (IP₃) i receptorów ryanodine (RyR) na siateczce sarkoplazmatycznej (SR) ^15,16,17,18. Obecne dowody sugerują, że receptory IP₃ dostarczają więcej Ca²⁺ wymaganego do normalnych skurczów LV w porównaniu do RyRs^{15,16,19,20,21}; jednak RyR może odgrywać rolę podczas patologii lub w odpowiedzi na interwencję farmaceutyczną^17,18. Dodatkowo, aktywacja kanałów K⁺ aktywowanych przez Ca^{2+ 22} i kanałów potasowych wrażliwych na ATP (K_ATP) ^23,24 może hiperpolaryzować błonę LMC i hamować spontaniczną aktywność skurczową.

Istnieje wiele innych kanałów jonowych i białek, które mogą regulować dynamikę Ca²⁺ podczas zbierania LV. Wykorzystanie metod do badania zmian w Ca²⁺ i kurczliwości naczyń w odpowiedzi na czynniki farmakologiczne w czasie rzeczywistym jest ważne dla zrozumienia tych potencjalnych regulatorów. Wcześniejsza metoda wykorzystująca Fura-2 do pomiaru względnych zmian w LV [Ca²⁺]_i została opisana²⁵. Ponieważ stała dysocjacji dla Fura-2 i Ca²⁺ jest znana²⁶, możliwe jest obliczenie rzeczywistych stężeń Ca²⁺, co rozszerza zastosowanie tej metody i zapewnia dodatkowy wgląd w sygnalizację Ca²⁺, pobudliwość błony i mechanizmy kurczliwości²⁷, a także pozwala na porównania linii wyjściowych między grupami eksperymentalnymi. To ostatnie podejście zostało zastosowane w kardiomiocytach²⁸, a zatem może być dostosowane do LV. W artykule przedstawiono ulepszoną metodę, która łączy te dwa podejścia do pomiaru i obliczania zmian w bezwzględnych [Ca^{2 +}] _i, a także kurczliwości/rytmiczności naczyń w sposób ciągły w czasie rzeczywistym w izolowanych, ciśnieniowych LV. Przedstawiamy również reprezentatywne wyniki dla pacjentów z lewej dawki leczonych nifedypiną.

Protokół

Dziewięcio- do 13-tygodniowych samców szczurów rasy Sprague-Dawley zakupiono od komercyjnego sprzedawcy. Po przybyciu na miejsce, wszystkie szczury były trzymane i utrzymywane w placówce University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Division of Lab Animal Medicine (DLAM) na standardowej diecie laboratoryjnej i wystawione na 12 godzin cyklu światło-ciemność w temperaturze 25 ^oC. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem użytkowania zwierząt #4127 przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) UAMS.

1. Rozwarstwienie i kaniulacja krezkowych LV

UWAGA: Ważne jest, aby przygotować komorę perfuzyjną przed izolacją krezkowych LV, aby upewnić się, że nie ma przerwy w przepływie lub wycieku, które mogłyby zakłócić eksperyment.

1. Przygotowanie kąpieli perfuzyjnej
   1. Mikropipety ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,2 mm, średnica wewnętrzna 0,68 mm i końcówka o średnicy zewnętrznej 75-100 μm) należy zakupić u komercyjnego sprzedawcy. Wytnij i wypoleruj mikropipety (inaczej kaniulę) do długości około 1-2 cm w celu zamontowania w komorze perfuzyjnej izolowanego naczynia.
   2. Podłącz każdą zamontowaną szklaną kaniulę w komorze perfuzyjnej naczynia do niezależnych przetworników ciśnienia umieszczonych w linii z niezależnymi grawitacyjnie zasilanymi regulatorami ciśnienia za pomocą rurki polietylenowej.
      UWAGA: Pozwala to na niezależną manipulację ciśnieniem dopływu i odpływu w zależności od projektu badania. Rysunek 1 pokazuje tę konfigurację w szczegółach.
   3. Napełnij komorę perfuzyjną (5 ml), szklane mikropipety i niezależny grawitacyjnie zasilany regulator ciśnienia wraz z rurkami polietylenowymi roztworem soli fizjologicznej (PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO₃; 1,17 mM NaH₂PO₄; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO₄; 5,5 mM C₆H₁₂O₆ (glukoza); 0,026 mM C₁₀H₁₆N₂O₈ (EDTA); oraz 1,6 mM CaCl₂) pozbawione jakichkolwiek pęcherzyków powietrza. Następnie zaciśnij ciśnienie, aby kaniule nie były pod ciśnieniem.
      UWAGA: pH tego roztworu wynosi ~7,5. pH 7,4 jest utrzymywane w kąpieli perfuzyjnej z wykorzystaniem bulgotania CO₂ do działania na system buforowy wodorowęglanów w PSS, jak opisano w kroku 1.3.7. EDTA jest tutaj używany do chelatacji nadmiaru jonów Ca²⁺.
2. Przygotowanie węzłów
   1. Zawiązać podwójne węzły pod mikroskopem za pomocą plecionej jedwabnej nici do szycia (rozmiar 8-0). Kluczowe kroki są zilustrowane w Rysunek 2.
      1. Oddziel pojedynczy żarnik.
      2. Użyj dwóch kleszczyków Dumont #5 z mikrostępionymi końcówkami i za pomocą jednego kleszcza wykonaj podwójną pętlę wokół końcówki drugich kleszczy.
      3. Za pomocą zapętlonych kleszczy chwyć luźny koniec szwu i przeciągnij go przez obie pętle, uważając, aby nie zaciągnąć węzła całkowicie i nie pozostawiając małego otworu.
      4. Użyj nożyczek sprężynowych Vanna, aby odciąć nadmiar szwu z obu stron. Użyj tych węzłów później, aby przymocować LV do kaniul.
         UWAGA: Nie używaj tych samych kleszczy, którymi będziesz ciąć lub kaniulować, ponieważ istnieje większe niebezpieczeństwo uszkodzenia końcówek kleszczy podczas wiązania węzłów.
3. Izolacja i kaniulacja krezkowych lewaków
   1. Głęboko znieczulij zwierzęta, podając 5% izofluranu przy przedawkowaniu 1,5 l/min_O2 i wykrwawić przez dekapitację.
   2. Wyizoluj całe krezki do rozwarstwienia LV krezki, najpierw wykonując podłużne cięcie wzdłuż linii środkowej ściany brzucha, wyegzekwując krezkę, a następnie przecinając połączenie tuż poniżej zwieracza odźwiernika i ~ 2-3 cm powyżej jelita ślepego, a także połączenie z odbytnicą.
   3. Umyj wypreparowane całe krezki w 200 ml lodowatego PSS, a następnie przenieś i przypnij do wyłożonej silikonem (8-10 mm) szalki Petriego (100 mm) zawierającej lodowaty PSS.
   4. Wypreparuj krezkowe LV drugiego rzędu z otaczającego tłuszczu i tkanki łącznej za pomocą stereomikroskopu, cienkich kleszczyków Dumont #5 Inox i nożyczek sprężynowych Vanna. Aby pomóc w identyfikacji końców LV po usunięciu z tkanki, pozostaw mały kawałek tłuszczu na bliższym końcu LV.
   5. Przenieś wypreparowane LV do komory perfuzyjnej naczynia w celu kaniulacji na szklanych kaniulach.
   6. Użyj dwóch wstępnie naostrzonych kleszczyków Dumont #5 Inox, prostej końcówki (0,05 x 0,01 mm), aby kantonować LV z dystalnym końcem LV na kaniuli P1 (dopływ) i bliższym końcem naczynia na kaniuli P2 (odpływ), aby naśladować kierunek przepływu limfy.
      UWAGA: Kaniule P1 i P2 są identyczne i różnią się tylko tym, który koniec LV jest podłączony. Ważne jest, aby używać kleszczy, które idealnie stykają się na czubku i bez uszkodzeń, aby ułatwić chwytanie cienkiej ścianki naczynia.
      1. Wsuń pojedynczy wstępnie zawiązany węzeł na każdą szklaną kaniulę, aby później przymocować naczynie do kaniul.
      2. Używając małego kawałka tłuszczu, aby pomóc zorientować się w kierunku LV, najpierw kaniuluj dystalny koniec na P1.
      3. Przesuń węzeł w dół kaniuli i dokręć, aby zabezpieczyć LV. Upewnij się, że nie dokręciłeś zbyt mocno i nie złamałeś końcówki kaniuli.
      4. Zwiększyć ciśnienie LV do 4-5 mm Hg w komorze perfuzyjnej.
         UWAGA: Dla naszych celów ustawiamy ciśnienie P1 i P2 tak, aby było równe; Jednakże, w zależności od warunków doświadczalnych, ciśnienie może być regulowane w każdej kaniuli w celu wywołania naprężeń ścinających lub przepływu wstecznego.
      5. Powtórz kroki 1.3.6.1-1.3.6.4, aby kaniulować bliższy koniec lewej komory na P2.
   7. Umieść bulgoczący kamień z 7% dwutlenkiem węgla (CO₂) / 93% tlenem (O₂) w komorze kąpieli, aby utrzymać fizjologiczne pH.
   8. Podłączyć komorę do regulatora temperatury i ustawić ją na 37 ^oC, aby LV zrównoważyły się i rozwinęły stabilne, spontaniczne skurcze (około 30 min).
      UWAGA: Rysunek 1 pokazuje tę konfigurację szczegółowo.

2. Pomiar bezwzględnych stężeń [Ca²⁺]_i w LV

1. Barwienie Fura-2AM kaniulowanych LV
   1. Po wystąpieniu spontanicznych skurczów (od kroku 1.3.8) inkubować LV z estrem fura-2-acetoksymetylowym (Fura-2AM; 2 μM lub 10 μL/5 ml) i kwasem pluronowym (PA; 0,02% w/v lub 5 μl/5 ml 20% PA) przez 30 minut w ciemności.
      UWAGA: Po dodaniu Fura-2AM wszystkie pozostałe kroki należy wykonać w ciemności.
   2. Po 30 minutach 3x wymienić roztwór w komorze perfuzyjnej opróżniając całą objętość kąpieli podciśnieniem, zastępując go roztworem PSS.
      o temperaturze (37 ^oC) wolnym od odczynników UWAGA: Należy to zrobić szybko, aby zminimalizować czas zawieszenia LV w powietrzu. Użyj obu rąk, na przykład prawej ręki do odkurzania, a lewej do wymiany nowego PSS bez odczynników.
   3. Po umyciu inkubować LV przez 15 minut w ciemności, aby usunąć nadmiar wskaźnika i umożliwić deestryfikację.
2. Wychwytywanie fluorescencji Ca²⁺ i średnicy naczynia
   1. Przenieś komorę na odwrócony stolik mikroskopu fluorescencyjnego wyposażony w źródło światła LED, obiektyw S Fluor 20x, adapter do kadrowania komórek i system szybkich kamer wideo CMOS, który umożliwia przechwytywanie fluorescencji klatka po klatce z częstotliwością 15 Hz.
      UWAGA: Schemat tej konfiguracji przepływu pracy jest przedstawiony w Rysunek 3. Sygnał Ca²⁺ może być rejestrowany za pomocą kamery CCD o prędkości co najmniej 15 kl./s.
   2. Podłącz mikroskop do komputera wyposażonego w oprogramowanie do obrazowania, aby rejestrować fluorescencję i detekcję krawędzi.
      UWAGA: Oprogramowanie, do którego się odnosi, umożliwia również jednoczesną rejestrację ciśnienia; Nie jest to jednak tutaj uwzględnione.
   3. Włącz źródło światła LED i interfejs systemu fluorescencyjnego.
      UWAGA: Opisane tutaj instrukcje dotyczące oprogramowania dotyczą oprogramowania referencyjnego, ale do uzyskania tych danych można użyć innego oprogramowania.
   4. Otwórz oprogramowanie (IonWizard).
   5. Na karcie Plik wybierz pozycję Nowy.
   6. Na karcie Zbieranie wybierz pozycję Eksperymentuj.
   7. Załaduj żądany szablon eksperymentalny i kliknij OK.
      UWAGA: Będziesz musiał skonfigurować eksperymentalny szablon z parametrami, które mają być mierzone. Instrukcje dotyczące konfiguracji szablonu można znaleźć w instrukcji oprogramowania²⁹.
   8. Dostosuj ślady na ekranie, aby zobaczyć średnicę naczynia, licznik (sygnał 340), mianownik (sygnał 380) i współczynnik w kolejności malejącej.
   9. W razie potrzeby dostosuj skalę osi y, aby ułatwić wizualizację śladów.
      1. W obszarze Ślady wybierz pozycję Edytuj limity użytkowników. Upewnij się, że opcja Automatyczne limity nie jest zaznaczona.
      2. Wybierz parametr, który chcesz dostosować, wprowadź wartości minimalne i maksymalne dla osi, a następnie wybierz przycisk OK.
   10. Aby rozpocząć eksperyment, kliknij przycisk START (u dołu ekranu).
   11. Aby jednocześnie mierzyć średnicę lewej wysokości, należy użyć oprogramowania do wykrywania krawędzi wbudowanego w system obrazowania, które generuje ślady kurczliwości LV przy 3 Hz. Użyj tych pomiarów do analizy parametrów kurczliwości i rytmiczności opisanych w sekcji 3 i pokazanych w Rysunek 4.
       1. Pamiętaj, aby dostosować oświetlenie tak, aby ściana LV wyglądała jak ciemne linie.
       2. Wybierz obszar zainteresowania (ROI), który jest pozbawiony tłuszczu i zanieczyszczeń. Po rozpoczęciu eksperymentu nie przenoś tego zwrotu z inwestycji.
       3. Upewnij się, że próg jest ustawiony w taki sposób, aby krawędź ściany naczynia była wykrywana przez cały cykl skurczu.
   12. Aby uzyskać pomiary fluorescencji, włącz lampę fotopowielacza (PMT).
   13. Wzbudz Fura-2, wskaźnik ratiometryczny, poprzez naprzemienne długości fal 340 i 380 nm w ekspozycjach 50 ms za pomocą oświetlaczy LED i uchwyć widma emisyjne przy 510 nm przy 15 Hz w całym polu obrazowania.
       UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie parametry optyczne (ustawienia wzbudzenia, filtry emisyjne, soczewki obiektywu i zwierciadła dichroiczne) były takie same dla całej serii eksperymentów w celu uzyskania powtarzalnych pomiarów Ca²⁺.
   14. Zmierz stosunek sygnału do tła, najpierw uzyskując fluorescencję 340 i 380 przy lewej wysokości w środku pola view (sygnał), a następnie, używając manipulatorów stage, przesunąć pole widzenia do krawędzi wanny bez naczynia (uważając, aby uniknąć krawędzi wyłożonej silikonem i/lub usuwając wszelkie zanieczyszczenia z wanny), aby uchwycić tło.
       UWAGA: Ważne jest, aby za każdym razem wracać do oryginalnej sekcji statku w celu pomiarów Ca²⁺.
   15. Zamień roztwór kąpieli na PSS o dopasowanej temperaturze, aby usunąć wskaźnik nadmiaru w kąpieli. Usunięcie nadmiaru Fura-2 może wymagać kilku wymian w kąpieli, więc powtarzaj tę wymianę, aż stosunek sygnału do tła wyniesie około 10:1.
   16. Rejestruj wyjściowy sygnał fluorescencyjny Fura-2 i spontaniczne skurcze przez około 30 minut, po których następuje skumulowana odpowiedź stężeniowa nifedypiny (NIF; 0,1-100 nM), zależnego od napięcia antagonisty Ca_v1,x. Uzyskaj pomiary tła dla każdego stężenia leku.
   17. Na koniec każdego eksperymentu przemyć LV dopasowanym temperaturowo PSS wolnym od Ca²⁺, aby uzyskać minimalny sygnał fluorescencyjny Fura-2 (R_min) i maksymalną średnicę LV pod nieobecność Ca²⁺. Pamiętaj, aby zmierzyć tło.
       UWAGA: PSS wolny od Ca²⁺ ma taki sam skład jak PSS, ale bez CaCl₂, a EDTA jest zastąpiony przez 1 mM EGTA (C₁₄H₂₄N₂O₁₀) (pH ~ 7,5).
   18. Roztwór kąpieli należy wymienić na PSS o dopasowanej temperaturze, zawierający 10 mM Ca²⁺ i jonomycynę (10 μM IONO), jonofor Ca²⁺, w celu uzyskania maksymalnego sygnału fluorescencji Fura-2 (R_max) i minimalnej średnicy LV w warunkach nasycenia Ca²⁺. Pamiętaj, aby zmierzyć tło.
3. Wzór na pomiar wartości _{bezwzględnej} [Ca²⁺]i
   1. Użyj R_min i R_max, aby skalibrować stosunek długości fal 340 i 380 nm i obliczyć bezwzględne stężenie wolnego cytozolu Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i).
   2. Obliczyć bezwzględne stężenie wolnego cytozolu Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) za pomocą równania (1)²⁶:
      (1)
      Gdzie K_d = 225 nM (stała dysocjacji dla Fura-2)²⁶, R = stosunek 340/380, stosunek R_min = 340/380 przy braku Ca²⁺, R_max = stosunek 340/380 przy warunkach nasycenia Ca²⁺, S_wolny = 380 sygnał przy braku Ca²⁺,_{S związany} = 380 sygnał o stanie nasycenia Ca²⁺
      UWAGA: Wszystkie sygnały fluorescencyjne zostały skorygowane o fluorescencję tła.
   3. Rysunek 5 to przykładowy ślad Ca²⁺ szczegółowo opisujący, które parametry są rejestrowane. Zdefiniuj linię bazową Ca²⁺ jako najniższy spoczynkowy Ca²⁺ przed skokiem Ca²⁺, a szczyt Ca²⁺ jako najwyższy Ca²⁺ osiągnięty podczas skoku Ca²⁺. Amplituda to różnica między szczytem a linią bazową Ca²⁺. Eksportuj wszystkie parametry bezpośrednio z oprogramowania do obrazowania, z wyjątkiem częstotliwości skoków Ca²⁺, która ma być obliczana w trybie offline jako liczba skoków Ca²⁺ / s. Poniżej znajdują się kluczowe kroki w oprogramowaniu, do którego się odwołuje, aby uzyskać te parametry.
      UWAGA: Całe ślady można wyeksportować do pliku .txt, a wszystkie parametry można przeanalizować lub obliczyć w wybranym oprogramowaniu.
   4. W przypadku R_min podświetl sekcję śladu licznika, która odpowiada tłu podczas Ca²+-free PSS. Otworzy się okno dialogowe z wartościami dla tej części śladu.
   5. W obszarze Operacje wybierz pozycję Stałe.
   6. Wybierz opcję Tło numeryczne wapnia i wprowadź numery tła dla licznika i mianownika z poprzedniego kroku. Kliknij przycisk OK.
   7. Podświetl sekcję ścieżki proporcji, która odpowiada najniższemu stosunkowi podczas PSS wolnego od Ca²⁺. To jest R_min. Zwróć również uwagę na wartość mianownika dla tej sekcji; to jest_{S za darmo}.
   8. Powtórzyć kroki od 2.3.4 do 2.3.7 dla R_max i S_związanych z odcinkiem śladu, który odpowiada wysokiemu PSS wolnego Ca²⁺ i najwyższemu stosunkowi.
   9. W obszarze Operacje wybierz pozycję Stałe.
   10. Wybierz opcję Kalibracja wapniowo-wapniowa i wprowadź wartości wymienione w równaniu 1. Kliknij przycisk OK.
   11. Dostosuj jeden ze śladów na ekranie zgodnie z opisem w kroku 2.2.8, tak aby wyświetlić odjęty wapń w liczbach wapnia.
   12. Wykonaj monotoniczną analizę stanów nieustalonych, aby uzyskać pozostałe parametry. Instrukcje na ten temat można znaleźć w instrukcji oprogramowania³⁰.
   13. Alternatywnie w obszarze Eksportuj wybierz pozycję Bieżące śledzenie.
   14. Wybierz lokalizację, do której chcesz wyeksportować plik .txt, a następnie kliknij przycisk OK.
       UWAGA: Upewnij się, że kliknąłeś pojedynczy ślad, który chcesz wyeksportować. Można wyeksportować cały ślad lub wybrane sekcje śladu.

3. Pomiar kurczliwości i rytmiczności NV

1. Oprogramowanie do wykrywania krawędzi wbudowane w system obrazowania generuje ślady kurczliwości dla pomiarów średnicy lewej wysokości, jak opisano powyżej. Pomiary te służą do analizy parametrów kurczliwości i rytmiczności. Rysunek 4 to przykładowy ślad skurczu wyszczególniający, które parametry skurczu mają być zarejestrowane. Eksportuj wszystkie parametry bezpośrednio z oprogramowania do obrazowania za pomocą funkcji Monotonicznej analizy stanów nieustalonych w Diameter trace³⁰, z wyjątkiem częstotliwości skurczów, obliczonego przepływu i interwału, które mają być obliczane w trybie offline.
   UWAGA: Całe ślady można wyeksportować do pliku .txt, a wszystkie parametry można przeanalizować lub obliczyć w wybranym oprogramowaniu, korzystając z poniższych równań.
2. EDD, ESD, amplituda, częstotliwość i obliczone pomiary przepływu
   1. Zmierz maksymalne i minimalne średnice (odpowiednio końcowa średnica rozkurczowa [EDD] i końcowa średnica skurczowa [ESD]), które LV mogą osiągnąć podczas swoich rytmicznych i spontanicznych skurczów.
   2. Oblicz amplitudę skurczów (AMP) jako różnicę między EDD a ESD.
   3. Oblicz częstotliwość jako liczbę skurczów w okresie pomiarowym (w s).
   4. Obliczyć obliczony przepływ na μm za pomocą równania (2):
      Obliczony przepływ = π/4(EDD²- ESD²)F (2)
      Gdzie EDD² = pole przekroju poprzecznego naczynia w stanie relaksu, ESD² = pomiar pola przekroju poprzecznego naczynia podczas zwężenia, F = częstotliwość skurczów/s
3. Rytmiczność: czas skurczu i relaksacji:
   1. Innymi miarami rytmiczności lewej komory są czas skurczu i czas relaksacji.
   2. Zdefiniuj czas skurczu jako czas potrzebny LV do osiągnięcia ESD przy każdym skurczu.
   3. Zdefiniuj czas relaksacji jako czas potrzebny LV do osiągnięcia PWW dla każdej relaksacji, co da ogólne wskazanie rytmiczności skorelowanej z bezwzględnym [Ca^{2 +}] _i w określonym przedziale czasowym.
   4. Obliczyć czas przedziału (ΔT) z równania (3).
      Δt = t2 _(ESD2)-t1 _(ESD1) (3)

Wyniki

Kurczliwość LV i odpowiadające im zmiany w cytozolowych, wolnych Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) oceniano w izolowanych LV krezkowych szczurów po ekspozycji na różne stężenia nifedypiny (NIF; 0,1-100 nM) (Ryc. 6). Parametry, w tym amplituda skoku Ca²⁺, linia bazowa Ca²⁺ i pik Ca²⁺, wykazywały redukcję zależną od stężenia wraz ze stopniowym dodawaniem NIF do komory perfuzyjnej (Rysunek 7A). Jednocześnie parametry skurczu, takie jak amplituda skurczu i obliczony przepływ, również wykazały stopniowy spadek (Rysunek 7B). Nastąpił niewielki wzrost średnicy EDD w przypadku NIF (Rysunek 7B). Częstotliwość skoków Ca²⁺ i częstotliwość skurczu wydają się być reakcją typu "wszystko albo nic". Efekt ten wystąpił jednak przy 10 nM dla jednej LV, podczas gdy wszystkie LV przestały się skurczać o 100 nM. W ten sposób połączone dane generują wykresy, które przypominają stopniowaną odpowiedź na stężenie. Efekt ten jest zgodny z wcześniejszymi publikacjami, w których stosowano NIF na LV w innych preparatach (miografia przewodowa i ciśnieniowa^13,14). Wykresy Manhattanu pokazują indywidualne odpowiedzi LV dla miar rytmiczności, w tym interwału, czasu skurczu i czasu relaksacji (Rysunek 7C). Ten rodzaj reprezentacji danych pozwala badaczowi wyodrębnić te reakcje typu "wszystko albo nic" lub zmienność rytmów skurczu, aby zapewnić dodatkowy wgląd w mechanizmy leżące u ich podstaw. Ostatecznie zmniejszenie amplitudy i częstotliwości skurczu spowodowało zmniejszenie obliczonego przepływu przez te izolowane LV, który służy jako wskaźnik zastępczy dla funkcji in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, spadek kurczliwości niskiego napięcia korelował ze zmniejszeniem [Ca²⁺]_i. Nasze odkrycia dostarczają bezpośrednich dowodów na to, że w zakresie 100 nM, NIF skutecznie zatrzymał skurcze i oscylacje [Ca^{2 +}] _i w LV poprzez antagonizowanie kanałów Ca_v1.x obecnych w komórkach mięśni limfatycznych (LMC).

Rysunek 1: Obraz przedstawiający konfigurację izolowanej komory naczynia. W badaniach perfuzji naczyń wykorzystano izolowaną komorę naczyniową wyposażoną w termoregulator. Grawitacja została wykorzystana do kontrolowania ciśnienia za pomocą zbiornika PSS. Ciśnienie było monitorowane przez przetworniki podłączone zarówno do kaniuli dopływowych (P1), jak i odpływowych (P2). Skrót: PSS = fizjologiczny roztwór soli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie węzła w skrócie. (A) Przygotowanie podwójnej pętli pod mikroskopem preparacyjnym przy użyciu pojedynczego włókna z 3-warstwowej nici jedwabnej, (B) złapanie luźnego końca i przeciągnięcie go przez obie pętle, (C) pociągnięcie węzła z obu końców, aby zachować mały otwór, oraz (D) odcięcie nadmiaru włókna z każdej strony i niebieskie pudełko pokazujące gotowy do użycia kompletny podwójny węzeł naciągany. Podziałka = 1,5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat eksperymentalnego procesu pozyskiwania danych. Zdrowego szczura znieczulono 5% indukcją izofluranu i wykonano dekapitację w celu usunięcia krwi z tułowia. Wykonano nacięcie w linii środkowej w celu odsłonięcia i odizolowania krezki. Wyizolowaną krezkę rozprowadzono w lodowatym roztworze PSS, a LV wypreparowano bez tłuszczu w celu kaniulacji w izolowanej komorze perfuzyjnej naczynia. Kąpiel umieszczono na stoliku mikroskopu odwróconego za pomocą soczewki obiektywowej o powiększeniu 20x. Naczynie było wzbudzane na przemian światłem o długości fali 340 i 380 nm, a widma emisji fluorescencyjnej zebrano za pomocą kamery CCD o długości fali 510 nm. Komputer podłączony do mikroskopu wygenerował ślady skurczu i Ca²⁺ za pomocą oprogramowania do obrazowania wychwytywania fluorescencji i wykrywania krawędzi. Podziałka = 1 mm. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; CCD = urządzenie sprzężone z ładunkiem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywny ślad skurczu LV. (A) Przykładowy zapis zmian średnicy kaniulowanych LV załadowanych wskaźnikiem obrazowania Ca²⁺ Fura 2 AM w PSS oraz (B) powiększony ślad pokazujący wszystkie parametry związane z kurczliwością naczynia: EDD, ESD, AMP i częstotliwość. Wartości te wykorzystano do obliczenia rytmiczności i przepływu. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; EDD = średnica końcoworozkurczowa; ESD = średnica końcowo-skurczowa; AMP = amplituda. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywny ślad obrazowania LV Ca²⁺. (A) Przykładowy zapis zmian w bezwzględnych [Ca²⁺]_i w kaniulowanych LV załadowanych Fura-2 w PSS i (B) powiększony ślad pokazujący wszystkie parametry (Szczyt, Amplituda i Linia bazowa) związane z [Ca²⁺]_i (bez korekcji tła). Skrót: PSS = fizjologiczny roztwór soli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Kurczliwość LV i obrazowanie Ca²⁺ w skrócie. Reprezentatywne ślady odpowiadające (A) średnicy, (B) stosunkowi 340/380 i (C) bezwzględnemu [Ca²⁺]_i linii podstawowej PSS, nifedypiny, antagoniście kanału Ca_v1,x (Ca²⁺), odpowiedzi stężeniowej, w tym R_min i R_max. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; NIF = nifedypina; R_min = minimalny sygnał fluorescencji Fura-2; R_max = maksymalny sygnał fluorescencji Fura-2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Oscylacja Ca²⁺ i odpowiadająca jej kurczliwość zablokowana przez nifedypinę w LV. (A) Parametry kurczliwości Ca²⁺ (n = 3) i (B) (n = 3) zmniejszyły się w sposób zależny od stężenia po dodaniu nifedypiny, zależnego od napięcia antagonisty kanału Ca_v1.x (Ca²⁺). (C) Reprezentatywne wykresy Manhattanu pokazują średni przedział czasu (Δt) między skurczami a czasami kurczenia się i relaksacji. Dane przedstawione jako średnia ± SEM. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; NIF = nifedypina; EDD = średnica końcoworozkurczowa; AMP = amplituda. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ze względu na delikatną i drobną naturę LV konieczne jest zachowanie najwyższej ostrożności zarówno podczas procesu preparacji, jak i kaniulacji. Nawet niewielkie uszkodzenie naczynia może prowadzić do rozwoju nieżywotnej lewej komory lub powodować nieprawidłowości w stanach nieustalonych [^Ca2+]_i . Spójność ustawień wzbudzenia jest równie istotna w całej serii eksperymentalnej, aby zapewnić porównywalność w pomiarach [Ca²⁺]_i między grupą kontrolną a grupą leczoną. Niezachowanie jednolitych ustawień stwarza znaczne ryzyko przeszacowania lub niedoszacowania [Ca²⁺]_i na wszystkich statkach w ramach serii eksperymentalnej. Podobnie, równie ważne jest dokładne identyfikowanie i monitorowanie tego samego regionu naczynia podczas każdego eksperymentu.

Zastosowanie wskaźnika ratiometrycznego Fura-2AM normalizuje zmiany fluorescencji spowodowane nierówną grubością tkanki, rozkładem/wyciekiem fluoroforu lub fotowybielaniem, problemami powszechnymi w przypadku barwników o pojedynczej długości fali. ³¹ Umożliwia to ciągłe monitorowanie opisane w niniejszym protokole. Ponieważ jednak Fura-2 działa poprzez chelatację Ca²⁺, możliwe jest przeciążenie LV i zmniejszenie [Ca²⁺]_i dostępnego do skurczu lub odpowiedzi na lek. W takich przypadkach skoki Ca²⁺ mogą być nadal obserwowane, gdy nie ma rytmicznych skurczów. Różna długość lewej komory również może przyczyniać się do tego zjawiska. Chociaż te pomiary Ca²⁺ prawdopodobnie mogą być nadal ważne, może być konieczne zmniejszenie stężenia Fura-2AM w replikowanych konfiguracjach, aby z powodzeniem osiągnąć zarówno pomiary Ca²⁺ , jak i średnicy. Nasze wyniki obejmują tylko LV, dla których zarówno skoki Ca²⁺ , jak i rytmiczne skurcze były obecne na początku badania.

Pomiar R_{, min} i R_{, max} jest krytycznym etapem obliczania wartości bezwzględnej [Ca²⁺]_i. Ponieważ R_min powinno być stosunkiem Fura-2 przy braku Ca²⁺, do PSS wolnego od Ca²⁺ dodano wysokie stężenie EGTA, aby zapewnić chelatację wszelkich pozostałych Ca²⁺. Wstępne badania przeprowadzono z EDTA w PSS wolnym od Ca²⁺, co skutkowało sporadycznymi skurczami naczyń z odpowiadającymi im kolcami Ca²⁺ . W przypadku R_max do PSS dodano wysokie stężenie Ca²⁺ wraz z jonoforem, jonomycyną, aby zmaksymalizować sygnał [Ca²⁺]_i . Roztwór o wysokiej zawartości Ca²⁺ może się wytrącać, co może wymagać usunięcia EDTA z PSS. Co ważne, te dodatkowe pomiary R_min i R_max dają możliwość oceny fizjologicznie istotnych zmian w [Ca^{2 +} ]_i, co może dostarczyć informacji na temat mechanizmów pobudliwości i kurczliwości błony²⁷ , a także pozwolić na porównania wyjściowe między grupami eksperymentalnymi w porównaniu z protokołami, które podają tylko stosunek 340/380 dla Fura-2. Nieosiągnięcie odpowiednich wartości R_{, min} i R_{, max} wyklucza możliwość obliczenia wartości bezwzględnych [^Ca2+]_i.

Ze względu na kurczliwy charakter LV, metoda ta może zapewnić jedynie pomiar globalnych poziomów Ca^{2 +}, a nie lokalnych zdarzeń uwalniania Ca^{2 +}, które można zmierzyć w sparaliżowanych naczyniach³². Jednak metoda ta jest korzystna do korelowania zmian bezwzględnej dynamiki [Ca^{2 +}] _i ze kurczliwością w porównaniu z metodami wykorzystującymi sparaliżowane naczynia lub pojedyncze komórki^28,32. W tym podejściu zakłada się, że większość mierzonego Ca²⁺ pochodzi z komórek mięśni limfatycznych. Jednak komórki śródbłonka, które są również obecne w tych izolowanych LV, mogą przyczyniać się do całkowitego obserwowanego sygnału Ca^{2 + 33}. Wkład ten można oszacować na podstawie lewej komory nabłonkowej, która została ogołocona ze śródbłonka³⁴. Skurcze LV mogą również powodować nieznaczne przesuwanie się ściany naczynia do przodu i z ostrości podczas cyklu skurczu. Dlatego ważne jest, aby używać krótkich segmentów naczynia, które można naciągnąć mocno, ale bez rozciągania naczynia.

Poza zastosowaniem w lewej dawce, metoda ta może być wykorzystana do badania izolowanych naczyń z innych łożysk naczyniowych, w tym tętniczek i żył, i jest obiecująca do potencjalnego wykorzystania w neurobiologii i innych gałęziach biologii naczyniowej. Badanie wpływu różnych agonistów lub antagonistów ukierunkowanych na różne szlaki transdukcji sygnału to kolejna droga do zbadania podstawowej dynamiki Ca^{2 +} . Co więcej, technika ta może być również stosowana do badań porównawczych obejmujących próbki kontrolne i poddane działaniu substancji od odpowiednich zwierząt. Co więcej, podejście to można dostosować do wdrożenia na poziomie komórkowym, na przykład w izolowanych komórkach mięśni limfatycznych, co wymaga minimalnych regulacji komory perfuzyjnej i obiektywów mikroskopu. Podsumowując, metoda ta zapewnia fizjologicznie istotny wgląd w globalną dynamikę Ca²⁺ , ponieważ koreluje z kurczliwością i rytmicznością w LV oraz zapewnia solidną ocenę potencjalnych regulatorów dynamiki Ca²⁺ w zbieraniu LV.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obiektyw fluorescencyjny 20x S	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stany Zjednoczone)	UPlanSApo
Mikropipety ze szkła borokrzemianowego	Oprzyrządowanie systemów żywych (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)	GCP-75-100
Chlorek wapnia (CaCl2)	Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	BP510-500
Dwutlenek węgla (CO2)	nexAir (Memphis, TN, Stany Zjednoczone)	UN3156
Kleszcze preparacyjne	Fine Science Tools (Foster City, CA, Stany Zjednoczone)	11254-20
EDTA (C10H16N2O8)	Odczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	BP118-500
EGTA (C14H24N2O10)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	O2783-100
Fura-2AM	Invitrogen (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	F1221
Glukoza (C6H12O6)	Odczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	D16-500
Grawitacyjny regulator ciśnienia	wykonany na zamówienie w laboratorium
Jednostka grzewcza	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)	TC-09S
Oprogramowanie do obrazowania	IonOptix (Westwood, MA, Stany Zjednoczone)
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stany Zjednoczone)	IX73
Ionomycin	Invitrogen (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	I24222
IonOptix Cell Framing Adaptor	IonOptix (Westwood, MA, Stany Zjednoczone)	665 DXR
Isoflurane	Piramal Critical Care (Telangana, Indie)	NDC 66794-017-10
Izolowana komora perfuzyjna naczynia	Oprzyrządowanie Żywych Systemów (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)	CH-1
Kleszcze do przygotowania węzłów	Fine Science Tools (Foster City, CA, Stany Zjednoczone)	11253-20
Źródło światła LED	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stany Zjednoczone)	TL4
Siarczan magnezu (MgSO4)	Acros Organics (New Jersey, NJ, Stany Zjednoczone)	213115000
System wideo MyoCam-S3 Fast CMOS	IonOptix (Westwood, MA, Stany Zjednoczone)	MCS300
Nifedipine	Sigma (St. Louis, MO, Stany Zjednoczone)	N7634
Nici
Tlen (O2)	nexAir (Memphis, TN, Stany Zjednoczone)	UN1072
Kwas pluronowy	Sigma (St. Louis, MO, Stany Zjednoczone)	P2443
Chlorek potasu (KCl)	Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone	BP366-500
System monitorowania ciśnienia	Oprzyrządowanie systemów żywych (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)	PM-4
Przetwornik ciśnienia	Oprzyrządowanie systemów żywych (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)	PT-F
Wyłożona silikonem szalka Petriego	wykonana na zamówienie w laboratorium
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone	BP328-500
Chlorek sodu (NaCl)	Odczynniki Fishera (Waltham, MA, Stany Zjednoczone	BP358-212
Fosforan sodu (NaH2PO4)	Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone	BP329-500
Szczury Sprague-Dawley	Envigo RMS (Indianapolis, IN, USA)	Samiec	w wieku 9-13 tygodni
Mikroskop stereoskopowy	Leica Microsystems (Wetzlar, Niemcy)	Nożyczki sprężynowe S9D
Vannas	Fine Science Tools (Foster City, CA, Stany Zjednoczone)	15000-03