Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca2+ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych

Soumiya Pal; Ashim K. Bagchi; Amanda J. Stolarz

doi:10.3791/66535

Artykuł metodologiczny

Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca²⁺ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66535

⸱

22 marca 2024

Soumiya Pal¹ , Ashim K. Bagchi¹ , Amanda J. Stolarz¹

¹Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego pomiaru cytozolu, wolnego wapnia [Ca²⁺]_i i średnicy naczynia w kurczących się naczyniach limfatycznych w czasie rzeczywistym, a następnie obliczania bezwzględnych stężeń Ca²⁺ oraz parametrów kurczliwości/rytmiczności. Protokół ten może być stosowany do badania Ca²⁺ i dynamiki kurczliwości w różnych warunkach eksperymentalnych.

Streszczenie

Układ naczyń limfatycznych, obecnie często określany jako "trzecie krążenie", znajduje się w wielu ważnych układach narządów. Główną funkcją mechaniczną układu limfatycznego jest powrót płynu z przestrzeni zewnątrzkomórkowych z powrotem do centralnych przewodów żylnych. W transporcie limfy pośredniczą spontaniczne rytmiczne skurcze naczyń limfatycznych (LV). Skurcze lewej dawki są w dużej mierze regulowane przez cykliczny wzrost i spadek cytozolowego, wolnego wapnia ([Ca^{2 +} ]_i).

Ten artykuł przedstawia metodę jednoczesnego obliczania zmian w bezwzględnych stężeniach [Ca²⁺]_i i kurczliwości/rytmiczności naczyń w czasie rzeczywistym w izolowanych, ciśnieniowych LV. Używając izolowanych LV krezkowych szczurów, badaliśmy zmiany w [Ca²⁺]_i i kurczliwości/rytmiczności w odpowiedzi na dodanie leku. Izolowane LV zostały załadowane wskaźnikiem ratiometrycznym Ca²⁺-sensoring Fura-2AM, a mikroskopia wideo w połączeniu z oprogramowaniem do wykrywania krawędzi została wykorzystana do uchwycenia [Ca²⁺]_i i pomiary średnicy w sposób ciągły w czasie rzeczywistym.

Sygnał Fura-2AM z każdego LV został skalibrowany do minimalnego i maksymalnego sygnału dla każdego statku i użyty do obliczenia bezwzględnego [Ca²⁺]_i. Pomiary średnicy wykorzystano do obliczenia parametrów kurczliwości (amplituda, średnica końcowa rozkurczowa, średnica końcowa skurczowa, obliczony przepływ) i rytmiczności (częstotliwość, czas skurczu, czas relaksacji) i skorelowano z pomiarami bezwzględnymi [Ca²⁺]_i.

Wprowadzenie

Układ naczyń limfatycznych znajduje się w wielu układach narządów, w tym w mózgu, sercu, płucach, nerkach i krezce^1,2^,³^,⁴^,⁵^,⁶, i działa poprzez wypychanie płynu (limfy) z przestrzeni śródmiąższowych do centralnych przewodów żylnych w celu utrzymania homeostazy płynów⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. Zaczyna się od ślepo zakończonych naczyń włosowatych limfatycznych w łożyskach naczyń włosowatych, które spływają do naczyń limfatycznych (LV). Komórki LV do zbierania składają się z dwóch warstw komórek: warstwy komórek śródbłonka otoczonej warstwą komórek mięśni limfatycznych (LMC)¹⁰^,¹¹. Transport płynu limfatycznego odbywa się zarówno poprzez siły zewnętrzne (np. tworzenie się nowej limfy, pulsacje tętnicze, wahania ciśnienia w żyłach centralnych), jak i siły wewnętrzne¹².

Wewnętrzną siłą transportu limfy jest spontaniczny, rytmiczny skurcz zbierających się LV, na którym skupia się większość badań nad funkcjonowaniem układu limfatycznego. Ta wewnętrzna pompa limfatyczna jest zasadniczo regulowana przez cykliczne wznoszenie się i opadanie cytozolowego, wolnego Ca^{2 +} ([Ca^{2 +} ]_i). Spontaniczna depolaryzacja błony plazmatycznej w LMC aktywuje bramkowane napięciem kanały Ca²⁺ typu "L" (Ca_v1.x), wywołując napływ Ca²⁺ i późniejszy rytmiczny skurcz LV⁸^,⁹^,¹⁰. Rola ta została zademonstrowana poprzez blokowanie Ca_v1.x za pomocą specyficznych środków, takich jak nifedypina, która hamowała skurcze LV i powodowała rozszerzenie naczyń krwionośnych¹³^,¹⁴. Przejściowy wzrost [Ca^{2 +} ]_i lub "skok Ca^{2 +}" w LMC, w którym pośredniczą kanały Ca_v1.x, może również mobilizować wewnątrzkomórkowe zapasy Ca²⁺ poprzez aktywację receptorów trifosforanu inozytolu (IP₃) i receptorów ryanodine (RyR) na siateczce sarkoplazmatycznej (SR) ¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Obecne dowody sugerują, że receptory IP₃ dostarczają więcej Ca²⁺ wymaganego do normalnych skurczów LV w porównaniu do RyRs¹⁵^,¹⁶^,¹⁹^,²⁰^,²¹; jednak RyR może odgrywać rolę podczas patologii lub w odpowiedzi na interwencję farmaceutyczną¹⁷^,¹⁸. Dodatkowo, aktywacja kanałów K⁺ aktywowanych przez Ca²⁺ ²² i kanałów potasowych wrażliwych na ATP (K_ATP) ²³^,²⁴ może hiperpolaryzować błonę LMC i hamować spontaniczną aktywność skurczową.

Istnieje wiele innych kanałów jonowych i białek, które mogą regulować dynamikę Ca²⁺ podczas zbierania LV. Wykorzystanie metod do badania zmian w Ca²⁺ i kurczliwości naczyń w odpowiedzi na czynniki farmakologiczne w czasie rzeczywistym jest ważne dla zrozumienia tych potencjalnych regulatorów. Wcześniejsza metoda wykorzystująca Fura-2 do pomiaru względnych zmian w LV [Ca²⁺]_i została opisana²⁵. Ponieważ stała dysocjacji dla Fura-2 i Ca²⁺ jest znana²⁶, możliwe jest obliczenie rzeczywistych stężeń Ca²⁺, co rozszerza zastosowanie tej metody i zapewnia dodatkowy wgląd w sygnalizację Ca²⁺, pobudliwość błony i mechanizmy kurczliwości²⁷, a także pozwala na porównania linii wyjściowych między grupami eksperymentalnymi. To ostatnie podejście zostało zastosowane w kardiomiocytach²⁸, a zatem może być dostosowane do LV. W artykule przedstawiono ulepszoną metodę, która łączy te dwa podejścia do pomiaru i obliczania zmian w bezwzględnych [Ca^{2 +}] _i, a także kurczliwości/rytmiczności naczyń w sposób ciągły w czasie rzeczywistym w izolowanych, ciśnieniowych LV. Przedstawiamy również reprezentatywne wyniki dla pacjentów z lewej dawki leczonych nifedypiną.

Protokół

Samce szczurów Sprague-Dawley w wieku od 9 do 13 tygodni zakupiono od komercyjnego dostawcy. Po przybyciu wszystkie szczury zakwaterowano i utrzymywano w placówce Division of Lab Animal Medicine (DLAM) na University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS), stosując standardową dietę laboratoryjną oraz cykl światła i ciemności 12 h w temperaturze 25 ^oC. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem wykorzystania zwierząt nr 4127, opracowanym przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) UAMS.

1. Disekcja i kanulacja naczyń limfatycznych (LV) krezki

UWAGA: Ważne jest przygotowanie komory perfuzyjnej przed izolacją naczyń krezkowych LVs, aby upewnić się, że nie występuje przerwa w przepływie ani wyciek, który mógłby zakłócić przebieg eksperymentu.

Przygotowanie kąpieli perfuzyjnej
1. Zakupić borokrzemowe mikropipety (średnica zewnętrzna 1,2 mm, średnica wewnętrzna 0,68 mm, wyciągnięte do średnicy końcówki zewnętrznej 75-100 µm) od komercyjnego dostawcy. Przyciąć i wypolerować mikropipety (tzw. kaniule) do długości około 1-2 cm w celu zamontowania ich w komorze perfuzyjnej do izolowanych naczyń.
2. Połączyć każdą zamontowaną szklaną kaniulę w komorze perfuzyjnej z niezależnymi przetwornikami ciśnienia, umieszczonymi w linii z niezależnymi grawitacyjnymi regulatorami ciśnienia, za pomocą rurek polietylenowych.
  UWAGA: Pozwala to na niezależne manipulowanie ciśnieniem dopływu i odpływu w zależności od projektu badania. Rysunek 1 szczegółowo przedstawia tę konfigurację.
3. Wypełnić wstecznie komorę perfuzyjną (5 mL), szklane mikropipety oraz niezależny grawitacyjny regulator ciśnienia wraz z rurkami polietylenowymi fizjologicznym roztworem soli (PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO₃; 1,17 mM NaH₂PO₄; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO₄; 5,5 mM C₆H₁₂O₆ (glukoza); 0,026 mM C₁₀H₁₆N₂O₈ (EDTA); oraz 1,6 mM CaCl₂), usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie zaklemować ciśnienie tak, aby kaniule nie były pod ciśnieniem.
  UWAGA: pH tego roztworu wynosi ~7,5. pH 7,4 w kąpieli perfuzyjnej jest utrzymywane poprzez napowietrzanie CO₂, który oddziałuje na układ buforowy wodorowęglanowy w PSS, jak opisano w punkcie 1.3.7. EDTA jest stosowany w celu chelatowania nadmiaru jonów Ca²⁺.
Przygotowanie węzłów
1. Zawiązać pod mikroskopem podwójne węzły nadgarstkowe, używając plecionej nici chirurgicznej z jedwabiu (rozmiar 8-0). Kluczowe kroki zilustrowano na Rysunku 2.
  1. Oddzielić pojedyncze włókno.
  2. Używając dwóch pęset Dumont #5 z mikrozaokrąglonymi końcówkami, wykonać jedną pęsetą podwójną pętlę wokół końcówki drugiej pęsety.
  3. Za pomocą pęsety z pętlą chwycić wolny koniec nici i przeciągnąć go przez obie pętle, dbając o to, aby nie zaciągnąć węzła całkowicie i pozostawić niewielki otwór.
  4. Użyć sprężynowych nożyczek Vanna, aby odciąć nadmiar nici z obu stron. Węzły te zostaną później wykorzystane do zamocowania LV na kaniulach.
    UWAGA: Nie należy używać tych samych pęset, których będziemy używać do dysekcji lub kaniulacji, ponieważ istnieje większe ryzyko uszkodzenia końcówek pęset podczas wiązania węzłów.
Izolacja i kaniulacja naczyni lmfatycznych (LV) krezkowych
1. Głęboko znieczulić zwierzęta, podając przedawkę 5% izofluranu z O₂ (1,5 L/min), a następnie upuścić krew poprzez dekapitację.
2. Wyizolować całe krezki do dysekcji LV krezkowych, wykonując najpierw cięcie wzdłuż linii środkowej ściany brzusznej, zewnętrzniając krezkę, a następnie przecinając połączenie tuż poniżej zwieracza odźwiernego i ok. 2-3 cm powyżej kątnicy, a także połączenie z odbytnicą.
3. Przemyć wyizolowane całe krezki w 200 mL lodowatego PSS, a następnie przenieść i przymocować szpilkami w wyłożonej silikonem (8-10 mm) szalce Petriego (100 mm) zawierającej lodowaty PSS.
4. Wypreparować krezkowe LV drugiego rzędu z otaczającej tkanki tłuszczowej i łącznej, używając stereomikroskopu, precyzyjnych pęset dysekcyjnych Dumont #5 Inox oraz sprężynowych nożyczek Vanna. Aby ułatwić identyfikację końców LV po usunięciu z tkanki, pozostawić mały fragment tłuszczu na końcu proksymalnym LV.
5. Przenieść wypreparowane LV do komory perfuzyjnej w celu kaniulacji na szklanych kaniulach.
6. Użyć dwóch wstępnie naostrzonych pęset Dumont #5 Inox Fine, proste końcówki (0,05 x 0,01 mm), aby przeprowadzić kaniulację LV, umieszczając koniec dystalny LV na kaniuli P1 (dopływ), a koniec proksymalny naczynia na kaniuli P2 (odpływ), aby naśladować kierunek przepływu limfy.
  UWAGA: Kaniule P1 i P2 są identyczne i różnią się jedynie tym, który koniec LV jest do nich podłączony. Ważne jest użycie pęset, których końcówki idealnie do siebie przylegają i nie są uszkodzone, co ułatwia chwytanie cienkiej ściany naczynia.
  1. Nasunąć jeden zawiązany wcześniej węzeł na każdą szklaną kaniulę, aby później zamocować naczynie na kaniulach.
  2. Wykorzystując mały fragment tłuszczu do zorientowania kierunku LV, najpierw przeprowadzić kaniulację końca dystalnego na P1.
  3. Zsunąć węzeł w dół kaniuli i zacisnąć, aby zamocować LV. Należy uważać, aby nie zacisnąć zbyt mocno i nie złamać końcówki kaniuli.
  4. Ustawić ciśnienie w LV na 4-5 mm Hg w komorze perfuzyjnej.
    UWAGA: Na potrzeby naszych badań ustawiliśmy ciśnienia P1 i P2 jako równe; jednak w zależności od warunków eksperymentalnych ciśnienie przy każdej kaniuli można dostosować, aby wywołać naprężenie ścinające lub przepływ wsteczny.
  5. Powtórzyć kroki 1.3.6.1-1.3.6.4, aby przeprowadzić kaniulację końca proksymalnego LV na P2.
7. Umieścić kamień napowietrzający z mieszaniną 7% dwutlenku węgla (CO₂)/93% tlenu (O₂) w komorze kąpieli, aby utrzymać fizjologiczne pH.
8. Podłączyć komorę do regulatora temperatury i ustawić ją na 37 ^oC, aby LV mogły się ustabilizować i rozwinąć stabilne, spontaniczne skurcze (około 30 min).
  UWAGA: Rysunek 1 szczegółowo przedstawia tę konfigurację.

2. Pomiar stężeń absolutnych [Ca²⁺]_i w LVs

Barwienie kanulowanych LV Fura-2AM
1. Po wystąpieniu skurczów spontanicznych (z kroku 1.3.8), inkubować LV z esterem acetoksymetylowym Fura-2 (Fura-2AM; 2 µM lub 10 µL/5 mL) i kwasem pluronicznym (PA; 0,02% W/V lub 5 µL/5 mL 20% PA) przez 30 min w ciemności.
  UWAGA: Po dodaniu Fura-2AM wszystkie pozostałe kroki muszą być wykonywane w ciemności.
2. Po 30 min wymienić roztwór w komorze perfuzyjnej 3x, opróżniając całkowitą objętość kąpieli za pomocą podciśnienia i zastępując ją PSS bez odczynników o odpowiedniej temperaturze (37 ^oC).
  UWAGA: Należy to zrobić szybko, aby zminimalizować czas, w którym LV znajduje się w powietrzu. Należy używać obu rąk, np. prawej do obsługi podciśnienia, a lewej do uzupełniania nowego PSS bez odczynników.
3. Po przemyciu inkubować LV przez 15 min w ciemności, aby usunąć nadmiar wskaźnika i umożliwić deestryfikację.
Rejestracja fluorescencji Ca²⁺ i średnicy naczynia
1. Przenieść komorę na stolik odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w źródło światła LED, obiektyw 20x S Fluor, adapter do kadrowania komórek oraz szybki system kamer wideo CMOS, który umożliwia klatka po klatce rejestrację fluorescencji z częstotliwością 15 Hz.
  UWAGA: Schemat tego układu roboczego przedstawiono na Rysunku 3. Sygnał Ca²⁺ można rejestrować za pomocą kamery CCD z szybkością co najmniej 15 fps.
2. Podłączyć mikroskop do komputera z oprogramowaniem do obrazowania w celu rejestracji fluorescencji i detekcji krawędzi.
  UWAGA: Wspomniane oprogramowanie umożliwia również jednoczesną rejestrację ciśnienia, jednak nie jest to tutaj ujęte.
3. Włączyć źródło światła LED oraz interfejs systemu fluorescencyjnego.
  UWAGA: Instrukcje oprogramowania opisane tutaj dotyczą wspomnianego programu, ale do uzyskania tych danych można użyć innego oprogramowania.
4. Otworzyć oprogramowanie (IonWizard).
5. W karcie File wybrać New.
6. W karcie Collect wybrać Experiment.
7. Wczytać odpowiedni szablon eksperymentalny i kliknąć OK.
  UWAGA: Konieczne będzie przygotowanie szablonu eksperymentalnego z parametrami do pomiaru. Instrukcje dotyczące konfiguracji szablonu znajdują się w instrukcji oprogramowania²⁹.
8. Dostosować ślady na ekranie tak, aby widoczne były w kolejności malejącej: Vessel Diameter, Numerator (sygnał 340), Denominator (sygnał 380) oraz Ratio.
9. Dostosować skalę osi y w razie potrzeby, aby ułatwić wizualizację śladów.
  1. W sekcji Traces wybrać Edit User Limits. Upewnić się, że opcja Automatic Limits jest odznaczona.
  2. Wybrać parametr, który należy dostosować, wprowadzić minimalną i maksymalną wartość dla osi, a następnie wybrać OK.
10. Aby rozpocząć eksperyment, kliknąć START (na dole ekranu).
11. Do jednoczesnego pomiaru średnicy LV użyć oprogramowania do detekcji krawędzi zintegrowanego z systemem obrazowania, które generuje ślady skurczowe LV z częstotliwością 3 Hz. Wykorzystać te pomiary do analizy parametrów skurczowych i rytmiczności opisanych w sekcji 3 i przedstawionych na Rysunku 4.
  1. Należy odpowiednio dostosować oświetlenie, aby ściana LV była widoczna jako ciemne linie.
  2. Wybrać obszar zainteresowania (ROI) wolny od tłuszczu i zanieczyszczeń. Po rozpoczęciu eksperymentu nie przesuwać tego ROI.
  3. Upewnić się, że próg jest ustawiony tak, aby krawędź ściany naczynia była wykrywana przez cały cykl skurczowy.
12. W celu pomiarów fluorescencji włączyć fotopowielacz (PMT).
13. Wzbudzić Fura-2, wskaźnik ratiometryczny, poprzez naprzemienne stosowanie długości fal 340 i 380 nm w ekspozycjach 50 ms przy użyciu iluminatorów LED, a następnie zarejestrować widma emisyjne przy 510 nm z częstotliwością 15 Hz w całym polu obrazowania.
  UWAGA: Ważne jest zachowanie tych samych parametrów optycznych (ustawienia wzbudzenia, filtry emisji, obiektyw i lustra dichroiczne) dla całej serii eksperymentów, aby uzyskać powtarzalne pomiary Ca²⁺.
14. Zmierzyć stosunek sygnału do tła, uzyskując najpierw fluorescencję 340 i 380 z LV w środku pola widzenia (sygnał), a następnie, przesuwając pole widzenia za pomocą manipulatorów stolika na krawędź kąpieli bez naczynia (uważając, aby uniknąć krawędzi wyłożonej silikonem i/lub usuwając wszelkie zanieczyszczenia z kąpieli), rejestrując tło.
  UWAGA: Ważne jest, aby przed każdym pomiarem Ca²⁺ powrócić do oryginalnej sekcji naczynia.
15. Wymienić roztwór w kąpieli na PSS bez odczynników o odpowiedniej temperaturze, aby usunąć nadmiar wskaźnika z kąpieli. Usunięcie nadmiaru Fura-2 może wymagać kilku wymian kąpieli, dlatego powtarzać tę czynność, aż stosunek sygnału do tła wyniesie około 10:1.
16. Rejestrować bazowy sygnał fluorescencji Fura-2 i skurcze spontaniczne przez około 30 min, a następnie przeprowadzić kumulacyjną odpowiedź stężeniową na nifedypinę (NIF; 0,1-100 nM), antagonistę Ca_v1.x zależnego od napięcia. Uzyskać pomiary tła dla każdego stężenia leku.
17. Na koniec każdego eksperymentu przemyć LV roztworem PSS bez Ca²⁺ o odpowiedniej temperaturze, aby uzyskać minimalny sygnał fluorescencji Fura-2 (R_min) i maksymalną średnicę LV w obecności braku Ca²⁺. Należy pamiętać o pomiarze tła.
  UWAGA: PSS bez Ca²⁺ ma taki sam skład jak PSS, ale bez CaCl₂, a EDTA zostaje zastąpiony przez 1 mM EGTA (C₁₄H₂₄N₂O₁₀) (pH ~7,5).
18. Wymienić roztwór w kąpieli na PSS o odpowiedniej temperaturze zawierający 10 mM Ca²⁺ i ionomycynę (10 µM IONO), ionofor Ca²⁺, aby uzyskać maksymalny sygnał fluorescencji Fura-2 (R_max) i minimalną średnicę LV w warunkach nasycenia Ca²⁺. Należy pamiętać o pomiarze tła.
Wzór do pomiaru absolutnego [Ca²⁺]_i
1. Użyć R_min i R_max do kalibracji stosunku długości fal 340 i 380 nm i obliczyć absolutne stężenie wolnego Ca²⁺ w cytozolu ([Ca²⁺]_i).
2. Obliczyć absolutne stężenie wolnego Ca²⁺ w cytozolu ([Ca²⁺]_i) za pomocą równania (1)²⁶:
  (1)
  Gdzie K_d = 225 nM (stała dysocjacji dla Fura-2)²⁶, R = stosunek 340/380, R_min = stosunek 340/380 w obecności braku Ca²⁺, R_max = stosunek 340/380 w warunkach nasycenia Ca²⁺, S_free = sygnał 380 w obecności braku Ca²⁺, S_bound = sygnał 380 w warunkach nasycenia Ca²⁺
  UWAGA: Wszystkie sygnały fluorescencyjne zostały skorygowane o fluorescencję tła.
3. Rysunek 5 przedstawia przykładowy ślad Ca²⁺ z wyszczególnieniem rejestrowanych parametrów. Zdefiniować bazowy poziom Ca²⁺ jako najniższy poziom spoczynkowy Ca²⁺ przed skokiem Ca²⁺, a szczytowy poziom Ca²⁺ jako najwyższy poziom Ca²⁺ osiągnięty podczas skoku Ca²⁺. Amplituda to różnica między szczytowym a bazowym poziomem Ca²⁺. Wszystkie parametry należy eksportować bezpośrednio z oprogramowania do obrazowania, z wyjątkiem częstotliwości skoków Ca²⁺, którą należy obliczyć offline jako liczbę skoków Ca²⁺/s. Poniżej znajdują się kluczowe kroki w wspomnianym oprogramowaniu w celu uzyskania tych parametrów.
  UWAGA: Całe ślady można wyeksportować do pliku .txt, a wszystkie parametry można analizować lub obliczać w wybranym oprogramowaniu.
4. Dla R_min zaznaczyć sekcję śladu Numerator, która odpowiada tłu podczas stosowania PSS bez Ca²⁺. Otworzy się okno dialogowe z wartościami dla tej części śladu.
5. W sekcji Operations wybrać Constants.
6. Wybrać Calcium-Numeric background i wprowadzić wartości tła dla Numeratora i Mianownika z poprzedniego kroku. Kliknąć OK.
7. Zaznaczyć sekcję śladu Ratio, która odpowiada najniższemu stosunkowi podczas stosowania PSS bez Ca²⁺. Jest to R_min. Należy również zanotować wartość Mianownika dla tej sekcji; jest to S_free.
8. Powtórzyć kroki 2.3.4 do 2.3.7 dla R_max i S_bound dla sekcji śladu odpowiadającej wysokiemu stężeniu wolnego Ca²⁺ w PSS i najwyższemu stosunkowi.
9. W sekcji Operations wybrać Constants.
10. Wybrać Calcium-Calcium Calibration i wprowadzić wartości wymienione w Równaniu 1. Kliknąć OK.
11. Dostosować jeden ze śladów na ekranie, jak opisano w kroku 2.2.8, aby widoczny był parametr Calcium-Numeric subtracted Calcium.
12. Przeprowadzić analizę przejściową monotoniczną (Monotonic Transient Analysis), aby uzyskać pozostałe parametry. Instrukcje na ten temat znajdują się w instrukcji oprogramowania³⁰.
13. Alternatywnie, w sekcji Export wybrać Current Trace.
14. Wybrać lokalizację eksportu pliku .txt i kliknąć OK.
  UWAGA: Należy pamiętać o kliknięciu w konkretny ślad, który ma zostać wyeksportowany. Można wyeksportować cały ślad lub jego wybrane sekcje.

3. Pomiar kurczliwości i rytmiczności LV

Oprogramowanie do detekcji krawędzi zintegrowane z systemem obrazowania generuje zapisy kurczliwości dla pomiarów średnicy LV, zgodnie z powyższym opisem. Wykorzystaj te pomiary do analizy parametrów kurczliwości i rytmiczności. Rycina 4 przedstawia przykładowy zapis kurczliwości, szczegółowo określający, które parametry kurczliwości należy zarejestrować. Wszystkie parametry wyeksportuj bezpośrednio z oprogramowania do obrazowania, korzystając z funkcji Monotonic Transient Analysis na zapisie średnicy³⁰, z wyjątkiem częstotliwości skurczów, obliczonego przepływu oraz odstępu, które należy obliczyć poza systemem (offline).
UWAGA: Całe zapisy można wyeksportować do pliku .txt, a wszystkie parametry można analizować lub obliczać w wybranym oprogramowaniu, korzystając z poniższych równań.
Pomiary EDD, ESD, amplitudy, częstotliwości i obliczonego przepływu
1. Zmierz maksymalną i minimalną średnicę (odpowiednio średnicę końcowozastępcową [EDD] i średnicę kończoskurczową [ESD]), jakie LV mogą osiągnąć podczas rytmicznych i spontanicznych skurczów.
2. Oblicz amplitudę skurczów (AMP) jako różnicę między EDD a ESD.
3. Oblicz częstotliwość jako liczbę skurczów w okresie pomiarowym (w s).
4. Oblicz obliczony przepływ na µm, korzystając z równania (2):
  Obliczony przepływ = π/4(EDD²- ESD²)F (2)
  Gdzie EDD² = przekrój poprzeczny naczynia w stanie rozluźnienia, ESD² = miara przekroju poprzecznego naczynia podczas skurczu, F = częstotliwość skurczów/s
Rytmiczność: czas skurczu i rozkurczu:
1. Innymi miarami rytmiczności LV są czas skurczu i czas rozkurczu.
2. Zdefiniuj czas skurczu jako czas potrzebny na osiągnięcie ESD przez LV przy każdym skurczu.
3. Zdefiniuj czas rozkurczu jako czas potrzebny na osiągnięcie EDD przez LV przy każdym rozkurczu, co da ogólną wskazówkę dotyczącą rytmiczności skorelowanej z absolutnym stężeniem [Ca²⁺]_i w określonym przedziale czasowym.
4. Oblicz czas odstępu (ΔT) z równania (3).
  Δt = t2 _(ESD2)-t1 _(ESD1) (3)

Wyniki

Kurczliwość naczyń limfatycznych (LVs) oraz odpowiadające im zmiany w wolnym Ca²⁺ cytozolu ([Ca²⁺]_i) oceniano w izolowanych naczyniach limfatycznych krezki szczura po ekspozycji na różne stężenia nifedypiny (NIF; 0.1-100 nM) (Rysunek 6). Parametry, w tym amplituda skoku Ca²⁺, bazowy poziom Ca²⁺ oraz szczytowy poziom Ca²⁺, wykazywały zależny od stężenia spadek wraz z sukcesywnym dodawaniem NIF do komory perfuzyjnej (Rysunek 7A). Jednocześnie parametry kurczliwości, takie jak amplituda skurczu i obliczony przepływ, również wykazały stopniowy spadek (Rysunek 7B). Odnotowano niewielki wzrost średnicy EDD pod wpływem NIF (Rysunek 7B). Częstotliwość skoków Ca²⁺ oraz częstotliwość skurczów wydają się być odpowiedzią typu wszystko albo nic. Jednak efekt ten wystąpił przy 10 nM w przypadku jednego naczynia LV, podczas gdy we wszystkich naczyniach LV skurcze ustały przy 100 nM. Tym samym połączone dane tworzą wykresy przypominające stopniową odpowiedź zależną od stężenia. Efekt ten jest zgodny z wcześniejszymi publikacjami, w których stosowano NIF w badaniach LVs w innych preparatach (miografia druciana i ciśnieniowa¹³^,¹⁴). Wykresy Manhattan pokazują indywidualne odpowiedzi LVs dla miar rytmiczności, w tym odstępu, czasu skurczu i czasu rozkurczu (Rysunek 7C). Ten rodzaj prezentacji danych pozwala badaczowi wyodrębnić te odpowiedzi typu wszystko albo nic lub zmienność rytmów skurczu, co dostarcza dodatkowych informacji o mechanizmach leżących u podstaw tych zjawisk. Ostatecznie spadki amplitudy i częstotliwości skurczów doprowadziły do zmniejszenia obliczonego przepływu przez te izolowane LVs, co służy jako wskaźnik zastępczy dla funkcji in vivo. Ogólnie spadek kurczliwości LVs korelował ze zmniejszeniem [Ca²⁺]_i. Nasze wyniki stanowią bezpośredni dowód na to, że w zakresie do 100 nM NIF skutecznie hamuje skurcze i oscylacje [Ca²⁺]_i w LVs poprzez antagonizowanie kanałów Ca_v1.x obecnych w komórkach mięśni limfatycznych (LMCs).

figure-results-1
Rysunek 1: Zdjęcie układu izolowanej komory naczyniowej. W badaniach nad perfuzją naczyń wykorzystano izolowaną komorę naczyniową wyposażoną w termoregulator. Do kontroli ciśnienia za pomocą zbiornika z PSS wykorzystano grawitację. Ciśnienie monitorowano za pomocą przetworników podłączonych do kaniul doprowadzających (P1) i odprowadzających (P2). Skrót: PSS = fizjologiczny roztwór soli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Schemat przygotowania węzła. (A) Przygotowanie podwójnej pętli pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu pojedynczej nici z 3-warstwowej jedwabnej nici chirurgicznej, (B) chwycenie wolnego końca i przeciągnięcie go przez obie pętle, (C) zaciśnięcie węzła z obu stron, aby zachować niewielki otwór, oraz (D) odcięcie nadmiaru nici z każdej strony; niebieska ramka pokazuje gotowy do użycia pełny podwójny węzeł nadgarstkowy. Pasek skali = 1.5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat przepływu pracy eksperymentalnej dla pozyskiwania danych. Zdrowego szczura zanieczulono poprzez indukcję 5% izofluranem, a następnie przeprowadzono dekapitację w celu usunięcia krwi z tułowia. Wykonano cięcie w linii pośrodkowej, aby odsłonić i wyizolować krezkę. Wyizolowaną krezkę rozłożono w lodowatym roztworze PSS, a LV oddzielono od tkanki tłuszczowej w celu kanulacji w izolowanej komorze perfuzyjnej naczyń. Kąpiel umieszczono na stoliku mikroskopu odwróconego, korzystając z obiektywu 20x. Naczynie pobudzano naprzemiennie światłem o długości fali 340 i 380 nm, a widma fluorescencyjne emisji rejestrowano za pomocą kamery CCD przy 510 nm. Komputer podłączony do mikroskopu generował zapisy skurczowe i Ca²⁺ przy użyciu oprogramowania do przechwytywania fluorescencji i detekcji krawędzi obrazu. Pasek skali = 1 mm. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; CCD = urządzenie sprzężone ładunkowo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Reprezentatywny zapis kurczliwości naczyń limfatycznych (LV). (A) Przykładowy zapis zmian średnicy kaniulowanych LV obciążonych wskaźnikiem obrazowania Ca²⁺ Fura 2 AM w PSS oraz (B) powiększony zapis pokazujący wszystkie parametry związane z kurczliwością naczyń: EDD, ESD, AMP i częstotliwość. Wartości te zostały wykorzystane do obliczenia rytmiczności i przepływu. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; EDD = średnica końcowodiastoliczna; ESD = średnica końcowosystoliczna; AMP = amplituda. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Reprezentatywny zapis obrazowania Ca²⁺ w LV. (A) Przykład zapisu zmian bezwzględnego stężenia [Ca²⁺]_i w kaniulowanych LV obciążonych Fura-2 w PSS oraz (B) powiększony zapis przedstawiający wszystkie parametry (Peak, Amplitude oraz Baseline) związane z [Ca²⁺]_i(bez korekcji tła). Skrót: PSS = fizjologiczny roztwór soli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rycina 6: Przegląd kurczliwości LV i obrazowania Ca²⁺. Reprezentatywne zapisy odpowiadające (A) średnicy, (B) stosunkowi 340/380 oraz (C) bezwzględnemu stężeniu [Ca²⁺]_i przy linii bazowej PSS, nifedypinie (antagoniście kanałów Ca_v1.x (Ca²⁺)) oraz odpowiedzi na stężenie, w tym R_min i R_max. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; NIF = nifedypina; R_min = minimalny sygnał fluorescencji Fura-2; R_max= maksymalny sygnał fluorescencji Fura-2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rysunek 7: Oscylacje Ca²⁺ i odpowiadająca im kurczliwość zablokowane przez nifedypinę w LV. (A) Parametry Ca²⁺ (n = 3) oraz (B) kurczliwości (n = 3) ulegały zmniejszeniu w sposób zależny od stężenia po dodaniu nifedypiny, antagonisty napięciowo-zależnych kanałów Ca_v1.x (Ca²⁺). (C) Reprezentatywne wykresy Manhattan przedstawiają średni odstęp czasowy (Δt) między skurczami oraz czasy skurczu i rozkurczu. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; NIF = nifedypina; EDD = średnica koniec-rozkurczowa; AMP = amplituda. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ze względu na delikatną i drobną naturę LV konieczne jest zachowanie najwyższej ostrożności zarówno podczas procesu preparacji, jak i kaniulacji. Nawet niewielkie uszkodzenie naczynia może prowadzić do rozwoju nieżywotnej lewej komory lub powodować nieprawidłowości w stanach nieustalonych [^Ca2+]_i . Spójność ustawień wzbudzenia jest równie istotna w całej serii eksperymentalnej, aby zapewnić porównywalność w pomiarach [Ca²⁺]_i między grupą kontrolną a grupą leczoną. Niezachowanie jednolitych ustawień stwarza znaczne ryzyko przeszacowania lub niedoszacowania [Ca²⁺]_i na wszystkich statkach w ramach serii eksperymentalnej. Podobnie, równie ważne jest dokładne identyfikowanie i monitorowanie tego samego regionu naczynia podczas każdego eksperymentu.

Zastosowanie wskaźnika ratiometrycznego Fura-2AM normalizuje zmiany fluorescencji spowodowane nierówną grubością tkanki, rozkładem/wyciekiem fluoroforu lub fotowybielaniem, problemami powszechnymi w przypadku barwników o pojedynczej długości fali. ³¹ Umożliwia to ciągłe monitorowanie opisane w niniejszym protokole. Ponieważ jednak Fura-2 działa poprzez chelatację Ca²⁺, możliwe jest przeciążenie LV i zmniejszenie [Ca²⁺]_idostępnego do skurczu lub odpowiedzi na lek. W takich przypadkach skoki Ca²⁺ mogą być nadal obserwowane, gdy nie ma rytmicznych skurczów. Różna długość lewej komory również może przyczyniać się do tego zjawiska. Chociaż te pomiary Ca²⁺ prawdopodobnie mogą być nadal ważne, może być konieczne zmniejszenie stężenia Fura-2AM w replikowanych konfiguracjach, aby z powodzeniem osiągnąć zarówno pomiary Ca²⁺ , jak i średnicy. Nasze wyniki obejmują tylko LV, dla których zarówno skoki Ca²⁺ , jak i rytmiczne skurcze były obecne na początku badania.

Pomiar R_{, min} i R_{, max}jest krytycznym etapem obliczania wartości bezwzględnej [Ca²⁺]_i. Ponieważ R_minpowinno być stosunkiem Fura-2 przy braku Ca²⁺, do PSS wolnego od Ca²⁺ dodano wysokie stężenie EGTA, aby zapewnić chelatację wszelkich pozostałych Ca²⁺. Wstępne badania przeprowadzono z EDTA w PSS wolnym od Ca²⁺, co skutkowało sporadycznymi skurczami naczyń z odpowiadającymi im kolcami Ca²⁺ . W przypadku R_max do PSS dodano wysokie stężenie Ca²⁺ wraz z jonoforem, jonomycyną, aby zmaksymalizować sygnał [Ca²⁺]_i . Roztwór o wysokiej zawartości Ca²⁺ może się wytrącać, co może wymagać usunięcia EDTA z PSS. Co ważne, te dodatkowe pomiary R_min i R_max dają możliwość oceny fizjologicznie istotnych zmian w [Ca^{2 +} ]_i, co może dostarczyć informacji na temat mechanizmów pobudliwości i kurczliwości błony²⁷ , a także pozwolić na porównania wyjściowe między grupami eksperymentalnymi w porównaniu z protokołami, które podają tylko stosunek 340/380 dla Fura-2. Nieosiągnięcie odpowiednich wartości R_{, min} i R_{, max} wyklucza możliwość obliczenia wartości bezwzględnych [^Ca2+]_i.

Ze względu na kurczliwy charakter LV, metoda ta może zapewnić jedynie pomiar globalnych poziomów Ca^{2 +}, a nie lokalnych zdarzeń uwalniania Ca^{2 +}, które można zmierzyć w sparaliżowanych naczyniach³². Jednak metoda ta jest korzystna do korelowania zmian bezwzględnej dynamiki [Ca^{2 +}] _ize kurczliwością w porównaniu z metodami wykorzystującymi sparaliżowane naczynia lub pojedyncze komórki^28,32. W tym podejściu zakłada się, że większość mierzonego Ca²⁺ pochodzi z komórek mięśni limfatycznych. Jednak komórki śródbłonka, które są również obecne w tych izolowanych LV, mogą przyczyniać się do całkowitego obserwowanego sygnału Ca^{2 +} ³³. Wkład ten można oszacować na podstawie lewej komory nabłonkowej, która została ogołocona ze śródbłonka³⁴. Skurcze LV mogą również powodować nieznaczne przesuwanie się ściany naczynia do przodu i z ostrości podczas cyklu skurczu. Dlatego ważne jest, aby używać krótkich segmentów naczynia, które można naciągnąć mocno, ale bez rozciągania naczynia.

Poza zastosowaniem w lewej dawce, metoda ta może być wykorzystana do badania izolowanych naczyń z innych łożysk naczyniowych, w tym tętniczek i żył, i jest obiecująca do potencjalnego wykorzystania w neurobiologii i innych gałęziach biologii naczyniowej. Badanie wpływu różnych agonistów lub antagonistów ukierunkowanych na różne szlaki transdukcji sygnału to kolejna droga do zbadania podstawowej dynamiki Ca^{2 +} . Co więcej, technika ta może być również stosowana do badań porównawczych obejmujących próbki kontrolne i poddane działaniu substancji od odpowiednich zwierząt. Co więcej, podejście to można dostosować do wdrożenia na poziomie komórkowym, na przykład w izolowanych komórkach mięśni limfatycznych, co wymaga minimalnych regulacji komory perfuzyjnej i obiektywów mikroskopu. Podsumowując, metoda ta zapewnia fizjologicznie istotny wgląd w globalną dynamikę Ca²⁺ , ponieważ koreluje z kurczliwością i rytmicznością w LV oraz zapewnia solidną ocenę potencjalnych regulatorów dynamiki Ca²⁺ w zbieraniu LV.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health, w tym National Institute of General Medical Sciences, Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE), Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy [P20-GM109005], National Cancer Institute [1R37CA282349-01] oraz American Heart Association Predoctoral Fellowship [Numer nagrody: 23PRE1020738; https://doi.org/10.58275/AHA.23PRE1020738.pc.gr.161089]. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH lub AHA. Rysunki 1 i 3 zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obiektyw fluorescencyjny 20x S	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stany Zjednoczone)	UPlanSApo
Mikropipety ze szkła borokrzemianowego	Oprzyrządowanie systemów żywych (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)	GCP-75-100
Chlorek wapnia (CaCl2)	Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	BP510-500
Dwutlenek węgla (CO2)	nexAir (Memphis, TN, Stany Zjednoczone)	UN3156
Kleszcze preparacyjne	Fine Science Tools (Foster City, CA, Stany Zjednoczone)	11254-20
EDTA (C10H16N2O8)	Odczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	BP118-500
EGTA (C14H24N2O10)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	O2783-100
Fura-2AM	Invitrogen (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	F1221
Glukoza (C6H12O6)	Odczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	D16-500
Grawitacyjny regulator ciśnienia	wykonany na zamówienie w laboratorium
Jednostka grzewcza	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)	TC-09S
Oprogramowanie do obrazowania	IonOptix (Westwood, MA, Stany Zjednoczone)
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stany Zjednoczone)	IX73
Ionomycin	Invitrogen (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)	I24222
IonOptix Cell Framing Adaptor	IonOptix (Westwood, MA, Stany Zjednoczone)	665 DXR
Isoflurane	Piramal Critical Care (Telangana, Indie)	NDC 66794-017-10
Izolowana komora perfuzyjna naczynia	Oprzyrządowanie Żywych Systemów (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)	CH-1
Kleszcze do przygotowania węzłów	Fine Science Tools (Foster City, CA, Stany Zjednoczone)	11253-20
Źródło światła LED	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stany Zjednoczone)	TL4
Siarczan magnezu (MgSO4)	Acros Organics (New Jersey, NJ, Stany Zjednoczone)	213115000
System wideo MyoCam-S3 Fast CMOS	IonOptix (Westwood, MA, Stany Zjednoczone)	MCS300
Nifedipine	Sigma (St. Louis, MO, Stany Zjednoczone)	N7634
Nici
Tlen (O2)	nexAir (Memphis, TN, Stany Zjednoczone)	UN1072
Kwas pluronowy	Sigma (St. Louis, MO, Stany Zjednoczone)	P2443
Chlorek potasu (KCl)	Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone	BP366-500
System monitorowania ciśnienia	Oprzyrządowanie systemów żywych (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)	PM-4
Przetwornik ciśnienia	Oprzyrządowanie systemów żywych (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)	PT-F
Wyłożona silikonem szalka Petriego	wykonana na zamówienie w laboratorium
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone	BP328-500
Chlorek sodu (NaCl)	Odczynniki Fishera (Waltham, MA, Stany Zjednoczone	BP358-212
Fosforan sodu (NaH2PO4)	Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone	BP329-500
Szczury Sprague-Dawley	Envigo RMS (Indianapolis, IN, USA)	Samiec	w wieku 9-13 tygodni
Mikroskop stereoskopowy	Leica Microsystems (Wetzlar, Niemcy)	Nożyczki sprężynowe S9D
Vannas	Fine Science Tools (Foster City, CA, Stany Zjednoczone)	15000-03

oftalmiczne

Bibliografia

Takahashi, T., Shibata, M., Kamiya, A. Mechanism of macromolecule concentration in collecting lymphatics in rat mesentery. Microvasc Res. 54 (3), 193-205 (1997).
Ishikawa, Y., et al. The human renal lymphatics under normal and pathological conditions. Histopathology. 49 (3), 265-273 (2006).
Fanous, M. Y. Z., Phillips, A. J., Windsor, J. A. Mesenteric lymph: the bridge to future management of critical illness. JOP. 8 (4), 374-399 (2007).
El-Chemaly, S., Levine, S. J., Moss, J. Lymphatics in lung disease. Ann N Y Acad Sci. 1131 (1), 195-202 (2008).
Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
Aukland, K., Reed, R. K. Interstitial-lymphatic mechanisms in the control of extracellular fluid volume. Physiol Rev. 73 (1), 1-78 (1993).
Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).
Nipper, M. E., Dixon, J. B. Engineering the Lymphatic System. Cardiovasc Eng Technol. 2 (4), 296-308 (2011).
Choi, I., Lee, S., Hong, Y. K. The new era of the lymphatic system: No longer secondary to the blood vascular system. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (4), 006445(2012).
Ji, R. C. Lymphatic endothelial cells, lymphedematous lymphangiogenesis, and molecular control of edema formation. Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 123-137 (2008).
Scallan, J. P., Zawieja, S. D., Castorena-Gonzalez, J. A., Davis, M. J. Lymphatic pumping: mechanics, mechanisms and malfunction. J Physiol. 594 (20), 5749-5768 (2016).
Lee, S., Roizes, S., vonder Weid, P. Y. Distinct roles of L- and T-type voltage-dependent Ca2+ channels in regulation of lymphatic vessel contractile activity. J Physiol. 592 (24), 5409-5427 (2014).
Telinius, N., et al. Human lymphatic vessel contractile activity is inhibited in vitro but not in vivo by the calcium channel blocker nifedipine. J Physiol. 592 (21), 4697-4714 (2014).
Imtiaz, M. S., Zhao, J., Hosaka, K., vonder Weid, P. Y., Crowe, M., van Helden, D. F. Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization. Biophys J. 92 (11), 3843-3861 (2007).
Jo, M., Trujillo, A. N., Yang, Y., Breslin, J. W. Evidence of functional ryanodine receptors in rat mesenteric collecting lymphatic vessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 317 (3), H561-H574 (2019).
Stolarz, A. J., et al. Doxorubicin Activates Ryanodine Receptors in Rat Lymphatic Muscle Cells to Attenuate Rhythmic Contractions and Lymph Flow. J Pharmacol Exp Ther. 371 (2), 278-289 (2019).
Van, S., et al. Dantrolene Prevents the Lymphostasis Caused by Doxorubicin in the Rat Mesenteric Circulation. Front Pharmacol. 12, 727526(2021).
Atchison, D. J., Johnston, M. G. Role of extra- and intracellular Ca2+ in the lymphatic myogenic response. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 272 (1), R326-R333 (1997).
Atchison, D. J., Rodela, H., Johnston, M. G. Intracellular calcium stores modulation in lymph vessels depends on wall stretch. Can J Physiol Pharmacol. 76 (4), 367-372 (1998).
Zhao, J., van Helden, D. F. ET-1-associated vasomotion and vasospasm in lymphatic vessels of the guinea-pig mesentery. Br J Pharmacol. 140 (8), 1399-1413 (2003).
Cotton, K. D., Hollywood, M. A., McHale, N. G., Thornbury, K. D. Outward currents in smooth muscle cells isolated from sheep mesenteric lymphatics. J Physiol. 503 (1), 1-11 (1997).
Mathias, R., vonder Weid, P. Y. Involvement of the NO-cGMP-KATP channel pathway in the mesenteric lymphatic pump dysfunction observed in the guinea pig model of TNBS-induced ileitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (6), G623-G634 (2013).
Garner, B. R., et al. KATP channel openers inhibit lymphatic contractions and lymph flow as a possible mechanism of peripheral edema. J Pharmacol Exp Ther. 376 (1), 40-50 (2021).
Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Breslin, J. W. Measurement of cytosolic Ca2+ in isolated contractile lymphatics. J Vis Exp. (58), e3438(2011).
Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), 1-20 (2011).
Harmer, A. R., Abi-Gerges, N., Morton, M. J., Pullen, G. F., Valentin, J. P., Pollard, C. E. Validation of an in vitro contractility assay using canine ventricular myocytes. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (2), 162-172 (2012).
IonOptix LLC. IonWizard 7.2 Acquisition. , IonOptix LLC. Westwood, PA. (2017).
IonOptix LLC. IonWizard 7.2 Core & Analysis Functions. IonOptix LLC. , IonOptix LLC. Westwood, PA. (2017).
Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
Zawieja, S. D., et al. Ano1 mediates pressure-sensitive contraction frequency changes in mouse lymphatic collecting vessels. J Gen Physiol. 151 (4), 532-554 (2019).
Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. J Physiol. 595 (24), 7347-7368 (2017).
Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., vonder Weid, P. Y. Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent manners. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2287-H2295 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

uk ad naczy limfatycznych kurczliwo naczy limfatycznych wap cytozolowy obrazowanie Fura 2AM naczynia limfatyczne krezowe detekcja kraw dzi mikroskopia fluorescencyjna sygnalizacja wapniowa kanulacja naczy

Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca2+ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych