Artykuł metodologiczny

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

DOI:

10.3791/66543

⸱

12 lipca 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siatkówka składa się z licznych komórek tworzących różnorodne obwody neuronalne, które stanowią pierwszy etap ścieżki wzrokowej. Każdy obwód charakteryzuje się unikalnymi cechami i odrębnymi neuroprzekaźnikami, co determinuje jego rolę i znaczenie funkcjonalne. Biorąc pod uwagę skomplikowane typy komórek w jego strukturze, złożoność obwodów neuronalnych w siatkówce stanowi wyzwanie dla badań. Aby lepiej zbadać obwody siatkówki i przesłuchy, takie jak związek między szlakami czopków i pręcików oraz precyzyjną lokalizację molekularną (neuroprzekaźniki lub neuropeptydy), taką jak obecność immunoreaktywności podobnej do P w siatkówce myszy, zastosowaliśmy metodę mikroskopii immunoelektronowej z wbudowanym zabudową (immuno-EM) w celu zbadania połączeń synaptycznych i organizacji. Takie podejście pozwala nam wskazać specyficzne międzykomórkowe połączenia synaptyczne i precyzyjną lokalizację molekularną oraz może odegrać wiodącą rolę w badaniu jego funkcji. W tym artykule opisano protokół, użyte odczynniki i szczegółowe etapy, w tym (1) przygotowanie do utrwalenia siatkówki, (2) wstępne zatapianie barwienia immunologicznego oraz (3) po utrwaleniu i osadzaniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożoność obwodów neuronalnych w siatkówce stanowi wyzwanie do zbadania, biorąc pod uwagę różnorodność typów komórek w jej strukturze1,2. Pierwszym krokiem jest identyfikacja połączeń synaptycznych między różnymi komórkami i określenie lokalizacji komórkowej określonych neuroprzekaźników lub neuropeptydów. Wraz z postępem biologii molekularnej wprowadzającym nowe białka, precyzyjna lokalizacja w siatkówce staje się kluczowa dla zrozumienia ich funkcji i analizy obwodów siatkówki i połączeń synaptycznych3,4,5.

Ze względu na ograniczoną rozdzielczość mikroskopii świetlnej, mikroskopia elektronowa (EM) jest powszechnie stosowana do wykrywania subkomórkowych struktur komórek nerwowych. EM ma różne klasyfikacje, z konwencjonalną transmisyjną mikroskopią elektronową (TEM) wykorzystywaną do obserwacji ultrastruktur komórek6,7,8,9. Mikroskopia immunoelektronowa (immuno-EM), która łączy rozdzielczość przestrzenną EM ze zdolnością identyfikacji chemicznej przeciwciał wiążących się specyficznie z białkami10, wyróżnia się jako optymalna i wyjątkowa metoda badania połączeń synaptycznych i lokalizacji białek subkomórkowych w siatkówce11,12.

Techniki immuno-EM można podzielić na metody pre-embedding i post-embedding w oparciu o kolejność osadzania i inkubacji przeciwciał. W porównaniu z metodą po osadzaniu, podejście pre-embedding jest zdolne do identyfikacji na dużą skalę i na duże odległości13,14,15, oferując optymalne podejście do badania procesów komórkowych, takich jak aksony i dendryty. Dodatkowo technika ta zapewnia silny sygnał i szerokie pole widzenia, dzięki czemu jest korzystna dla kompleksowych badań ekspresji białek i lokalizacji molekularnej w cytoplazmie. Metoda ta okazuje się szczególnie cenna w zapewnieniu chemicznie zidentyfikowanych struktur, które są widoczne w całej cytoplazmie, komórkach czy siatkówce.

Jednak metoda po osadzeniu, choć ma mniejszą penetrację lub dyfuzję w porównaniu do metody przed osadzaniem, nie jest tak czuła16,17. Mówiąc prościej, jeśli celem jest zbadanie lokalizacji określonych neuroprzekaźników w cytoplazmie lub zakończeniach synaptycznych, preferowaną metodą jest wstępne osadzenie immuno-EM. I odwrotnie, w celu identyfikacji lokalizacji receptorów błonowych, bardziej zaleca się stosowanie immunogold EM po zasadzeniu.

Biorąc pod uwagę te rozważania, decydujemy się na metodę wstępnego osadzenia immuno-EM, aby zagłębić się w obwody siatkówki, w tym interakcję między szlakami czopków i pręcików oraz lokalizację molekularną, taką jak dystrybucja i organizacja synaptyczna substancji P-podobnej immunoreaktywności (SP-IR) w siatkówce myszy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Regulamin Komisji Etyki Uniwersytetu Medycznego w Wenzhou zgodnie z wytycznymi ARVO. W badaniach wykorzystano dorosłe myszy (C57BL/6J, samiec i samica, w wieku od 8 do 12 tygodni). Sprzęt i odczynniki potrzebne do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie do stabilizacji siatkówki

  1. Zbierz następujące materiały i narzędzia: mikroskop preparacyjny, dwa kleszcze z bardzo cienkimi końcówkami, nożyczki, igłę do strzykawki o pojemności 1 ml (rozmiar igły: G26) i bibułę filtracyjną.
  2. Głęboko znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 2,2,2-tribromoetanolu w dawce 0,25 mg/g masy ciała. Następnie odetnij głowy myszom i odetnij im głowy16.
  3. Enukleować ich oczy nożyczkami łokciowymi i umieścić je w szklanym naczyniu zawierającym 4% paraformaldehydu-0,2% kwasu pikrynowego w 0,1 M buforze fosforanowym (PB; pH 7,4).
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym wybij otwór w rąbku rogówki za pomocą igły strzykawkowej o pojemności 1 ml i odetnij przedni odcinek nożyczkami, podążając za otworem. Następnie usuń soczewkę z wewnętrznej powierzchni siatkówki za pomocą kleszczy.
  5. Użyj dwóch kleszczy, aby ostrożnie oderwać twardówkę, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana od muszli ocznej (tkanka siatkówki bańki całkowicie oddzielona od naczyniówki). Następnie przetnij siatkówkę na cztery części.
  6. Utrwalić te skrawki w 4% paraformaldehydzie-0,2% kwasie pikrynowym w 0,1 M PB (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przenieść tkankę do 4% paraformaldehydu w 0,1 M PB (pH 10,4) przez noc w temperaturze 4 °C.

2. Wstępne osadzanie barwienia immunologicznego

  1. Po przemyciu w 0,01 M PBS (pH 7,4) sześć razy przez 10 minut każdy, inkubować tkanki siatkówki w 1% borowodorku sodu (NaBH4) w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 30 minut.
  2. Przemyć skrawki siatkówki w 0,01 M PBS (pH 7,4) co najmniej sześć razy. W międzyczasie usuń ciało szkliste bibułą filtracyjną, a następnie pokrój siatkówkę na małe plasterki o średnicy 100-300 μm za pomocą obosiecznej żyletki.
  3. Po zablokowaniu 5% normalną surowicą kozią (NGS) w 0,1 M PB (pH 7,4) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, inkubować wycinki siatkówki z pierwszorzędowymi przeciwciałami (Anty-królicze PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) wraz z 2% NGS w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na shakerze. Następnie inkubować przez 96 godzin (5 dni) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
  4. Po sześciokrotnym myciu przez 10 minut każdy w 0,01 M PBS (pH 7,4), inkubować plastry siatkówki z przeciwciałem drugorzędowym w stosunku 1:200, takim jak kozia anty-królicza IgG, wraz z 2% NGS w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Następnie inkubować przez 48 godzin (2 dni) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
    UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe stosowano samodzielnie w eksperymentach kontrolnych.
  5. Przemyć prążki siatkówki w 0,01 M PBS (pH 7,4) sześć razy przez 10 minut każdy przed inkubacją z odczynnikiem A i odczynnikiem B z zestawu ABC w stosunku 1:100 w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 2 dni w temperaturze 4°C. (Zarówno odczynnik A, jak i odczynnik B rozcieńczono 0,01 M PBS. Na przykład: Roztwór: 6 μl; roztwór B: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, łącznie 600 μl).
  6. Przemyj prążki siatkówki w 0,05 M buforze Tris (pH 7,2) trzy razy po 10 minut każdy. Następnie wstępnie inkubować paski siatkówki z 5% odczynnikiem 1 i 5% odczynnikiem 3 z zestawu DAB w wodzie destylowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. (Na przykład: odczynnik 1: 50 μl; odczynnik 3: 50 μl; woda destylowana: 900 μl, łącznie 1000 μl).
  7. Wybarwić paski siatkówki za pomocą DAB. Dodać kolejno tę samą objętość roztworu z trzech probówek z zestawu DAB (odczynnik 1-odczynnik 2-odczynnik 3). Obserwuj stan barwienia za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Zatrzymaj barwienie, gdy komórki staną się brązowe; Ten proces trwa 10-20 minut.
  8. Przemyć paski siatkówki 0,05 M buforem Tris (pH 7,2) trzy razy przez 10 minut każdy, a następnie przemyć w 0,01 M PBS sześć razy przez 10 minut każdy.

3. Po utrwaleniu i osadzeniu

  1. Utrwal paski siatkówki w 2% aldehydzie glutarowym przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej (RT), a następnie umyj w 0,01 M PBS (pH 7,4) sześć razy przez 10 minut każdy.
  2. Inkubować prążki siatkówki z 1% tetratlenkiem osmu (OsO4) w 0,1 M PB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przechowywać w ciemnym miejscu.
  3. Po przemyciu w wodzie destylowanej (ddH2O) sześciokrotnie po 10 minut, należy inkubować tkanki siatkówki z octanem uranylu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przechowywać je w ciemnym miejscu, aby zabarwić te tkanki.
  4. Umieść tkanki siatkówki w roztworach acetonu (50%, 70%, 80% i 90%) na 10 minut każda, a następnie w 100% dwa razy po 10 minut.
  5. Zanurzyć tkanki siatkówki w mieszaninie zawierającej taką samą objętość octanu uranylu i żywicy epoksydowej na 1 godzinę w suszarce w temperaturze 37 °C, a następnie w mieszaninie zawierającej octan uranylu i żywicę (1:4) przez noc w suszarce w temperaturze 37 °C.
  6. Delikatnie przenieść tkanki siatkówki za pomocą wykałaczki do nowej żywicy na 1 godzinę w temperaturze 45 °C w suszarce, a następnie zorientowany pasek siatkówki jest zatapiany w płytce do zatapiania żywicy.
  7. Umieścić próbkę w suszarce w temperaturze 45 °C na 3 godziny i w suszarce w temperaturze 65 °C na 48 godzin.
  8. Uformuj bloki osadzania w trapezy i pokrój blok na odcinki o grubości 1 μm za pomocą ultramikrotomu, wybarwić te odcinki błękitem toluidynowym i wstępnie przesiać obszary zainteresowania pod mikroskopem świetlnym.
  9. Zbierz ultracienkie skrawki (70-90 nm) na miedzianych siatkach i obejrzyj je pod mikroskopem elektronowym.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje przykłady eksperymentów kontrolnych bez inkubacji pierwotnych przeciwciał przeciwko kinazie białkowej C alfa (PKCα) lub SP, w których nie stwierdzono immunoreaktywności (IR).

Rysunek 2 przedstawia PKCα-IR w siatkówce myszy. PKCα służy jako marker dla wszystkich pręcików dwubiegunowych komórek (RBC) w siatkówce18. Na poziomie mikroskopii elektronowej (EM) RBC można zidentyfikować za pomocą PKCα-IR, uwidocznionego przez produkt reakcji diaminobenzydyny (DAB) o wysokiej gęstości elektronów. Rysunek 2A ilustruje PKCα-dodatni dendryt RBC tworzący synapsę z końcówką pręcikową w zewnętrznej warstwie splotowatej (OPL), podczas gdy Rysunek 2B pokazuje synapsę RBC stożko-czerwoną, w której PKCα-dodatni dendryt RBC jest postsynaptyczny do zakończenia stożka. Dodatkowo produkt reakcji DAB pomaga w identyfikacji końcówek RBC (Rysunek 2C) i procesów aksonalnych ( Rysunek 2D) w wewnętrznej warstwie splotowatej (IPL).

Rysunek 3 przedstawia ekspresję substancji P (SP) zarówno w połączeniach przed-, jak i postsynaptycznych w IPL siatkówki myszy. Komórki amakrynowe SP-IR są presynaptyczne w stosunku do komórek amakrynowych SP-ujemnych (Rysunek 3A), a także procesów amakrynowych SP-IR (dane nie pokazane). Co więcej, komórki amakrynowe SP-IR są zakończeniami postsynaptycznymi do dwubiegunowych odpowiednio na poziomie podwarstwy 3 (S3) i podwarstwy 5 (S5) IPL (Rysunek 3B, C). Nasze poprzednie badania szczegółowo opisują analizę synaps, w których procesy komórkowe amakrynowe SP-IR tworzą wyjścia synaptyczne do innych procesów w klasie IPL19. Warto zauważyć, że subkomórkowa lokalizacja SP znajduje się głównie w pęcherzykach synaptycznych w zakończeniach presynaptycznych (Ryc. 3).

figure-results-1
Rysunek 1: Mikrofotografie immunoelektronowe z eksperymentów kontrolnych. Zarówno stożkowa szypułka (CP) z dwiema wstęgami (grot strzały) (A), jak i sferula prętowa (RS) z jedną wstęgą w OPL (B) nie wykazywały żadnych przebarwień. Podziałka skali: 500 nm (A), 200 nm (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Mikrofotografie immunoelektronowe znakowane przeciwciałem PKCα w siatkówce myszy. (A) RS łączy się z jedną PKCα-dodatnią krwią czerwoną (strzałki wskazują immunoreaktywność) i dwiema komórkami poziomymi (H) w OPL. (B) CP łączy się z PKCα-dodatnim RBC w OPL. (C) i (D) pokazują odpowiednio PKCα-dodatni koniec RBC i proces aksonalny w IPL. Podziałki: 200 nm (A), 500 nm (B), 500 nm (C), 500 nm (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Mikrofotografie immunoelektronowe znakowane przeciwciałem SP w IPL siatkówki myszy. (A) Komórka amakrynowa SP-IR (A+) jest presynaptyczna w stosunku do SP-ujemnej komórki amakrynowej (A-). Komórki amakrynowe SP-IR otrzymywały dane wejściowe z końcówek bipolarnych odpowiednio na poziomach S3 (B) i S5 (C) IPL. Podziałka skali: 200 nm (A), 200 nm (B), 200 nm (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisano trzy kluczowe etapy pomyślnej obserwacji obwodów synaptycznych i lokalizacji białek: (1) szybkie i słabe utrwalenie, (2) wstępne zagnieżdżenie immunobarwienia oraz (3) po utrwaleniu i osadzeniu.

Sugerujemy, że fiksacja jest kluczowym krokiem dla skutecznego podejścia opartego na wstępnym osadzeniu immuno-EM. W związku z tym podkreślono tutaj znaczenie świeżego utrwalacza i szybkiej fiksacji, nazywając tę zasadę "zasadą 4F", która ma kluczowe znaczenie w przygotowaniu tkanek. Jednak osiągnięcie zarówno zwiększonej penetracji przeciwciał, jak i skutecznego utrwalenia stanowi wyzwanie20. Aby temu zaradzić, aldehyd glutarowy został zastąpiony kwasem pikrynowym podczas początkowego utrwalenia, aby poprawić penetrację przeciwciał, ponieważ aldehyd glutarowy może zakłócać determinanty antygenowe i wpływać na barwienie immunologiczne21. Z kolei kwas pikrynowy lepiej zachowuje strukturę błony i integralność tkanek22, aczkolwiek z kompromisem w skuteczności utrwalania. W trzecim etapie użyto 2% aldehydu glutarowego do utrwalenia po utrwaleniu, aby zoptymalizować utrwalenie tkanek.

Kluczowe punkty przedstawionego tutaj protokołu obejmują pięć kroków: (1) Wczesna fiksacja: Wykorzystanie kwasu pikrynowego we wczesnym etapie w celu lepszej penetracji przeciwciał przy jednoczesnej minimalizacji zakłóceń w działaniu determinantów antygenowych. (2) Po utrwaleniu: Użycie 2% aldehydu glutarowego w celu zwiększenia wiązania tkanek po barwieniu immunologicznym. (3) Leczenie redukcyjne: Inkubacja tkanki w 1% NaBH4 w 0,1 M PB (pH 7,4) przez 30 minut w celu przywrócenia dużej części immunoreaktywności i poprawy reaktywności immunologicznej antygenów i przeciwciał, intensyfikując pozytywne sygnały23. (4) Przygotowanie tkanki: Usuwanie tkanki szklistej i cięcie tkanki siatkówki na małe paski, aby ułatwić skuteczną inkubację przeciwciał i zapewnić jednolite sygnały. (5) Ponadto konieczne jest obchodzenie się z tkanką siatkówki z najwyższą ostrożnością, unikając wszelkich uszkodzeń, które mogłyby zagrozić późniejszym obserwacjom podczas całej procedury. Środki te łącznie przyczyniają się do sukcesu metody wstępnego osadzania immuno-EM, umożliwiając badanie różnych aspektów, takich jak synapsy stożkowo-RBC24, lokalizacja molekularna SP-IR19 i dokładna ekspresja α-Syn w siatkówce myszy25.

Przed inkubacją pierwszego przeciwciała konieczne jest zablokowanie pasków siatkówki za pomocą 2% NGS w celu wyeliminowania niespecyficznych zakłóceń sygnału. Stężenie pierwszego przeciwciała musi być określone na podstawie samego przeciwciała, zwykle wyższe niż stężenie stosowane do barwienia zamrożonych sekcji, i musi być wcześniej zoptymalizowane. Podczas pierwotnego okresu inkubacji przeciwciał konieczne jest ciągłe obracanie probówki mikrowirówki, aby zapewnić pełny kontakt ułożonych w stos pasków siatkówki z przeciwciałem, zapobiegając niepełnej penetracji ułożonych części. Aby wzmocnić sygnał, DAB był wstępnie inkubowany przed standardowym barwieniem DAB, przy czym określony czas barwienia zwykle wynosił od 10 do 20 minut. Jeśli czas jest zbyt krótki, sygnał może być zbyt słaby do obserwacji, a jeśli jest zbyt długi, może prowadzić do fałszywych sygnałów dodatnich, wpływając na dokładną ocenę. Ogólnie rzecz biorąc, czas inkubacji barwników jest bezpośrednio zależny od koloru powierzchni tkanki (od brązowego do ciemnobrązowego).

Podczas gdy eksperymenty przeprowadzono z zamrażaniem tkanki w ciekłym azocie w celu wzmocnienia sygnału, jak wspomniano wcześniej 18,26,27, metoda ta wzmocniła sygnały pozytywne, ale spowodowała słabą strukturę błony komórek siatkówki (dane nie pokazane). Ta degradacja strukturalna sprawiła, że dokładna identyfikacja typów komórek była trudna. Biorąc to pod uwagę, tkanka siatkówki nie była wielokrotnie zamrażana. Aby wzmocnić pozytywny sygnał, czas inkubacji przeciwciał został odpowiednio wydłużony. Proponowany protokół łączy w sobie wcześniejsze zalety, upraszczając kroki w porównaniu z osadzaniem w agarze. To nie tylko chroni antygenowe determinanty białek, ale także zachowuje integralność błon komórkowych. Nadrzędnym celem jest zbadanie połączeń synaptycznych i lokalizacji komórkowej neuroprzekaźników na całym szlaku. W związku z tym produkty reakcji DAB w protokole nie zostały poddane intensyfikacji obróbki srebrem, co czyni je bardziej odpowiednimi do badania połączeń i szlaków synaptycznych specyficznych dla neuroprzekaźników28.

Obecnie istnieją ograniczone metody chemicznej identyfikacji szlaków lub neuroprzekaźników na poziomie ultrastrukturalnym. Jedną z takich metod jest skorelowana mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM)29,30, która jednak ogranicza się do bardzo małego obszaru i nie ma możliwości identyfikacji połączeń na całej ścieżce. Mocne strony wstępnie osadzonej immuno-EM leżą w jej solidnym sygnale, szerokim zasięgu i zdolności do długoterminowego pozycjonowania analitycznego i śledzenia 13,14,15. Jednak ta metoda ma również swoje ograniczenia, takie jak sygnały rozproszone, co czyni je mniej specyficznymi. W celu precyzyjnej lokalizacji receptorów błonowych, zwłaszcza tych na błonie, bardziej odpowiednie może być użycie immunogold EM po zasadzeniu. Technika ta umożliwia bezpośrednie zliczanie cząstek złota, ułatwiając analizę liczby i zmienności tych receptorów błonowych16.

W przyszłości integracja wstępnie osadzonej immuno-EM z objętościowym EM jest obiecująca jako skuteczna metoda długoterminowej eksploracji zidentyfikowanych obwodów neuronalnych, co stanowi przyszłe perspektywy dalszego rozwoju tej metody. Tom EM koncentruje się na rekonstrukcji struktury, opierając się na morfologii do identyfikacji konkretnych struktur, przy braku precyzyjnej identyfikacji chemicznej31,32. Dzięki połączeniu wstępnego osadzenia immuno-EM z objętością EM, określone struktury lub substancje mogą być identyfikowane podczas trójwymiarowej rekonstrukcji, zapewniając bardziej kompleksowe i wizualnie intuicyjne podejście do identyfikacji obwodów neuronalnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Narodowego Programu Kluczowych Badań i Rozwoju Chin (2022YFA1105503), Państwowego Kluczowego Laboratorium Neuronauki (SKLN-202103), Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych Zhejiang (Y21H120019).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml igła do strzykawkikangdelai
1% OsO4Mikroskopia elektronowa Science19100
2,2,2-tribromoetanolSigma-AldrichT48402
8% aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowa Science16020
8% paraformaldehydMikroskopia elektronowa Nauka157-8
Mikroskopia elektronowaacetonu10000
Anty-królik PKCSigma-AldrichP4334
Anti-Rabbit SPAbcamab67006
Zestaw podłoży DABMXB BiotechnologiesKIT-9701/9702/9703
Nożyczki do łokciSuzhou66 wizja firmy54010
Mikroskop elektronowyPhillipsCM120
Żywica EponMikroskopia elektronowa Nauka14910
kleszczSuzhou66 firma wizyjnaS101A Bibuła
filtracyjna MilliporeMerck Millipore 
Na2HPO4· 12H2OSigma71650Składnik buforu fosforanowego
NaH2PO4· H2OSigma71507Składnik buforu fosforanowego
Kwas pikrynowyMikroskopia elektronowa Nauka19550
Borowodorek sodu (NaBH4) Sigma215511
TrisSolarbio917R071
UltramikrotomLeica
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Science22400
Zestaw ABC VACTASTAIN, Peroksydaza (IgG królika)Vector LaboratoriesPK-4001
Science PR05538

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
  2. Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).
  3. Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
  4. Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).
  5. Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
  6. Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
  7. Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).
  8. Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).
  9. Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
  10. Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).
  13. Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).
  14. Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
  15. Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).
  16. Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547(2016).
  17. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
  18. Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
  19. Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
  20. van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).
  21. Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381(2023).
  22. Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
  23. Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
  24. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  25. Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  26. Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
  27. Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
  28. Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
  29. Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
  30. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
  31. Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
  32. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Retinal CircuitsImmunoelectron MicroscopyMolecular LocalizationSynaptic ConnectionsPre Embedding ImmunostainingRetinal Neuronal CircuitsSubstance P ImmunoreactivityRod Bipolar CellsOuter Plexiform LayerDAB Staining

Powiązane artykuły