Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Siatkówka składa się z licznych komórek tworzących różnorodne obwody neuronalne, które stanowią pierwszy etap ścieżki wzrokowej. Każdy obwód charakteryzuje się unikalnymi cechami i odrębnymi neuroprzekaźnikami, co determinuje jego rolę i znaczenie funkcjonalne. Biorąc pod uwagę skomplikowane typy komórek w jego strukturze, złożoność obwodów neuronalnych w siatkówce stanowi wyzwanie dla badań. Aby lepiej zbadać obwody siatkówki i przesłuchy, takie jak związek między szlakami czopków i pręcików oraz precyzyjną lokalizację molekularną (neuroprzekaźniki lub neuropeptydy), taką jak obecność immunoreaktywności podobnej do P w siatkówce myszy, zastosowaliśmy metodę mikroskopii immunoelektronowej z wbudowanym zabudową (immuno-EM) w celu zbadania połączeń synaptycznych i organizacji. Takie podejście pozwala nam wskazać specyficzne międzykomórkowe połączenia synaptyczne i precyzyjną lokalizację molekularną oraz może odegrać wiodącą rolę w badaniu jego funkcji. W tym artykule opisano protokół, użyte odczynniki i szczegółowe etapy, w tym (1) przygotowanie do utrwalenia siatkówki, (2) wstępne zatapianie barwienia immunologicznego oraz (3) po utrwaleniu i osadzaniu.
Wprowadzenie
Złożoność obwodów neuronalnych w siatkówce stanowi wyzwanie do zbadania, biorąc pod uwagę różnorodność typów komórek w jej strukturze1,2. Pierwszym krokiem jest identyfikacja połączeń synaptycznych między różnymi komórkami i określenie lokalizacji komórkowej określonych neuroprzekaźników lub neuropeptydów. Wraz z postępem biologii molekularnej wprowadzającym nowe białka, precyzyjna lokalizacja w siatkówce staje się kluczowa dla zrozumienia ich funkcji i analizy obwodów siatkówki i połączeń synaptycznych3,4,5.
Ze względu na ograniczoną rozdzielczość mikroskopii świetlnej, mikroskopia elektronowa (EM) jest powszechnie stosowana do wykrywania subkomórkowych struktur komórek nerwowych. EM ma różne klasyfikacje, z konwencjonalną transmisyjną mikroskopią elektronową (TEM) wykorzystywaną do obserwacji ultrastruktur komórek6,7,8,9. Mikroskopia immunoelektronowa (immuno-EM), która łączy rozdzielczość przestrzenną EM ze zdolnością identyfikacji chemicznej przeciwciał wiążących się specyficznie z białkami10, wyróżnia się jako optymalna i wyjątkowa metoda badania połączeń synaptycznych i lokalizacji białek subkomórkowych w siatkówce11,12.
Techniki immuno-EM można podzielić na metody pre-embedding i post-embedding w oparciu o kolejność osadzania i inkubacji przeciwciał. W porównaniu z metodą po osadzaniu, podejście pre-embedding jest zdolne do identyfikacji na dużą skalę i na duże odległości13,14,15, oferując optymalne podejście do badania procesów komórkowych, takich jak aksony i dendryty. Dodatkowo technika ta zapewnia silny sygnał i szerokie pole widzenia, dzięki czemu jest korzystna dla kompleksowych badań ekspresji białek i lokalizacji molekularnej w cytoplazmie. Metoda ta okazuje się szczególnie cenna w zapewnieniu chemicznie zidentyfikowanych struktur, które są widoczne w całej cytoplazmie, komórkach czy siatkówce.
Jednak metoda po osadzeniu, choć ma mniejszą penetrację lub dyfuzję w porównaniu do metody przed osadzaniem, nie jest tak czuła16,17. Mówiąc prościej, jeśli celem jest zbadanie lokalizacji określonych neuroprzekaźników w cytoplazmie lub zakończeniach synaptycznych, preferowaną metodą jest wstępne osadzenie immuno-EM. I odwrotnie, w celu identyfikacji lokalizacji receptorów błonowych, bardziej zaleca się stosowanie immunogold EM po zasadzeniu.
Biorąc pod uwagę te rozważania, decydujemy się na metodę wstępnego osadzenia immuno-EM, aby zagłębić się w obwody siatkówki, w tym interakcję między szlakami czopków i pręcików oraz lokalizację molekularną, taką jak dystrybucja i organizacja synaptyczna substancji P-podobnej immunoreaktywności (SP-IR) w siatkówce myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Regulamin Komisji Etyki Uniwersytetu Medycznego w Wenzhou zgodnie z wytycznymi ARVO. W badaniach wykorzystano dorosłe myszy (C57BL/6J, samiec i samica, w wieku od 8 do 12 tygodni). Sprzęt i odczynniki potrzebne do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie do stabilizacji siatkówki
- Zbierz następujące materiały i narzędzia: mikroskop preparacyjny, dwa kleszcze z bardzo cienkimi końcówkami, nożyczki, igłę do strzykawki o pojemności 1 ml (rozmiar igły: G26) i bibułę filtracyjną.
- Głęboko znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 2,2,2-tribromoetanolu w dawce 0,25 mg/g masy ciała. Następnie odetnij głowy myszom i odetnij im głowy16.
- Enukleować ich oczy nożyczkami łokciowymi i umieścić je w szklanym naczyniu zawierającym 4% paraformaldehydu-0,2% kwasu pikrynowego w 0,1 M buforze fosforanowym (PB; pH 7,4).
- Pod mikroskopem preparacyjnym wybij otwór w rąbku rogówki za pomocą igły strzykawkowej o pojemności 1 ml i odetnij przedni odcinek nożyczkami, podążając za otworem. Następnie usuń soczewkę z wewnętrznej powierzchni siatkówki za pomocą kleszczy.
- Użyj dwóch kleszczy, aby ostrożnie oderwać twardówkę, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana od muszli ocznej (tkanka siatkówki bańki całkowicie oddzielona od naczyniówki). Następnie przetnij siatkówkę na cztery części.
- Utrwalić te skrawki w 4% paraformaldehydzie-0,2% kwasie pikrynowym w 0,1 M PB (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przenieść tkankę do 4% paraformaldehydu w 0,1 M PB (pH 10,4) przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Wstępne osadzanie barwienia immunologicznego
- Po przemyciu w 0,01 M PBS (pH 7,4) sześć razy przez 10 minut każdy, inkubować tkanki siatkówki w 1% borowodorku sodu (NaBH4) w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 30 minut.
- Przemyć skrawki siatkówki w 0,01 M PBS (pH 7,4) co najmniej sześć razy. W międzyczasie usuń ciało szkliste bibułą filtracyjną, a następnie pokrój siatkówkę na małe plasterki o średnicy 100-300 μm za pomocą obosiecznej żyletki.
- Po zablokowaniu 5% normalną surowicą kozią (NGS) w 0,1 M PB (pH 7,4) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, inkubować wycinki siatkówki z pierwszorzędowymi przeciwciałami (Anty-królicze PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) wraz z 2% NGS w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na shakerze. Następnie inkubować przez 96 godzin (5 dni) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
- Po sześciokrotnym myciu przez 10 minut każdy w 0,01 M PBS (pH 7,4), inkubować plastry siatkówki z przeciwciałem drugorzędowym w stosunku 1:200, takim jak kozia anty-królicza IgG, wraz z 2% NGS w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Następnie inkubować przez 48 godzin (2 dni) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe stosowano samodzielnie w eksperymentach kontrolnych. - Przemyć prążki siatkówki w 0,01 M PBS (pH 7,4) sześć razy przez 10 minut każdy przed inkubacją z odczynnikiem A i odczynnikiem B z zestawu ABC w stosunku 1:100 w 0,01 M PBS (pH 7,4) przez 2 dni w temperaturze 4°C. (Zarówno odczynnik A, jak i odczynnik B rozcieńczono 0,01 M PBS. Na przykład: Roztwór: 6 μl; roztwór B: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, łącznie 600 μl).
- Przemyj prążki siatkówki w 0,05 M buforze Tris (pH 7,2) trzy razy po 10 minut każdy. Następnie wstępnie inkubować paski siatkówki z 5% odczynnikiem 1 i 5% odczynnikiem 3 z zestawu DAB w wodzie destylowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. (Na przykład: odczynnik 1: 50 μl; odczynnik 3: 50 μl; woda destylowana: 900 μl, łącznie 1000 μl).
- Wybarwić paski siatkówki za pomocą DAB. Dodać kolejno tę samą objętość roztworu z trzech probówek z zestawu DAB (odczynnik 1-odczynnik 2-odczynnik 3). Obserwuj stan barwienia za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Zatrzymaj barwienie, gdy komórki staną się brązowe; Ten proces trwa 10-20 minut.
- Przemyć paski siatkówki 0,05 M buforem Tris (pH 7,2) trzy razy przez 10 minut każdy, a następnie przemyć w 0,01 M PBS sześć razy przez 10 minut każdy.
3. Po utrwaleniu i osadzeniu
- Utrwal paski siatkówki w 2% aldehydzie glutarowym przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej (RT), a następnie umyj w 0,01 M PBS (pH 7,4) sześć razy przez 10 minut każdy.
- Inkubować prążki siatkówki z 1% tetratlenkiem osmu (OsO4) w 0,1 M PB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przechowywać w ciemnym miejscu.
- Po przemyciu w wodzie destylowanej (ddH2O) sześciokrotnie po 10 minut, należy inkubować tkanki siatkówki z octanem uranylu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przechowywać je w ciemnym miejscu, aby zabarwić te tkanki.
- Umieść tkanki siatkówki w roztworach acetonu (50%, 70%, 80% i 90%) na 10 minut każda, a następnie w 100% dwa razy po 10 minut.
- Zanurzyć tkanki siatkówki w mieszaninie zawierającej taką samą objętość octanu uranylu i żywicy epoksydowej na 1 godzinę w suszarce w temperaturze 37 °C, a następnie w mieszaninie zawierającej octan uranylu i żywicę (1:4) przez noc w suszarce w temperaturze 37 °C.
- Delikatnie przenieść tkanki siatkówki za pomocą wykałaczki do nowej żywicy na 1 godzinę w temperaturze 45 °C w suszarce, a następnie zorientowany pasek siatkówki jest zatapiany w płytce do zatapiania żywicy.
- Umieścić próbkę w suszarce w temperaturze 45 °C na 3 godziny i w suszarce w temperaturze 65 °C na 48 godzin.
- Uformuj bloki osadzania w trapezy i pokrój blok na odcinki o grubości 1 μm za pomocą ultramikrotomu, wybarwić te odcinki błękitem toluidynowym i wstępnie przesiać obszary zainteresowania pod mikroskopem świetlnym.
- Zbierz ultracienkie skrawki (70-90 nm) na miedzianych siatkach i obejrzyj je pod mikroskopem elektronowym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia przykłady eksperymentów kontrolnych bez inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko kinazie białkowej C alfa (PKCα) lub SP, w których nie stwierdzono immunoreaktywności (IR).
Rysunek 2 przedstawia PKCα-IR w siatkówce myszy. PKCα służy jako marker dla wszystkich komórek bipolarnych pręcikowych (RBC) w siatkówce18. Na poziomie mikroskopii elektronowej (EM) RBC można zidentyfikować...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule opisano trzy kluczowe etapy pomyślnej obserwacji obwodów synaptycznych i lokalizacji białek: (1) szybkie i słabe utrwalenie, (2) wstępne zagnieżdżenie immunobarwienia oraz (3) po utrwaleniu i osadzeniu.
Sugerujemy, że fiksacja jest kluczowym krokiem dla skutecznego podejścia opartego na wstępnym osadzeniu immuno-EM. W związku z tym podkreślono tutaj znaczenie świeżego utrwalacza i szybkiej fiksacji, nazywając tę zasadę "zasadą 4F", która ma kluczowe znaczenie w przygotowaniu tka...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Narodowego Programu Kluczowych Badań i Rozwoju Chin (2022YFA1105503), Państwowego Kluczowego Laboratorium Neuronauki (SKLN-202103), Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych Zhejiang (Y21H120019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 ml igła do strzykawki | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Mikroskopia elektronowa Science | 19100 | |
| 2,2,2-tribromoetanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% aldehyd glutarowy | Mikroskopia elektronowa Science | 16020 | |
| 8% paraformaldehyd | Mikroskopia elektronowa Nauka | 157-8 | |
| Mikroskopia elektronowa | acetonu | 10000 | |
| Anty-królik PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Rabbit SP | Abcam | ab67006 | |
| Zestaw podłoży DAB | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Nożyczki do łokci | Suzhou66 wizja firmy | 54010 | |
| Mikroskop elektronowy | Phillips | CM120 | |
| Żywica Epon | Mikroskopia elektronowa Nauka | 14910 | |
| kleszcz | Suzhou66 firma wizyjna | S101A Bibuła | |
| filtracyjna Millipore | Merck Millipore | ||
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | Składnik buforu fosforanowego |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | Składnik buforu fosforanowego |
| Kwas pikrynowy | Mikroskopia elektronowa Nauka | 19550 | |
| Borowodorek sodu (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramikrotom | Leica | ||
| Octan uranylu | Mikroskopia elektronowa Science | 22400 | |
| Zestaw ABC VACTASTAIN, Peroksydaza (IgG królika) | Vector Laboratories | PK-4001 |
Bibliografia
- Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
- Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).
- Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
- Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).
- Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
- Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
- Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).
- Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).
- Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
- Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).
- Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
- Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).
- Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).
- Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
- Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).
- Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547(2016).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
- Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
- Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
- van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).
- Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381(2023).
- Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
- Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
- Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
- Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
- Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
- Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
- Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
