Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66562

⸱

23 lutego 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Neuroscience Research Institute, Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California Santa Barbara, 3Photothermal Spectroscopy Corp., 4School of Biological Sciences, University of Southampton, 5Department of Electrical & Computer Engineering, Photonics Center, Boston University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Streszczenie

Zrozumienie aktywności metabolicznej poszczególnych komórek w złożonych społecznościach jest kluczowe dla odkrycia ich roli w chorobach ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół jednoczesnej identyfikacji komórek i analizy metabolicznej za pomocą platformy OPTIR-FISH poprzez połączenie sond FISH znakowanych rRNA i substratów znakowanych izotopowo. Obrazowanie fluorescencyjne zapewnia identyfikację komórek poprzez specyficzne wiązanie sond FISH znakowanych rRNA, podczas gdy obrazowanie OPTIR zapewnia aktywność metaboliczną w pojedynczych komórkach poprzez indukowane izotopem przesunięcie ku czerwieni w widmach OPTIR. Wykorzystując bakterie hodowane z 13C-glukozą jako stanowisko testowe, protokół przedstawia hodowlę drobnoustrojów z znakowaniem izotopowym, fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH), przygotowanie próbki, optymalizację konfiguracji obrazowania OPTIR-FISH i pozyskiwanie danych. Pokazujemy również, jak przeprowadzać analizę obrazu i interpretować dane spektralne na poziomie pojedynczej komórki z dużą przepustowością. Ustandaryzowany i szczegółowy charakter tego protokołu znacznie ułatwi jego przyjęcie przez naukowców z różnych środowisk i dyscyplin w ramach szerokiej społeczności badawczej zajmującej się metabolizmem pojedynczych komórek.

Wprowadzenie

Metabolizm komórkowy stanowi fundamentalny filar biologii komórki, kierując wieloma procesami, które decydują o zdrowiu, funkcjonowaniu i interakcji komórki ze środowiskiem. Analiza metabolizmu na poziomie poszczególnych komórek, szczególnie w środowisku natywnym, dostarcza bezcennych informacji, które pozwalają ujawnić heterogeniczne i złożone działania w systemach biologicznych1. Jest to szczególnie ważne w badaniach nad mikroorganizmami, ponieważ wiele mikroorganizmów wykazuje unikalne wymagania dotyczące wzrostu lub zależności środowiskowe, które stanowią wyzwanie dla tradycyjnych metod uprawy2. Na przykład, niektóre gatunki mogą wymagać określonych kompozycji składników odżywczych lub symbiotycznych relacji, które nie są łatwe do odtworzenia w warunkach laboratoryjnych, co sprawia, że nie nadają się do hodowli za pomocą standardowych technik3. Ponadto wydłużone okresy potrzebne do uprawy niektórych gatunków stanowią poważne wyzwanie dla badań mikrobiologicznych, często wykraczające poza praktyczne ramy czasowe przeznaczone na badania i analizy. Aby obejść te ograniczenia, alternatywne metody, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), pozwalają na identyfikację gatunków drobnoustrojów bez konieczności uprawy4, co pozwala uzyskać dokładniejszy i bardziej holistyczny obraz ekosystemów mikrobiologicznych. Jednak te technologie analityczne nie są w stanie wyjaśnić metabolizmu komórkowego. Luka ta uwypukla bieżące wyzwania w dziedzinie mikrobiologii: równoległe zadanie różnicowania tożsamości komórkowej i wyjaśniania metabolizmu na poziomie pojedynczej komórki. Postępy w technikach, takich jak obrazowanie spektrometrii mas (IMS) w połączeniu ze stabilnymi izotopami, stały się potężnymi narzędziami do analizy metabolicznej pojedynczych komórek5. W tych eksperymentach komórki inkubowano z substratami zawierającymi izotopy, takie jak 13C lub 15N. Nowo anabolizowane biomolekuły przenoszą te izotopy, dzięki czemu można je odróżnić w widmach m/z. Jednak IMS cierpi z powodu drogiego oprzyrządowania, skomplikowanego przygotowania próbek, stosunkowo niskiej przepustowości i wiedzy specjalistycznej wymaganej do analizy widm m/z. W połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym specyficznym dla markerów molekularnych, poczyniono postępy w wyjaśnianiu metabolizmu komórkowego ze zwiększoną swoistością6. Niemniej jednak nadal istnieją wyzwania związane z połączeniem tych dwóch modalności. Różnica w rozdzielczości między IMS a obrazowaniem fluorescencyjnym, w połączeniu z różnymi konfiguracjami operacyjnymi, utrudnia wyrównanie i skorelowanie wyników7.

Integracja obrazowania spektroskopowego wibracyjnego z znakowaniem stabilnych izotopów oferuje nowatorskie rozwiązanie do badania metabolizmu pojedynczych komórek. Włączenie cięższych izotopów spowalnia wibracje wiązań chemicznych, prowadząc do przesuniętych ku czerwieni pików w widmach oscylacyjnych8. Warto zauważyć, że obrazowanie wibracyjne zapewnia rozdzielczość przestrzenną porównywalną z obrazowaniem fluorescencyjnym, a zarówno kwantyfikację metaboliczną, jak i identyfikację komórek można przeprowadzić w jednym ustawieniu, upraszczając rejestrację i korelację obrazu. Nasze ostatnie prace wykazały połączenie zaawansowanej platformy obrazowania wibracyjnego: optycznej fototermicznej podczerwieni (OPTIR) z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu zbadania metabolizmu glukozy w społecznościach bakteryjnych9 (Rysunek 1). OPTIR to wibracyjny system spektroskopowy mikroskopowy, który wykorzystuje efekt fototermiczny absorpcji w średniej podczerwieni poprzez wykrywanie zmiany światła widzialnego, co zapewnia rozdzielczość submikrometrową, jak w mikroskopii optycznej, ale z dodatkowymi informacjami spektroskopowymi drgań pochodzącymi z absorpcji w średniej podczerwieni. FISH jest powszechnie stosowaną techniką określania tożsamości mikroorganizmów na poziomie pojedynczej komórki. Sekwencję oligonukleotydów można zaprojektować tak, aby celowała w określone sekwencje 16S różnych taksonów i można do niej dołączyć różne fluorofory. Specyficzna hybrydyzacja zaprojektowanych sond oligonukleotydowych z docelowym rRNA prowadzi do silnych sygnałów fluorescencyjnych gatunków docelowych w poszczególnych komórkach, a wielokanałowe obrazowanie fluorescencyjne może być wykonane w celu identyfikacji wielu gatunków w populacji. Ponieważ zarówno OPTIR, jak i obrazowanie fluorescencyjne opierają się na detekcji optycznej, połączenie fluorescencji OPTIR i FISH jest proste do wdrożenia. Obie metody mają tę samą rozdzielczość optyczną do analizy pojedynczej komórki i można je wygodnie przełączać bez konieczności dodatkowego wyrównywania lub korejestracji.

Ten protokół przedstawia szczegółowy przewodnik po wykorzystaniu platformy OPTIR-FISH do zaawansowanej analizy funkcji struktury pojedynczej komórki. Wykorzystaliśmy próbki bakteryjne wyhodowane w pożywkach zawierających 13C-glukozy jako stanowisko testowe i określiliśmy ilościowo syntezę białek de novo z 13C-glukozy. Aby zademonstrować zdolność platformy do identyfikacji komórek, wykorzystaliśmy mieszanki bakteryjne, w których każdy gatunek został znakowany za pomocą sond FISH ukierunkowanych na rRNA. Podejście to ułatwiło precyzyjną identyfikację pojedynczych komórek określonych szczepów bakterii, takich jak Escherichia coli (E. coli) i Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), oraz ich metabolizm. Protokół ten oferuje naukowcom potężne narzędzie do jednoczesnego profilowania metabolicznego i identyfikacji gatunków na poziomie pojedynczej komórki, obiecując pogłębienie naszej wiedzy na temat interakcji komórkowych, fizjologii i ich roli w złożonych środowiskach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użycie próbek bakteryjnych w tym badaniu jest zgodne z wytycznymi Institutional Review Board (IRB) Uniwersytetu Bostońskiego i National Institute of Health.

UWAGA: Ogólny przebieg pracy stosowany w tym protokole jest podsumowany w Rysunek 2.

1. Hodowla bakterii i znakowanie izotopów (Rysunek 2A)

UWAGA: Podany tutaj przykład służy do oznaczania czystej kultury bakteryjnej. W przypadku stosowania niniejszego protokołu do zbiorowisk wielodrobnoustrojowych, pożywka i czas etykietowania muszą być dostosowane do społeczności i fizjologii organizmów będących przedmiotem zainteresowania.

  1. Zaszczepij interesujący nas szczep bakteryjny z pojedynczej kolonii i kultury wstępnej w pożywce bogatej w składniki odżywcze, takie jak bulion sojowy tryptyczny (TSB) lub bulion Luria-Bertani (LB) przez 3 godziny, aby osiągnąć fazę wzrostu wykładniczego (logarytmiczną). Bakteria E. coli BW25113 jest używany jako przykładowy szczep w tym protokole.
    UWAGA: Czas osiągnięcia fazy logarytmicznej będzie się różnić w zależności od używanego szczepu. Czas ten należy dostosować do każdego szczepu.
  2. Zmierz gęstość optyczną przy 600 nm, aby oszacować stężenie bakterii.
  3. Przygotować minimalną pożywkę wzrostową uzupełnioną substratami znakowanymi izotopowo. W przypadku BW25113 E. coli należy uzupełnić minimalną pożywkę M9 o 13C-glukozy w końcowym stężeniu 0,2% (w/v).
    UWAGA: Zastosowana 13C-glukoza (D-glukoza U−13C6, 99%) została uniwersalnie oznaczona, gdzie wszystkie atomy węgla zastąpiono 13atomami C. Wybór minimalnej pożywki będzie zależał od szczepu bakteryjnego. Wybór substratu izotopowego będzie zależał od konkretnego procesu metabolicznego, który jest przedmiotem zainteresowania. Ogólnym celem jest, aby substrat izotopowy służył jako główne źródło pożywienia w porównaniu z ich nieznakowanymi odpowiednikami.
  4. Rozcieńczyć bakterie w minimalnej pożywce wzrostowej zawierającej izotopowo znakowany substrat do końcowego stężenia 5 × 105 CFU/mL.
    UWAGA: Zwykle stosuje się wysoki współczynnik rozcieńczenia, taki jak 1:100, a nieznakowane składniki odżywcze z bogatego podłoża stają się znikome. Alternatywnie, aby zapewnić całkowite usunięcie pożywki bogatej w składniki odżywcze, można przeprowadzić płukanie solą fizjologiczną buforowaną 1 x fosforanem (PBS) przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponowne zawieszenie w PBS, a następnie drugie odwirowanie i końcowe ponowne zawieszenie w minimalnym podłożu wzrostowym.
  5. Hoduj próbki bakterii w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym w optymalnych warunkach wzrostu. Ogólnie rzecz biorąc, ustawić inkubator z wytrząsaniem orbitalnym na prędkość 220 obr./min i temperaturę 37 °C, a następnie umieścić probówki hodowlane przechylone luźną nasadką do inkubacji tlenowej. W przypadku E. coli 24 godziny inkubacji tlenowej w temperaturze 37 °C zwykle wystarczają, aby osiągnąć maksymalne oznakowanie 13C.
    UWAGA: Czas inkubacji zależy od interesującego nas procesu metabolicznego. Dłuższy czas inkubacji na ogół prowadzi do wyższego znakowania izotopowego. Pomiar krzywej wzrostu w tych samych warunkach z nieoznakowanym substratem może dostarczyć informacji na temat określenia odpowiednich punktów czasowych zbierania.
  6. Zebrać komórki bakteryjne w żądanych punktach czasowych przez odwirowanie w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w równej objętości 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS. Utrwalić komórki w roztworze PFA na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) lub 2 godziny w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy dwukrotnie umyć komórki PBS, ponownie zawiesić komórki w 1 ml 50% (v/v) PBS i 96% etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

2. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) (Rysunek 2B)

  1. Hybrydyzuj komórki E. coli za pomocą sondy oligonukleotydowej Gam42a10 znakowanej fluoroforem cyjaniny5 (Cy5) (Gam42a-Cy5) i komórek B. theta za pomocą klasy Bac30311 sondy oligonukleotydowej znakowanej fluoroforem cyjanininy3 (Cy3) (Bac303-Cy3), zgodnie ze standardowym protokołem FISH.
    UWAGA: Podstawy rRNA-FISH do identyfikacji: cząsteczki rRNA są idealnymi celami dla FISH, ponieważ są wszechobecne i naturalnie amplifikowane w komórkach drobnoustrojów. rRNA zawiera również zarówno konserwatywne, jak i zmienne regiony sekwencji, dzięki czemu głębia filogenetyczna grupy docelowej może być określona na podstawie stopnia zachowania sondy oligonukleotydowej. Poprzez specyficzne wiązanie zaprojektowanej sondy z sekwencją docelową, znakowany fluorofor pokazuje sygnały fluorescencyjne dla poszczególnych komórek.
  2. Zapoznaj się z wcześniej opublikowaną literaturą12,13,14 w celu uzyskania szczegółowego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Poniższe kroki pokrótce opisują standardowy protokół dla komórek drobnoustrojów.
    1. odwodnienie:
      1. Odwirować stałe komórki (100 μl) przy 14 000 x g przez 10 minut w celu osadzania, ponownie zawiesić w 100 μl 96% etanolu o czystości analitycznej i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
      2. Następnie ponownie odwirować komórki przy 14 000 x g przez 5 minut, usunąć etanol i pozostawić osad komórek do wyschnięcia na powietrzu.
    2. Hybrydyzacja: Hybrydyzować komórki w roztworze (100 μl) przez 3 godziny w temperaturze 46 °C.
      UWAGA: Bufor hybrydyzacyjny składa się z 900 mM NaCl, 20 mM HCl tris-(hydroksymetylo)-aminometanu, 1 mM kwasu tetraoctowego etylenodiaminy, 0,01% dodecylosiarczanu sodu, 100 ng odpowiedniego znakowanego fluorescencyjnie oligonukleotydu i wymaganego stężenia formamidu w celu uzyskania rygorystycznych warunków.
    3. Wirówka: Natychmiast po hybrydyzacji przenieść próbki do wirówki z wirnikiem podgrzanym do temperatury 46 °C i wirować przy 14 000 x g przez 15 minut w maksymalnej dopuszczalnej temperaturze (zwykle 40 °C).
    4. Myć i przechowywać:
      1. Próbki przemywać w buforze o odpowiedniej rygorystyczności przez 15 minut w temperaturze 48 °C. Następnie odwirować komórki przy 14 000 x g przez 15 minut w maksymalnej dopuszczalnej temperaturze w wirówce z wirnikiem podgrzanym do 46 °C.
      2. Na koniec umyj komórki 500 μl lodowatego PBS, ponownie zawieś je w 20 μl 1x PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.
        UWAGA: Specyficzne wiązanie sondy jest zapewnione przez prawidłową rygorystyczność hybrydyzacji. Wysoką rygorystyczność można osiągnąć poprzez zwiększenie temperatury hybrydyzacji, zmniejszenie stężenia soli lub dodanie denaturantu formamidu. Interferencje formamidu z wiązaniami wodorowymi, które stabilizują dupleksy kwasów nukleinowych. W tym przypadku temperatura i stężenie soli nie są modyfikowane podczas hybrydyzacji podczas dostrajania stężenia formamidu. Optymalne stężenie formamidu dla nowo zaprojektowanych sond jest określane eksperymentalnie za pomocą krzywych dysocjacji formamidu10. Wymagane stężenie formamidu dla opublikowanych sond można znaleźć w probeBase15 lub poprzez wyszukiwanie w literaturze. Alternatywnie, przewidywane stężenia formamidu można uzyskać z analizy in-silico przy użyciu mathFISH16. Na etapie prania nieco wyższa temperatura prowadzi do nieco bardziej rygorystycznych warunków, co prowadzi do wyższej specyficzności wiązania.

3. Przygotowanie próbki (Rysunek 2C)

  1. Czyszczenie i powlekanie szkiełek:
    1. Używaj znormalizowanych szkiełek CaF2 (o średnicy 10 mm i grubości 350 μm w celu zapewnienia kompatybilności z uchwytem na próbkę instrumentu). Zanurz CaF2 w 70% etanolu na 15 minut i spłucz dwukrotnie wodą DI.
    2. Przenieść oczyszczone szkiełka do 0,1% roztworu poli-L-lizyny i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Jednokrotnie przepłukać szkiełka wodą demineralizowaną i wysuszyć na powietrzu.
  2. Przygotowane próbki komórek rozmrozić w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.
  3. Aby uniknąć nadmiernej ilości kryształów soli z PBS podczas suszenia próbki, należy wykonać kroki 3.3.1-3.3.2.
    1. Umyj komórki dwukrotnie wodą dejonizowaną (DI). Odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut i usunąć supernatant.
    2. Dodaj z powrotem pierwotną objętość wody DI i delikatnie wymieszaj. Powtórz wirowanie i ponownie dodaj płukanie wodą DI.
  4. (Opcjonalnie) W przypadku próbek mieszanin przenieść tę samą objętość z każdej próbki i wymieszać do jednej probówki wirówkowej.
  5. Zagęścić próbki komórek bakteryjnych przez odwirowanie w stężeniu 14 000 x g przez 10 minut i usunąć sklarowany sklarant.
  6. Pozostałą zawartość roztworu delikatnie wirować przez ~30 s i dodać 1-2 μL roztworu na przygotowane szkiełko CaF2. Suszyć próbkę na powietrzu przez 30 minut, chroniąc ją przed światłem.
    UWAGA: Po wyschnięciu na powietrzu na szkiełku powinna pojawić się mała okrągła kropka. Ze względu na efekt "pierścienia kawy" krawędzie kropki miałyby większą gęstość komórek bakteryjnych. Ten etap wirowania ma na celu osiągnięcie odpowiedniej gęstości do wydajnego obrazowania bakterii jednokomórkowych. Idealne stężenie powinno prowadzić do uzyskania jednolitej i gęstej warstwy pojedynczych komórek bakteryjnych pod mikroskopem. Jeśli po odwirowaniu znajduje się przezroczysty osad, który można zobaczyć gołym okiem, usuń supernatant tak, aby po wirze roztwór wyglądał na prawie przezroczysty. Szybki test można przeprowadzić na próbce kontrolnej w celu oszacowania objętości usuwania supernatantu. Układ kropelek z różnymi ilościami pozostałego supernatantu można nanieść na szkiełko mikroskopu w celu zbadania optymalnej objętości rozcieńczenia pod mikroskopem jasnego pola. Jeżeli po odwirowaniu nie ma widocznego osadu, należy usunąć większość supernatantu, aby w jak największym stopniu zagęścić próbki. Sztuczka polega na ustawieniu probówki wirówki z zawiasem na zewnątrz w wirniku o stałym kącie tak, aby granulat znajdował się po tej samej stronie zawiasu probówki. Dodatkowo można wyrównywać rozmiary pipet (P1000, P200, P10) w celu zwiększenia precyzji podczas usuwania supernatantu i utrzymania osadu w stanie nienaruszonym.
  7. Zamontuj szkiełko w dostarczonym uchwycie na próbkę i użyj małych kropek taśmy poliestrowej, aby zabezpieczyć szkiełko podczas pomiaru.

4. Obrazowanie OPTIR-FISH

UWAGA: Obrazowanie fluorescencyjne i obrazowanie OPTIR zostaną przeprowadzone w systemie OPTIR.

  1. Geometria systemu:
    1. Użyj przeciw-propagacji pompy średniej podczerwieni i sondy widzialnej, wstecznej (epi) detekcji światła widzialnego za pomocą tego protokołu.
    2. Aby skupić światło widzialne i zebrać światło widzialne odbite i rozproszone, użyj obiektywu pneumatycznego (50x 0,8 NA). Aby ustawić ostrość światła w średniej podczerwieni, użyj obiektywu Cassegraina (40x 0.78NA).
    3. Upewnij się, że system jest również wyposażony w szerokokątny moduł epi-fluorescencji z wieloma zestawami filtrów fluorescencyjnych. Dla fluoroforów używanych w tym protokole należy wybrać zestaw filtrów z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do wykrywania Cy3 i zestaw filtrów Alexa Fluor 647 do wykrywania Cy5.
  2. Przygotuj się do pomiarów:
    1. Włącz system i otwórz oprogramowanie sterujące instrumentem. Po inicjalizacji przełącz suwak Counterprop i Fluorescence do pozycji włączonej.
    2. Ustaw obiektyw na 50x, a następnie wykonaj automatyczne tło, aby uzyskać widmo mocy podczerwieni. Użyj widma mocy, aby znormalizować uzyskane widma próbek lub znormalizować obrazy OPTIR przy różnych liczbach falowych. Wykluczy to wpływ różnic mocy lasera w średniej podczerwieni na analizę danych i kwantyfikację.
      UWAGA: Pozyskiwanie widm mocy w podczerwieni w celu normalizacji jest niezbędne do dalszej analizy ilościowej, ponieważ zmierzona intensywność jest liniowo związana z mocą podczerwieni. Po wykonaniu automatycznego tła oprogramowanie automatycznie znormalizuje widma OPTIR i obrazy OPTIR do widm mocy podczerwieni dla użytkowników. Przedmuchiwanie systemuN2 może zminimalizować wpływ pary wodnej i zwiększyć powtarzalność między eksperymentami.
  3. Aby załadować próbkę, użyj przycisku Rozładuj, aby przesunąć stolik próbki. Użyj obiektywu o małym powiększeniu, takiego jak 10x, aby zlokalizować obszar próbki i przejść do obszaru o optymalnej gęstości próbki. Ustaw ostrość próbki, regulując wysokość obiektywu w oprogramowaniu sterującym. Zmień wybór obiektywu na 50x.
  4. Akwizycja obrazu
    UWAGA: Użyte próbki to: i) E. coli (13C-glukozy w inkubacji); ii) E. coli (12C-glukozy w inkubacji); iii) B. theta (12C-glukoza w inkubacji); iv) mieszanina E. coli (13C-glukoza inkubowana) i B. theta (12C-glukoza inkubowana).
    1. Obrazy w jasnym polu (Rysunek 2D): Ustaw ostrość próbki, patrząc na obrazy w jasnym polu.
    2. Obrazy fluorescencyjne (Rysunek 2E): Zmień zestaw filtrów, klikając przycisk nazwy filtra (GFP dla Cy3 i Alexa Fluor 647 dla Cy5), aby wykryć fluorofory związane z zaprojektowanymi sondami FISH i uzyskać sekwencyjne obrazowanie fluorescencji za pomocą modułu fluorescencji w oprogramowaniu. Dostosuj natężenie światła i czas ekspozycji, aby uzyskać odpowiedni kontrast sygnału przed wybielaniem fluoroforów.
      UWAGA: Ponieważ sonda używana w pomiarach OPTIR może fotowybielać fluorofory, zawsze uzyskuj obrazy fluorescencyjne przed obrazami OPTIR. W przypadku obaw dotyczących wpływu markerów fluorescencyjnych na wykrywanie OPTIR, zapoznaj się z wcześniej opublikowaną pracą, która wykazała, że FISH z fluoroforem Cy5 nie wpływa na następującą kwantyfikację na podstawie obrazów OPTIR, ponieważ Cy5 ma mały rozmiar i niską liczebność w porównaniu z docelowym białkiem bakteryjnym9.
    3. Obrazy OPTIR (Rysunek 2F):
      1. Określ normalny pik i pozycję piku przesuniętego ku czerwieni wywołanego izotopem. W przypadku syntezy białek z 13C-glukozy, normalny pik amidu I jest wykrywany na poziomie około 1656 cm-1, a pik przesunięty ku czerwieni występuje na około 1612 cm-1 (Rysunek 3A).
        UWAGA: Normalna pozycja piku zależy od składnika biochemicznego i/lub produktu metabolicznego będącego przedmiotem zainteresowania. Przesunięta pozycja piku zależy również od tego, który izotop jest używany do znakowania. Te dwie liczby falowe można również wyznaczyć eksperymentalnie, mierząc pełne widma komórek nieznakowanych i maksymalnie znakowanych (patrz krok 4.5)
      2. Dostosuj długość fali pompy IR do 1656 cm-1 za pomocą oprogramowania. Zmodyfikuj odpowiednio moc sondy i wzmocnienie detektora, aby uniknąć nasycenia sygnału DC (8 V). Dostosuj dolną wysokość obiektywu Cassegraina, aby zmaksymalizować sygnał AC.
        UWAGA: Typowa moc podczerwieni na próbce wynosi około 5 mW, a moc sondy na próbce wynosi około 3-15 mW, w zależności od próbki. Zarówno moc podczerwieni, jak i sondy można regulować za pomocą oprogramowania sterującego, aby zoptymalizować poziom mocy w celu zapewnienia wysokiego kontrastu obrazu przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzenia komórek.
      3. Ustaw obrazy OPTIR tak, aby zawierały 200 x 200 pikseli i ustaw szybkość skanowania na 100 μm/s. Ustaw rozmiar kroku w kierunkach X i Y na 150 nm, aby rozmiar obrazu wynosił około 30 x 30μm2.
      4. Uzyskaj obraz.
      5. Dostosuj długość fali pompy podczerwieni do 1612 cm-1 i uzyskaj obraz z tego samego pola view przy tej liczbie falowej.
      6. Dla każdej próbki należy przedstawić co najmniej trzy pola widzenia do analizy statystycznej.
  5. (Opcjonalnie) Pomiar spektralny: Po uzyskaniu obrazu, jeśli zlokalizowany jest obiekt przestrzenny będący przedmiotem zainteresowania, wykonaj pomiar spektralny.
    1. Wybierz lokalizacje: Wybierz pojedynczy punkt lub określ tablicę punktów do analizy w module Spectral oprogramowania.
    2. Ustaw parametr skanowania spektralnego. Wybierz zakres pokrycia liczb falowych, szybkość skanowania i odstępy wyjściowe danych w zależności od wymagań.
      UWAGA: jeśli szybkość skanowania i odstępy wyjściowe danych różnią się od tych użytych w kroku akwizycji tła (krok 4.2), do poprawnej normalizacji potrzebne jest nowe tło oparte na bieżących parametrach skanowania spektralnego.
    3. Ustaw liczbę współuśredniania i rozpocznij pomiar spektralny. Zwiększenie współuśredniania zwiększa również stosunek sygnału do szumu widm, ale wymaga dłuższych czasów akwizycji.
      UWAGA: Jeśli podczas współuśredniania zaobserwuje się znaczne wahania, może to wskazywać na niestabilność próbki wywołaną ogrzewaniem laserowym. Często można temu zaradzić, zmniejszając moc podczerwieni i/lub zmniejszając widoczną moc sondy.

5. Przetwarzanie i analiza danych na poziomie pojedynczej komórki

  1. Ilościowe określenie syntezy metabolicznej z substratów izotopowych (Rysunek 2G)
    UWAGA: Poniższa kwantyfikacja inkorporacji metabolicznej z substratów izotopowych opiera się na obrazach OPTIR o dwóch liczbach falowych odpowiadających normalnym i przesuniętym pikom docelowych makrocząsteczek. W porównaniu z pełnym stosem hiperspektralnym, obrazowanie dwufalowe może znacznie skrócić czas wymagany dla każdego pola widzenia i poprawić przepustowość, jednocześnie w pełni odzyskując efekt izotopowy krytyczny dla kwantyfikacji metabolizmu.
    1. Odejmij przesunięty obraz piku OPTIR od normalnego obrazu piku OPTIR generuje wizualną mapę czynności syntezy z substratów izotopowych. Jako demonstrację (Rysunek 3C), dla E. coli hodowanej z 13C-glukozą, dodatnie piksele na obrazie (1656 cm-1-1612 cm-1) wskazują na aktywne włączenie 13C do białek, a zatem wyższy poziom syntezy białek.
      UWAGA: Odejmowanie można wykonać za pomocą funkcji ImageJ Image Calculator. Alternatywnie, odejmowanie można łatwo wykonać w dowolnym preferowanym języku programowania do przetwarzania wsadowego.
    2. Kwantyfikacja aktywności metabolicznej pojedynczej komórki
      1. Uzyskaj współczynniki (reprezentowane przez h w Rysunek 2G) z nieoznakowanych i w pełni oznakowanych próbek referencyjnych. Ponieważ pik przesunięty ku czerwieni wywołany izotopem częściowo pokrywałby się z normalnym pikiem, zarówno nieznakowane, jak i znakowane (nowo zsyntetyzowane z izotopowo znakowanego substratu) próbki będą przyczyniać się do sygnałów OPTIR przy normalnym i przesuniętym piku. Określ ilościowo te różne wkłady, używając znormalizowanego natężenia sygnału OPTIR przy normalnym i przesuniętym piku z nieznakowanych i w pełni znakowanych próbek referencyjnych.
        UWAGA: W przypadku próbek referencyjnych, nieznakowane próbki referencyjne są hodowane (lub inkubowane) bez żadnego substratu znakowanego izotopowo. W pełni oznakowane próbki referencyjne są zwykle uprawiane z najwyższym stężeniem substratu znakowanego izotopowo o najdłuższym czasie uprawy.
      2. Do analizy pojedynczych komórek należy uzyskać maski jednokomórkowe na podstawie obrazów w jasnym polu.
        UWAGA: Do wygenerowania tej maski można tutaj zastosować różne techniki przetwarzania obrazu, w tym różne metody wykrywania cząstek, takie jak analiza plam i metody segmentacji komórek, takie jak zlewnia.
      3. Zmierz natężenie sygnału OPTIR z poszczególnych komórek. Zastosuj uzyskaną maskę jednokomórkową do dwóch obrazów OPTIR (przy normalnym szczycie i przesuniętym piku) i dla każdej pojedynczej komórki uśrednij wartości pikseli w obszarze maski jednokomórkowej. Uśredniona wartość z poszczególnych komórek zostanie wykorzystana do oceny ilościowej.
      4. Dla każdej komórki oblicz względny udział nieznakowanych i znakowanych biokomponentów na podstawie współczynników z kroku 5.1.2.1 i sygnałów z kroku 5.1.2.3.
        UWAGA: Współczynnik zastępczości izotopowej definiuje się jako względny udział znakowanych składników biologicznych w stosunku do sumy zarówno znakowanych, jak i nieznakowanych składników biologicznych (Rysunek 2G). Stosunek ten powinien mieścić się w zakresie od 0 do 1. Stosunek wymiany izotopowej jest liniowo proporcjonalny do stosunku 13C-glukozy do 12C-glukozy (przy stałej całkowitej ilości glukozy)9. Wykazano wysoką czułość wykrywania wynoszącą 5% 13C-glukozy dla komórek E. coli.
  2. Identyfikacja gatunków bakterii na podstawie wielokanałowych obrazów fluorescencyjnych (Rysunek 2H)
    1. Połącz wielokolorowe kanały fluorescencji, aby stworzyć wizualne wskazówki dla różnych gatunków bakterii za pomocą ImageJ (Image > Color > Merge Channels).
    2. W przypadku analizy pojedynczej komórki, dla każdego kanału fluorescencyjnego, wygeneruj zestaw obszarów zainteresowania (ROI) dla poszczególnych komórek.
      UWAGA: Do wygenerowania maski można tutaj zastosować różne techniki przetwarzania obrazu, w tym różne metody automatycznego progowania i metody segmentacji komórek.
  3. Skoreluj tożsamości FISH i aktywność metaboliczną OPTIR (Rysunek 2I)
    1. Połącz tożsamości bakterii na poziomie pojedynczej komórki z obrazów fluorescencyjnych FISH bezpośrednio z aktywnością metaboliczną z obrazów OPTIR poprzez skorelowanie pozycji ROI.
    2. Wykonaj analizę statystyczną, aby porównać aktywność metaboliczną różnych gatunków.
      UWAGA: Maski są generowane oddzielnie od obrazów fluorescencyjnych i obrazów OPTIR, ponieważ aktywność metaboliczna może być analizowana dla wszystkich komórek z obrazów OPTIR, podczas gdy nieznane komórki nie pojawią się na żadnym z kanałów fluorescencyjnych. Gwarantuje to, że wszystkie komórki mogą zostać włączone do analizy metabolicznej. Jeśli istnieje duża liczba niezidentyfikowanych komórek, może być konieczne rozważenie różnych sond FISH ukierunkowanych na rRNA różnych taksonów będących przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny schemat analizy metabolicznej pojedynczych komórek drobnoustrojów z identyfikacją genetyczną za pomocą OPTIR-FISH przedstawiono na Rysunku 2. Reprezentatywne wyniki demonstrujące możliwości obrazowania metabolicznego pojedynczych komórek metodą OPTIR pokazano na Rysunku 3. W tym przykładzie wykorzystano komórki E. coli inkubowane z glukozą 12C lub 13C przez 24 h. Wykazano, że wbudowanie 13C do białek powoduje znaczne przes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy szczegółowy protokół zastosowania platformy OPTIR-FISH do jednoczesnej identyfikacji gatunków drobnoustrojów i ilościowego oznaczania aktywności metabolicznej w rozdzielczości pojedynczej komórki. Kluczowe etapy obejmują hodowlę ze znakowaniem stabilnych izotopów w celu zbadania określonych aktywności metabolicznych oraz fluorescencyjną hybrydyzację in situ w celu identyfikacji docelowych gatunków drobnoustrojów. Wielokanałowe obrazowanie fluorescencyjne i obrazowanie OPTIR przy wybranyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Y.B. jest konsultantem w niepełnym wymiarze godzin w Photothermal Spectroscopy Corp.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institute of Health R35GM136223, R01AI141439 J.X.C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96% etanolThermoScientificT032021000
Fluorek wapniaCrystranCAFP10-0,35
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG7021-1KG
D-Glukoza (U-13C6, 99%)Cambridge Isotopic LaboratoriesCLM-1396-1
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-AldrichE9884-100G
formamidThermoScientific17899
Rosół Luria-Bertani Sigma-AldrichL3522-250G
M9 Sole minimalne 5xSIGMAM6030-1KG
OPTIR instrumentSpektroskopia fototermiczna Corp.mIRage LS
Roztwór paraforaldehydu, 4% w PBSThermoScientificJ19943-K2
roztwór poli-L-lizyny 0,1% (w/v) Sigma-AldrichP8920-500ML
Chlorek soduSigma-AldrichS9888-25G
Dodecylosiarczan soduSigma-AldrichL3771-25G
Chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu, 99+%ThermoScientificA11379.18
Trypic Rosół sojowySigma-Aldrich22092-500G

Bibliografia

  1. Evers, T. M. J., et al. Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis. Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).
  2. Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. Present and future of culturing bacteria. Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).
  3. Epstein, S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
  4. Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -Q., Yang, J. Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective. Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).
  5. Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS. FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).
  6. Jiang, H., Kilburn, M. R., Decelle, J., Musat, N. NanoSIMS chemical imaging combined with correlative microscopy for biological sample analysis. Curr Opin Biotechnol. 41, 130-135 (2016).
  7. Porta Siegel, T., et al. Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues. Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).
  8. Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species. Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).
  9. Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -X. Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells. Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).
  10. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -H. Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions. System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).
  11. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -H. Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment. Microbiology. 142, 1097-1106 (1996).
  12. Daims, H., Stoecker, K., Wagner, M. Fluorescence In Situ Hybridization for the Detection of Prokaryotes. Molecular Microbial Ecology. , Taylor & Francis. London. (2004).
  13. Bridger, J. M., Volpi, E. V. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications. , Springer, Humana. Totowa, NJ. (2010).
  14. Wang, D. O., et al. A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes. RNA. 18 (1), 166-175 (2012).
  15. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).
  16. Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. mathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Appl Environ Microbiol. 77 (3), 1118-1122 (2011).
  17. Lima, C., Muhamadali, H., Xu, Y., Kansiz, M., Goodacre, R. Imaging isotopically labeled bacteria at the single-cell level using high-resolution optical infrared photothermal spectroscopy. Anal Chem. 93 (6), 3082-3088 (2021).
  18. Yin, J., et al. Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering. Nat Commun. 12 (1), 7097(2021).
  19. Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -X. Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect. Sci Adv. 7 (20), (2021).
  20. Xia, Q., Yin, J., Guo, Z., Cheng, J. -X. Mid-infrared photothermal microscopy: principle, instrumentation, and applications. J Phys Chemi B. 126 (43), 8597-8613 (2022).
  21. Du, J., Wang, H., Wei, L. Bringing vibrational imaging to chemical biology with molecular probes. ACS Chem Biol. 17 (7), 1621-1637 (2022).
  22. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Phys Biol. 16 (4), 041003(2019).
  23. Shi, L., et al. Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes. Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).
  24. Bai, Y., et al. Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems. Nat Commun. 15 (1), 350(2024).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Ge, X., et al. SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (26), e2203519119(2022).
  27. Bai, Y., et al. Ultrafast chemical imaging by widefield photothermal sensing of infrared absorption. Sci Adv. 5 (7), 7127(2019).
  28. Zhang, J., Zhao, J., Lin, H., Tan, Y., Cheng, J. -X. High-speed chemical imaging by dense-net learning of femtosecond stimulated Raman scattering. J Phys Chem Lett. 11 (20), 8573-8578 (2020).
  29. Lin, H., et al. Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning. Nat Commun. 12 (1), 3052(2021).
  30. Fu, P., et al. Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy. Nat Photon. 17, 330-337 (2023).
  31. Tamamitsu, M., et al. Mid-infrared widefield nanoscopy. arXiv. , (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

metabolizm pojedynczych komórekznakowanie izotopoweidentyfikacja komórek bakteryjnychobrazowanie metabolicznesondy rRNA FISHszkiełka z fluorku wapniaanaliza danych spektralnych
Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.