Artykuł metodologiczny

Monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów PCR

3.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66545

⸱

22 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Tulane University, 2Native American Center for Health Professions, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, 4Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, 5School of Science and Engineering, Tulane University, 6Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Boston Children’s Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru względnej długości telomerów (TL) za pomocą monochromatycznego multipleksowego ilościowego testu łańcuchowego polimerazy (MMqPCR). Test MMqPCR jest powtarzalną, wydajną i opłacalną metodą pomiaru TL z ludzkiego DNA w badaniach populacyjnych.

Streszczenie

Telomery to struktury rybonukleoproteinowe na końcu wszystkich chromosomów eukariotycznych, które chronią DNA przed uszkodzeniem i zachowują stabilność chromosomów. Długość telomerów (TL) jest związana z różnymi ekspozycjami, procesami biologicznymi i wynikami zdrowotnymi. W artykule opisano protokół monochromatycznego ilościowego testu łańcuchowej polimerazy (MMqPCR) rutynowo przeprowadzanego w naszym laboratorium w celu pomiaru względnej średniej TL z ludzkiego DNA. Istnieje kilka różnych metod pomiaru TL opartych na PCR, ale konkretny protokół dla metody MMqPCR przedstawiony w tej publikacji jest powtarzalny, wydajny, opłacalny i odpowiedni dla badań populacyjnych. Ten szczegółowy protokół przedstawia wszystkie informacje niezbędne badaczom do ustalenia tego testu w swoim laboratorium. Ponadto protokół ten zapewnia konkretne kroki w celu zwiększenia odtwarzalności pomiaru TL za pomocą tego testu, zdefiniowanego przez współczynnik korelacji wewnątrzklasowej (ICC) w powtarzających się pomiarach tej samej próbki. ICC jest kluczowym czynnikiem w ocenie oczekiwanej mocy dla określonej badanej populacji; w związku z tym zgłaszanie specyficznych dla kohorty ICC dla dowolnego testu TL jest niezbędnym krokiem w celu zwiększenia ogólnego rygoru populacyjnych badań TL. Przykładowe wyniki wykorzystujące próbki DNA wyekstrahowane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pokazują możliwość generowania wysoce powtarzalnych danych TL przy użyciu tego protokołu MMqPCR.

Wprowadzenie

Telomery to kompleksy ochronne znajdujące się na końcach wszystkich chromosomów eukariotycznych, składające się z wysoce konserwatywnych, powtarzalnych sekwencji DNA oraz białek z nimi związanych. Telomer chroni integralność DNA, zapewniając stabilność chromosomową. Postępujące skracanie telomerów zachodzi w dzielących się komórkach w wyniku niepełnej syntezy DNA nici opóźnionej, uszkodzeń DNA oraz innych czynników1,2. Rosnąca liczba dowodów wspierających uznanie długości telomerów (TL) za biomarker starzenia się i chorób związanych z wiekiem w ciągu całego życia człowieka wiąże się ze zwiększeniem liczby rodzajów testów pomiaru TL wykorzystywanych do oceny roli TL w badaniach nad ekspozycją, chorobami i stanem zdrowia ludzi3,4,5. Metaanalizy wykazały związki TL z ogólną śmiertelnością, ekspozycją na czynniki środowiskowe oraz efektami zdrowotnymi, w tym z nowotworami, chorobami układu sercowo-naczyniowego i cukrzycą6,7,8,9,10,11,12,13. Powyższe meta-asocjacje wynikają z badań wykorzystujących jedną z ponad dwóch tuzinów różnych metod pomiaru TL, przy czym siła tych związków wykazuje tendencję do zróżnicowania w zależności od zastosowanej metody14,15,16. Wybór optymalnej metody pomiaru TL dla danego badania naukowego jest kluczowym krokiem w celu zapewnienia dokładnych wyników, ponieważ każda metoda posiada własne zalety i wady5,17.

Ze względu na stosunkowo niski koszt odczynników, krótki czas oczekiwania na wyniki analiz, skalowalność oraz mniejsze zapotrzebowanie na początkową ilość DNA, techniki pomiaru TL oparte na metodzie PCR są często preferowane podczas prowadzenia badań na dużych populacjach próbek, badań z ograniczonym dostępem do próbek o wysokich stężeniach DNA lub badań, w których priorytetem jest wysoka przepustowość. Pierwsza metoda pomiaru TL oparta na PCR, czyli jednoplexowa ilościowa reakcja polimerazy łańcuchowej (qPCR) opracowana pierwotnie przez Richarda Cawthona, wykorzystuje stosunek sygnałów fluorescencji amplifikacji telomerów (T) i genu pojedynczej kopii (S), przeprowadzanych na oddzielnych płytkach PCR18. W tym podejściu startery komplementarne do powtarzalnych sekwencji DNA telomerów (T) są używane do amplifikacji całkowitej zawartości DNA telomerowego w próbce, a następnie są one ilościowo określane poprzez detekcję fluorescencyjnego reportera SYBR green. Podobnie, startery komplementarne do regionu międzygenowego konserwatywnego genu pojedynczej kopii (S) są wykorzystywane do ilościowego określenia liczby kopii genomu. Te dwie wartości są wyznaczane w odniesieniu do standardowej krzywej DNA genomowego, stosowanej we wszystkich analizach w ramach projektu w celu kontrolowania zmienności między płytkami. Podzielenie całkowitej ilości DNA telomerowego (T) przez liczbę pojedynczych kopii genomu (S) daje stosunek T/S, będący bezwymiarową, względną miarą reprezentującą średnią zawartość telomerów na komórkę dla danej próbki DNA18,19. Zatem stosunek T/S nie jest bezpośrednim pomiarem długości funkcjonalnej; niemniej jednak, zgodnie z normami literaturowymi, w całym niniejszym protokole posługujemy się terminem średnia TL na próbkę.

Metoda ta została opracowana w 2009 roku, kiedy Richard Cawthon opisał test monochromatycznego multipleksowego qPCR (MMqPCR) jako podejście mające na celu potencjalne zmniejszenie zmienności stosunku T/S w porównaniu z pierwotną metodą pojedynczego qPCR19. Test MMqPCR łączy zalety metody qPCR z dodatkową korzyścią w postaci pomiaru sygnałów T i S w tej samej studzience reakcyjnej przy użyciu jednego fluoroforu raportującego, co zmniejsza błąd w stosunku do pojedynczego qPCR i skutkuje wyższą precyzją oraz powtarzalnością19. Ponadto ta metoda multipleksowa potencjalnie obniża koszty i zwiększa wydajność, ponieważ wymaga połowy liczby reakcji w porównaniu z testem pojedynczym19.

Biorąc pod uwagę zalety pomiaru TL metodą MMqPCR, metoda ta jest odpowiednia do badań populacyjnych nad powiązaniami TL z czynnikami ekspozycji, efektami zdrowotnymi i procesami biologicznymi. Jednakże wdrożenie tej metody może być trudne. Aby sprostać tym wyzwaniom, szczegółowo opisujemy protokół pomiaru TL metodą MMqPCR stosowany w naszym laboratorium, podkreślając kluczowe kroki wprowadzone w celu zwiększenia precyzji analizy, zmniejszenia ryzyka kontaminacji oraz poprawy powtarzalności.

Ponadto protokół ten opisuje kroki służące do oczyszczania danych i obliczania współczynnika korelacji wewnątrzklasowej (ICC), który jest ważną miarą statystyczną powtarzalności pomiarów TL 2. Na podstawie naszych reprezentatywnych wyników wykazujemy możliwość uzyskania wysokich wartości ICC przy zastosowaniu tego protokołu. Dodatkowo identyfikujemy kroki kontroli jakości (QC) i rozwiązywania problemów, które powinny zmniejszyć zmienność pomiarów TL i zwiększyć wynikowy wskaźnik ICC. Ze względu na wysoką powtarzalność, wydajność i opłacalność tej metody, pomiar TL za pomocą MMqPCR jest idealny do epidemiologicznych badań nad TL. Rysunek 1  przedstawia wizualny przegląd metody MMqPCR opisanej w tym protokole.

figure-introduction-1
Rycina 1: Przegląd metody. Ogólny schemat monochromatycznej multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej do pomiaru długości telomerów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Protokół

Badania te zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Niniejszy protokół opisuje test MMqPCR przeprowadzony z głębokością pomiaru w formie powtórzeń dublowanych troistnie, tj. pomiary troiste dla każdej próbki powtórzone na dwóch płytkach, zrealizowane przy użyciu dwóch termocyklerów jednocześnie w celu zwiększenia przepustowości. Zastosowanie dublowanych płytek jest kluczowym aspektem wdrożenia tego protokołu, mającym na celu uzyskanie wysokiej powtarzalności, na co wskazują wysokie wartości ICC. Choć możliwe jest zastosowanie mniejszej liczby powtórzeń, wpływ na ICC, a w konsekwencji na moc testu i wymaganą wielkość próby, musi być starannie rozważony i zmierzony dla każdej kohorty przez każde laboratorium20,21. W przypadku dostępności tylko jednego termocyklera sugerujemy zachowanie głębokości pomiaru (tj. powtórzeń dublowanych troistnie) i sekwencyjne uruchomienie 2 płytek.

1. Przygotowanie i warunki przechowywania roztworów stokowych

  1. Wszystkie materiały i sprzęt wykorzystywane w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów. Dodatkowo, w przypadku konkretnych odczynników master mix i ilości użytych w analizie MMqPCR, należy zapoznać się z Tabelą 1. W przypadku sekwencyjnego uruchomienia dwóch płytek, należy zmniejszyć objętość master mixu o połowę przy zachowaniu stężenia, upewniając się, że w kolejnych płytkach tej samej analizy stosowane są te same alikwoty odczynników.
    UWAGA: Wszystkie roztwory zapasowe odczynników powinny być przygotowane wcześniej, a alikwoty odczynników powinny być całkowicie rozmrożone przed użyciem.
  2. Alikwotować i przechowywać 1x Tris-EDTA, pH 7,6 (TE) w probówkach 5 mL w objętościach 3 mL w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 2 lata.
  3. Alikwotować i przechowywać 5 M betainę w probówkach 5 mL w objętościach 1 280 µL w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 1 rok.
  4. Alikwotować i przechowywać SYBR Green w objętościach 3 µL w pojedynczych probówkach w pasku do PCR w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 2 lata, owinięte folią i z minimalną ekspozycją na światło.
  5. Przechowywać polimerazę DNA w oryginalnych probówkach w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 1 rok.
  6. Alikwotować i przechowywać 10x bufor polimerazy w probówkach 1,5 mL w objętościach 660 µL w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 1 rok.
    1. W celu przygotowania rozcieńczeń 1x buforu polimerazy 10x, dodać 9,9 µL buforu 10x do 89,1 µL H2O klasy PCR w probówkach 0,5 mL; przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 1 rok.
  7. Alikwotować i przechowywać 1 M MgCl2 w probówkach 0,5 mL w objętościach 70 µL w temperaturze 4 °C, z dala od światła, przez maksymalnie 1 rok.
  8. Przechowywać liofilizowane primery do telomerów (T) oraz genu pojedynczej kopii (S), zarówno bezpośrednie, jak i odwrotne, w temperaturze pokojowej, z dala od światła. Cztery specyficzne sekwencje primerów oligonukleotydowych przedstawiono w Tabeli 2.
    UWAGA: Genem pojedynczej kopii w tym protokole jest albumina; w przypadku wyboru innego genu pojedynczej kopii konieczna może być korekta stężeń primerów, aby zapewnić akceptowalną wydajność PCR.
    1. Rekonstytucja primerów: Wymieszać w wirówce (vortex) każdą probówkę z liofilizowanym primerem przez 10 s, a następnie umieścić probówki w miniwirówce na 5 s, aby upewnić się, że liofilizowany osad znajduje się na dnie probówki przed dodaniem buforu 1x TE.
    2. Sprawdzić stężenie nM ([nM]= alpha) dla każdej probówki z primerem i nawodnić każdą z nich, dodając 1x TE w ilości równej 10-krotności wartości alpha w µL (np. jeśli stężenie nM na probówce wynosi 24,6 nM, należy dodać 246 µL 1x TE do probówki z primerem), aby otrzymać roztwór każdego primera o stężeniu 100 µM.
    3. Alikwotować osobno primery telomerowe bezpośrednie i odwrotne w objętościach 16 µL oraz primery albuminy bezpośrednie i odwrotne osobno w objętościach 11 µL. Wszystkie cztery rodzaje alikwotów primerów przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.
  9. Mieszanina dNTP: Wymieszać w wirówce (vortex) od 4 do 8 probówek każdego z czterech typów roztworów zapasowych dNTP o stężeniu 25 mM (łącznie 16-32 probówki) przez 10 s, a następnie krótko wirować w temperaturze pokojowej w miniwirówce. Rozmieścić probówki równomiernie w gniazdach miniwirówki, zamknąć pokrywę, aby urządzenie osiągnęło pełną prędkość, i wirować przez około 5 s.
    1. Do probówki 5 mL dodać po 200-250 µL z każdej probówki, upewniając się, że dodano równe części każdego z czterech typów dNTP, a następnie wymieszać mieszaninę dNTP w wirówce (vortex).
    2. Alikwotować 210 µL mieszaniny do probówek 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 1 rok.
  10. Przechowywać zapasowy DTT w temperaturze -20 °C, a zapasowy 3 M octan sodu w temperaturze pokojowej.
    1. Roztwór DTT: Odważyć 0,1545 g DTT do tary lodzy wagowej na wadze przy użyciu szpatułki ze stali nierdzewnej.
      OSTROŻNIE: Ditiotreitol (DTT) jest odczynnikiem niebezpiecznym. DTT jest szkodliwy w przypadku połknięcia, powoduje podrażnienie skóry i może powodować poważne uszkodzenie oczu. Podczas pracy z DTT należy stosować rękawice ochronne, ochronę oczu i twarzy. Ponadto należy unikać wdychania oparów DTT, pracować pod wyciągiem PCR i unikać długotrwałej lub powtarzającej się ekspozycji.
    2. Przygotować 10 mL 0,01 M octanu sodu, dodając 33,33 µL 3 M octanu sodu oraz 9 967 µL H2O klasy PCR do probówki 15 mL i dobrze wymieszać w wirówce (vortex). Dodać odważony DTT do probówki 15 mL z 0,01 M octanem sodu. Przenieść około 100 µL roztworu 0,01 M octanu sodu do lodzy wagowej, aby zebrać pozostałości DTT. Pipetować 100 µL z powrotem do probówki 15 mL. Gdy cały DTT znajdzie się w roztworze, mieszać probówkę w wirówce (vortex) do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Przelać zawartość probówki 15 mL do korytkowego dozownika i wciągnąć cały roztwór do plastikowej strzykawki 10 mL z jednego końca dozownika. Do końcówki wypełnionej strzykawki przymocować sterylny filtr strzykawkowy z octanu celulozy 0,2 µm 25 mm , pozwolić na całkowite nasycenie przez 1 min, a następnie powoli dozować roztwór do nowej probówki 15 mL, lekko naciskając tłok strzykawki, upewniając się, że cały roztwór przelał się przez filtr do nowej probówki 15 mL.
    4. Alikwotować roztwór DTT w objętościach 200 µL do probówek 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 tygodni.

Tabela 1: Końcowe objętości i stężenia odczynników. Objętości i stężenia odczynników w poszczególnych aliquotach, mieszaninie master mix oraz w dołkach PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Sekwencje starterów oligonukleotydowych dla telomerów i genu pojedynczej kopii. Lista sekwencji starterów dla telomerów oraz genu albuminy pojedynczej kopii wykorzystanych w metodologii. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

2. Ekstrakcja genomowego DNA i przygotowanie próbek

  1. Ekstrakcja próbek analitycznych: Przeprowadzić ekstrakcję genomowego DNA z próbek zgodnie z wytycznymi producenta, korzystając z zestawów lub uznanych metod stosowanych w laboratorium.
    1. Sprawdzić jakość próbek DNA za pomocą spektrofotometru oraz zawartość dwuniciowego DNA (dsDNA) za pomocą fluorometru. Próbki z nieakceptowalnymi średnimi stosunkami 260/280 i 260/230 lub stężeniem dsDNA poniżej granicy wykrywalności (<0,20 ng/µL) nie powinny być analizowane pod kątem TL22,23. Ponadto, jeśli stężenie dsDNA jest zbyt wysokie, aby uzyskać odczyt z fluorometru (>1000 ng/µL), należy rozcieńczyć próbkę i powtórzyć analizę.
      UWAGA: Dla przedstawionych tutaj wyników akceptowalne wartości czystości kwasów nukleinowych wynosiły od 1,6 do 2,0 dla stosunku 260/280 oraz od 2,0 do 2,2 dla stosunku 260/230.
  2. Ekstrakcja próbek kontrolnych: Przeprowadzić ekstrakcję genomowego DNA z próbki kontrolnej pochodzącej z tego samego materiału biologicznego, co próbki badawcze analizowane w ramach danego projektu. Należy wyekstrahować wystarczającą ilość kontrolnego DNA dla wszystkich płytek planowanych do analizy w całej kohorcie, aby dla wszystkich testów wykorzystano ten sam standard DNA.
    1. Sprawdzić jakość kontrolnej próbki DNA za pomocą spektrofotometru i fluorometru. Próbka kontrolna powinna  wykazywać akceptowalne średnie stosunki 260/280 i 260/230 oraz wykrywalne stężenia dsDNA22,23.
    2. Przygotować aliquoty kontrolnego DNA o stężeniu 2 ng/µL w objętości 150 µL w probówkach 0,5 mL opisanych rodzajem próbki i datą. Alikwoty kontrolnego DNA przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 5 lat. Użyć jednej próbki kontrolnego DNA dla wszystkich płytek wszystkich próbek z tej samej kohorty lub projektu badawczego. Przygotować te alikwoty zapasowe z wyprzedzeniem.
  3. Przygotowanie próbek analitycznych: Dla próbek o stężeniu początkowym >5 ng/µL przygotować alikwoty rozcieńczeń, stosując całkowity czynnik rozcieńczenia, dodając odpowiednią ilość wyekstrahowanej próbki DNA (Supplementary File 1 MMqPCR Set Up Sheet, kolumna F) i H2O klasy PCR (Supplementary File 1 MMqPCR Set Up Sheet, kolumna G), aby rozcieńczyć stężenie do poziomu między 2,5 a 5,0 ng/µL (Supplementary File 1 MMqPCR Set Up Sheet, kolumna K). Nie rozcieńczać próbek o stężeniu <5 ng/µL, natomiast przygotować alikwot o objętości wystarczającej do trzykrotnego przebadania próbki zgodnie z tym protokołem.
    UWAGA: Alikwoty rozcieńczeń muszą zostać przygotowane podczas przygotowania próbek, aby do każdej odpowiadającej próbce w pasku probówek PCR można było dodać 15 ng DNA. Alikwotowanie próbek pozwala technikom uniknąć niepotrzebnych cykli zamrażania i rozmrażania, które mogłyby wpłynąć na integralność zapasowego DNA, jeśli próbka nie spełni kryteriów jakości i będzie wymagała powtórzenia analizy. Szablon MMqPCR dla próbek znajdujący się w Supplementary File 1 może pomóc w określeniu właściwego czynnika rozcieńczenia i objętości do przygotowania alikwotów rozcieńczeń (Supplementary File 1, MMqPCR Set Up Sheet, kolumny E-I).
    1. Napełnić paski PCR próbkami A1-8 w pasku PCR A, próbkami B1-8 w pasku PCR B oraz próbkami C1-8 w pasku PCR C, zgodnie z opisem w Supplementary File 1 MMqPCR Set Up Sheet i zestawieniem w Table 3, stosując odpowiednio rozcieńczone ilości próbek (Supplementary File 1 MMqPCR Set Up Sheet, kolumna L) oraz ilości H2O klasy PCR (Supplementary File 1 MMqPCR Set Up Sheet, kolumna M), aby uzyskać łączną ilość 15 ng DNA na probówkę PCR i całkowitą objętość 75 µL. Odstawić na bok.
      UWAGA: Próbki w paskach PCR można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C, aby nanieść je na płytkę następnego dnia.
  4. Przygotowanie krzywej wzorcowej: Rozmrozić alikwot kontrolnego DNA, wymieszać w wirówce (vortex) przez 30 s, odwirować przez 5 s i pobrać pełną objętość (150 µL) do pierwszej probówki w pasku PCR dla krzywej wzorcowej (SC).
    1. Pipetować 70 µL H2O klasy PCR do probówek od drugiej do ósmej w pasku PCR SC. Dokładnie resuspendować kontrolne DNA w pierwszej probówce przed pobraniem 70 µL i przeniesieniem ich do drugiej probówki PCR. Odczekać 30 s, a następnie dokładnie resuspendować roztwór w drugiej probówce PCR przed pobraniem 70 µL i przeniesieniem ich do trzeciej probówki PCR. Powtórzyć tę procedurę dla probówek od trzeciej do siódmej, aby stworzyć dwukrotne rozcieńczenie szeregowe siedmiu standardów. Ostatnia probówka powinna zawierać wyłącznie H2O klasy PCR, aby służyć jako kontrola bez matrycy (NTC). Odstawić pasek PCR SC na bok.

Tabela 3: Organizacja próbek i standardu kontrolnego na płytce. Lokalizacja wszystkich próbek i standardów na 96-dołkowej płytce PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Przygotowanie master mixu do MMqPCR

  1. Przygotować alikwoty odczynników do mieszaniny głównej (master mix) wymienione w Tabeli 1,  z wyjątkiem polimerazy DNA, i pozostawić je do osiągnięcia temperatury pokojowej w dygestorium do PCR. Dodać 1 µL alikwotu SYBR Green do alikwotu buforu 1x.
    UWAGA: Dokładna ilość ta jest niezbędna do uzyskania prawidłowego stężenia SYBR ze względu na ograniczenia dokładności pipetowania podczas analizy, dlatego nawet jeśli w jednym czasie analizowana jest tylko jedna płytka, ilość ta powinna pozostać niezmieniona.
  2. Wymieszać wszystkie alikwoty w wirówce typu vortex przez 10 s, odwirować przez 5 s, a następnie dodać następujące ilości odczynników do probówki 5 mL zawierającej betainę 5 M (która teraz staje się probówką z mieszaniną główną): 1,235.2 µL H2O klasy PCR, 640 µL buforu 10x, 204.8 µL dNTP, 192 µL DTT, 64 µL MgCl2, 48 µL SYBR Green / bufor 1x (z kroku 3.1), 14.4 µL obu starterów telomerowych oraz 9.6 µL obu starterów albuminy, zgodnie z Tabelą 1.
  3. Wyjąć polimerazę DNA z przechowywania w -20 °C, wymieszać w vortexie przez 10 s, odwirować przez 5 s, a następnie powoli dodać 128 µL do mieszaniny głównej; niezwłocznie przenieść polimerazę DNA z powrotem do przechowywania w -20 °C.
  4. Wymieszać probówkę 5 mL z mieszaniną główną w vortexie przez 30 s.

4. Przygotowanie płytki 96-dołkowej

  1. Umieść dwie płytki 96-dołkowe, rynienkę do dozowania oraz końcówki do pipety wielokanałowej wewnątrz komory PCR. Oznacz każdą płytkę numerem płytki (1 lub 2). Obróć płytkę pierwszą (płytkę P1) 180° Zatem numery kolumn są odwrócone. Pozostaw płytkę drugą (P2) skierowaną w stronę technika.
  2. Przelej zawartość probówki z 5 ml master mixu do rynienki do nakładania próbek. Za pomocą końcówki do pipety zbierz i nanieś pozostałą w probówce część roztworu.
  3. Załaduj końcówki do pipety wielokanałowej, dociskając podstawę każdej końcówki, aby zapewnić szczelne dopasowanie. Upewnij się, że w obszarze wylotu, z którego pobierany będzie master mix, nie znajdują się żadne filtry; jeśli w tym miejscu znajduje się fragment filtra, wymień końcówkę.
  4. Napełnij płytki lepkim master miksem, stosując technikę pipetowania odwrotnego; zakręć zawartością korytka do nakładania, a następnie naciśnij tłok pipety poza pierwszy stopień, pobierając objętość większą niż 15 µL do końcówek pipety, dbając o to, aby końcówki napełniały się jednocześnie tą samą objętością. Podczas wydawania master miksu do kolumny należy wcisnąć tłok do pierwszego ogranicznika, pozostawiając nadmiar master miksu w końcówkach pipety. Przy wciśniętym tłoku należy ponownie zanurzyć końcówki w rynnie do ładowania i zwolnić tłok, aby ponownie napełnić końcówki 15 µLDo napełnienia obu płytek należy użyć tych samych końcówek.
    1. Napełniaj płytki, dozując mieszaninę główną najpierw we wszystkie kolumny parzyste lub wszystkie nieparzyste, naprzemiennie dla poszczególnych płytek (tzn. Jeśli technik zdecyduje się rozpocząć od nieparzystych numerów kolumn, w pierwszej kolejności wypełniona zostanie kolumna 1 na P2, następnie kolumna 11 na P1, potem kolumna 3 na P2 itd.). Po wypełnieniu przez technika wszystkich studni w serii (nieparzystej lub parzystej), pracując od lewej do prawej, należy w ten sam sposób wypełnić pozostałą serię (parzystą lub nieparzystą) kolumn. Patrz Rycina 2 do schematu tego procesu.
      UWAGA: Taki sposób wypełniania płytek służy do kontrolowania efektów położenia na płytkach.
  5. Wymieszać w wirówce wortex czteropasmowe zamknięte paski do PCR zawierające próbki i krzywą wzorcową, a następnie wirować każdy z nich w miniwirówce przez 5 s.
    1. Ustaw paski do PCR w statywie do probówek PCR w kolejności, w jakiej zostaną umieszczone na płytce. Dla P1 pierwsze 3 kolumny stanowią próbki (pasek do PCR A), kolumny 4–6 stanowią wzorzec (pasek do PCR S), kolumny 7–9 stanowią próbki (pasek do PCR B), a kolumny 10–12 stanowią próbki (pasek do PCR C; patrz Rycina 3 i Tabela 3). Ponieważ P2 jest napełniane podczas obracania 180° W odniesieniu do technika kolumny będą odwrotne.
  6. Obrócić obie płytki 180° zatem numeracja kolumn jest odwrócona względem technika dla każdej płytki (tzn. jeśli wcześniej technik był zwrócony w stronę etykiety dla P2, teraz będzie zwrócony w stronę etykiety dla P1 na krawędzi płytki).
  7. Ustaw pipetę wielokanałową na 10 µL następnie założyć końcówki do pipety wielokanałowej zgodnie z opisem w kroku 4.3.
    1. Użyj pipety wielokanałowej do resuspensji roztworów, a następnie wykonaj pipetowanie odwrócone, zgodnie z opisem w kroku 4.4, aby pobrać i dozować ciecz. 10 µL próbek i roztworów wzorcowych, zaczynając od listwy PCR A.
    2. Wypełnij pierwsze 3 kolumny każdej płytki, używając paska PCR A, naprzemiennie w taki sam sposób, w jaki do płytki naniesiono master mix (tj. kolumny parzyste lub nieparzyste).
    3. Wypełnij następne trzy kolumny, używając paska do krzywej standardowej PCR. W przypadku tego paska resuspenduj 7th standardowa probówka do rozcieńczeń (przedostatnia), używając 200 µL ustawić pipetę na ~90 µLdokładnie przed ponownym zawieszeniem całej paski za pomocą pipety wielokanałowej.
      UWAGA: Większa objętość i mniejsze stężenie DNA w tej probówce często prowadzą do zróżnicowanych pomiarów w poszczególnych dołkach płytki PCR ze względu na niewystarczające wymieszanie. Zastosowanie większej objętości do mieszania pozwala na lepszą homogenizację roztworu DNA.
    4. Kolejne trzy kolumny wypełnij próbkami z paska PCR B, a ostatnie trzy z paska PCR C. Wymieniaj końcówki pipet przed każdym paskiem PCR, wypełniając wszystkie 96 dołków na obu płytkach odpowiednimi próbkami oraz wzorcem kontrolnym, zgodnie z opisem w Rycina 3.
  8. Po napełnieniu płytek należy delikatnie ostukać je o blat, aby ciecz z boków studzienek spłynęła na dno, a następnie przykryć płytki foliami uszczelniającymi. opuszkami palców należy docisnąć wszystkie krawędzie folii, aby zapewnić szczelne zamknięcie.
    1. Wymieszać zawartość płytek, wykonując koliste ruchy na blacie dygestorium przez 30 s, a następnie umieścić szczelnie zamknięte płytki w wirówce do płytek na 2 min, tak aby otwory dojątek były skierowane do środka.
    2. Umieść płytki w termocyklerze w taki sposób, aby numery kolumn na płytkach były ułożone w czytelnej kolejności. Przed zamknięciem pokrywy termocyklera oczyść wierzch każdej płytki za pomocą czystej chusteczki.

figure-protocol-1
Rycina 2: Proces napełniania płytek. (A) W przypadku wyboru napełniania najpierw kolumn nieparzystych, jest to kolejność napełniania studni. (B) W przypadku wyboru napełniania najpierw kolumn parzystych, jest to kolejność napełniania studni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Układ płytki. Paski PCR A, B, C oraz pasek krzywej standardowej (SC) powinny zostać wykorzystane do wypełnienia trzech kolumn na każdej płytce, aby uzyskać dublety z trzech powtórzeń dla każdej próbki i rozcieńczenia standardu. Schemat ten pokazuje, które kolumny powinny zostać wypełnione poszczególnymi paskami. Płytka druga zostaje obrócona o 180° (należy zauważyć, że nagłówki kolumn i wierszy są odwrócone do góry nogami) przed załadowaniem, jednak płytka jest wypełniana identycznie jak płytka pierwsza, co eliminuje potencjalne błędy pipetowania, jednocześnie kontrolując efekty położenia na płytkach. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

5. Termocyklowanie MMqPCR

  1. Podczas wirowania płytek w kroku 4.8.1, włącz komputer oraz termocyklery. Otwórz oprogramowanie termocyklera. Niniejszy protokół opisuje korzystanie z oprogramowania CFX Maestro.
  2. Utwórz protokół termocyklowania TL zgodnie z protokołem termocyklowania MMqPCR19(Rysunek 4).
    1. Dodaj etap inkubacji w celu aktywacji polimerazy DNA w temperaturze 95 °C przez 15 min.
    2. Aby uniknąć tworzenia dimerów starterów, przeprowadź dwa cykle: 94 °C przez 15 s, 49 °C przez 1 min, a następnie 3 cykle: 94 °C przez 15 s, 59 °C przez 15 s.
    3. W celu amplifikacji telomerów dodaj 27 cykli: 85 °C przez 15 s, 74 °C przez 30 s, a następnie akwizycję sygnału.
    4. W celu amplifikacji albuminy dodaj 31 cykli: 94 °C przez 15 s, 84 °C przez 30 s, a następnie akwizycję sygnału.
    5. W protokole termocyklowania uwzględnij krzywą topnienia od 59 °C do 95 °C w odstępach 5 s dla każdego stopnia wzrostu temperatury.
  3. Kliknij Start Run dla obu termocyklerów. Po pojawieniu się prośby wprowadź tytuł plików analizy.

figure-protocol-3
Rycina 4: Profil termocyklingu dla testu MMqPCR. Protokół MMqPCR utworzony w oprogramowaniu zgodnie z oryginalnym protokołem termocyklingu19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Analiza danych MMqPCR

  1. Po zakończeniu termocyklowania należy przeanalizować dane w następujący sposób, aby wyznaczyć wartości TL dla przetworzonych próbek.
  2. W oprogramowaniu należy wybrać Przygotowanie płytki funkcja. W menu rozwijanym kliknij Wyświetl/Edytuj płytkę.
    1. Zaznacz wszystkie dołki i kliknij Wybór fluoroforów, a następnie zaznacz pole o nazwie SYBR i odznacz wszystkie pozostałe pola. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
    2. Podczas gdy wszystkie dołki są nadal zaznaczone, obok słowa Obciążeniezaznacz pole obok SYBRTeraz wszystkie studzienki powinny być opisane jako SYBR.
    3. Następnie zaznacz trzy studzienki NTC u góry lub u dołu seryjnych rozcieńczeń kontroli standardowej i wybierz NTC (kontrola nietranskrypcyjna) z menu typów próbek po prawej stronie. Trzy studzienki powinny teraz zmienić kolor na żółty i zostać oznaczone jako NTC. Rysunek 5A pokazuje, które studzienki należy wybrać dla P1 i Rysunek 5B pokazuje, które studzienki należy wybrać dla P2.
      UWAGA: P2 będzie odwrócone względem P1, zatem NTC znajdzie się w dolnej części kolumn 4–6 dla P1 oraz w górnej części kolumn 7–9 dla P2.
    4. Zaznacz 21 dołków seryjnych rozcieńczeń kontroli standardowej i wybierz Standard z menu typów próbek. Studzienki te powinny mieć kolor zielony. Gdy studzienki są nadal zaznaczone, kliknij Powtórzenie techniczneWybierz 3 z menu Replicate Size, następnie wybierz Poziomy > ZastosujDołki te należy opisać w grupach po trzy, od Std-1 do Std-7.
    5. Gdy standard jest nadal zaznaczony, przewiń w dół i wybierz Serie rozcieńczeńW polu Dilution Factor wprowadź wartość 2, a następnie wpisz początkowe stężenie rozcieńczenia oraz kierunkowość zgodnie z numerem płytki, jak opisano w poniższych krokach.
    6. W przypadku płytki P1 wprowadź wartość 2,00E-03 w polu stężenia początkowego i zaznacz pole wyboru dla Zmniejszanie następnie wybierz ZastosujW 21 dołkach powinny zostać zapisane wartości stężeń w zakresie od 2,00E-03 do 3,13E-05, licząc od góry do dołu.
    7. Dla płytki P2 wprowadź wartość 3,13E-5 w polu stężenia początkowego i zaznacz pole wyboru dla Zwiększanie następnie wybierz ZastosujW 21 studzienkach powinny znaleźć się wartości stężeń w zakresie od 3,13E-05 do 2,00E-03, zapisane kolejno od góry do dołu.
  3. W przypadku próbek zaznacz kolumny dla paska PCR A (1-3 dla P1 i P2), wybierz Nieznany z menu typów próbek, a następnie wybierz Powtórzenie techniczneWybierz 3 z Wielkość replikacji menu, a następnie wybierz Poziomy > ZastosujDołki dla tych kolumn powinny być koloru niebieskiego i oznakowane w rzędach w grupach po 3, od Unk-1 do Unk-8.
    1. Powtórz krok 6.3 dla kolumn dla paska PCR B (kolumny 7–9 dla P1 oraz 4–6 dla P2). Należy je oznaczyć jako Unk-9 do Unk-16.
    2. Powtórz krok 6.3 dla kolumn dla paska PCR C (kolumny 10-12 dla P1 i P2). Należy je oznaczyć od Unk-17 do Unk-24. Po zakończeniu kroków 6.2-6.3.2 okna konfiguracji płytki powinny wyglądać następująco Rysunek 5A,B.
  4. Wybierz Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. w dolnym prawym rogu okna edytora płytek. Kliknij Tak aby zastosować zmiany po wyświetleniu odpowiedniego komunikatu.
  5. W przypadku kontroli jakości (QC) na poziomie analizy należy upewnić się, że krzywe w zakładce kwantyfikacji są prawidłowe (np. brak odwróconych krzywych amplifikacji) zarówno dla kroku 9, jak i kroku 12 profilu termocyklera, które odpowiadają odpowiednio amplikonom telomeru i albuminy. Dostęp do krzywych uzyskuje się za pomocą menu rozwijanego znajdującego się po prawej stronie w środkowej części okna oprogramowania. Rycina 6A,B wyświetl odpowiednie krzywe.
    1. Upewnij się, że wydajności PCR podane w kroku 9 i kroku 12 mieszczą się w przedziale od 90% do 110% i że te dwie wartości nie różnią się od siebie o więcej niż 10% (np. 92,4% dla kroku 9 i 98% dla kroku 12 jest dopuszczalne, natomiast 92,4% dla kroku 9 i 108% dla kroku 12 jest niedopuszczalne). Dodatkowo upewnij się, że standard R2 krzywa jest >0.995. W przypadku niespełnienia tych kryteriów przez P1 lub P2, konieczne jest ponowne przeprowadzenie analizy płytek.
  6. Dla P1 należy wybrać Krok 9 oraz zaznacz 21 dołków odpowiadających krzywej wzorcowej, zgodnie z przedstawionym w Rycina 6A,BSkopiuj wartości Cq znajdujące się w prawym dolnym rogu okna oprogramowania. Otwórz szablon arkusza danych telomerowych dostępny jako Plik uzupełniający 1i wklej te wartości do arkusza „standard 1”, kolumna B. Wybierz Krok 12 następnie skopiuj te wartości Cq. Wklej te wartości do arkusza standard 1, do kolumny I.
    1. Odczytaj wartość nachylenia w kroku 9 i wpisz ją do komórki C4 w arkuszu standard 1. Odczytaj wartość nachylenia w kroku 12 i wpisz ją do komórki J4 w arkuszu standard 1.
      UWAGA: System oblicza procentową wydajność starterów na podstawie nachyleń krzywej wzorcowej wyznaczonej w kroku 6.6.1. Procentową wydajność można obliczyć ręcznie, korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-4
    2. Upewnij się, że współczynnik zmienności (CV) dla każdego powtórzenia w trzech próbkach dla każdego rozcieńczenia standardu wynosi mniej niż 0,1. Jeśli wartość ta jest większa niż lub równa 0,1, wyklucz łącznie do trzech poszczególnych dołków ze wszystkich stężeń próbek kontrolnych zawartych w 7-punktowej seryjnej krzywej rozcieńczeń standardu na płytce. Z każdego zestawu trzech powtórzeń można wykluczyć tylko jeden dołek.
      UWAGA: Wykluczenie standardowych punktów z analizy w oprogramowaniu zmieni raportowane nachylenie, wartość R, punkt przecięcia z osią y oraz wydajność dla obu starterów. W związku z tym, po usunięciu którejkolwiek studzienki ze standardem z analizy, należy powtórzyć kroki od 6.5.1 do 6.6.1.
    3. Powtórz kroki 6.6.1 – 6.6.2 dla pliku analizy P2 i odpowiadającej mu arkusza standard 2.
    4. Dopiero po wypełnieniu arkuszy standardu 1 i standardu 2 z akceptowalnymi wartościami CV, należy pobrać dane z poszczególnych próbek z plików analizy. Należy upewnić się, że korekty kontroli jakości (QC) zostały odnotowane w kolumnie L arkusza P1 v P2, np. podając liczbę dołków wykluczonych w pliku analizy P1.
  7. Upewnij się, że w zakładce Quantification pliku analizy P1 na niebiesko zaznaczonych jest tylko 72 dolek z próbkami, tak jak pokazano w Rycina 7A,BWybierz Krok 9Skopiuj wartości Cq i SQ znajdujące się w prawym dolnym rogu okna oprogramowania. Wklej te wartości do arkusza „samples P1”, zaczynając od komórki D3. Zaznacz Krok 12 następnie skopiuj te wartości Cq i SQ i wklej je do arkusza samples P1, zaczynając od komórki F3.
    1. Powtórz ten krok dla próbek w pliku analizy P2 oraz odpowiadających im próbek w arkuszu P2. Stosunki telomerów do pojedynczej kopii (T/S) (kolumna H) są obliczane automatycznie, ale można je obliczyć ręcznie, korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-5
      Gdzie ET/S wynosi wydajność amplifikacji wykładniczej odpowiednio dla reakcji celujących w telomer oraz gen pojedynczej kopii, a także CqT/S jest cyklem, w którym dana powtórka celująca w zawartość telomerów lub gen jednokopiowy osiąga krytyczny próg kwantyfikacji fluorescencji. Średnie stosunki T/S (Kolumna I) obliczane są na podstawie sześciu pomiarów na próbkę.
      UWAGA: Numery identyfikacyjne próbek w systemie CFX nie odpowiadają tej samej próbce biologicznej w obu płytkach. Szablon arkusza danych telomerowych uwzględnia tę różnicę i dopasuje odpowiednie powtórzenia trzykrotne.
    2. W programie CFX Maestro należy sprawdzić, czy wartości Cq dla wszystkich próbek analitycznych mieszczą się w zakresie między najniższą a najwyższą wartością Cq krzywej standardowej, zgodnie z przedstawionym w Rycina 7BJeśli próbka znajduje się poza zakresem widocznym w Rysunek 7Aw takim przypadku konieczne będzie powtórzenie analizy po dostosowaniu stężenia. Próbkę o wartości Cq niższej niż wartość dla standardu o najwyższym stężeniu należy rozcieńczyć w stopniu odpowiadającym liczbie cykli amplifikacji, o którą przekracza ona zakres, natomiast próbkę o wartości Cq wyższej niż wartość dla standardu o najniższym stężeniu należy zagęścić w stopniu odpowiadającym liczbie cykli amplifikacji powyżej progu.
      UWAGA: Duże zróżnicowanie stężeń próbek analitycznych wprowadza dodatkowy potencjalny poziom zmienności, dlatego należy postępować z zachowaniem ostrożności.
    3. Należy upewnić się, że stężenie początkowe w NTC stanowiło mniej niż 5% średniej ilości DNA obecnej w dołkach z próbkami. Można to sprawdzić, analizując procent zanieczyszczenia wodą (% water contamination) w arkuszach samples P1 i samples P2 w pliku MMqPCR. Jeśli NTC wskazuje na zanieczyszczenie, należy powtórzyć analizę płytek.
      UWAGA: Ze względu na wysoką czułość testu MMqPCR, sporadycznie może dojść do amplifikacji w studzienkach NTC na skutek niewielkiego, niekontrolowanego zanieczyszczenia. Amplifikacja ta powinna być jednak minimalna i wystąpić kilka cykli po amplifikacji genu pojedynczej kopii w kroku 12 protokołu termocyklingu.
    4. W celu przeprowadzenia kontroli jakości (QC) na poziomie próbek należy sprawdzić odchylenia standardowe (SD) (kolumna J) oraz współczynniki zmienności (CV) (kolumna K) w arkuszach samples P1 i samples P2. Należy upewnić się, że wartości CV w obrębie płyt dla stosunków T/S w powtórzeniach trzykrotnych próbek są mniejsze niż 0,10 (10%). Aby skorygować wartości CV w obrębie płyt przekraczające 0,1, można wykluczyć jeden stosunek T/S z zestawu powtórzeń trzykrotnych.
      UWAGA: Z sześciu pomiarów na próbkę można wykluczyć łącznie tylko jedną powtórkę, co oznacza, że powtórka dla tej samej próbki nie może zostać wykluczona zarówno w P1, jak i w P2.
    5. Sprawdź, czy współczynniki zmienności (CV) między płytkami dla poszczególnych próbek w arkuszu P1 v P2, kolumna G, są mniejsze niż 0,05 (5%). Aby skorygować wartości CV przekraczające 0,05, należy wykluczyć jeden stosunek T/S z sześciu pomiarów na próbkę wykonanych na obu płytkach. Wykluczaj próbki po inspekcji wizualnej powtórzeń w obrębie płytki oraz wszystkich sześciu pomiarów, jeśli jest to konieczne.
      UWAGA: Tylko próbki spełniające te kryteria kontroli jakości (QC), CV wewnątrz płytki < CV wewnątrz płytowego i między płytami wynosi 10% < 5%, mogą zostać uwzględnione w końcowych wynikach TL. W przeciwnym razie próbkę należy wykluczyć z arkuszy danych P1 v P2 oraz ICC dla tego cyklu, a następnie poddać ponownej ocenie w drugim teście MMqPCR.
    6. W przypadku kontroli jakości (QC) na poziomie płytek należy sprawdzić, czy średnia zmienność wewnątrz płytki dla wszystkich próbek na każdej płytce, znajdująca się na dole arkuszy samples P1 i samples P2, wynosi mniej niż 0,05 (5%). W ramach dodatkowej kontroli jakości na poziomie płytek należy sprawdzić, czy całkowita zmienność między płytkami w arkuszu P1 v P2, komórka G29, wynosi mniej niż 0,06 (6%). Należy upewnić się, że próbki, które nie przeszły kontroli jakości, zostały wykluczone z obliczeń CV między płytkami w komórce G30.
      UWAGA: W przypadku pracy z powiązanymi grupami próbek (np. członkami rodziny, różnymi punktami czasowymi itp.) wszystkie próbki w grupie muszą zostać naniesione na tę samą płytkę. W związku z tym, jeśli jedna próbka z grupy nie spełni kryteriów kontroli jakości (QC), wszystkie próbki w danej grupie muszą zostać poddane ponownemu badaniu.
    7. W oddzielnym pliku danych kohorty ogólnej lub eksperymentu należy zapisać końcowe dane TL dla każdej próbki, która przeszła kontrolę jakości (arkusz P1 v P2, kolumna I), ICC obliczenia dla każdej próbki, która przeszła kontrolę jakości (Arkusz danych ICC, kolumny E-K), oraz końcowe dane kontroli jakości z przebiegu analizy z arkusza P1 v P2 (kolumny J-L)
  8. Zastosowanie Plik uzupełniający 2 stworzone przez Telomere Research Network (TRN) w celu obliczenia współczynnika ICC dla projektu20.
  9. Na koniec, aby zwiększyć porównywalność między badaniami długości telomerów (TL), należy przekształcić końcowe dane TL dla każdej próbki w oddzielnym pliku z danymi całej kohorty lub eksperymentu w wyniki Z (Z-scores), korzystając z następującego równania, w którym od stosunku T/S dla poszczególnych próbek odejmuje się średni stosunek T/S dla wszystkich próbek w kohorcie, a następnie dzieli wynik przez odchylenie standardowe (SD). we wszystkich próbkach w kohorcie.
    figure-protocol-6

figure-protocol-7
Rysunek 5: Konfiguracja płytki w oprogramowaniu. (A) Konfiguracja płytki P1 w oprogramowaniu po wykonaniu kroków 6.2-6.4. (B) Konfiguracja płytki P2 w oprogramowaniu po wykonaniu kroków 6.2-6.4. Identyfikatory próbek i standardów nie są zgodne między dwiema płytkami CFX ze względu na sposób przypisywania przez oprogramowanie identyfikatorów próbek na podstawie położenia studzienki (np. próbka CFX 1 na P1 to próbka CFX 24 na P2). Szablon Excel dostarczony w Pliku uzupełniającym 1 uwzględnia ten fakt, zapewniając właściwe dopasowanie pomiarów między płytkami wykonanych dla tej samej próbki biologicznej Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-8
Rysunek 6: Krzywe standardowe dla amplikonów telomerów i albuminy. (A) Ta krzywa standardowa pochodzi z amplikonu telomeru P1 z reprezentatywnego zestawu wyników. Jeden standard został usunięty, ponieważ nie spełnił kryteriów kontroli jakości (QC). (B) Ta krzywa standardowa pochodzi z amplikonu albuminy P2 z reprezentatywnego zestawu wyników. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-9
Rycina 7: Amplikony telomerów i genów pojedynczej kopii. (A) Amplifikacja telomerów oraz (B) amplifikacja genu albuminy w próbkach przedstawionych w reprezentatywnych wynikach wyświetlonych w oprogramowaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

7. Raportowanie danych MMqPCR

  1. Raportując wyniki badań z wykorzystaniem danych TL uzyskanych z MMqPCR, należy upewnić się, że uwzględniono elementy opisane w Wytycznych dotyczących minimalnych wymagań raportowania TRN (TRN Minimum Reporting Guidelines). Wytyczne te są dostępne na stronie internetowej TRN (https://trn.tulane.edu/resources/reporting-guidelines/), a szablon do raportowania tych informacji znajduje się w Pliku uzupełniającym 3. W odpowiednich miejscach należy powołać się na niniejszy protokół oraz inne wytyczne i zasoby TRN.

Wyniki

Wyniki przedstawione w Tabeli 4 i Tabeli 5 stanowią przykład wysoce powtarzalnych pomiarów TL uzyskanych zgodnie z protokołem. W przypadku tych wyników DNA wyekstrahowano z 24 próbek mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z wytycznymi producenta. Te 24 próbki analizowano na dwóch płytkach 96-dołkowych. Jakość wszystkich próbek DNA sprawdzono za pomocą spektrofotometru i fluorometru, wykorzystując średni stosunek 260/280, średni stosunek 260/230 oraz stężenie dsDNA w celu określenia kwalifikowalności do analizy i czynnika rozcieńczenia próbek (Tabela 6). Tabela 6 podkreśla również znaczenie ilościowego oznaczenia stężenia dsDNA, które może różnić się od stężenia DNA zmierzonego za pomocą spektrofotometru. Zmienność ta wynika z różnych podejść do kwantyfikacji. W szczególności spektrofotometr wyznacza stężenie DNA na podstawie absorbancji przy 280 nm i jest podatny na wahania spowodowane zanieczyszczeniami (np. białkami, solami itp.), które wpływają na odczyty absorbancji. W przeciwieństwieństwie do tego, stężenia dsDNA mierzone za pomocą fluorometru są określane przez fluorescencję barwnika, który wiąże się specyficznie z dsDNA, i w związku z tym przyjmuje się, że są one dokładniejszym odzwierciedleniem zawartości DNA. Próbki DNA poddano do trzech cykli zamrażania i rozmrażania przed analizą MMqPCR TL. Kontrolne DNA przygotowano z połączonych ekstraktów DNA z PBMC jednej osoby, co posłużyło do stworzenia siedmiopunktowego rozcieńczenia seryjnego od 2 ng/μL do 0,0313 ng/μL DNA. Niezależne krzywe standardowe stworzone dla kroku 9 PCR (amplikon telomerowy) i kroku 12 (amplikon genu pojedynczej kopii, w tym protokole albuminy) przedstawiono na Rysunku 6A,B. Analizy przeprowadzono na komercyjnym systemie detekcji Real-Time PCR, który wygenerował krzywą topnienia wykazującą powstawanie poszczególnych produktów amplikonowych w różnych temperaturach, co przedstawiono na Rysunku 8.

Tabela 4: Dane wyjściowe z pomiaru MMqPCR dla optymalnych wyników reprezentatywnych. Średnie stosunki T/S, SD, CV oraz Z-score TL dla 24 próbek. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Wyniki danych dotyczących długości telomerów. Surowe dane z analizy MMqPCR są analizowane w oprogramowaniu, a następnie dodawane do szablonu arkusza kalkulacyjnego dołączonego jako Plik uzupełniający 1  w celu dalszej analizy i kontroli jakości (QC). Ten arkusz wynikowy szablonu TL przedstawia podsumowanie danych, wyświetlając identyfikatory próbek, średnie TL, odchylenia standardowe (SD) oraz współczynniki zmienności (CV)  dla każdej próbki na obu płytkach. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Metryki jakości DNA z pomiarów spektrofotometrycznych i fluorometrycznych dla wyników próbek. Dane QC z podwójnej analizy spektrofotometrycznej i pojedynczego pomiaru fluorometrycznego dsDNA oraz wszelkich zanieczyszczeń w każdej próbce. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

figure-results-1
Rycina 8: Przykład krzywej topnienia. Krzywa topnienia dla danych próbki wygenerowana przez oprogramowanie. Pierwszy pik w ~80 °C reprezentuje amplikon telomeru, a drugi pik w ~89 °C reprezentuje amplikon albuminy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W tym projekcie średnia wydajność telomerów wyniosła 98,6% w zakresie od 90,7 do 102,1, a średnia wydajność albuminy wyniosła 102,3% w zakresie od 93,6 do 108,2 we wszystkich seriach pomiarowych. Średnio z krzywych wzorcowych usunięto 0,97 powtórzeń, co spełnia kryteria kontroli jakości (QC) niniejszego protokołu. Średni współczynnik zmienności (CV) między płytkami wyniósł 1,83% przy SD równym 0,00616, a średni CV w obrębie płytki wyniósł 3,78% przy SD równym 0,00658. Średnie długości telomerów (TL) dla tych reprezentatywnych próbek przedstawiono w tabeli 4 oraz tabeli 5. Średnia wartość TL wyniosła 1,37 przy SD równym 0,24 i zakresie od 0,84 do 2,32. Stosunek T/S, SD, CV oraz TL znormalizowane do wyniku Z dla każdej próbki wymieniono w tabeli 4. Ponieważ wynik stosunku T/S w teście  MMqPCR jest pomiarem względnym TL, wartości te przekształcono w wynik Z, aby umożliwić porównania między badaniami. ICC dla tego projektu obliczono za pomocą skryptu R zgodnie z wytycznymi TRN zawartymi w pliku uzupełniającym 2, uwzględniając efekty partii i serii pomiarowych20. Aby obliczyć ICC w obrębie projektu, ponownie przebadano 10% próbek, które przeszły weryfikację, dbając o to, aby na płytkach do ICC znalazła się co najmniej jedna próbka z każdej płytki kohorty. Ogólny wynik ICC projektu wynoszący 0,801 [CI: 0,703, 0,86] wskazuje na wysoką powtarzalność wyników TL.

Nie wszystkie wyniki będą optymalne. Wyniki przedstawione na Rysunku 9 oraz w Tabeli 7  ukazują suboptymalne wyniki testu MMqPCR. Rysunek 9  przedstawia krzywą standardową z wydajnością telomerów poniżej 90%, co nie spełnia standardów kontroli jakości (QC) i wymaga powtórzenia całego płytki. Problemy z wydajnością starterów zazwyczaj wynikają z kwestii związanych z odczynnikami, dlatego w pierwszej kolejności należy monitorować daty przygotowania aliquotów oraz terminy ważności odczynników, aby ustalić, który z nich odpowiada za niską wydajność. Przeterminowane odczynniki powinny zostać wymienione przed ponownym uruchomieniem płytki. Tabela 7  przedstawia płytkę, która przeszła wstępne kryteria QC na poziomie próbek, ale wykazuje wysoką zmienność między płytkami, co prowadzi do niepowodzenia QC na poziomie płytki. Zmienność między płytkami zazwyczaj wynika z błędów w technikach pipetowania i napełniania płytek. W takim przypadku technik powinien ocenić wszelkie problemy, które wystąpiły podczas przygotowania płytki, i upewnić się, że pipety są skalibrowane.

figure-results-2
Rysunek 9: Suboptymalne wyniki. Krzywa standardowa wyświetlona w oprogramowaniu nie przeszła kontroli jakości (QC), ponieważ wydajność amplifikacji dla primera telomerowego była mniejsza niż 90%. Obraz pochodzi z P1, lecz P2 wykazał podobnie niską wydajność. Dane z tego przebiegu nie mogły zostać wykorzystane i wszystkie próbki musiały zostać poddane analizie ponownie po wymianie przeterminowanego odczynnika, który był przyczyną problemu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 7: Wyniki suboptymalne. Tabela przedstawia szablon danych telomerowych dla serii pomiarowej, w której wiele próbek nie spełniło standardów kontroli jakości (QC). Próbki wymagające powtórzenia analizy określono na podstawie wartości CV, a następnie nazwę próbki zmieniono na czerwoną czcionkę w celu łatwej identyfikacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Szablon arkusza danych telomerowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Obliczanie ICC. Protokół ten został opracowany przez Telomere Research Network (TRN). Plik ten został zmodyfikowany na podstawie 20. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Wytyczne dotyczące raportowania TRN. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Metodą najczęściej stosowaną do pomiaru TL w większych badaniach populacyjnych przed 2002 r. była analiza Southern blot końcowych długości fragmentów restrykcyjnych (TRF)24,25. TRF, pomimo doskonałej precyzji i odtwarzalności w specjalistycznych laboratoriach, ma ograniczoną możliwość zastosowania ze względu na ilość i jakość wymaganego DNA oraz ograniczoną przepustowość, zapewniając w ten sposób tło dla zwiększonego wykorzystania testów TL opartych na qPCR, a następnie testu MMqPCR. Metoda MMqPCR TL zapewnia powtarzalny pomiar TL po skonfigurowaniu, optymalizacji i konserwacji z uwagą poświęconą każdemu kryteriom kontroli jakości. Obliczanie i raportowanie specyficznego ICC dla każdej analizowanej kohorty jest wymagane w celu zapewnienia wiarygodności testu. Chociaż metoda MMqPCR zależy od jakości DNA i wiedzy technicznej, dobrze nadaje się do dużych badań populacyjnych badających TL, ponieważ wymaga niewielkich ilości DNA, jest bardziej niezawodna niż PCR singleplex i jest bardziej wydajna pod względem kosztów odczynników i czasu techników niż inne metody. Zdolność do generowania wysokich ICC dostarcza dodatkowych danych wspierających zastosowanie MMqPCR w dużych badaniach populacyjnych TL. Pomiar MMqPCR TL może być stosowany w szerokim zakresie badań mających na celu określenie roli TL jako biomarkera śmiertelności z jakiejkolwiek przyczyny, starzenia się, stresu w ciągu życia, narażenia środowiskowego i wyników zdrowia fizycznego, takich jak choroby układu krążenia i nowotwory 4,7,8,10,11,12,13,26,27,28, 29,30,31.

Jednym z ograniczeń metody MMqPCR jest to, że podaje ona TL jako stosunek T/S, względne oszacowanie długości, które różni się w zależności od wyboru pojedynczej kopii genu, składu mieszanki głównej i parametrów cyklicznych PCR32. Stosunek T/S jest niejednostkowy. W związku z tym, bez połączenia z innymi metodologiami pomiaru TL, metoda ta nie jest w stanie podać oszacowań w wartościach par podstawowych 18,33,34. W rezultacie, stosunek T/S musi zostać przekształcony w Z-score, aby miał znaczenie we wszystkich badaniach35. Należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania tej czynności w różnych laboratoriach, metodach i testach. Ponadto metoda ta, podobnie jak w przypadku testów hybrydyzacji na bazie żelu, może obejmować kwantyfikację telomerów śródmiąższowych. Jednak sekwencje te stanowią bardzo małą część całkowitej zawartości telomerów DNA na genom. Ponadto śródmiąższowe sekwencje telomerowe z większym prawdopodobieństwem zawierają niedopasowane sekwencje par zasad, które odbiegają od kanonicznych powtórzeń telomerów, zmniejszając prawdopodobieństwo wiązania i amplifikacji starterów. Ponadto, chociaż minimalna ilość DNA potrzebna do testu MMqPCR jest korzystna, ważne jest, aby zauważyć, że na pomiary TL oparte na qPCR mają wpływ czynniki przedanalityczne wpływające na jakość i integralność DNA, w tym warunki przechowywania próbki, metodologia ekstrakcji DNA i tkanka biologiczna 36,37. Wykazano, że kontrola analityczna tych czynników może zwiększyć zewnętrzną trafność pomiarów TL wygenerowanych za pomocą qPCR38. Mimo to wpływ różnic w jakości DNA na TL generowany za pomocą testu MMqPCR musi być w szczególności systematycznie oceniany, ponieważ nie istnieją obecnie żadne wytyczne oparte na danych, które pozwoliłyby określić, czy próbka jest wystarczającej jakości, aby wygenerować dokładne oszacowanie TL przy użyciu tego podejścia. Pomimo tych ograniczeń zastosowania tego testu w badaniach nad wynikami zdrowotnymi na poziomie populacji są znaczące.

W przypadku korzystania z testu MMqPCR konieczna jest ciągła ocena precyzji i przepustowości. Zgodnie z obecnymi założeniami, technicy przeprowadzają jednocześnie potrójne pobieranie próbek na zduplikowanych płytkach za pomocą dwóch termocyklerów. W przypadku braku wielu termocyklerów zalecamy zachowanie zduplikowanych pomiarów i sekwencyjne uruchamianie płyt w celu zwiększenia precyzji, nawet kosztem zmniejszonej przepustowości. Każda decyzja o nadaniu priorytetu przepustowości nad precyzją, na przykład poprzez zastosowanie pojedynczych potrójnych pomiarów, powinna być poprzedzona dokładnym testowaniem i oceną otrzymanych ICC przed przystąpieniem do analizy próbek analitycznych. Podejmując decyzje dotyczące przepustowości i precyzji, należy wziąć pod uwagę wielkość próbki i jakość próbki DNA. Mniejszy rozmiar próbki lub próbki DNA niskiej jakości wymagają priorytetowego traktowania większej precyzji23. Ma to jeszcze większe znaczenie podczas pracy z próbkami z powiązanych grup (np. członków rodziny, osób z wieloma punktami czasowymi). W takich przypadkach staranne planowanie, na przykład przypisanie powiązanych próbek do tej samej płytki przed rozpoczęciem eksperymentu, jest jednym ze sposobów zapobiegania utracie mocy statystycznej w wyniku niezamierzonego pomieszania grupy po płytce.

Do tego testu użyto spektrofotometru do oceny jakości próbki DNA: próbki w zakresie 1,6-2,0 dla proporcji 260/280 i 2,0-2,2 dla proporcji 260/230 uznano za dopuszczalne. Ta ocena jakości i dokładna ocena dwuniciowego DNA za pomocą fluorometru są krytycznymi krokami w tym protokole w celu uzyskania powtarzalnych danych TL. Inne, bardziej opisowe miary integralności DNA, takie jak wielkość fragmentu i/lub sumarczne miary jakości DNA określone za pomocą żelu agarozowego (np. liczba integralności DNA) mogą być również wykorzystane do określenia jakości próbki38. Zalecamy również, aby rozcieńczanie próbek następowało tylko w momencie przygotowania próbki do przeprowadzenia testu MMqPCR. Gwarantuje to, że podwielokrotności DNA są poddawane jak najmniejszej ilości manipulacji po ekstrakcji, co zmniejsza zmienność w postępowaniu przed testem. W przypadku konieczności transportu próbek DNA, należy je przewozić w suchym lodzie w najwyższym możliwym stężeniu, aby złagodzić degradację zachodzącą w próbkach DNA przy niższych stężeniach39,40. Ze względu na degradację DNA, która zachodzi w cyklach zamrażania i rozmrażania, liczba zamrażania i rozmrażania w celu zaopatrzenia DNA powinna być zminimalizowana41. Podwielokrotności zbiorczego kontrolnego DNA należy utworzyć przed uruchomieniem kohorty, a podwielokrotności poszczególnych analitycznych próbek DNA należy utworzyć przed przeprowadzeniem testu.

Kluczowe wskaźniki wydajności testu i kontroli jakości obejmują sygnał NTC, CV międzypłytkowe i wewnątrzpłytkowe oraz krzywą wzorcową R2. Niespełnienie kryteriów kontroli jakości można złagodzić na kilka sposobów. Regularna zmiana zapasów PCR klasyH2Oi porcjowanie podzapasów PCR klasyH2Odla każdej pary płytek zminimalizuje źródła zanieczyszczeń, a także amplifikację NTC. Dodatkowe kroki mające na celu zmniejszenie zanieczyszczenia obejmują: wyznaczenie specjalnego kaptura PCR dedykowanego tylko do testu MMqPCR; przetarcie kaptura i sprzętu do PCR roztworem odkażającym DNA; naświetlanie pomieszczenia światłem ultrafioletowym; i ćwiczenie sterylnej techniki w kapturze PCR. Aby zwiększyć powtarzalność testu i zmniejszyć CV, zaleca się energiczne wirowanie próbek, rozcieńczeń i pasków PCR na odpowiednich etapach wirowania i dokładne ponowne zawieszenie podczas pipetowania próbek DNA. Poniżej progowej wzorcowej krzywej R2 (<0,995) można najprawdopodobniej przypisać błędom pipetowania podczas ładowania płytek. Aby tego uniknąć, należy zwracać szczególną uwagę na precyzyjne pipetowanie i kalibrować pipety raz w roku, energicznie mieszać standardowe paski PCR przed załadowaniem i starannie organizować materiały eksploatacyjne, aby promować wydajny przepływ pracy. Jeśli zaobserwuje się, że przy użyciu dwóch obrabiarek i jednej płyty zaobserwowano, że stale osiągają wyższe CV, maszyna powinna być serwisowana jako potencjalny sposób na rozwiązanie problemu. Płytki kontroli jakości od producenta powinny być regularnie uruchamiane na płytach w celu oceny wydajności termocyklera.

Jeśli problemy nie ustąpią nawet po zastosowaniu kroków zalecanych powyżej, poniższe kroki można wykonać w celu rozwiązania problemu z protokołem. Prowadzenie rejestru tego, kiedy wszystkie odczynniki zostały poddane porcjowaniu i wszelkich istotnych dat ważności, może pomóc usprawnić proces rozwiązywania problemów, gdy nieuchronnie pojawią się trudności. Ważną częścią każdego procesu rozwiązywania problemów jest dostosowanie tylko jednego odczynnika na raz w celu określenia konkretnej przyczyny niespełniających kryteriów kontroli jakości, zaczynając od najtańszego odczynnika, o którym mowa. Na przykład, jeśli zarówno telomer, jak i gen z pojedynczą kopią mają niską wydajność, bardziej prawdopodobną przyczyną są wspólne odczynniki, takie jak DTT, dNTP lub podwielokrotność SYBR niż startery specyficzne dla amplikonu. Przy podanej cenie nowe porcje powinny być testowane w kolejności DTT, następnie dNTP, a na końcu, jeśli problem nadal występuje, nowe podwielokrotności SYBR. I odwrotnie, jeśli tylko jeden z amplikonów (telomer lub pojedyncza kopia genu) ma niską wydajność, przyczyną trudności jest najprawdopodobniej jeden ze starterów. Interpretacja pików krzywej topnienia przedstawiona na rysunku 8 może służyć jako źródło kluczowych informacji na potrzeby rozwiązywania problemów. Wizualizacja dwóch pików krzywej topnienia może być wykorzystana do zidentyfikowania potencjalnych problemów z konkretną próbką, ponieważ pojedyncza próbka problemowa będzie wyróżniać się na tle ogólnego trendu pików wykazywanych przez wzorce lub pozostałe próbki analityczne. Krzywa topnienia może być również wykorzystana do zdiagnozowania problemów z konkretnym starterem, jeśli piki dla danego amplikonu są systematycznie mniej ostre niż dla drugiego.

W tym manuskrypcie szczegółowo opisano, jak skutecznie skonfigurować test MMqPCR do pomiaru TL o szerokim zastosowaniu w badaniach nad zdrowiem publicznym oraz przedstawiono kluczowe zalecenia dotyczące kontroli jakości i rozwiązywania problemów w celu zwiększenia dostępności i niezawodności tej wydajnej i opłacalnej metody.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Komitetowi Doradczemu Sieci Badawczej Telomerów oraz funduszom National Institute on Aging / National Institute of Environmental Health Sciences (U24 AG066528 i U24 AG066528-S1), które umożliwiły wykonanie tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 0,5 mlUSA Scientific1605-0099Seal-Rite 0,5 ml Probówki mikrowirówkowe, sterylne
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Probówki 1,5 mlUSA Scientific1615-5599Seal-Rite 1,5 ml Probówki do mikrowirówek, sterylne
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
100mM DTTIn HouseNie dotyczyWykonane z zapasu DTT, rozcieńczonego octanu sodu i klasy PCR H2O
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C 
Probówki 15 mlThermo Fisher14-959-53ACorning 352196 Falcon 15 ml stożkowe probówki wirówkowe
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
1M MgCl2Thermo Fisher50152107Biotang Inc 1M MgCl2 1M roztwór chlorku magnezu, przygotowany w wodzie 18,2 megaomów i przefiltrowany przez filtr 0,22 mikrona
Temperatura i warunki przechowywania: 4 & stopnie; C 
1x Złoty buforw domuNie dotyczy10X Złoty bufor rozcieńczony PCR klasy H2O
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 & stopni; C 
25mM dNTPsNew England BioLabsN0446SZestaw roztworów deoksynukleotydowych
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C 
Probówki 5 mlTermo Fisher3391276Argos Technologies Probówki do mikrowirówek – 5mL
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
96-dołkowa płytkaBio-RadHSP960196-dołkowe płytki PCR z twardą skorupą, niskoprofilowe, cienkościenne, listwowe, białe / przezroczyste
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Folia aluminiowa OfficeDepot3489072Reynolds Wrap Stanard Rolka folii aluminiowej, 12" x 75', srebrna
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
AmpliTaq Gold Kit – Polimeraza i buforThermo Fisher4311806AmpliTaq Gold DNA Polymerase z Gold Buffer i MgCl2 (MgCl2 w tym zestawie nie jest używany), 10X Gold Buffer, 2.5U AmpliTaq Gold Polymerase
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C 
BetainaThermo FisherAAJ77507ABBetaina, 5M Solution, klasa biologii molekularnej, ultraczysta, 10mL
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C 
Big Tube RackThermo Fisher344817Fisherbrand 4-drożny stojak na tuby
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Oprogramowanie CFX MaestroBio-Rad12004110Oprogramowanie do konfiguracji płytki PCR w czasie rzeczywistym, zbierania danych, statystyk i tworzenia wykresów wyników
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Moduł reakcji optycznej CFX96 do systemów PCR w czasie rzeczywistym z pakietem startowymBio-Rad184509696-dołkowy moduł optyczny do PCR
w czasie rzeczywistym Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
DTTFisher ScientificAAJ1539706Ditiothreitol, >99.5+ Klasa biologii molekularnej, 5 g
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C 
ELIMINaseFisher Scientific04-355-32ELIMINase Laboratory Deminmin
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Filtr HEPAUSA ScientificFiltry zamienneWysokowydajny filtr cząstek stałych do stacji roboczych AirClean
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
KimwipesThermo Fisher06666AKimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki zadaniowe, 1-warstwowe
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Koryto załadowczeThermo Fisher14387069Thermo Scientific Matrix Zbiorniki odczynników
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Microsoft ExcelMicrosoftNie dotyczyPakiet Microsoft 365, aplikacja Excel
Temperatura i warunki przechowywania:
Mini wirówkaGenesee Scientific31-500BMini wirówka Poseidon 31-500B, niebieska pokrywka
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
PCR klasy H2OThermo FisherAM9937Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
PCR HoodUSA Scientific4263-2588Stacja robocza z kwasami nukleinowymi z filtracją HEPA, systemy AirClean Kombinowana stacja robocza PCR
Temperatura i warunki przechowywania: Paski PCR o temperaturze pokojowej
Thermo FisherAB0776Niskoprofilowe probówki i płaskie nakrętki, paski 8
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Stojak na probówki do PCRThermo Fisher344820Fisherbrand 96-dołkowy stojak na probówki do PCR
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Końcówki do pipet (wielokanałowe)Ranin17005860Końcówki do pipet SR LTS 20µ L F 960A/5, 20&mikro; L Maksymalna
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Końcówki do pipet (jednokanałowe)USA Scientific1181-385010µ L Końcówki filtra TipOne RPT z podziałką
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Końcówki do pipet (jednokanałowe)USA Scientific1180-185020µ L Skośne końcówki filtra TipOne RPT
Temperatura i warunki przechowywania: Końcówki
(jednokanałowe)USA Scientific1111-0880200µ l Naturalne końcówki do pipet TipOne w stojakach
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Końcówki do pipet (jednokanałowe)USA Scientific1111-28901000µ l Naturalne końcówki do pipet TipOne z podziałką w stojakach
Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej
(wielokanałowe)PipetyRanin17013802Pipet-Lite L8-10XLS, 0,5 do 10 i mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej
(wielokanałowe)PipetyRanin17013803Pipet-Lite L8-20LS+, od 2 do 20 mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej
(jednokanałowe)Pipety Thermo FisherF144802GGilson Pipetman Classic, od 1 do 10 i mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej
(jednokanałowe)Pipety Thermo FisherF123600Gilson Pipetman Classic, od 2 do 20 i mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej
(jednokanałowe)Pipety Thermo FisherF123601Gilson Pipetman Classic, od 20 do 200 i mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Pipettory do temperatury pokojowej
(jednokanałowe)Pipety Thermo FisherF123602Gilson Pipetman Classic, od 200 do 1000 mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Folia uszczelniająca do płytBio-RadMSB1001Microseal " B” Folia uszczelniająca do płytek PCR, klej, optyczna
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Wirówka płytkowaThermo Fisher14-100-141Fisherbrand Mini wirówka do płytek, 230 V
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Filtr wstępnyUSA Scientific4235-3724Filtr wstępny do systemów AirClean Stacje robocze
Temperatura i warunki przechowywania: Pomieszczenie temperatura
Oprogramowanie RProjekt R do obliczeń statystycznychNie dotyczyWersja R 4.2.2
Temperatura i warunki przechowywania: Skala temperatury pokojowej
Thermo Fisher01-922-329Waga analityczna OHAUS 30430060 serii PR, pojemność 62g
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
NożyczkiOffice Depot458612Nożyczki marki Office Depot, 8 ", proste, czarne, opakowanie 2
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
SharpiesSharpie2151734Brush Twin Markery permanentne,
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Single Copy Gene Forward PrimerZintegrowane technologie DNANiestandardowePatrz oddzielna tabela
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C po ponownym uwodnieniu
Pojedynczy kopiujący gen Odwrotny starterZintegrowane technologie DNA NiestandardowePatrz oddzielna tabela
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C po nawodnieniu
Mały stojak na probówkiThermo Fisher21-402-17Thermo Fisher 8601 Odwracalne stojaki na mikroprobówki z pokrywą
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Octan soduThermo FisherJ63560. EQE3M NaOAc pH 5,2
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Szpatułka ze stali nierdzewnejThermo Fisher3990240Bel-Art SP Scienceware Łyżka do pobierania próbek ze stali nierdzewnej i szpatułka
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
SYBR GreenThermo FisherS7563SYBR Green I Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym – 10 000X Koncentrat w DMSO
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C po ponownym uwodnieniu
Filtry strzykawkoweFisher Scientific09-927-55AGD/X 25 mm Sterylny filtr strzykawkowy, medium filtracyjne z octanu celulozy, 0,2 i mu; m
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
StrzykawkiThermo Fisher148232ABD Luer-Lok Jednorazowe strzykawki bez igieł, 10mL
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
TE BufferFisher ScientificBP2474100TE Buffer, Tris-EDTA, 1X roztwór, pH 7,6, Biologia molekularna, Fisher BioReagents
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Telomere Forward PrimerZintegrowane technologie DNANiestandardoweZobacz oddzielną tabelę
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C po uwodnieniu
Odwrócony podkład telomerówZintegrowane technologie DNANiestandardowePatrz oddzielna tabela
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C po ponownym nawodnieniu
ŻarówkaLight USA Scientific4288-2540do stacji roboczych
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
VortexThermo Fisher14-955-151Fisherbrand Mini Vortex Mixer, 115 V, 50/60 Hz
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Waż łódźThermo Fisher01-549-752Sterylna sześciokątna łódka wagowa Fisherbrand, 10 mL
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
w temperaturze pokojowej do pipet w temperaturze pokojowej wielofunkcyjne wielofunkcyjne UV

Bibliografia

  1. Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability. Cell. 107 (1), 67-77 (2001).
  2. Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. The role of telomere biology in cancer. Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).
  3. Lindrose, A., Drury, S. Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement. Telomere Research Network. , (2020).
  4. Verhulst, S., et al. Commentary: The reliability of telomere length measurements. Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).
  5. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).
  6. Mundstock, E., et al. Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis. Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).
  7. Haycock, P. C., et al. Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis. BMJ. 349, 4227(2014).
  8. Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis. Environ Res. 158, 480-489 (2017).
  9. Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. Depression and telomere length: A meta-analysis. J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).
  10. Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis. Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).
  11. Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis. Andrologia. 51 (7), e13304(2019).
  12. Schneider, C. V., et al. Association of telomere length with risk of disease and mortality. JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).
  13. Deng, Y., et al. Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study. Front Cardiovasc Med. 9, 1012615(2022).
  14. D'mello, M. J., et al. Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis. Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).
  15. Wilbourn, R. V., et al. The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447(2018).
  16. Gardner, M., et al. Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis. Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).
  17. Lai, T. -P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451(2018).
  18. Cawthon, R. Telomere measurement by quatitative pcr. Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).
  19. Cawthon, R. M. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method. Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).
  20. Lindrose, A. R., et al. Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature. PLoS One. 16 (1), e0245582(2021).
  21. Lin, J., et al. Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement - a multi-lab impartial study. bioRxiv. , (2022).
  22. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  23. Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting. Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
  24. Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
  25. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  26. Ye, Q., et al. Telomere length and chronological age across the human lifespan: A systematic review and meta-analysis of 414 study samples including 743,019 individuals. Ageing Res Rev. 90, 102031(2023).
  27. Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence. J Vis Exp. (75), e50246(2013).
  28. Liu, M., et al. Immune-mediated inflammatory diseases and leukocyte telomere length: A mendelian randomization study. Front Genetics. 14, 1129247(2023).
  29. Van Ockenburg, S., et al. Stressful life events and leukocyte telomere attrition in adulthood: A prospective population-based cohort study. Psychol Med. 45 (14), 2975-2984 (2015).
  30. Zong, Z. Q., et al. Ambient air pollution exposure and telomere length: A systematic review and meta-analysis. Public Health. 215, 42-55 (2023).
  31. Tang, L., Li, D., Wang, J., Su, B., Tian, Y. Ambient air pollution, genetic risk and telomere length in uk biobank. J Expo Sci Environ Epidemiol. , (2023).
  32. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1), 59-67 (2012).
  33. Lin, J., et al. Systematic and cell type-specific telomere length changes in subsets of lymphocytes. J Immunol Res. 2016, 5371050(2016).
  34. Needham, B. L., et al. Socioeconomic status, health behavior, and leukocyte telomere length in the national health and nutrition examination survey, 1999-2002. Soc Sci Med. 85, 1-8 (2013).
  35. Verhulst, S. Improving comparability between qpcr-based telomere studies. Mol Ecol Res. 20 (1), 11-13 (2020).
  36. Dagnall, C. L., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PloS one. 12 (9), e0184098(2017).
  37. Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., Drury, S. Telomere length measurement by qpcr-summary of critical factors and recommendations for assay design. Psychoneuroendocrinology. 99, 271-278 (2019).
  38. Wolf, S. E., et al. Cross-tissue comparison of telomere length and quality metrics of DNA among individuals aged 8 to 70 years. PLOS One. 19 (2), e0290918(2024).
  39. RoDer, B., FruHwirth, K., Vogl, C., Wagner, M., Rossmanith, P. Impact of long-term storage on stability of standard DNA for nucleic acid-based methods. J Clin Microbiol. 48 (11), 4260-4262 (2010).
  40. Dagnall, C., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PLoS One. 12 (9), e0184098(2017).
  41. Shao, W., Khin, S., Kopp, W. C. Characterization of effect of repeated freeze and thaw cycles on stability of genomic DNA using pulsed field gel electrophoresis. Biopreserv Biobank. 10 (1), 4-11 (2012).
  42. Institute for Statistics and Mathematics of WU. The Comprehensive R Archive Network. , Available from: https://cran.r-project.org/ (2024).
  43. Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biol Rev. 85 (4), 935-956 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

monochromatyczny PCR multipleksowypomiar telomerówtest MMqPCRmonocyty krwi obwodowejSYBR Greenkrzywa wzorcowapowtórzenie technicznekontrola jakości płytki
Monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów PCR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.