Artykuł metodologiczny

Monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów PCR

DOI:

10.3791/66545

⸱

22 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Tulane University, 2Native American Center for Health Professions, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, 4Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, 5School of Science and Engineering, Tulane University, 6Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Boston Children’s Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru względnej długości telomerów (TL) za pomocą monochromatycznego multipleksowego ilościowego testu łańcuchowego polimerazy (MMqPCR). Test MMqPCR jest powtarzalną, wydajną i opłacalną metodą pomiaru TL z ludzkiego DNA w badaniach populacyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomery to struktury rybonukleoproteinowe na końcu wszystkich chromosomów eukariotycznych, które chronią DNA przed uszkodzeniem i zachowują stabilność chromosomów. Długość telomerów (TL) jest związana z różnymi ekspozycjami, procesami biologicznymi i wynikami zdrowotnymi. W artykule opisano protokół monochromatycznego ilościowego testu łańcuchowej polimerazy (MMqPCR) rutynowo przeprowadzanego w naszym laboratorium w celu pomiaru względnej średniej TL z ludzkiego DNA. Istnieje kilka różnych metod pomiaru TL opartych na PCR, ale konkretny protokół dla metody MMqPCR przedstawiony w tej publikacji jest powtarzalny, wydajny, opłacalny i odpowiedni dla badań populacyjnych. Ten szczegółowy protokół przedstawia wszystkie informacje niezbędne badaczom do ustalenia tego testu w swoim laboratorium. Ponadto protokół ten zapewnia konkretne kroki w celu zwiększenia odtwarzalności pomiaru TL za pomocą tego testu, zdefiniowanego przez współczynnik korelacji wewnątrzklasowej (ICC) w powtarzających się pomiarach tej samej próbki. ICC jest kluczowym czynnikiem w ocenie oczekiwanej mocy dla określonej badanej populacji; w związku z tym zgłaszanie specyficznych dla kohorty ICC dla dowolnego testu TL jest niezbędnym krokiem w celu zwiększenia ogólnego rygoru populacyjnych badań TL. Przykładowe wyniki wykorzystujące próbki DNA wyekstrahowane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pokazują możliwość generowania wysoce powtarzalnych danych TL przy użyciu tego protokołu MMqPCR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomery to ochronne kompleksy znajdujące się na końcu wszystkich chromosomów eukariotycznych, składające się z wysoce konserwatywnych, powtarzających się sekwencji DNA i związanych z nimi białek. Telomer chroni integralność DNA, zachowując stabilność chromosomów. Postępujące skracanie telomerów następuje w dzielących się komórkach w wyniku niepełnej syntezy opóźnionej nici DNA, uszkodzenia DNA i innych czynników1,2. Zwiększonym dowodom potwierdzającym długość telomerów (TL) jako biomarker starzenia się i chorób związanych z wiekiem w ciągu życia człowieka towarzyszy wzrost liczby typów testów pomiaru TL wykorzystywanych do oceny roli TL w badaniach narażenia, choroby i zdrowia ludzi3,4,5. Metaanalizy wykazały powiązania TL z ogólną śmiertelnością, narażeniem środowiskowym i wynikami zdrowotnymi, w tym rakiem, chorobami układu krążenia i cukrzycą6,7,8,9,10,11,12,13. Te metaasocjacje wywodzą się z badań wykorzystujących jedną z ponad dwóch tuzinów różnych metodologii pomiaru TL, w których siła powiązań ma tendencję do różnienia się w zależności od różnych metodologii14,15,16. Wybór optymalnej metody pomiaru TL dla badania naukowego jest kluczowym krokiem do zapewnienia dokładnych wyników, ponieważ każda metoda ma swoje zalety i wady5,17.

Ze względu na stosunkowo niski koszt odczynników, szybki czas realizacji testów, skalowalność i niższe początkowe wymagania DNA, techniki pomiaru TL oparte na PCR są często preferencyjnie wykorzystywane podczas prowadzenia badań z dużymi populacjami próbek, badań z ograniczonym dostępem do próbek o wysokich stężeniach DNA lub badań priorytetowych o wysokiej przepustowości. Pierwsza metoda pomiaru TL oparta na PCR, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy singleplex (qPCR) pierwotnie opracowana przez Richarda Cawthona, wykorzystuje stosunek sygnałów fluorescencyjnych amplifikacji telomeru (T) i pojedynczej kopii genu (S), uruchamiany na oddzielnych płytkach PCR18. W tym podejściu startery komplementarne do powtarzających się sekwencji telomerowego DNA (T) są używane do amplifikacji całkowitej zawartości telomerowego DNA w próbce i oznaczane ilościowo przez detekcję fluorescencyjnego zielonego reportera SYBR. Podobnie, startery komplementarne do międzygenowego regionu konserwatywnej pojedynczej kopii genu (S) są używane do ilościowego określenia liczby kopii genomu. Te dwa oszacowania są określane ilościowo w odniesieniu do standardowej krzywej genomowego DNA wykorzystywanej we wszystkich testach w projekcie w celu kontrolowania zmienności między płytkami. Dzielenie całkowitego telomerowego DNA (T) przez liczbę kopii pojedynczego genomu (S) daje stosunek T/S, niejednolitą, względną miarę reprezentującą średnią zawartość telomerów na komórkę dla pojedynczej próbki DNA18,19. W związku z tym stosunek T/S nie jest specyficzną miarą długości funkcjonalnej; jednakże, zgodnie z normami literaturowymi, w całym tym protokole używamy terminu średnia TL na próbkę.

Ta metoda została rozwinięta w 2009 roku, kiedy Richard Cawthon opisał monochromatyczny test multiplex qPCR (MMqPCR) jako podejście do potencjalnego zmniejszenia zmienności w stosunku do oryginalnej metody singleplex qPCR19. Test MMqPCR ma zalety testu qPCR z dodatkową zaletą polegającą na pomiarze sygnałów T i S w tej samej studni reakcyjnej przy użyciu jednego raportującego fluoroforu, zmniejszając w ten sposób błąd w stosunku do pojedynczego qPCR i skutkując wyższą precyzją i odtwarzalnością19. Co więcej, ta metoda multipleksowa potencjalnie obniża koszty i zwiększa przepustowość, ponieważ wymagana jest o połowę mniej reakcji w porównaniu z testem singleplex19.

Biorąc pod uwagę zalety pomiaru TL MMqPCR, metoda ta doskonale nadaje się do badań populacyjnych nad powiązaniami TL z ekspozycją, wynikami zdrowotnymi i procesami biologicznymi. Jednak zainicjowanie metody może być trudne. Aby sprostać tym wyzwaniom, szczegółowo opisujemy protokół pomiarowy MMqPCR TL stosowany w naszym laboratorium, podkreślając kluczowe kroki wdrożone w celu zwiększenia precyzji testu, zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia i poprawy powtarzalności.

Ponadto, ten protokół przedstawia kroki czyszczenia danych i obliczania współczynnika korelacji wewnątrzklasowej (ICC), ważnej statystycznej miary odtwarzalności pomiarów TL2. Dzięki naszym reprezentatywnym wynikom pokazujemy zdolność do generowania wysokich ICC przy użyciu tego protokołu. Ponadto identyfikujemy kroki kontroli jakości (QC) i rozwiązywania problemów, które mają zmniejszyć zmienność pomiarów TL i zwiększyć wynikową ICC. Ze względu na wysoką powtarzalność, wydajność i opłacalność tej metody, pomiar MMqPCR TL jest idealny do epidemiologicznych badań TL. Rysunek 1 przedstawia wizualny przegląd metody MMqPCR opisanej w tym protokole.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd metody. Szeroki przegląd monochromatycznej metody ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej do pomiaru długości telomerów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji. Protokół ten opisuje test MMqPCR przeprowadzany na głębokości pomiaru zduplikowanych potrójnych próbek, tj. potrójnych pomiarów każdej próbki powtórzonych na zduplikowanych płytkach, realizowanych przy użyciu dwóch termocyklerów jednocześnie w celu zwiększenia przepustowości. Stosowanie zduplikowanych płytek jest głównym czynnikiem branym pod uwagę przy wdrażaniu tego protokołu w celu osiągnięcia wysokiej odtwarzalności, na co wskazują wysokie ICC. Chociaż możliwe jest użycie mniejszej liczby powtórzeń, wpływ na ICC, a co za tym idzie moc i potrzebna wielkość próby, musi być dokładnie rozważony i zmierzony dla każdej kohorty przez każde laboratorium20,21. Jeśli dostępny jest tylko jeden termocykler, sugerujemy zachowanie głębokości pomiaru (tj. zduplikowane potrójne próbki) i sekwencyjne uruchamianie 2 płytek.

1. Przygotowanie zapasów i warunki przechowywania

  1. Aby zapoznać się ze wszystkimi materiałami i sprzętem używanym w tym protokole, patrz Tabela materiałów. Ponadto w odniesieniu do konkretnych odczynników i ilości mieszaniny głównej stosowanych w teście MMqPCR zob. tabela 1. W przypadku sekwencyjnego uruchamiania dwóch płytek, połowę objętości mieszanki wzorcowej, utrzymując stężenie, upewniając się, że te same podwielokrotności odczynnika są używane na kolejnych płytkach tego samego testu.
    UWAGA: Wszystkie odczynniki podstawowe powinny być przygotowane z wyprzedzeniem, a podczynniki powinny być całkowicie rozmrożone przed użyciem.
  2. Podaj i przechowuj 1x Tris-EDTA, pH 7,6 (TE) w probówkach o pojemności 5 ml w objętościach 3 ml w temperaturze pokojowej przez okres do 2 lat.
  3. Porcję należy przechowywać i przechowywać 5 M betainy w probówkach o pojemności 5 ml w objętości 1 280 μl w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
  4. Podwielokrotność i przechowywanie SYBR Green w objętościach 3 μl w pojedynczych probówkach paskowych do PCR w temperaturze -20 °C przez okres do 2 lat, przykryte folią i w minimalnym stopniu naświetlane światłem.
  5. Polimerazę DNA należy przechowywać w oryginalnych probówkach w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
  6. Porcję i przechowywać 10 razy bufor polimerazy w probówkach o pojemności 1,5 ml w objętości 660 μl w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
    1. W przypadku 1x rozcieńczenia buforu 10x buforu polimerazy, dodać 9,9 μl 10x buforu do 89,1 μl PCR gradeH 2O w probówkach 0,5 ml; przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
  7. Porcję i przechowywać 1 M MgCl2 w probówkach 0,5 ml w objętości 70 μl w temperaturze 4 °C z dala od światła przez okres do 1 roku.
  8. Przechowuj liofilizowane startery oligonukleotydów oligonukleotydowych do przodu i do tyłu (T) i pojedynczej (S) kopii genu w temperaturze pokojowej z dala od światła. Cztery specyficzne sekwencje starterów oligonukleotydowych przedstawiono w tabeli 2.
    UWAGA: Pojedynczą kopią genu w tym protokole jest albumina; w przypadku wyboru innej pojedynczej kopii genu może być konieczne dostosowanie stężeń starterów w celu zapewnienia akceptowalnej wydajności PCR.
    1. Rekonstytucja startera: Wiruj każdą liofilizowaną probówkę startera przez 10 s, a następnie umieść probówki w mini wirówce na 5 sekund, aby upewnić się, że liofilizowany osad znajduje się na dnie probówki przed dodaniem 1x buforu TE.
    2. Sprawdź każdą pojedynczą probówkę ze starterem pod kątem stężenia nM ([nM] = alfa) i ponownie uwodnić każdą probówkę ze starterem, dodając 1x TE równą 10x wartości alfa w μL (np. jeśli stężenie nM na probówce wynosi 24,6 nM, dodaj 246 μL 1x TE do probówki ze starterem), aby uzyskać 100 μM roztwór każdego startera.
    3. Podwielokrotność starterów telomerów do przodu i do tyłu oddzielnie w objętościach 16 μl, a startery albuminy do przodu i do tyłu oddzielnie w objętościach 11 μl. Przechowywać wszystkie cztery rodzaje podwielokrotności podkładu w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
  9. Mieszanina dNTP: Wirować 4-8 probówek każdego z czterech typów dNTPS roztworów podstawowych 25 mM (tj. łącznie 16-32 probówek) przez 10 sekund, a następnie szybko odwirować w temperaturze pokojowej za pomocą mini wirówki. Umieść probówki w równomiernym rozkładzie w pozycjach probówek w mini wirówce, a następnie zamknij pokrywę, aby maszyna mogła osiągnąć pełną prędkość, Wirowanie przez około 5 s.
    1. W probówce o pojemności 5 ml dodaj 200-250 μl z każdej probówki, upewniając się, że dodano równe części każdego z czterech typów dNTP, i odwiruj mieszaninę dNTP.
    2. Podaniec 210 μl mieszaniny w probówkach o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
  10. Przechowywać zapasy DTT w temperaturze -20 °C i przechowywać 3 M octan sodu w temperaturze pokojowej.
    1. Roztwór DTT: Odmierz 0,1545 g naziemnej telewizji cyfrowej w tarowanej łódce wagowej na wadze za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej.
      UWAGA: Ditiotreitol (DTT) jest niebezpiecznym odczynnikiem. Naziemna telewizja cyfrowa jest szkodliwa w przypadku połknięcia, powoduje podrażnienie skóry i może spowodować poważne uszkodzenie oczu. Podczas obchodzenia się z DTT należy nosić rękawice ochronne, ochronę oczu i ochronę twarzy. Ponadto osoby powinny unikać wdychania oparów DTT, pracować w kapturze PCR podczas pracy z DTT oraz unikać długotrwałego lub powtarzającego się narażenia.
    2. Przygotować 10 ml 0,01 M octanu sodu, dodając 33,33 μl 3 M octanu sodu i 9,967 μl H2O do PCR w probówce o pojemności 15 ml i dobrze przetoczyć wir. Dodaj odmierzoną DTT do 15 ml probówki z 0,01 M octanem sodu. Przenieść około 100 μl 0,01 M roztworu octanu sodu do łodzi wagowej w celu zebrania pozostałości DTT. Odpipetować 100 μl z powrotem do probówki o pojemności 15 ml. Gdy cała naziemna terapia cyfrowa (DTT) znajdzie się w roztworze, należy wirować probówkę, aż całkowicie się rozpuści.
    3. Wlej zawartość probówki o pojemności 15 ml do koryta załadowczego, odessaj cały roztwór do plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml z jednego końca koryta załadowczego. Podłączyć sterylny filtr strzykawkowy z octanu celulozy 0,2 μm 25 mm do końca napełnionej strzykawki, pozostawić do całkowitego nasycenia przez 1 minutę i powoli wlać roztwór do nowej probówki o pojemności 15 ml, lekko dociskając tłok strzykawki w dół, upewniając się, że cały roztwór kapie przez filtr do nowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Podwielokrotny roztwór DTT w objętości 200 μl rozlać do probówek o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 tygodni.

Tabela 1: Końcowe objętości i stężenia odczynników. Objętości i stężenia odczynników w poszczególnych podwielokrotnościach, mieszance głównej i w studzienkach PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Sekwencje starterów oligonukleotydowych telomerów i pojedynczych kopii genów. Wykaz sekwencji startera genów z pojedynczą kopią telomerów i albumin zastosowanych w metodologii. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

2. Ekstrakcja genomowego DNA i przygotowanie próbki

  1. Ekstrakcja próbek analitycznych: Przeprowadzić ekstrakcję genomowego DNA dla próbek zgodnie z wytycznymi producenta przy użyciu zestawów lub metod uznanych w laboratorium.
    1. Sprawdź jakość próbki DNA za pomocą spektrofotometru i dwuniciowego DNA (dsDNA) za pomocą fluorometru. Próbki o niedopuszczalnych średnich proporcjach 260/280 i 260/230 lub stężeniu dsDNA poniżej wykrycia (<0,20 ng/μL) nie powinny być analizowane pod kątem TL22,23. Dodatkowo, jeśli stężenie dsDNA jest zbyt wysokie, aby wygenerować odczyt za pomocą fluorometru (>1000 ng/μL), rozcieńczyć próbkę i powtórzyć test.
      UWAGA: Dla przedstawionych tutaj wyników dopuszczalne wartości czystości kwasów nukleinowych wynosiły stosunek 260/280 między 1,6 a 2,0 oraz stosunek 260/230 między 2,0 a 2,2.
  2. Ekstrakcja próbek kontrolnych: Przeprowadzić ekstrakcję genomowego DNA na próbce kontrolnej pochodzącej z tego samego materiału biologicznego, co próbki badane w ramach danego projektu. Upewnij się, że wyekstrahowano wystarczającą ilość kontrolnego DNA dla wszystkich płytek, które mają być przeprowadzone dla całej kohorty, tak aby jeden wzorzec DNA był stosowany do wszystkich testów.
    1. Sprawdź jakość kontrolnej próbki DNA za pomocą spektrofotometru i fluorometru. Próbka kontrolna powinna mieć akceptowalne średnie proporcje 260/280 i 260/230 oraz wykrywalne stężenia dsDNA22,23.
    2. Podwielokrotność kontrolnego DNA w stężeniu 2 ng/μl w ilościach 150 μl w probówkach o pojemności 0,5 ml oznakowanych typem próbki i datą. Kontrolne podwielokrotności DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 5 lat. Użyj jednej kontrolnej próbki DNA dla wszystkich płytek wszystkich próbek z tej samej kohorty lub projektu badawczego. Przygotuj te porcje zapasów z wyprzedzeniem.
  3. Przygotowanie próbek analitycznych: Dla próbek, których początkowe stężenie wynosi >5 ng/μl, należy utworzyć podwielokrotności rozcieńczenia, stosując współczynnik rozcieńczenia liczby całkowitej, dodając odpowiednią ilość wyekstrahowanej próbki DNA (plik uzupełniający 1 arkusz konfiguracyjny MMqPCR, kolumna F) i klasy H2O(plik uzupełniający 1 arkusz konfiguracyjny MMqPCR, Kolumna G) w celu rozcieńczenia stężenia w przedziale 2,5 - 5,0 ng/μL (plik uzupełniający 1 arkusz konfiguracyjny MMqPCR, kolumna K). Nie należy rozcieńczać próbek o stężeniu <5 ng/μL, jednak należy je podsycić wystarczającą objętością, aby oznaczyć próbkę 3 razy przy użyciu tego protokołu.
    UWAGA: Podwielokrotności rozcieńczenia muszą być wykonane podczas przygotowywania próbki, tak aby można było dodać 15 ng DNA do odpowiedniej probówki paskowej PCR każdej próbki. Podwielokrotności próbki pozwalają technikom uniknąć niepotrzebnych cykli zamrażania i rozmrażania, które mogłyby wpłynąć na integralność DNA próbki podstawowej, jeśli próbka nie spełnia kryteriów jakości i musi zostać ponownie uruchomiona. Przykładowy szablon MMqPCR znajdujący się w pliku uzupełniającym 1 może pomóc w określeniu prawidłowego współczynnika rozcieńczenia i objętości do przygotowania podwielokrotności rozcieńczania (plik uzupełniający 1, arkusz instalacyjny MMqPCR, kolumny E-I).
    1. Paski PCR należy wypełnić próbkami A1-8 w pasie A do PCR, próbkami B1-8 w pasie B do PCR i próbkami C1-8 w pasie C ChRL, zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 1 Arkusz konfiguracyjny MMqPCR i wymienionymi w tabeli 3, odpowiednio rozcieńczonymi ilościami próbki (plik uzupełniający 1 arkusz konfiguracyjny MMqPCR, kolumna L) i ilościami klasy H2O do PCR (plik uzupełniający 1 Arkusz konfiguracyjny MMqPCR, kolumna M) na łączną ilość 15 ng DNA na probówkę PCR i całkowitą objętość 75 μl. Odłożyć na bok.
      UWAGA: Próbki w paskach PCR mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4 °C w celu posiewu następnego dnia.
  4. Przygotowanie krzywej wzorcowej: Rozmrozić kontrolną porcję DNA, wirować przez 30 s, odwirować przez 5 s i odessać pełną objętość (150 μl) do pierwszej probówki w pasku probówki PCR o krzywej wzorcowej (SC).
    1. Pobrać pipetę 70 μl materiału do PCR klasyH2Odo drugiej do ósmej probówki paska SC PCR. Dokładnie zawiesić kontrolne DNA w pierwszej probówce przed zasysaniem 70 μl i dozowaniem go do drugiej probówki PCR. Odczekaj 30 s, a następnie dokładnie zawieś roztwór w drugiej probówce do PCR, a następnie odessaj 70 μl i dozuj go do trzeciej probówki do PCR. Powtórz to dla probówek od trzeciej do siódmej, aby uzyskać 2-krotne seryjne rozcieńczenie siedmiu wzorców. Ostatnia probówka powinna zawierać tylko stopień H2O do PCR, aby działała jako kontrola bez matrycy (NTC). Odłóż pasek SC PCR na bok.

Tabela 3: Organizacja próbek i standard kontrolny na płycie. Umiejscowienie wszystkich próbek i wzorców na 96-dołkowej płytce do PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Przygotowanie mieszanki wzorcowej MMqPCR

  1. Zebrać podwielokrotności odczynnika mieszaniny głównej wymienione w tabeli 1, z wyjątkiem polimerazy DNA, i pozwolić im osiągnąć temperaturę pokojową wewnątrz kaptura PCR. Dodać 1 μl podwielokrotności SYBR Green do 1x bufora podwielokrotność.
    UWAGA: Ta dokładna ilość jest potrzebna do wygenerowania prawidłowego stężenia SYBR ze względu na ograniczenia dokładności pipet podczas testu, więc nawet jeśli w danym momencie uruchamia się tylko jedną płytkę, ilość ta powinna pozostać niezmieniona.
  2. Wirować wszystkie podwielokrotności przez 10 s, wirować przez 5 s, następnie dodać następujące ilości odczynników do probówki o pojemności 5 ml zawierającej 5 M betainę (obecnie probówka główna mieszanki): 1 235,2 μl PCR klasyH2O, 640 μl buforu 10x, 204,8 μl dNTP, 192 μl DTT, 64 μl MgCl2, 48 μl SYBR Green / 1x bufor (od kroku 3.1), 14,4 μl obu starterów telomerów i 9,6 μl obu starterów albuminy, jak wymieniono w tabeli 1.
  3. Wyjąć polimerazę DNA z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C, wirować przez 10 s, wirować przez 5 s, a następnie powoli dodawać 128 μl do mieszanki wzorcowej; natychmiast przenieść polimerazę DNA z powrotem do przechowywania w temperaturze -20 °C.
  4. Wirować 5 ml głównej probówki mieszającej przez 30 sekund.

4. Przygotowanie płytki 96-dołkowej

  1. Umieść dwie 96-dołkowe płytki, koryto załadowcze i wielokanałowe końcówki do pipet w kapturze do PCR. Oznacz każdą tabliczkę numerem rejestracyjnym (1 lub 2). Obróć płytę pierwszą (płytę P1) o 180°, tak aby numery kolumn były odwrócone do góry nogami. Pozostaw płytę drugą (P2) skierowaną w stronę technika.
  2. Wsypać zawartość 5 ml probówki z mieszanką wzorcową do koryta załadowczego. Użyj końcówki pipety, aby zebrać i dozować roztwór pozostały w probówce.
  3. Załaduj końcówki do pipety wielokanałowej, dociskając podstawę każdej końcówki pipety, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Sprawdź, czy końcówki nie mają żadnego filtra w obszarze wyjściowym, w którym będzie zasysana mieszanka główna; Jeśli jest kawałek filtra, wymień końcówkę.
  4. Za pomocą pipetowania odwróconego napełnić płytki lepką mieszanką główną, zakręcić korytem załadowczym, a następnie wcisnąć tłok pipety poza pierwszy ogranicznik, zasysając do końcówek pipet więcej niż 15 μl, upewniając się, że końcówki napełniają się w tym samym czasie tą samą objętością. Podczas wyrzucania mieszanki wzorcowej do kolumny, należy wcisnąć tłok do pierwszego oporu, pozostawiając dodatkową mieszankę wzorcową w końcówkach pipet. Pozostawiając tłok wciśnięty, zanurz końcówki z powrotem w korycie załadowczym i zwolnij tłok, aby napełnić końcówki kolejnymi 15 μl. Użyj tych samych końcówek, aby napełnić obie płytki.
    1. Wypełnij płytki, wyrzucając najpierw mieszankę wzorcową do wszystkich parzystych lub wszystkich kolumn nieparzystych, naprzemiennie między płytkami (tj. jeśli technik zdecyduje się zacząć od nieparzystych numerów kolumn, najpierw zostanie wypełniona kolumna 1 na P2, następnie kolumna 11 na P1, a następnie kolumna 3 na P2 itd.). Po tym, jak technik wypełni wszystkie studzienki serii (nieparzyste lub parzyste) pracując od lewej do prawej, wykonaj pozostałe serie (parzyste lub nieparzyste) kolumn w ten sam sposób. Zobacz Rysunek 2 dla wykresu tego procesu.
      UWAGA: Ten sposób napełniania płyt służy do kontrolowania efektów położenia na płytach.
  5. Wirować cztery zamknięte paski PCR zawierające próbki i krzywą wzorcową, a następnie obracać każdy z nich w mini wirówce przez 5 sekund.
    1. Ułóż paski PCR w stojaku na probówki do PCR w kolejności, w jakiej zostaną umieszczone na płytce. W przypadku P1 pierwsze 3 kolumny to próbki (pasek A do PCR), kolumny 4-6 to próbki standardowe (pasek S do PCR), kolumny 7-9 to próbki (pasek B do PCR), a kolumny 10-12 to próbki (pasek C do PCR; patrz Rysunek 3 i Tabela 3). Ponieważ P2 jest napełniany, gdy jest obrócony o 180° w stosunku do technika, kolumny będą odwrotne.
  6. Obróć obie tabliczki o 180°, tak aby numery kolumn zostały odwrócone w stosunku do technika dla każdej tabliczki (tj. jeśli technik wcześniej był zwrócony w stronę etykiety P2, teraz będzie zwrócony twarzą do etykiety P1 na krawędzi płytki).
  7. Ustaw pipetę wielokanałową na 10 μl i załaduj końcówki pipet na pipetę wielokanałową zgodnie z opisem w kroku 4.3.
    1. Za pomocą pipety wielokanałowej ponownie zawiesić roztwory, a następnie wykonać pipetowanie odwrotne zgodnie z opisem w kroku 4.4, aby zassać i dozować 10 μl próbek i roztworów wzorcowych, zaczynając od paska A do PCR.
    2. Wypełnij pierwsze 3 kolumny każdej płytki za pomocą paska A do PCR, zmieniając kolumny w podobny sposób, w jaki mieszanka wzorcowa została umieszczona na płytce (tj. parzyste lub nieparzyste).
    3. Wypełnij kolejne trzy kolumny za pomocą paska PCR o standardowej krzywej. W przypadku tego paska należy dokładnie zawiesić 7. standardową probówkę rozcieńczającą (przedostatnią) za pomocą pipety o pojemności 200 μl ustawionej na ~90 μl, a następnie ponownie zawiesić cały pasek za pomocą pipety wielokanałowej.
      UWAGA: Większa objętość i mniejsze stężenie DNA w tej probówce często skutkuje różnymi pomiarami w dołkach płytki PCR z powodu złego wymieszania. Użycie większej objętości do wymieszania tej probówki lepiej homogenizuje roztwór DNA.
    4. Napełnij kolejne trzy kolumny paskiem B do PCR, a ostatnie trzy paskiem C do PCR. Zamień końcówki pipet między każdym paskiem PCR, wypełniając wszystkie 96 dołków na obu płytkach odpowiednimi próbkami i wzorcem kontrolnym, jak opisano w Rysunek 3.
  8. Po napełnieniu płytek delikatnie postukaj w płytkę na blacie stołu, aby upewnić się, że płyn po bokach studzienek spływa na dno, a następnie przykryj blaty płyt foliami uszczelniającymi. Opuszkami palców dociśnij wszystkie krawędzie folii, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.
    1. Wymieszaj płytki, obracając je na górze okapu przez 30 sekund, a następnie umieść uszczelnione płytki w wirówce do talerzy na 2 minuty z otworami studzienek skierowanymi do środka.
    2. Umieść płytki w termocyklerze, z numerami kolumn płytek w czytelnej kolejności. Użyj czystej chusteczki do wyczyszczenia górnej części każdej płytki przed zamknięciem górnej części termocyklera.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Proces napełniania płyt. (A) Jeśli zdecydujesz się najpierw wypełnić kolumny nieparzyste, jest to kolejność, w jakiej studzienki są napełniane. (B) Jeśli zdecydujesz się najpierw wypełnić parzyste kolumny, jest to kolejność, w jakiej studzienki są napełniane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Układ płyt. Pasek A, pasek B, pasek C i pasek krzywej wzorcowej (SC) powinny być użyte do wypełnienia trzech kolumn na każdej płytce w celu uzyskania podwójnych potrójnych próbek każdej próbki i standardowego rozcieńczenia. Ten diagram pokazuje, które z kolumn powinny być wypełnione każdym paskiem. Płytka druga jest obracana o 180° (należy pamiętać, że nagłówki kolumn i rzędów są odwrócone do góry nogami) przed załadowaniem, ale płytka jest napełniana identycznie jak płytka pierwsza, co eliminuje potencjalne błędy pipetowania, a jednocześnie kontroluje wpływ położenia na płytkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Termocyklowanie MMqPCR

  1. Podczas obracania się płytek w kroku 4.8.1 włącz komputer i termocyklery. Otwórz oprogramowanie termocyklera. Protokół ten opisuje sposób korzystania z oprogramowania CFX Maestro.
  2. Stwórz protokół termocyklingu TL zgodnie z protokołem termocyklingu MMqPCR19(Rysunek 4).
    1. Dodać etap inkubacji, aby aktywować polimerazę DNA w temperaturze 95 °C przez 15 minut.
    2. Aby uniknąć wiązania starter-dimer, uruchom dwa cykle po 94 °C przez 15 s, 49 °C przez 1 min, następnie 3 cykle po 94 °C przez 15 s, 59 °C przez 15 s.
    3. W celu wzmocnienia telomerów dodaj 27 cykli po 85 °C przez 15 s, 74 °C przez 30 s, a następnie akwizycję sygnału.
    4. W celu wzmocnienia albuminy dodaj 31 cykli po 94 °C przez 15 s, 84 °C przez 30 s, a następnie akwizycję sygnału.
    5. Uwzględnić krzywą topnienia od 59 °C do 95 °C w odstępach 5 s dla każdego rosnącego stopnia w protokole cykli termicznych.
  3. Kliknij przycisk Start Run dla obu termocyklerów. Po wyświetleniu monitu podaj tytuł plików analizy.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Profil termocykliczny testu MMqPCR. Protokół MMqPCR stworzony w oprogramowaniu zgodnie z oryginalnym protokołem thermocyclingu19. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Analiza danych MMqPCR

  1. Po zakończeniu termocyklingu przeanalizuj dane w następujący sposób, aby uzyskać wartości TL dla próbek, które zostały przetworzone.
  2. W oprogramowaniu wybierz funkcję Ustawienia blachy. W menu rozwijanym kliknij opcję Widok/Edytuj blachę.
    1. Zaznacz wszystkie studzienki i kliknij Wybierz fluorofory, a następnie zaznacz pole oznaczone SYBR i odznacz wszystkie inne pola. Kliknij przycisk OK.
    2. Podczas gdy wszystkie studnie są nadal podświetlone, obok słowa Load zaznacz pole obok SYBR. Teraz wszystkie studnie powinny mieć napisane SYBR.
    3. Następnie podświetl trzy studzienki NTC na górze lub na dole standardowego rozcieńczenia szeregowego kontroli i wybierz NTC z menu typu próbki po prawej stronie. Trzy studnie powinny być teraz żółte i nazywać się NTC. Rysunek 5A pokazuje, które studnie powinny być wybrane dla P1 i Rysunek 5B pokazuje, które studnie powinny być wybrane dla P2.
      UWAGA: P2 zostanie odwrócone od P1, więc NTC będzie znajdować się na dole kolumn 4-6 dla P1 i na górze kolumn 7-9 dla P2.
    4. Podświetl 21 dołków standardowego rozcieńczenia szeregowego kontroli i wybierz Standard z menu typu próbki. Te studnie powinny być zielone. Podczas gdy te studnie są nadal podświetlone, kliknij pozycję Replikacja techniczna. Wybierz pozycję 3 z menu Replikuj rozmiar, a następnie wybierz pozycję Poziomo > Zastosuj. Studnie te powinny być oznaczone w zestawach po trzy od Std-1 do Std-7.
    5. Gdy norma jest nadal podświetlona, przewiń w dół i wybierz Seria rozcieńczeń. W polu Współczynnik rozcieńczenia wprowadź wartość 2, a następnie wpisz początkowe stężenie i kierunkowość rozcieńczenia zgodnie z numerem tabliczki zgodnie z opisem w poniższych krokach.
    6. W przypadku tabliczki P1 wprowadź 2.00E-03 w polu stężenia początkowego i zaznacz pole Malejąc, a następnie wybierz Zastosuj. Wartości w 21 studzienkach powinny mieć wartości stężeń zapisane w każdym dołku w zakresie od 2.00E-03 do 3.13E-05 od góry do dołu.
    7. W przypadku płytki P2 wprowadź 3.13E-5 w polu stężenia początkowego i zaznacz pole Zwiększanie, a następnie wybierz Zastosuj. Wartości w 21 studzienkach powinny mieć wartości stężeń zapisane w każdym dołku w zakresie od 3.13E-05 do 2.00E-03 od góry do dołu.
  3. W przypadku próbek podświetl kolumny dla paska A PCR (1-3 dla P1 i P2), wybierz opcję Nieznany z menu typu próbki, a następnie wybierz opcję Replikacja techniczna. Wybierz pozycję 3 z menu Replikuj rozmiar, a następnie wybierz pozycję Poziomo > Zastosuj. Studzienki dla tych kolumn powinny być niebieskie i oznaczone wierszami w zestawach po 3 od Unk-1 do Unk-8.
    1. Powtórz krok 6.3 dla kolumn dla paska B do PCR (kolumny 7-9 dla P1 i 4-6 dla P2). Powinny być oznaczone jako Unk-9 do Unk-16.
    2. Powtórz krok 6.3 dla kolumn dla paska C do PCR (kolumny 10-12 dla P1 i P2). Powinny być oznaczone jako Unk-17 do Unk-24. Po wykonaniu kroków 6.2-6.3.2 okna ustawień płyty powinny wyglądać podobnie jak Rysunek 5A,B.
  4. Wybierz przycisk OK w prawym dolnym rogu okna edytora blach. Kliknij przycisk Tak, aby zastosować zmiany po wyświetleniu monitu.
  5. W przypadku kontroli jakości na poziomie testu należy upewnić się, że krzywe w zakładce oznaczania ilościowego są odpowiednie (np. brak odwróconych krzywych amplifikacji) zarówno dla etapu 9, jak i kroku 12 profilu termocyklingu, które odpowiadają odpowiednio amplikonom telomerów i albumin. Dostęp do krzywych można uzyskać za pomocą menu rozwijanego w prawym środkowym rogu okna oprogramowania. Rysunek 6A,B wyświetla odpowiednie krzywe.
    1. Należy upewnić się, że skuteczność PCR zgłoszona zarówno na etapie 9, jak i na etapie 12 wynosi od 90 % do 110 % i że te dwie sprawności nie różnią się od siebie o więcej niż 10 % (tj. 92,4 % dla etapu 9 i 98 % dla etapu 12 jest odpowiednie, ale 92,4 % dla etapu 9 i 108 % dla etapu 12 nie jest odpowiednie). Dodatkowo upewnij się, że standardowa krzywa R2 wynosi >0,995. Jeśli P1 lub P2 nie spełniają tych kryteriów, płyty muszą zostać ponownie uruchomione.
  6. Dla P1 wybierz Krok 9 i zaznacz 21 dołków odpowiadających krzywej standardowej, jak pokazano na Rysunek 6A,B. Skopiuj wartości Cq w prawym dolnym rogu okna oprogramowania. Otwórz szablon arkusza danych telomerów dostępny jako plik uzupełniający 1 i wklej te wartości do standardowego arkusza 1, kolumny B. Wybierz krok 12, a następnie skopiuj te wartości Cq. Wklej te wartości do standardowego 1 arkusza, kolumna I.
    1. Zidentyfikuj wartość nachylenia w kroku 9 i wpisz ją w komórce C4 w standardowym arkuszu 1. Zidentyfikuj wartość nachylenia w kroku 12 i wpisz ją w komórce J4 w standardowym arkuszu 1.
      UWAGA: System oblicza procentową skuteczność podkładów przy użyciu nachyleń krzywej standardowej określonej w kroku 6.6.1. Procentową wydajność można obliczyć ręcznie, korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-4
    2. Upewnij się, że współczynnik zmienności (CV) dla każdego trójki roztworu wzorcowego jest mniejszy niż 0,1. Jeżeli jest większa lub równa 0,1, należy wykluczyć maksymalnie trzy pojedyncze studzienki łącznie ze wszystkich stężeń próbek kontrolnych zawartych w 7-punktowej wzorcowej krzywej seryjnego rozcieńczania na płytce. Tylko jedna studzienka powinna być wyłączona z każdego zestawu potrójnego.
      UWAGA: Wykluczenie standardowych punktów z analizy w oprogramowaniu zmieni raportowane nachylenie, R, punkt przecięcia z osią y i wydajność dla obu podkładów. W związku z tym, po usunięciu z analizy dowolnego standardowego studzienki, kroki 6.5.1-6.6.1 należy powtórzyć.
    3. Powtórz kroki 6.6.1 - 6.6.2 dla pliku analizy P2 i odpowiadającego mu arkusza wzorca 2.
    4. Tylko wtedy, gdy zarówno standardowe arkusze 1, jak i standardowe 2 są wypełnione akceptowalnymi CV, należy zebrać indywidualne dane próbki z plików analizy. Upewnij się, że korekty kontroli jakości są zgłaszane w kolumnie L arkusza P1 v P2, np. ile studzienek zostało wykluczonych w pliku analizy P1.
  7. Upewnij się, że tylko 72 dołki na próbki w pliku analizy P1 są podświetlone na niebiesko na karcie Kwantyfikacja, jak pokazano w Rysunek 7A,B. Wybierz krok 9. Skopiuj wartości Cq i SQ w prawym dolnym rogu okna oprogramowania. Wklej te wartości do arkusza próbek P1, zaczynając od komórki D3. Wybierz krok 12, a następnie skopiuj te wartości Cq i SQ, a następnie wklej je w przykładowym arkuszu P1, zaczynając od komórki F3.
    1. Powtórz ten krok dla próbek w pliku analizy P2 i odpowiadających im próbkach w arkuszu P2. Stosunek telomerów do pojedynczej kopii (T/S) (kolumna H) jest obliczany automatycznie, ale można go obliczyć ręcznie przy użyciu następującego wzoru:
      figure-protocol-5
      Gdzie ET/S jest efektywnością amplifikacji wykładniczej dla reakcji ukierunkowanych odpowiednio na telomer lub gen pojedynczej kopii, a CqT/S jest cyklem, w którym dana kontrpróba ukierunkowana na zawartość telomerów lub gen z pojedynczą kopią osiąga krytyczny próg kwantyfikacji fluorescencji. Średnie współczynniki T/S (kolumna I) są obliczane dla sześciu pomiarów na próbkę.
      UWAGA: Numery identyfikacyjne próbek w CFX nie odpowiadają tej samej próbce biologicznej na dwóch płytkach. Szablon arkusza danych telomerów uwzględnia tę różnicę i wyrówna odpowiednie zduplikowane triplikaty
      2. .
    2. W CFX Maestro sprawdź, czy wartości Cq dla wszystkich próbek analitycznych mieszczą się między najniższą a najwyższą wartością Cq krzywej standardowej, jak pokazano na Rysunek 7B. Jeśli próbka wykracza poza zakres, jak pokazano na rysunku Rysunek 7A, po dostosowaniu stężenia należy ją ponownie uruchomić. Próbka o wartości Cq niższej niż najwyższy wzorzec stężenia musi zostać rozcieńczona o współczynnik przybliżony do liczby cykli amplifikacji, w których znajduje się poza zakresem, a próbka o wartości Cq wyższej niż najniższy wzorzec stężenia musiałaby zostać zagęszczona przez współczynnik przybliżony do liczby cykli amplifikacji powyżej progu.
      UWAGA: Duże zróżnicowanie stężenia próbek analitycznych wprowadza dodatkowy potencjalny poziom zmienności i powinno być wykonywane z zachowaniem ostrożności.
    3. Upewnij się, że początkowe stężenie w NTC było mniejsze niż 5% średniej ilości DNA obecnego w dołkach na próbki. Można to sprawdzić, przeglądając % zanieczyszczenia wodą na próbkach P1 i próbkach P2 arkuszy MMqPCR. Jeśli NTC wskazuje na zanieczyszczenie, uruchom ponownie płyty.
      UWAGA: Ze względu na czułość testu MMqPCR, niewielkie niekontrolowane zanieczyszczenie może czasami powodować amplifikację studzienek NTC. Jednak amplifikacja ta powinna być niewielka i wystąpić kilka cykli po amplifikacji pojedynczej kopii genu w kroku 12 protokołu termocyklingu.
    4. W przypadku kontroli jakości na poziomie próbki należy dokonać przeglądu odchyleń standardowych (SD) (kolumna J) i CV (kolumna K) w próbkach P1 i próbkach P2 Arkusze. Upewnij się, że wewnątrzpłytkowe CV w potrójnym stosunku T/S próbki są mniejsze niż 0,10 (10%). W celu skorygowania wszelkich wewnątrzpłytkowych CV większych niż 0,1 można wykluczyć jeden stosunek T/S z zestawu trzech egzemplarzy.
      UWAGA: Można wykluczyć tylko jedną całkowitą kontrpróbę z sześciu pomiarów na próbkę, tj. kontrpróby dla tej samej próbki nie można wykluczyć zarówno dla P1, jak i P2.
    5. Sprawdzić, czy CV między poszczególnymi próbkami w arkuszu P1 v P2, kolumna G, są mniejsze niż 0,05 (5%). Aby skorygować wszelkie CV większe niż 0,05, należy wykluczyć jeden stosunek T/S z sześciu pomiarów na próbkę na obu płytkach. Wykluczyć próbki po oględzinach na trzech próbkach wewnątrz płytki i wszystkich sześciu pomiarach, jeśli to konieczne.
      UWAGA: Tylko próbki spełniające te kryteria kontroli jakości, wewnątrzpłytkowe CV < 10% i międzypłytkowe CV < 5%, mogą być włączone do końcowych wyników TL. W przeciwnym razie próbka powinna zostać wyłączona z kart charakterystyki P1 v P2 i ICC dla tej serii, a próbka powinna zostać ponownie oceniona w drugim teście MMqPCR.
    6. W przypadku kontroli jakości na poziomie płytki należy sprawdzić, czy średnia zmienność wewnątrz płytki we wszystkich próbkach na każdej płytce, znajdującej się na dole arkuszy próbek P1 i próbek P2, jest mniejsza niż 0,05 (5%). W przypadku dodatkowej kontroli jakości na poziomie płyty należy sprawdzić, czy całkowita różnica między płytkami w arkuszu P1 i P2, komórka G29, jest mniejsza niż 0,06 (6%). Upewnij się, że próbki, które nie przeszły kontroli jakości, zostały usunięte z obliczeń CV międzypłytkowego w komórce G30.
      UWAGA: Podczas pracy z powiązanymi grupami próbek (np. członkami rodziny, różnymi punktami czasowymi itp.), wszystkie próbki w grupie muszą być prowadzone na tej samej płycie. W związku z tym, jeśli jedna próbka z grupy nie przejdzie kryteriów kontroli jakości, wszystkie próbki w grupie muszą zostać ponownie przeprowadzone.
    7. W oddzielnym ogólnym pliku danych kohortowych lub eksperymentalnych zapisz końcowe dane TL dla każdej próbki, która przeszła kontrolę jakości (arkusz P1 v P2, kolumna I), obliczenia ICC dla każdej próbki, która przeszła kontrolę jakości (arkusz danych ICC, kolumny E-K) i końcowe dane kontroli jakości z arkusza P1 v P2 (kolumny J-L)
  8. Użyj pliku uzupełniającego 2 utworzonego przez Telomere Research Network (TRN), aby obliczyć ICC dla projektu20.
  9. Wreszcie, aby poprawić porównywalność między badaniami TL, przekształć końcowe dane TL dla każdej próbki w oddzielnym pliku danych z ogólnej kohorty lub eksperymentu w wyniki Z, korzystając z następującego równania, w którym średni stosunek T/S dla wszystkich próbek w kohorcie jest odejmowany od stosunku T/S dla pojedynczej próby, a następnie dzielony przez SD dla wszystkich próbek w kohorcie.
    figure-protocol-6

figure-protocol-7
Rysunek 5: Konfiguracja płyty oparta na oprogramowaniu. (A) Konfiguracja płyty opartej na oprogramowaniu dla tabliczki P1 po wykonaniu kroków 6.2-6.4. (B) Konfiguracja płytki opartej na oprogramowaniu dla płytki P2 po wykonaniu kroków 6.2-6.4. Identyfikatory próbki i wzorca nie są wyrównane między dwiema płytkami CFX ze względu na sposób, w jaki oprogramowanie przypisuje identyfikatory próbek na podstawie pozycji dołka (tj. próbka CFX 1 na P1 to próbka CFX 24 na P2). Szablon Excela dostarczony w pliku uzupełniającym 1 uwzględnia to, zapewniając, że pomiary międzypłytkowe wykonane na tej samej próbce biologicznej są odpowiednio wyrównane względem siebie Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-8
Rysunek 6: Standardowe krzywe dla wzmacniaczy telomere i albumin. (A) Ta krzywa standardowa pochodzi z amplikonu telomerów P1 w zbiorze danych reprezentatywnych wyników. Jedna norma została usunięta, ponieważ nie spełniała kryteriów kontroli jakości. (B) Ta krzywa wzorcowa pochodzi z amplikonu albuminy P2 reprezentatywnego zbioru danych wyników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-9
Rysunek 7: Amplikony telomerów i pojedynczych kopii. (A) Amplifikacja genu telomerów i (B) amplifikacja genu albuminy w próbkach zgłoszonych w reprezentatywnych wynikach wyświetlanych w oprogramowaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Raportowanie danych MMqPCR

  1. Zgłaszając wyniki badań z wykorzystaniem danych TL utworzonych z MMqPCR, należy zapewnić raportowanie pozycji opisanych w Wytycznych Minimalnego Raportowania TRN. Wytyczne te można znaleźć na stronie internetowej TRN (https://trn.tulane.edu/resources/reporting-guidelines/), a wzór do zgłaszania tych informacji znajduje się w pliku uzupełniającym 3. W stosownych przypadkach należy powołać się na ten protokół oraz inne wytyczne i zasoby TRN.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki przedstawione w Tabeli 4 i Tabeli 5 stanowią przykład wysoce powtarzalnych pomiarów TL uzyskanych dzięki przestrzeganiu protokołu. W celu uzyskania tych wyników DNA wyekstrahowano z 24 próbek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z wytycznymi producentów. Te 24 próbki przeprowadzono na dwóch 96-dołkowych płytkach. Wszystkie próbki DNA zostały sprawdzone pod kątem jakości za pomocą spektrofotometru i fluorometru, przy użyciu średniego stosunku 260/280, średniego stosunku 260/230 i stężenia dsDNA w celu określenia kwalifikowalności testu i współczynnika rozcieńczenia próbki (Tabela 6). W tabeli 6 podkreślono również znaczenie ilościowego określania stężenia dsDNA, które może różnić się od stężenia DNA mierzonego za pomocą spektrofotometru. Ta zmienność wynika z różnych podejść do kwantyfikacji. W szczególności spektrofotometr określa stężenie DNA na podstawie absorpcji przy 280 nm i jest podatny na wahania spowodowane zanieczyszczeniami (np. białkiem, solą itp.) wpływającymi na odczyty absorbancji. Natomiast stężenia dsDNA mierzone za pomocą fluorometru są określane przez fluorescencję barwnika, który specyficznie wiąże się z dsDNA i jako takie zakłada się, że są dokładniejszym odzwierciedleniem zawartości DNA. Próbki DNA przeszły do trzech cykli zamrażania i rozmrażania przed analizą MMqPCR TL. DNA kontrolne zostało utworzone z połączonych ekstrakcji DNA PBMC od jednego osobnika, które wykorzystano do stworzenia siedmiopunktowego seryjnego rozcieńczenia od 2 ng / μl do 0,0313 ng / μL DNA. Niezależne krzywe wzorcowe utworzone dla PCR Krok 9 (amplikon telomerowy) i Etap 12 (amplikon z pojedynczą kopią genu, albumina w tym protokole) są przedstawione w Rysunek 6A,B. Testy przeprowadzono na komercyjnym systemie wykrywania PCR w czasie rzeczywistym, który wygenerował krzywą topnienia, która pokazuje poszczególne produkty amplikonu wytwarzane w różnych temperaturach, jak widać na Rysunek 8.

Tabela 4: Dane wyjściowe z pomiaru MMqPCR dla optymalnych reprezentatywnych wyników. Średnie współczynniki T/S, SD, CV i TL z punktacją Z dla 24 próbek. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Dane wyjściowe długości telomerów. Surowe dane z testu MMqPCR są analizowane w oprogramowaniu, a następnie dodawane do szablonu arkusza kalkulacyjnego dołączonego jako plik uzupełniający 1 w celu dalszej analizy i kontroli jakości. Ten arkusz wyjściowy szablonu TL przedstawia podsumowanie danych, wyświetlając identyfikatory próbek, średnie TL, SD i CV dla każdej próbki na obu płytach. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Wskaźniki jakości DNA spektrofotometru i fluorometru dla wyników próbek. Dane QC z podwójnej analizy spektrofotometru i pojedynczego pomiaru fluorometrem dsDNA i wszelkich zanieczyszczeń na próbkę. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

figure-results-1
Rysunek 8: Przykładowa krzywa topnienia. Krzywa topnienia dla danych próbki wygenerowanych w oprogramowaniu. Wcześniejszy pik ~80 °C reprezentuje amplikon telomerów, a wtórny pik w temperaturze ~89 °C reprezentuje amplikon albuminowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dla tego projektu średnia wydajność telomerów wynosiła 98,6% w zakresie od 90,7 do 102,1, a średnia wydajność albuminy wynosiła 102,3% w zakresie od 93,6 do 108,2 we wszystkich przebiegach. Z krzywych standardowych usunięto średnio 0,97 powtórzenia, co spełnia kryteria kontroli jakości tego protokołu. Średni CV międzypłytkowy wynosił 1,83% przy SD 0,00616, a średni CV wewnątrzpłytkowy wynosił 3,78% przy SD 0,00658. Średnie TL dla tych reprezentatywnych próbek przedstawiono w tabelach 4 i 5. Średnia TL wynosiła 1,37 przy SD 0,24 i zakresie od 0,84 do 2,32. Stosunek T/S, SD, CV i TL z nacinką Z na próbkę podano w tabeli 4. Ponieważ wynik stosunku T/S testu MMqPCR jest względnym pomiarem TL, współczynniki zostały przekształcone w ten wskaźnik Z, aby umożliwić porównanie między badaniami. ICC dla tego projektu zostało obliczone przy użyciu skryptu R, zgodnie z wytycznymi TRN znajdującymi się w pliku uzupełniającym 2, z uwzględnieniem efektów wsadowych i uruchomieniowych20. Aby obliczyć ICC wewnątrz projektu, ponownie przeprowadziliśmy 10% próbek, upewniając się, że płytki ICC są wypełnione co najmniej jedną próbką z każdej płytki kohorty. Ogólny ICC projektu wynoszący 0,801 [CI: 0,703, 0,86] wskazuje na wysoką odtwarzalność wyników TL.

Nie wszystkie wyniki będą optymalne. Wyniki w Rysunek 9 i Tabela 7 pokazują nieoptymalne wyniki testu MMqPCR. Rysunek 9 przedstawia standardową krzywą z wydajnością telomerów poniżej 90%, która jest poniżej standardów QC, co wymaga powtórzenia całej płytki. Problemy z wydajnością starterów są zwykle spowodowane problemem z odczynnikami, dlatego ważne jest, aby śledzić daty podziału odczynników i datę ich ważności, co jest pierwszym krokiem do określenia, który odczynnik jest odpowiedzialny za niską wydajność. Przeterminowane odczynniki należy wymienić przed ponownym uruchomieniem płytki. Tabela 7 przedstawia płytkę, która spełniła początkowe kryteria kontroli jakości na poziomie próbki, ale ma wysoki poziom zmienności między płytkami, co prowadzi do niepowodzenia kontroli jakości na poziomie płytki. Różnice między płytkami są zwykle spowodowane błędami w technikach pipetowania i napełniania płytek. W takim przypadku technik powinien ocenić wszelkie problemy, które wystąpiły podczas ustawiania płytki i upewnić się, że pipety są skalibrowane.

figure-results-2
Rysunek 9: Nieoptymalne wyniki. Ta standardowa krzywa wyświetlana w oprogramowaniu nie przeszła kontroli jakości, ponieważ skuteczność amplifikacji dla startera telomerów była mniejsza niż 90%. Obraz pochodzi z P1, ale P2 miał podobnie niską wydajność. Dane z tego przebiegu nie mogły być wykorzystane i wszystkie próbki musiały zostać ponownie zbadane po wymianie odczynnika przyczynowego, który utracił ważność. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 7: Nieoptymalne wyniki. W tabeli przedstawiono szablon danych telomerów dla serii, w której wiele próbek nie spełniało standardów kontroli jakości. Próbki, które należało ponownie przeprowadzić, zostały określone na podstawie wartości CV, a następnie nazwa próbki została zmieniona na czerwoną czcionkę w celu łatwej identyfikacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Szablon arkusza kalkulacyjnego danych telomerowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Obliczenia ICC. Protokół ten został stworzony przez Telomere Research Network (TRN). Ten plik został zmodyfikowany z20. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Wytyczne dotyczące raportowania TRN. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodą najczęściej stosowaną do pomiaru TL w większych badaniach populacyjnych przed 2002 r. była analiza Southern blot końcowych długości fragmentów restrykcyjnych (TRF)24,25. TRF, pomimo doskonałej precyzji i odtwarzalności w specjalistycznych laboratoriach, ma ograniczoną możliwość zastosowania ze względu na ilość i jakość wymaganego DNA oraz ograniczoną przepustowość, zapewniając w ten sposób tło dla zwiększonego wykorzystania testów TL opartych na qPCR, a następnie testu MMqPCR. Metoda MMqPCR TL zapewnia powtarzalny pomiar TL po skonfigurowaniu, optymalizacji i konserwacji z uwagą poświęconą każdemu kryteriom kontroli jakości. Obliczanie i raportowanie specyficznego ICC dla każdej analizowanej kohorty jest wymagane w celu zapewnienia wiarygodności testu. Chociaż metoda MMqPCR zależy od jakości DNA i wiedzy technicznej, dobrze nadaje się do dużych badań populacyjnych badających TL, ponieważ wymaga niewielkich ilości DNA, jest bardziej niezawodna niż PCR singleplex i jest bardziej wydajna pod względem kosztów odczynników i czasu techników niż inne metody. Zdolność do generowania wysokich ICC dostarcza dodatkowych danych wspierających zastosowanie MMqPCR w dużych badaniach populacyjnych TL. Pomiar MMqPCR TL może być stosowany w szerokim zakresie badań mających na celu określenie roli TL jako biomarkera śmiertelności z jakiejkolwiek przyczyny, starzenia się, stresu w ciągu życia, narażenia środowiskowego i wyników zdrowia fizycznego, takich jak choroby układu krążenia i nowotwory 4,7,8,10,11,12,13,26,27,28, 29,30,31.

Jednym z ograniczeń metody MMqPCR jest to, że podaje ona TL jako stosunek T/S, względne oszacowanie długości, które różni się w zależności od wyboru pojedynczej kopii genu, składu mieszanki głównej i parametrów cyklicznych PCR32. Stosunek T/S jest niejednostkowy. W związku z tym, bez połączenia z innymi metodologiami pomiaru TL, metoda ta nie jest w stanie podać oszacowań w wartościach par podstawowych 18,33,34. W rezultacie, stosunek T/S musi zostać przekształcony w Z-score, aby miał znaczenie we wszystkich badaniach35. Należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania tej czynności w różnych laboratoriach, metodach i testach. Ponadto metoda ta, podobnie jak w przypadku testów hybrydyzacji na bazie żelu, może obejmować kwantyfikację telomerów śródmiąższowych. Jednak sekwencje te stanowią bardzo małą część całkowitej zawartości telomerów DNA na genom. Ponadto śródmiąższowe sekwencje telomerowe z większym prawdopodobieństwem zawierają niedopasowane sekwencje par zasad, które odbiegają od kanonicznych powtórzeń telomerów, zmniejszając prawdopodobieństwo wiązania i amplifikacji starterów. Ponadto, chociaż minimalna ilość DNA potrzebna do testu MMqPCR jest korzystna, ważne jest, aby zauważyć, że na pomiary TL oparte na qPCR mają wpływ czynniki przedanalityczne wpływające na jakość i integralność DNA, w tym warunki przechowywania próbki, metodologia ekstrakcji DNA i tkanka biologiczna 36,37. Wykazano, że kontrola analityczna tych czynników może zwiększyć zewnętrzną trafność pomiarów TL wygenerowanych za pomocą qPCR38. Mimo to wpływ różnic w jakości DNA na TL generowany za pomocą testu MMqPCR musi być w szczególności systematycznie oceniany, ponieważ nie istnieją obecnie żadne wytyczne oparte na danych, które pozwoliłyby określić, czy próbka jest wystarczającej jakości, aby wygenerować dokładne oszacowanie TL przy użyciu tego podejścia. Pomimo tych ograniczeń zastosowania tego testu w badaniach nad wynikami zdrowotnymi na poziomie populacji są znaczące.

W przypadku korzystania z testu MMqPCR konieczna jest ciągła ocena precyzji i przepustowości. Zgodnie z obecnymi założeniami, technicy przeprowadzają jednocześnie potrójne pobieranie próbek na zduplikowanych płytkach za pomocą dwóch termocyklerów. W przypadku braku wielu termocyklerów zalecamy zachowanie zduplikowanych pomiarów i sekwencyjne uruchamianie płyt w celu zwiększenia precyzji, nawet kosztem zmniejszonej przepustowości. Każda decyzja o nadaniu priorytetu przepustowości nad precyzją, na przykład poprzez zastosowanie pojedynczych potrójnych pomiarów, powinna być poprzedzona dokładnym testowaniem i oceną otrzymanych ICC przed przystąpieniem do analizy próbek analitycznych. Podejmując decyzje dotyczące przepustowości i precyzji, należy wziąć pod uwagę wielkość próbki i jakość próbki DNA. Mniejszy rozmiar próbki lub próbki DNA niskiej jakości wymagają priorytetowego traktowania większej precyzji23. Ma to jeszcze większe znaczenie podczas pracy z próbkami z powiązanych grup (np. członków rodziny, osób z wieloma punktami czasowymi). W takich przypadkach staranne planowanie, na przykład przypisanie powiązanych próbek do tej samej płytki przed rozpoczęciem eksperymentu, jest jednym ze sposobów zapobiegania utracie mocy statystycznej w wyniku niezamierzonego pomieszania grupy po płytce.

Do tego testu użyto spektrofotometru do oceny jakości próbki DNA: próbki w zakresie 1,6-2,0 dla proporcji 260/280 i 2,0-2,2 dla proporcji 260/230 uznano za dopuszczalne. Ta ocena jakości i dokładna ocena dwuniciowego DNA za pomocą fluorometru są krytycznymi krokami w tym protokole w celu uzyskania powtarzalnych danych TL. Inne, bardziej opisowe miary integralności DNA, takie jak wielkość fragmentu i/lub sumarczne miary jakości DNA określone za pomocą żelu agarozowego (np. liczba integralności DNA) mogą być również wykorzystane do określenia jakości próbki38. Zalecamy również, aby rozcieńczanie próbek następowało tylko w momencie przygotowania próbki do przeprowadzenia testu MMqPCR. Gwarantuje to, że podwielokrotności DNA są poddawane jak najmniejszej ilości manipulacji po ekstrakcji, co zmniejsza zmienność w postępowaniu przed testem. W przypadku konieczności transportu próbek DNA, należy je przewozić w suchym lodzie w najwyższym możliwym stężeniu, aby złagodzić degradację zachodzącą w próbkach DNA przy niższych stężeniach39,40. Ze względu na degradację DNA, która zachodzi w cyklach zamrażania i rozmrażania, liczba zamrażania i rozmrażania w celu zaopatrzenia DNA powinna być zminimalizowana41. Podwielokrotności zbiorczego kontrolnego DNA należy utworzyć przed uruchomieniem kohorty, a podwielokrotności poszczególnych analitycznych próbek DNA należy utworzyć przed przeprowadzeniem testu.

Kluczowe wskaźniki wydajności testu i kontroli jakości obejmują sygnał NTC, CV międzypłytkowe i wewnątrzpłytkowe oraz krzywą wzorcową R2. Niespełnienie kryteriów kontroli jakości można złagodzić na kilka sposobów. Regularna zmiana zapasów PCR klasyH2Oi porcjowanie podzapasów PCR klasyH2Odla każdej pary płytek zminimalizuje źródła zanieczyszczeń, a także amplifikację NTC. Dodatkowe kroki mające na celu zmniejszenie zanieczyszczenia obejmują: wyznaczenie specjalnego kaptura PCR dedykowanego tylko do testu MMqPCR; przetarcie kaptura i sprzętu do PCR roztworem odkażającym DNA; naświetlanie pomieszczenia światłem ultrafioletowym; i ćwiczenie sterylnej techniki w kapturze PCR. Aby zwiększyć powtarzalność testu i zmniejszyć CV, zaleca się energiczne wirowanie próbek, rozcieńczeń i pasków PCR na odpowiednich etapach wirowania i dokładne ponowne zawieszenie podczas pipetowania próbek DNA. Poniżej progowej wzorcowej krzywej R2 (<0,995) można najprawdopodobniej przypisać błędom pipetowania podczas ładowania płytek. Aby tego uniknąć, należy zwracać szczególną uwagę na precyzyjne pipetowanie i kalibrować pipety raz w roku, energicznie mieszać standardowe paski PCR przed załadowaniem i starannie organizować materiały eksploatacyjne, aby promować wydajny przepływ pracy. Jeśli zaobserwuje się, że przy użyciu dwóch obrabiarek i jednej płyty zaobserwowano, że stale osiągają wyższe CV, maszyna powinna być serwisowana jako potencjalny sposób na rozwiązanie problemu. Płytki kontroli jakości od producenta powinny być regularnie uruchamiane na płytach w celu oceny wydajności termocyklera.

Jeśli problemy nie ustąpią nawet po zastosowaniu kroków zalecanych powyżej, poniższe kroki można wykonać w celu rozwiązania problemu z protokołem. Prowadzenie rejestru tego, kiedy wszystkie odczynniki zostały poddane porcjowaniu i wszelkich istotnych dat ważności, może pomóc usprawnić proces rozwiązywania problemów, gdy nieuchronnie pojawią się trudności. Ważną częścią każdego procesu rozwiązywania problemów jest dostosowanie tylko jednego odczynnika na raz w celu określenia konkretnej przyczyny niespełniających kryteriów kontroli jakości, zaczynając od najtańszego odczynnika, o którym mowa. Na przykład, jeśli zarówno telomer, jak i gen z pojedynczą kopią mają niską wydajność, bardziej prawdopodobną przyczyną są wspólne odczynniki, takie jak DTT, dNTP lub podwielokrotność SYBR niż startery specyficzne dla amplikonu. Przy podanej cenie nowe porcje powinny być testowane w kolejności DTT, następnie dNTP, a na końcu, jeśli problem nadal występuje, nowe podwielokrotności SYBR. I odwrotnie, jeśli tylko jeden z amplikonów (telomer lub pojedyncza kopia genu) ma niską wydajność, przyczyną trudności jest najprawdopodobniej jeden ze starterów. Interpretacja pików krzywej topnienia przedstawiona na rysunku 8 może służyć jako źródło kluczowych informacji na potrzeby rozwiązywania problemów. Wizualizacja dwóch pików krzywej topnienia może być wykorzystana do zidentyfikowania potencjalnych problemów z konkretną próbką, ponieważ pojedyncza próbka problemowa będzie wyróżniać się na tle ogólnego trendu pików wykazywanych przez wzorce lub pozostałe próbki analityczne. Krzywa topnienia może być również wykorzystana do zdiagnozowania problemów z konkretnym starterem, jeśli piki dla danego amplikonu są systematycznie mniej ostre niż dla drugiego.

W tym manuskrypcie szczegółowo opisano, jak skutecznie skonfigurować test MMqPCR do pomiaru TL o szerokim zastosowaniu w badaniach nad zdrowiem publicznym oraz przedstawiono kluczowe zalecenia dotyczące kontroli jakości i rozwiązywania problemów w celu zwiększenia dostępności i niezawodności tej wydajnej i opłacalnej metody.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Komitetowi Doradczemu Sieci Badawczej Telomerów oraz funduszom National Institute on Aging / National Institute of Environmental Health Sciences (U24 AG066528 i U24 AG066528-S1), które umożliwiły wykonanie tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 0,5 mlUSA Scientific1605-0099Seal-Rite 0,5 ml Probówki mikrowirówkowe, sterylne
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Probówki 1,5 mlUSA Scientific1615-5599Seal-Rite 1,5 ml Probówki do mikrowirówek, sterylne
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
100mM DTTIn HouseNie dotyczyWykonane z zapasu DTT, rozcieńczonego octanu sodu i klasy PCR H2O
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C 
Probówki 15 mlThermo Fisher14-959-53ACorning 352196 Falcon 15 ml stożkowe probówki wirówkowe
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
1M MgCl2Thermo Fisher50152107Biotang Inc 1M MgCl2 1M roztwór chlorku magnezu, przygotowany w wodzie 18,2 megaomów i przefiltrowany przez filtr 0,22 mikrona
Temperatura i warunki przechowywania: 4 & stopnie; C 
1x Złoty buforw domuNie dotyczy10X Złoty bufor rozcieńczony PCR klasy H2O
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 & stopni; C 
25mM dNTPsNew England BioLabsN0446SZestaw roztworów deoksynukleotydowych
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C 
Probówki 5 mlTermo Fisher3391276Argos Technologies Probówki do mikrowirówek – 5mL
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
96-dołkowa płytkaBio-RadHSP960196-dołkowe płytki PCR z twardą skorupą, niskoprofilowe, cienkościenne, listwowe, białe / przezroczyste
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Folia aluminiowa OfficeDepot3489072Reynolds Wrap Stanard Rolka folii aluminiowej, 12" x 75', srebrna
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
AmpliTaq Gold Kit – Polimeraza i buforThermo Fisher4311806AmpliTaq Gold DNA Polymerase z Gold Buffer i MgCl2 (MgCl2 w tym zestawie nie jest używany), 10X Gold Buffer, 2.5U AmpliTaq Gold Polymerase
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C 
BetainaThermo FisherAAJ77507ABBetaina, 5M Solution, klasa biologii molekularnej, ultraczysta, 10mL
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C 
Big Tube RackThermo Fisher344817Fisherbrand 4-drożny stojak na tuby
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Oprogramowanie CFX MaestroBio-Rad12004110Oprogramowanie do konfiguracji płytki PCR w czasie rzeczywistym, zbierania danych, statystyk i tworzenia wykresów wyników
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Moduł reakcji optycznej CFX96 do systemów PCR w czasie rzeczywistym z pakietem startowymBio-Rad184509696-dołkowy moduł optyczny do PCR
w czasie rzeczywistym Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
DTTFisher ScientificAAJ1539706Ditiothreitol, >99.5+ Klasa biologii molekularnej, 5 g
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C 
ELIMINaseFisher Scientific04-355-32ELIMINase Laboratory Deminmin
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Filtr HEPAUSA ScientificFiltry zamienneWysokowydajny filtr cząstek stałych do stacji roboczych AirClean
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
KimwipesThermo Fisher06666AKimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki zadaniowe, 1-warstwowe
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Koryto załadowczeThermo Fisher14387069Thermo Scientific Matrix Zbiorniki odczynników
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Microsoft ExcelMicrosoftNie dotyczyPakiet Microsoft 365, aplikacja Excel
Temperatura i warunki przechowywania:
Mini wirówkaGenesee Scientific31-500BMini wirówka Poseidon 31-500B, niebieska pokrywka
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
PCR klasy H2OThermo FisherAM9937Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
PCR HoodUSA Scientific4263-2588Stacja robocza z kwasami nukleinowymi z filtracją HEPA, systemy AirClean Kombinowana stacja robocza PCR
Temperatura i warunki przechowywania: Paski PCR o temperaturze pokojowej
Thermo FisherAB0776Niskoprofilowe probówki i płaskie nakrętki, paski 8
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Stojak na probówki do PCRThermo Fisher344820Fisherbrand 96-dołkowy stojak na probówki do PCR
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Końcówki do pipet (wielokanałowe)Ranin17005860Końcówki do pipet SR LTS 20µ L F 960A/5, 20&mikro; L Maksymalna
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Końcówki do pipet (jednokanałowe)USA Scientific1181-385010µ L Końcówki filtra TipOne RPT z podziałką
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Końcówki do pipet (jednokanałowe)USA Scientific1180-185020µ L Skośne końcówki filtra TipOne RPT
Temperatura i warunki przechowywania: Końcówki
(jednokanałowe)USA Scientific1111-0880200µ l Naturalne końcówki do pipet TipOne w stojakach
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Końcówki do pipet (jednokanałowe)USA Scientific1111-28901000µ l Naturalne końcówki do pipet TipOne z podziałką w stojakach
Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej
(wielokanałowe)PipetyRanin17013802Pipet-Lite L8-10XLS, 0,5 do 10 i mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej
(wielokanałowe)PipetyRanin17013803Pipet-Lite L8-20LS+, od 2 do 20 mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej
(jednokanałowe)Pipety Thermo FisherF144802GGilson Pipetman Classic, od 1 do 10 i mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej
(jednokanałowe)Pipety Thermo FisherF123600Gilson Pipetman Classic, od 2 do 20 i mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej
(jednokanałowe)Pipety Thermo FisherF123601Gilson Pipetman Classic, od 20 do 200 i mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Pipettory do temperatury pokojowej
(jednokanałowe)Pipety Thermo FisherF123602Gilson Pipetman Classic, od 200 do 1000 mikro; L
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Folia uszczelniająca do płytBio-RadMSB1001Microseal " B” Folia uszczelniająca do płytek PCR, klej, optyczna
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Wirówka płytkowaThermo Fisher14-100-141Fisherbrand Mini wirówka do płytek, 230 V
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Filtr wstępnyUSA Scientific4235-3724Filtr wstępny do systemów AirClean Stacje robocze
Temperatura i warunki przechowywania: Pomieszczenie temperatura
Oprogramowanie RProjekt R do obliczeń statystycznychNie dotyczyWersja R 4.2.2
Temperatura i warunki przechowywania: Skala temperatury pokojowej
Thermo Fisher01-922-329Waga analityczna OHAUS 30430060 serii PR, pojemność 62g
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
NożyczkiOffice Depot458612Nożyczki marki Office Depot, 8 ", proste, czarne, opakowanie 2
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
SharpiesSharpie2151734Brush Twin Markery permanentne,
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Single Copy Gene Forward PrimerZintegrowane technologie DNANiestandardowePatrz oddzielna tabela
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C po ponownym uwodnieniu
Pojedynczy kopiujący gen Odwrotny starterZintegrowane technologie DNA NiestandardowePatrz oddzielna tabela
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C po nawodnieniu
Mały stojak na probówkiThermo Fisher21-402-17Thermo Fisher 8601 Odwracalne stojaki na mikroprobówki z pokrywą
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Octan soduThermo FisherJ63560. EQE3M NaOAc pH 5,2
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Szpatułka ze stali nierdzewnejThermo Fisher3990240Bel-Art SP Scienceware Łyżka do pobierania próbek ze stali nierdzewnej i szpatułka
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
SYBR GreenThermo FisherS7563SYBR Green I Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym – 10 000X Koncentrat w DMSO
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C po ponownym uwodnieniu
Filtry strzykawkoweFisher Scientific09-927-55AGD/X 25 mm Sterylny filtr strzykawkowy, medium filtracyjne z octanu celulozy, 0,2 i mu; m
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
StrzykawkiThermo Fisher148232ABD Luer-Lok Jednorazowe strzykawki bez igieł, 10mL
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
TE BufferFisher ScientificBP2474100TE Buffer, Tris-EDTA, 1X roztwór, pH 7,6, Biologia molekularna, Fisher BioReagents
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Telomere Forward PrimerZintegrowane technologie DNANiestandardoweZobacz oddzielną tabelę
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C po uwodnieniu
Odwrócony podkład telomerówZintegrowane technologie DNANiestandardowePatrz oddzielna tabela
Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 ° C po ponownym nawodnieniu
ŻarówkaLight USA Scientific4288-2540do stacji roboczych
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
VortexThermo Fisher14-955-151Fisherbrand Mini Vortex Mixer, 115 V, 50/60 Hz
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Waż łódźThermo Fisher01-549-752Sterylna sześciokątna łódka wagowa Fisherbrand, 10 mL
Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
w temperaturze pokojowej do pipet w temperaturze pokojowej wielofunkcyjne wielofunkcyjne UV

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability. Cell. 107 (1), 67-77 (2001).
  2. Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. The role of telomere biology in cancer. Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).
  3. Lindrose, A., Drury, S. Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement. Telomere Research Network. , (2020).
  4. Verhulst, S., et al. Commentary: The reliability of telomere length measurements. Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).
  5. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).
  6. Mundstock, E., et al. Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis. Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).
  7. Haycock, P. C., et al. Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis. BMJ. 349, 4227(2014).
  8. Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis. Environ Res. 158, 480-489 (2017).
  9. Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. Depression and telomere length: A meta-analysis. J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).
  10. Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis. Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).
  11. Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis. Andrologia. 51 (7), e13304(2019).
  12. Schneider, C. V., et al. Association of telomere length with risk of disease and mortality. JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).
  13. Deng, Y., et al. Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study. Front Cardiovasc Med. 9, 1012615(2022).
  14. D'mello, M. J., et al. Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis. Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).
  15. Wilbourn, R. V., et al. The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447(2018).
  16. Gardner, M., et al. Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis. Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).
  17. Lai, T. -P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451(2018).
  18. Cawthon, R. Telomere measurement by quatitative pcr. Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).
  19. Cawthon, R. M. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method. Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).
  20. Lindrose, A. R., et al. Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature. PLoS One. 16 (1), e0245582(2021).
  21. Lin, J., et al. Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement - a multi-lab impartial study. bioRxiv. , (2022).
  22. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  23. Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting. Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
  24. Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
  25. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  26. Ye, Q., et al. Telomere length and chronological age across the human lifespan: A systematic review and meta-analysis of 414 study samples including 743,019 individuals. Ageing Res Rev. 90, 102031(2023).
  27. Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence. J Vis Exp. (75), e50246(2013).
  28. Liu, M., et al. Immune-mediated inflammatory diseases and leukocyte telomere length: A mendelian randomization study. Front Genetics. 14, 1129247(2023).
  29. Van Ockenburg, S., et al. Stressful life events and leukocyte telomere attrition in adulthood: A prospective population-based cohort study. Psychol Med. 45 (14), 2975-2984 (2015).
  30. Zong, Z. Q., et al. Ambient air pollution exposure and telomere length: A systematic review and meta-analysis. Public Health. 215, 42-55 (2023).
  31. Tang, L., Li, D., Wang, J., Su, B., Tian, Y. Ambient air pollution, genetic risk and telomere length in uk biobank. J Expo Sci Environ Epidemiol. , (2023).
  32. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1), 59-67 (2012).
  33. Lin, J., et al. Systematic and cell type-specific telomere length changes in subsets of lymphocytes. J Immunol Res. 2016, 5371050(2016).
  34. Needham, B. L., et al. Socioeconomic status, health behavior, and leukocyte telomere length in the national health and nutrition examination survey, 1999-2002. Soc Sci Med. 85, 1-8 (2013).
  35. Verhulst, S. Improving comparability between qpcr-based telomere studies. Mol Ecol Res. 20 (1), 11-13 (2020).
  36. Dagnall, C. L., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PloS one. 12 (9), e0184098(2017).
  37. Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., Drury, S. Telomere length measurement by qpcr-summary of critical factors and recommendations for assay design. Psychoneuroendocrinology. 99, 271-278 (2019).
  38. Wolf, S. E., et al. Cross-tissue comparison of telomere length and quality metrics of DNA among individuals aged 8 to 70 years. PLOS One. 19 (2), e0290918(2024).
  39. RoDer, B., FruHwirth, K., Vogl, C., Wagner, M., Rossmanith, P. Impact of long-term storage on stability of standard DNA for nucleic acid-based methods. J Clin Microbiol. 48 (11), 4260-4262 (2010).
  40. Dagnall, C., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PLoS One. 12 (9), e0184098(2017).
  41. Shao, W., Khin, S., Kopp, W. C. Characterization of effect of repeated freeze and thaw cycles on stability of genomic DNA using pulsed field gel electrophoresis. Biopreserv Biobank. 10 (1), 4-11 (2012).
  42. Institute for Statistics and Mathematics of WU. The Comprehensive R Archive Network. , Available from: https://cran.r-project.org/ (2024).
  43. Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biol Rev. 85 (4), 935-956 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

monochromatyczny PCR multipleksowypomiar telomer wtest MMqPCRmonocyty krwi obwodowejSYBR Greenkrzywa wzorcowapowt rzenie technicznekontrola jako ci p ytki

Powiązane artykuły