Artykuł metodologiczny

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66566

⸱

19 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Streszczenie

Powikłania po przeszczepie płuc są w dużej mierze związane z reakcją układu odpornościowego gospodarza na przeszczep. Takie odpowiedzi immunologiczne są regulowane przez przesłuchy między komórkami dawcy i biorcy. Lepsze zrozumienie tych procesów opiera się na wykorzystaniu przedklinicznych modeli zwierzęcych i jest wspomagane przez możliwość badania transportu komórek odpornościowych wewnątrz przeszczepu w czasie rzeczywistym. Przyżyteczna mikroskopia dwufotonowa może być stosowana do obrazowania tkanek i narządów na głębokości do kilkuset mikronów przy minimalnym fotouszkodzeniu, co daje dużą przewagę nad jednofotonową mikroskopią konfokalną. Selektywne wykorzystanie myszy transgenicznych z ekspresją białka fluorescencyjnego specyficzną dla promotora i/lub adoptywnym transferem komórek znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym podczas przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej pozwala na dynamiczne badanie pojedynczych komórek w ich środowisku fizjologicznym. Nasza grupa opracowała technikę stabilizacji płuc myszy, która umożliwiła nam zobrazowanie dynamiki komórkowej w płucach naiwnych i ortotopowo przeszczepionych przeszczepach płuc. Technika ta pozwala na szczegółową ocenę zachowania komórek w obrębie układu naczyniowego i śródmiąższu, a także na badanie interakcji między różnymi populacjami komórek. Procedury tej można się łatwo nauczyć i dostosować do badania mechanizmów immunologicznych, które regulują reakcje zapalne i tolerogenne po przeszczepie płuc. Można go również rozszerzyć o badanie innych patogennych chorób płuc.

Wprowadzenie

Przeszczep płuc jest ostatnią opcją dla wielu pacjentów cierpiących na schyłkową niewydolność płuc; jednak długoterminowe przeżycie po przeszczepie płuc jest słabe w porównaniu z innymi przeszczepami narządów litych. Przeżywalność po 5 latach wynosi tylko ~60%-70%1, w porównaniu do 80%-90% w hearts2 i 85%-90% w nerkach3. Wiele powikłań po przeszczepie płuc, takich jak pierwotna dysfunkcja przeszczepu, odrzucenie za pośrednictwem przeciwciał i przewlekła dysfunkcja alloprzeszczepu płuc, wynika z odpowiedzi immunologicznej gospodarza na przeszczep allogeniczny. Na przykład, nasza grupa wykazała, że neutrofile są szybko rekrutowane do alloprzeszczepu płuc po indukowanym przeszczepem uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym i tworzą dynamiczne skupiska otaczające monocyty krwi4. Przesłuch między komórkami dawcy i biorcy jest odpowiedzialny za szkodliwe odpowiedzi alloimmunologiczne5,6,7, a możliwość badania tych dynamicznych interakcji komórkowych w żywym modelu zwierzęcym jest nieoceniona.

Mikroskopia dwufotonowa pozwala na obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości na głębokości do kilkuset mikronów przy minimalnym fotowybielaniu tkanek8,9. Jest stosowany w różnych tkankach i miejscach anatomicznych, w tym w korze nowej10,11, skin12,13 i kidney14,15. Ostatnio został dostosowany do niestatycznych narządów, takich jak płuca i serce4,16,17. W tym protokole opisujemy technikę obrazowania stabilizowanych, wentylowanych i perfundowanych przeszczepów płuc po mysim ortotopowym przeszczepie lewego płuca. Kluczową zaletą modelu przeszczepu jest możliwość oddzielnej manipulacji genetycznej dawcą i biorcą. Poszczególne populacje komórek można wizualizować za pomocą transgenicznych szczepów myszy z ekspresją białek fluorescencyjnych knock-in, adoptywnym transferem komórek znakowanych fluorescencyjnie5 lub dożylnym wstrzyknięciem przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie w celu związania markerów specyficznych dla komórki4,16,17,18.

Aby ustabilizować płuco podczas obrazowania, protokół ten polega na przyklejeniu płuca do szkła nakrywkowego, podczas gdy inne grupy opisały stabilizację ssania za pomocą specjalnie zaprojektowanego odwracalnego urządzenia próżniowego19. Nasz protokół ma kilka zalet, w tym większy obszar obrazowania i względną łatwość konfiguracji przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów w laboratorium mikroskopowym (w tym szkła nakrywkowego i kleju). Ponieważ ta technika klejenia ogranicza płuca na górnej powierzchni, oczekuje się, że zmniejszy ruchy wentylacyjne i umożliwi głębsze obrazowanie. Ta technika obrazowania przyżyciowego pozwala na szczegółową obserwację zachowania i interakcji komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym, co przyczynia się do badania mechanizmów immunologicznych, które regulują reakcje zapalne i tolerogenne po przeszczepie płuc.

Protokół

Wszystkie procedury obchodzenia się ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w Washington University School of Medicine.

1. Znieczulenie i intubacja

UWAGA: Ortotopowy przeszczep lewego płuca myszy jest wykonywany, jak opisano wcześniej20,21. Płuca myszy C57BL/6 (B6) o gramaturze 20-25 g są przeszczepiane biorcom witaminy B6 o tej samej płci i wieku. Klasa B6. Myszy reporterowe LysM-GFP są wykorzystywane jako biorcy w wybranych eksperymentach mających na celu wizualizację infiltracji neutrofili do przeszczepów płuc. Myszy biorcy można obrazować bezpośrednio po przeszczepie płuc.

  1. Ponownie znieczulić myszy za pomocą dootrzewnowego podawania ketaminy (80-100 mg / kg) i ksylazyny (8-10 mg / kg). Buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu (0,5-1,0 mg/kg) należy podawać podskórnie w celu dodatkowej kontroli bólu. Potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia szczypcem łapy.
    UWAGA: Jeśli czas między przeszczepem płuc a planowanym obrazowaniem przyżyciowym jest krótszy niż dwie godziny, można ponownie podać znieczulenie z 50% początkowej dawki ketaminy.
  2. Usuń włosy z całej lewej klatki piersiowej za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia i wytrzyj klatkę piersiową, aby usunąć nadmiar przyciętych włosów.
  3. Nałóż maść okulistyczną bez leku na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  4. Ponownie zaintubuj mysz ustnie i tchawiczo za pomocą angiocewnika 20 G, jak opisano wcześniej21.
  5. Wietrzyć powietrzem z pomieszczenia o prędkości 120 oddechów/min i objętości oddechowej 0,5 cm³.
  6. Dostarczyć 1% izofluoranu dotchawiczo podczas całego zabiegu.
  7. Aby uwidocznić naczynia krwionośne podczas obrazowania, należy wstrzyknąć 20 μl niedocelowych kropek kwantowych (q-dots) o długości 655 nm w 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami dożylnie co najmniej 5 minut przed obrazowaniem.

2. Chirurgiczne przygotowanie lewego płuca do obrazowania

  1. Ustaw mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowej (patrz Rysunek 1A).
  2. Trzykrotnie zdezynfekuj skórę klatki piersiowej mieszaniną 0,75% jodu i 70% etanolu.
  3. Ponownie otwórz lewą torakotomię (po przeszczepie płuc myszy) przez trzecią przestrzeń międzyżebrową (patrz Rysunek 1A).
  4. Usuń część skóry i tkanki miękkiej z miejsca lewej torakotomii o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm (patrz Rysunek 1B).
  5. Przed resekcją żeber najpierw zaciśnij żebra na ~10 s, aby zakrzepić mikrokrążenie w celu uzyskania hemostazy (patrz Rysunek 1C, D).
    6. Wytnij części żeber od 3 do 5, aby stworzyć okno obrazowania wystarczająco duże, aby wydobyć płuco (~0,8 cm czaszkowo-ogonowo i ~1,0 cm przednio-tylnie, Rysunek 1D, E).
  7. Zatrzymać dodatkowe krwawienie z krawędzi żeber za pomocą elektrokoagulacji.
    UWAGA: Bardzo ważne jest uzyskanie hemostazy na krawędzi cięcia żeber, aby uniknąć nadmiernej utraty krwi w okresie obrazowania.
  8. Umieść mały guzek (4 cm x 4 cm gaza złożona wzdłużnie 3 razy) pod prawą klatką piersiową (patrz Rysunek 1E).
  9. Za pomocą bawełnianych wacików podnieś przeszczep płuca z klatki piersiowej i umieść dolną część płuca na pasku gazy nasączonej solą fizjologiczną o wymiarach 1 cm x 3 cm (patrz Rysunek 1F).
    UWAGA: Ten pasek gazy nasączonej solą fizjologiczną zapobiega przesuwaniu się płuc, utrzymuje wilgotne środowisko dla płuc, chroni płuco przed ostrymi krawędziami wyciętych żeber i oddziela płuca od ruchu serca. Po nałożeniu obwodowej komory obrazowania na płuco (Rysunek 1G, H, opisany w sekcji 3), utrata ciepła i płynu z otwartej jamy klatki piersiowej powinna być minimalna w okresie obrazowania.

3. Przygotowanie komory obrazowania

UWAGA: Komora obrazowania jest budowana na zamówienie (zobacz Rysunek 2A). Ta komora obrazowania składa się z płyty podstawy i płyty górnej, pomiędzy którymi mysz jest umieszczona i zabezpieczona sprężynowymi po obu stronach (Rysunek 2B). Na górnej płycie znajduje się okrągłe wycięcie o średnicy ~2 cm. W tym otworze z przodu górnej płyty umieszczono odpowiednio duży pierścień uszczelniający, który będzie chronił soczewkę obiektywu (Rysunek 2C). Szkło nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm przykleja się do tylnej części górnej płyty za pomocą smaru o wysokiej podciśnieniowości, co zapewnia wodoszczelne uszczelnienie. To szkło nakrywkowe będzie służyć jako okienko obrazowania, przylegając do płuca poniżej i utrzymując media obrazowe (tj. wodę) powyżej. Upewnij się, że smar próżniowy nie dostał się do okrągłego okienka obrazowania. Szkło nakrywkowe będzie wymieniane przy każdym nowym eksperymencie obrazowania. Płyta podstawy jest podgrzewana do temperatury 35-37 °C za pomocą sondy temperatury termopary ( Rysunek 2A).

  1. Umieść zaintubowaną mysz na płycie podstawy komory obrazowania z otwartą lewą klatką piersiową skierowaną do góry (patrz Rysunek 1G, H). Przymocuj mysz jedwabną taśmą do pyska, przednich łap i ogona (patrz Rysunek 1H i Rysunek 2A).
  2. Nałóż klej na dolną stronę szkła nakrywkowego przymocowanego do górnej płyty (szare kółko w Rysunek 2C, na dole), pozostawiając 0,8-1,0 cm bezklejowego koła pośrodku.
    UWAGA: Istnieje kompromis między rozmiarem okręgu bez kleju a ilością artefaktu ruchu; Dlatego zaleca się, aby okrąg nie przekraczał 1,0 cm średnicy.
  3. Opuść górną płytę, aż szkło nakrywkowe zetknie się z płucem, a klej dotknie powierzchni płuca (patrz Rysunek 1G).
    UWAGA: Lewe płuco zostanie przyklejone do szkła nakrywkowego z czystym, bezklejowym okręgiem pośrodku, czyli obszarem, który zostanie zobrazowany.
  4. Przyłóż szkło nakrywkowe do płuca i napompuj płuco przez 1-2 sekundy, aby obszar kleju przylegał do otaczającej tkanki. Osiągnij napompowanie płuc poprzez zamknięcie rurki odpływowej z rurki dotchawiczej myszy do respiratora.
    UWAGA: Nie należy pompować płuc dłużej niż 1-2 sekundy, ponieważ może to spowodować nadmierną barotraumę.
  5. Lekko cofnij górną płytkę, aby zmniejszyć nacisk na tkankę płucną. Upewnij się, że obszar płuca w okienku obrazowania nie porusza się wraz z wentylacją.
  6. Zabezpiecz oba końce górnej płyty, dokręcając nakrętkę skrzydełkową do każdej (patrz Rysunek 2B).

4. Obrazowanie dwufotonowe

UWAGA: Do mikroskopii przyżyciowej powinien być używany mikroskop pionowy o stałym stopniu widzenia z obiektywem zanurzeniowym w wodzie >o aperturze numerycznej (NA) 20x lub 25x. Poniżej znajduje się konfiguracja użyta w tym badaniu dla B6 do B6. Przeszczep lewego płuca LysM-GFP z znakowaniem naczyń krwionośnych q-dot 655 nm. Stosując ten protokół, konfigurację mikroskopu, laserów i filtrów dichroicznych można dostosować w zależności od potrzeb konkretnego eksperymentu i zastosowanych reporterów fluorescencyjnych.

  1. Umieść całą komorę obrazowania z zaintubowaną myszą biorcą (B6 lewe płuco przeszczepione do B6. LysM-GFP z kropkami q 655 nm) na stolik mikroskopu (patrz Rysunek 2A).
  2. Stosuj filtry dichroiczne o długościach fal 480 nm, 560 nm i 635 nm, które odpowiednio oddzielą sygnały od reportera GFP, q-dots i sygnału generacji drugiej harmonicznej (SHG) (445 nm) generowanego przez kolagen. Filtry te można dostosować w zależności od konkretnego eksperymentu.
    UWAGA: Sygnał SHG generowany przez kolagen wyznacza ciemne struktury przypominające kratery, które reprezentują pęcherzykowe przestrzenie powietrzne (patrz białe strzałki w Rysunek 3).
  3. Ustaw tytanowo-szafirowy laser impulsowy femtosekundowy na 890 nm (w zakresie bliskiej podczerwieni) w celu wzbudzenia. Użyj najniższej możliwej mocy lasera, aby uzyskać wystarczający sygnał.
    UWAGA: Ustawienia lasera należy dostosować do konkretnego eksperymentu, aby zmaksymalizować separację sygnału.
  4. Nałóż ~ 1 ml wody, aby całkowicie pokryć szkło nakrywkowe na górnej płycie, które będzie utrzymywane na miejscu przez O-ring i próżniową uszczelkę smarową szkła nakrywkowego do górnej płyty (patrz Rysunek 1G i Rysunek 2C).
  5. Użyj obiektywu 20x >1.0 NA zanurzonego w wodzie w mikroskopie. Upewnij się, że soczewka obiektywu jest dostosowana do konkretnego eksperymentu.
    UWAGA: Większa Ameryka Północna pozwala na lepsze zbieranie światła, wyższy kontrast i bardziej szczegółowe obrazy. Preferowane są cele zanurzenia w wodzie, ponieważ woda lub bufor są bardziej kompatybilne z tkankami biologicznymi.
  6. Opuść obiektyw mikroskopu do wody i skup się na powierzchni płuc
    7. .
  7. Włączyć grzałkę płyty bazowej i utrzymać temperaturę na poziomie 35-37 °C.
    UWAGA: Jeśli istnieją obawy dotyczące niemożności utrzymania temperatury tkanki lub odpowiedniej perfuzji do płuc, można przymocować dwa dodatkowe rezystory w celu ogrzania górnej płytki oprócz płytki podstawy (patrz rysunek uzupełniający 1).
  8. Pobieraj stosy obrazów za pomocą wybranego oprogramowania do akwizycji.
    UWAGA: Upewnij się, że pomieszczenie jest całkowicie ciemne podczas akwizycji, co może wiązać się z użyciem zasłon/żaluzji zaciemniających i strategicznego zakrycia wszystkich źródeł światła.

5. Akwizycja wideo

UWAGA: Następujące parametry mogą być dostosowane w zależności od konkretnego eksperymentu. Kroki 5.1-5.3 opisują konkretne parametry używane dla B6 do B6. Mysi przeszczep lewego płuca Lysm-GFP, który może być używany jako przewodnik referencyjny.

  1. Korzystając ze skanera dwukierunkowego o szybkości wideo, ustaw wymiary skanowania x-y na 512 x 512 pikseli.
  2. Korzystając z jednostki krokowej xyz, uzyskaj nagrania poklatkowe 21-stopniowego stosu z 10-klatkowym uśrednianiem na krok. Uzyskanie każdego stosu zajmuje około 20 s, co obejmuje czas potrzebny na uśrednienie klatek, ruch silnika krokowego i sprawdzenie jego położenia oraz opóźnienie 100 ms.
    UWAGA: Dwukierunkowy skaner w mikroskopie użytym w tym badaniu działa z szybkością wideo 30 klatek/s. Może się to różnić w zależności od konkretnej konfiguracji mikroskopu.
  3. Uzyskaj 80 kolejnych stosów z, aby uzyskać obrazowanie poklatkowe migracji leukocytów w miąższu tkanki. Zajmuje to około ~27 min przy 20 s/stos.
    UWAGA: Rozmiar stosu, uśrednianie klatek, moc lasera i całkowita długość nagrania poklatkowego powinny być zminimalizowane, aby zapobiec nadmiernej ekspozycji lasera na tkankę. Jeśli używane reportery fluorescencyjne są jasne (tj. GFP), a moc lasera jest niska, to powtarzanie 21-krokowego stosu z 10-klatkowym średnim skanem 512 x 512 pikseli, w odstępach 20 s przez ~27 minut jest dobrze tolerowane przez mysz. Jeśli pożądane są dłuższe okresy obrazowania, czas akwizycji na stos należy wydłużyć, aby utrzymać całkowitą ekspozycję lasera na tym samym poziomie (tj. 1 minuta na stos przez ~1,5 godziny). Ustawienia te będą musiały zostać zoptymalizowane w oparciu o używane reportery fluorescencyjne.
  4. Poddaj mysz eutanazji pod koniec akwizycji obrazu. Aby poddać się eutanazji, znieczulij mysz ketaminą (80-100 mg / kg) i ksylazyną (8-10 mg / kg), a następnie zwichnięciem szyjki macicy. Typowe preparaty do obrazowania z łatwością utrzymują żywotność myszy do 2 godzin
    UWAGA: Aby przedłużyć ten okres, może być wymagana dodatkowa suplementacja płynów, znieczulenie izofluranem i zwrócenie uwagi na regulację temperatury.
  5. Pełne renderowanie wideo za pomocą Imaris. Można również korzystać z innego oprogramowania do obrazowania (takiego jak ImageJ).
    UWAGA: Obrazy mogą być przetwarzane po akwizycji przy użyciu poprawy kontrastu, wygładzania i arytmetyki kanałów w celu usunięcia przesłuchów kanałów.

Wyniki

Po 1 h zimnego przechowywania niedokrwiennego w temperaturze 4 ˚C, ortotopowo przeszczepiliśmy lewe płuco od myszy B6 do myszy B6.LysM-GFP4, a następnie przeprowadziliśmy obrazowanie dwufotonowe in vivo, zgodnie z powyższym opisem. Obrazowanie wykonano w dwóch punktach czasowych po przeszczepieniu – 2 h (Rysunek 3A) oraz 24 h (Rysunek 3B). Naczynia krwionośne są znakowane na czerwono za pomocą kropek kwantowych (q-dots) wstrzykniętych bezpośrednio przed obrazowaniem. Dodatkowo, po 24 h możemy zwizualizować monocyty, które pochłonęły q-dots4. Zielono znakowane neutrofile pochodzące od biorcy można zaobserwować infiltrujące przeszczep płuca w odpowiadającym im filmie po 24 h od przeszczepienia (Supplementary Video 1). Pęcherzyki płucne są widoczne jako ciemne kratery ze względu na generowanie drugiej harmonicznej (SHG) z kolagenu (białe strzałki na Rysunku 3). Obserwujemy, że 24 h po przeszczepieniu w płucach znajduje się więcej neutrofili w porównaniu do 2 h po przeszczepieniu (Rysunek 3).

Układ mikroskopii dwufotonowej: sekwencja przygotowania chirurgicznego myszy z urządzeniem obrazującym.
Rysunek 1: Przygotowanie myszy do obrazowania dwufotonowego. (A) Ponowne otwarcie skóry nad lewą torakotomią. (B) Wycięcie skóry i tkanek miękkich nad lewą klatką piersiową. (C,D) Zaciśnięcie żeber kleszczykami na 10 s przed ich przecięciem. (E) Resekcja lewych żeber 3rd-5th w celu utworzenia okna o wymiarach ~0.8 cm w kierunku głowowo-ogonowym x 1,0 cm w kierunku przednio-tylnym. (F) Uniesienie lewego płuca z lewej klatki piersiowej i umieszczenie go na pasku gazy. (G) Komora obrazująca z oknem obrazującym umieszczona nad lewym płucem. (H) Komora obrazująca umieszczona na stoliku mikroskopu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Konfiguracja komory obrazowania z obiektywem 20x, myszą, płytką podstawową; schemat eksperymentu wzbudzenia optycznego.
Rysunek 2: Konfiguracja komory obrazowania. (A) Komora obrazowania umieszczona na stole mikroskopu. (B) Powiększony widok mechanizmu śruby z blaszką sprężystą do zabezpieczenia górnej płytki nad lewym płucem. (C) Przednia i tylna strona górnej płytki z nałożonym o-ringiem i szkiełkiem nakrywnym. Białe linie reprezentują obszar, w którym nakłada się smar próżniowy, aby przytwierdzić szkiełko nakrywne do górnej płytki. Szary okrąg reprezentuje pierścień kleju do nałożenia na szkiełko nakrywne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia immunofluorescencyjna tkanki wykazująca kropki kwantowe (q-dots) i komórki LysMGFP w odstępach 2 h i 24 h.
Rycina 3: Dwufotonowe obrazowanie intravitalne przeszczepu lewego płuca myszy z linii B6 do myszy B6.LysM-GFP po 1 h zimnego przechowywania niedokrwiennego. Obrazowanie wykonano (A) 2 h i (B) 24 h po transplantacji. Kolor czerwony oznacza q-dots. Kolor zielony oznacza neutrofile biorcy B6.LysM-GFP. Kolor niebieski oznacza SHG z pęcherzyków bogatych w kolagen. Białe strzałki wskazują przestrzenie powietrzne pęcherzyków płucnych. Pasek skali reprezentuje 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Górna płyta z dwoma przymocowanymi rezystorami w celu zapewnienia dodatkowego ogrzewania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 1: Dwufotonowe obrazowanie time-lapse przeszczepionego lewego płuca myszy z linii B6 do myszy B6.LysM-GFP po 1 h zimnego przechowywania niedokrwiennego, wykonane 24 h po transplantacji. Kolor czerwony reprezentuje kropki kwantowe (q-dots). Kolor zielony reprezentuje neutrofile biorcy LysM-GFP. Kolor niebieski reprezentuje generację drugiej harmonicznej z pęcherzyków płucnych bogatych w kolagen. Pasek skali odpowiada 20 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wzbudzenie dwufotonowe zostało po raz pierwszy opisane w jej pracy doktorskiej przez Marię Göppert-Mayer w 1931 roku, która później otrzymała Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki za opisanie struktury powłoki jądrowej22,23. Tradycyjna mikroskopia fluorescencyjna opiera się na wzbudzeniu pojedynczych fotonów, przy czym długości fal wzbudzenia są krótsze i mają wyższą energię niż fale emisyjne. W przeciwieństwie do mikroskopii jednofotonowej, mikroskopia dwufotonowa polega na jednoczesnym wzbudzeniu przez dwa fotony, z których każdy ma większą długość fali niż emitowany sygnał fluorescencyjny 24,25,26. Ponieważ dwa pojedyncze fotony muszą się kolokalizować, aby wzbudzić pojedynczy punkt ogniskowy w tkance, wzbudzenie dwufotonowe odbywa się przestrzennie do małej objętości próbki, co pozwala na przekrój optyczny 24,25,26 i jest mniej fotowybielania powyżej i poniżej płaszczyzny zawierającej ognisko27. Prawdopodobieństwo jednoczesnego wzbudzenia przez dwa fotony jest bardzo niskie, dlatego do osiągnięcia intensywności wzbudzenia wymaganej dla sygnału emisji fluorescencji potrzebny jest femtosekundowy laser impulsowy 25,26,27. Laser wzbudzający znajduje się w zakresie bliskiej podczerwieni (700-1100 nm), którego zaletą jest mniejsze rozproszenie, co pozwala światłu wnikać głębiej w tkankę28. Głębokość obrazowania zależy od prędkości oscylacji i mocy lasera24. W obrębie płuc można uzyskać głębokość obrazowania ~500-600 μm17. Tak więc połączenie głębokości obrazowania i niskiego fotowybielania sprawia, że mikroskopia dwufotonowa doskonale nadaje się do obrazowania przyżyciowego narządów.

Mikroskopia dwufotonowa została zastosowana w wielu różnych tkankach i miejscach anatomicznych, takich jak skóra12,13, węzły chłonne29, śródbłonek żylny30, kora mózgowa10,11, nerki14,15 i wątroba31,32. Na przykład w skórze właściwej myszy obrazowanie dwufotonowe przyżyciowe zostało wykorzystane do opisania roju neutrofili po sterylnym urazie fizycznym12. W modelu zakrzepicy żylnej uwidoczniono monocyty krwi i neutrofile pełzające wzdłuż śródbłonka żyły głównejdolnej 30. Ludzki mikroglej został z powodzeniem zobrazowany in vivo po tym, jak został ksenoprzeszczepiony do modelu organoidu ludzkiego mózgu33. Dzięki ciągłemu postępowi w mikroskopii dwufotonowej, obrazowanie przyżyciowe jest możliwe na większych głębokościach, a nawet w narządach niestatycznych. Na przykład głębokości do 1000 μm zostały zobrazowane w korze nowej u myszy za pomocą wzmacniacza regeneracyjnego Ti:Al2O3 34.

Jednym z wyzwań związanych z obrazowaniem przyżyciowym w narządach klatki piersiowej jest stabilizacja obrazu. Ze względu na ruch bijącego serca i oddychanie płuc, artefakty ruchu mogą znacznie obniżyć jakość obrazu. Opracowano kilka metod stabilizacji do obrazowania serca i płuc, w tym klejenie narządu 4,7, stabilizację ssania-stabilizację 19,35,36,37 oraz korekcję ruchu a posteriori38. Nasza technika obrazowania płuc polega na przyklejeniu powierzchni płuca do stabilizowanego szkła nakrywkowego. Utrzymujemy płuca w stanie perfuzji, wentylacji i normotermii, co symuluje warunki występujące in vivo. W porównaniu z metodą ssąco-stabilizacyjną opisaną przez Looneya i wsp.19, protokół ten ma kilka zalet. Po pierwsze, nie wymagamy tworzenia specjalistycznego urządzenia ssącego. Zamiast tego nasza komora obrazowania i górna płyta mogą być zbudowane z materiałów łatwo dostępnych w laboratorium mikroskopowym. Dodatkowo, w porównaniu z urządzeniem ssącym (które ma średnicę wewnętrzną 4 mm), technika klejenia zastosowana w tym badaniu pozwala na uzyskanie większej powierzchni obrazowania (do 10 mm). Dzięki klejeniu obwodowemu obszar płuc w okręgu kleju jest odpowiednio ograniczony, a ruchy wentylacyjne są zminimalizowane. W porównaniu z techniką ssania, podejście ze szkłem nakrywkowym zapobiega wypukłej deformacji powierzchni płuc, która mogłaby wpływać na przepływ krwi w naczyniach włosowatych podopłucnowych. Do wad naszego systemu należy brak możliwości usunięcia szkiełka nakrywkowego bez naruszenia połączenia pleuroparenchymalnego. W związku z tym nie jest możliwe zobrazowanie płuca po raz drugi za pomocą zastosowanej tu techniki klejenia, podczas gdy technika ssania pozwala na obrazowanie seryjne. Dodatkowo zastosowanie torakotomii wiąże się z utratą normalnego ujemnego ciśnienia w klatce piersiowej, co w połączeniu z wentylacją nadciśnieniową nie jest fizjologiczne. Dodatkowe ograniczenia, ograniczenia obrazowania dwufotonowego omówiono poniżej.

Chociaż klatka piersiowa jest otwarta podczas obrazowania przyżyciowego, bardzo ważne jest, aby utrzymać ją jak najbliżej środowiska fizjologicznego. Płytka podstawy, na której leży mysz, jest utrzymywana w temperaturze 35-37 °C. Po podgrzaniu tylko płyty podstawy odkryliśmy, że temperatura rdzenia myszy (mierzona za pomocą sondy doodbytniczej) jest dobrze regulowana przez kilka godzin. Z naszego doświadczenia wynika, że ruchliwość i zachowanie komórek są widocznie zmienione tylko wtedy, gdy temperatura spada poniżej 32 °C, co jest mało prawdopodobne w przypadku tej konfiguracji. Jeśli wystąpią trudności w utrzymaniu normotermii tkankowej lub perfuzji płuc podczas początkowej konfiguracji tej komory obrazowania, można dołączyć dwa dodatkowe rezystory w celu ogrzania górnej płytki oprócz płyty podstawy (rysunek uzupełniający 1). Po zoptymalizowaniu komory obrazowania nie jest konieczne rutynowe monitorowanie wewnętrznej temperatury myszy podczas każdego eksperymentu obrazowania. Ponadto odkryliśmy, że połączenie gazy nasączonej solą fizjologiczną umieszczonej na otwartej jamie klatki piersiowej i okluzyjnego pierścienia kleju wokół obszaru płuca, który ma być obrazowany, skutecznie minimalizuje straty płynów podczas obrazowania.

Ważną kwestią techniczną jest uzyskanie dobrej hemostazy podczas resekcji żeber podczas tworzenia okna obrazowania klatki piersiowej. Części lewych żeber od 3do 5są recięte, a trwający krwotok z tych przeciętych żeber zagrozi przeżyciu myszy podczas obrazowania. Aby temu zaradzić, zalecamy najpierw zaciśnięcie żeber proksymalnie do miejsca, w którym mają zostać wycięte przez 10 sekund, aby zakrzepić mikrokrążenie (patrz ryc. 1C,D). Następnie, po resekcji żeber, przycięte krawędzie żeber należy obficie skoagulować za pomocą elektrokoagulacji. Wreszcie, bardzo ważne jest, aby umieścić lewe płuco na pasku gazy nasączonej solą fizjologiczną (patrz rysunek 1F) podczas obrazowania, aby zapobiec przebiciu płuca przez ostre krawędzie żeber. Dzięki tej kombinacji rozważań technicznych możemy uchwycić wyraźne filmy z transportu komórek odpornościowych w miąższu płuc przy minimalnym artefaktie ruchu przez kilka godzin bez uszkodzenia płuc lub utraty normalnych wzorców perfuzji.

Mikroskopia dwufotonowa została wykorzystana w płucach do badania modeli chorób zakaźnych i sterylnego stanu zapalnego. Jedna grupa wykorzystała obrazowanie dwufotonowe do zbadania ruchliwości i migracji komórek B pamięci rezydentnej po powtarzających się wyzwaniach płuc myszy wirusem grypy39. Dodatkowo mikroskopia dwufotonowa została wykorzystana w transplantacji skóry, nerek i wysp trzustkowych 40,41,42,43. Dzięki modelowi przeszczepu dawca i biorca mogą zostać zmienieni genetycznie w celu zbadania odpowiednich populacji komórek. Według naszej wiedzy, nasza grupa była pierwszą, która wykonała przyżyciowe obrazowanie dwufotonowe w mysich przeszczepach płuc4. Zaobserwowaliśmy szybką rekrutację i grupowanie neutrofili po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym za pośrednictwem przeszczepu, które zmniejszyło się wraz z farmakologicznym wyczerpaniem monocytówwe krwi 4. W kolejnych pracach wykazaliśmy, że monocyty pochodzące ze śledziony biorcy ułatwiają wynaczynienie neutrofili poprzez produkcję IL-1B44. Obrazowanie przyżyciowe w tych badaniach pozwoliło nam odkryć wcześniejsze regulatory wynaczynienia neutrofili jako możliwe cele terapeutyczne w celu zmniejszenia odpowiedzi zapalnej po przeszczepie45. Dodatkowo wykonaliśmy również obrazowanie przyżyciowe w bijącym sercu myszy po przeszczepieniu heterotopowym16. Uwidoczniliśmy rekrutację neutrofili do mięśnia sercowego i stwierdziliśmy, że ferroptotyczna śmierć komórek przeszczepu serca inicjuje stan zapalny po przeszczepie serca46. Zastosowaliśmy podobną technikę stabilizacji do przeszczepionych łuków aorty, aby uwidocznić transport monocytarny do blaszek miażdżycowych47. Badania te wykazały wykonalność i użyteczność obrazowania przyżyciowego niestatycznie przeszczepionych narządów klatki piersiowej.

Na koniec warto omówić metody wizualizacji różnych typów komórek i miąższu płuc. Do znakowania komórek stosuje się dwie główne metody - 1) transgeniczne szczepy myszy z mutacjami knock-in białek fluorescencyjnych i 2) znakowane fluorescencyjnie przeciwciała przeciwko komórkom barwionym. Powszechnie stosowane transgeniczne szczepy myszy do identyfikacji komórek odpornościowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej obejmują LysM-GFP dla neutrofili48, CX3Cr1-GFP dla różnych śródmiąższowych populacji makrofagów49,50, CCR2-GFP dla klasycznych monocytów51, CD19-tdTomato dla limfocytów B52 i Foxp3-GFP dla regulatorowych limfocytów T5. Warto zauważyć, że sam CX3Cr1 nie jest wystarczający do jednoznacznej identyfikacji komórek, ale może to być wspomagane przez morfologię i lokalizację komórek zgodną z morfologią i lokalizacją makrofagów śródmiąższowych. Makrofagi pęcherzykowe można obrazować bez znakowania ze względu na ich autofluorescencję53,54, charakterystyczną morfologię i zachowanie (tj. brak ruchliwości w rozdzielczości czasowej nagrań poklatkowych). W porównaniu z eozynofilami, które również są autofluorescencyjne, makrofagi pęcherzykowe są większe i znacznie jaśniejsze z wzbudzeniem 890 nm54. Alternatywnie, makrofagi pęcherzykowe można również znakować na podstawie ich funkcji fagocytarnej poprzez dopłucne podawanie agregatów barwnika54.

Wizualizacja komórek odpornościowych u biorców przeszczepów może być również osiągnięta przez wewnątrznaczyniowy transfer adoptywny komórek znakowanych fluorescencyjnie lub przez wstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał przeciwko specyficznym dla komórki markerom powierzchniowym18,55. Inną nieodłączną zaletą mikroskopii dwufotonowej jest SHG przez pewne dwójłomne struktury w tkance, takie jak kolagen56. Zjawisko to jest szczególnie przydatne w obrazowaniu płuc ze względu na wysoką zawartość kolagenu w workach pęcherzykowych, który działa jako wewnętrzny wskaźnik struktury pęcherzyków płucnych bez dodatkowych barwników fluorescencyjnych. Co więcej, pęcherzyki płucne są również otoczone naczyniami włosowatymi pęcherzyków płucnych oznaczonych kropkami q o długości 655 nm. Wreszcie, naczynia krwionośne można znakować za pomocą dożylnego wstrzyknięcia q-dots (zgodnie z opisem w niniejszym protokole) lub dextanu rodaminy B. Projektując eksperyment z mikroskopią dwufotonową w trybie przyżyciowym, zalecamy użycie nie więcej niż czterech różnych kanałów emisyjnych, aby zminimalizować ryzyko krwawienia i słabego rozróżnienia między kanałami.

Jednym z głównych ograniczeń opisanej przez nas techniki stabilizacji kleju jest niemożność usunięcia szkła nakrywkowego z płuca bez potencjalnego uszkodzenia tkanek i pozostałości kleju na powierzchni płuc. W związku z tym płuco można zobrazować tylko raz, a nie w wielu punktach czasowych w ciągu wielu dni. Aby rozwiązać ten problem, jedna grupa opisała półstałe okno obrazowania klatki piersiowej, które pozwala na seryjne obrazowanie płuc57. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że takie podejście nie pozwala na odpowiednią stabilizację płuc przez dłuższy czas obrazowania. Technika ta umożliwia obrazowanie płuc przez wiele godzin, co dostarcza kluczowych informacji na temat wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych po przeszczepie.

Inne ograniczenia obrazowania dwufotonowego obejmują wysokie koszty początkowe konfiguracji i wiedzy specjalistycznej wymaganej do konserwacji systemu. Pola skanowania są stosunkowo małe w porównaniu z obrazowaniem immunofluorescencyjnym. Uszkodzenia termiczne i fotologiczne mogą być znaczne bez starannej optymalizacji parametrów akwizycji. Funkcja rozproszenia punktu wzbudzenia dwóch fotonów jest szeroka, co nieco ogranicza rozdzielczość, zwłaszcza w wymiarze z. Ponadto obrazowanie dwufotonowe wymaga, aby komórki będące przedmiotem zainteresowania były znakowane fluorescencyjnie, a niektórych komórek nie można jednoznacznie oznaczyć pojedynczym markerem komórkowym. Liczba sygnałów, które mogą być obrazowane jednocześnie, jest często ograniczona do czterech lub mniej. Wreszcie, znieczulenie, operacja i obrazowanie mogą wywołać dodatkowe stany zapalne i zmiany fizjologiczne na szczycie przeszczepu płuc, które mogą zakłócić wyniki eksperymentalne i interpretacje, pomimo najlepszych wysiłków w celu utrzymania środowiska fizjologicznego. Przyszłe kierunki obejmują rozwój małoinwazyjnych metod obrazowania przyżyciowego (takich jak mniejsza torakotomia lub dostęp bronchoskopowy).

Podsumowując, przyżyteczna mikroskopia dwufotonowa jest nieocenionym narzędziem w badaniu wielu procesów chorobowych. W tym miejscu opisano wiarygodną technikę unieruchomienia płuc i obrazowania dwufotonowego, która pozwala na przyżyciową obserwację transportu komórkowego i dynamicznych interakcji między różnymi populacjami komórek po przeszczepieniu płuc u myszy. Technika ta poszerzyła naszą wiedzę na temat krajobrazu immunologicznego po przeszczepie i nadal będzie niezastąpionym narzędziem w badaniach nad przeszczepem płuc i innymi procesami chorobowymi płuc.

Oświadczenia

Autorzy nie informują o żadnych istotnych ujawnieniach.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez granty z NIH 1P01AI11650 i Fundacji na rzecz Szpitala Żydowskiego Barnes. Dziękujemy Rdzeniowi Obrazowania In Vivo w Washington University School of Medicine.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,75% powidon-jodAplicareNDC 52380-0126-2Do środka dezynfekującego
1-calowy cewnik dożylny 20GTerumoSROX2025CADo rurki dotchawiczej (ETT)
1-calowa taśma jedwabnaDurapore3M ID 7100057168Aby zabezpieczyć mysz w pozycji
20-krotne zanurzenie w wodzie długa soczewka obiektywuOlympusN20X-PFH
3M KlejVetbondMedi-Vet.com10872Do przyklejania szkła nakrywkowego do płuc
655 nm niedocelowych kropek kwantowychThermoFisherQ21021MPDo znakowania naczyń krwionośnych
70% etanoluSigma AldrichEX0281Do środka dezynfekującego
Argent High Temp Fine Tip Długopis kauterycznyMcKesson231
O-ring (2 cm)Sklep z narzędziamiNie dotyczy Doobrazowania na zamówienie komora
Śruba (2)Sklep z narzędziamiNie dotyczy Dokomory obrazowania
Mosiężna nakrętka kciukowa (2)Sklep z narzędziamiNie dotyczy Dokomory obrazowania zbudowanej na zamówienie
Buprenorfina 1,3 mg / mlFidelis Zdrowie zwierzątNDC 86084-100-30Do kontroli bólu
Chameleon tytanowo-szafirowy femtosekundowy laser impulsowyCoherentN/A
Szkło nakrywkowe (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63Do niestandardowej komory obrazowania
Zakrzywiony zacisk na komary (1)Fine Science Tools13009-12
Dwukanałowy sterownik grzałkiWarner InstrumentsTC-344B
Precyzyjne nożyczki (1)Fine Science Tools15040-11
Mikroskop pionowy stojącyOlympusBX51WI
Gaza (przycięta do 1 cm x 3 cm)McKesson476709Do umieszczenia pod lewym płucem
Smar wysokopróżniowyDow CorningN/ADo przyklejenia szkła nakrywkowego do górnej płyty
Izofluran 1%Sigma Aldrich26675-46-7Do znieczulenia
Chlorowodorek ketaminy 100 mg/mlVedcoNDC 50989-996-06Do znieczulenia
Blacha (3 cm x 7 cm)Sklep z narzędziamiN/ADo zbudowanej na zamówienie komory obrazowania
Spiczaste aplikatory z bawełnianą końcówkąSolon56225Do manipulowania płucami i do sekcji
Maszynka do strzyżenia Power Pro UltraOster078400-020-001
Puralube Maść do oczu weterynarzaMedi-Vet.com11897Aby zapobiec wysuszeniu oczu
Respirator dla małych zwierzątHarvard Aparatura55-0000
Kleszcze proste (1)Fine Science Tools91113-10
Trzykanałowy sterownik migawkiUniblitzVMM-D3Skaner rezonansowy
x.y.z Optyczny silnik krokowyPrior ScientificOptiScan II
Ksylazyna 20 mg / mlAkornNDC 59399-110-20Do kontroli bólu
zbudowanej na zamówienie

Bibliografia

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Khush, K. K., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 37th adult heart transplantation report-2020; focus on deceased donor characteristics. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1003-1015 (2020).
  3. Wang, J. H., Skeans, M. A., Israni, A. K. Current status of kidney transplant outcomes: Dying to survive. Adv Chronic Kidney Dis. 23 (5), 281-286 (2016).
  4. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  5. Li, W., et al. Bronchus-associated lymphoid tissue-resident Foxp3+ T lymphocytes prevent antibody-mediated lung rejection. J Clin Invest. 129 (2), 556-568 (2019).
  6. Kurihara, C., et al. Crosstalk between nonclassical monocytes and alveolar macrophages mediates transplant ischemia-reperfusion injury through classical monocyte recruitment. JCI Insight. 6 (6), e147282(2021).
  7. Spahn, J. H., et al. DAP12 expression in lung macrophages mediates ischemia/reperfusion injury by promoting neutrophil extravasation. J Immunol. 194 (8), 4039-4048 (2015).
  8. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  9. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2 (11), 872-880 (2002).
  10. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  11. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  12. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Ashworth, S. L., Sandoval, R. M., Tanner, G. A., Molitoris, B. A. Two-photon microscopy: visualization of kidney dynamics. Kidney Int. 72 (4), 416-421 (2007).
  15. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9(+) cell to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203-12213 (2020).
  16. Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. J Clin Invest. 122 (7), 2499-2508 (2012).
  17. Nava, R. G., et al. Two-photon microscopy in pulmonary research. Semin Immunopathol. 32 (3), 297-304 (2010).
  18. Li, W., et al. Necroptosis triggers spatially restricted neutrophil-mediated vascular damage during lung ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (10), e2111537119(2022).
  19. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  20. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
  21. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
  22. Grzybowski, A., Pietrzak, K. Maria Goeppert-Mayer (1906-1972): two-photon effect on dermatology. Clin Dermatol. 31 (2), 221-225 (2013).
  23. Göppert-Mayer, M. Uber Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys. 401 (3), 273-294 (1931).
  24. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  25. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Diaspro, A., et al. Multi-photon excitation microscopy. Biomed Eng Online. 5, 36(2006).
  27. Williams, R. M., Piston, D. W., Webb, W. W. Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry. FASEB J. 8 (11), 804-813 (1994).
  28. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  29. Chtanova, T., et al. Dynamics of neutrophil migration in lymph nodes during infection. Immunity. 29 (3), 487-496 (2008).
  30. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  31. Stanciu, S. G., et al. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and Bag-of-Features image classification. Sci Rep. 4, 4636(2014).
  32. Hsiao, C. Y., et al. Improved second harmonic generation and two-photon excitation fluorescence microscopy-based quantitative assessments of liver fibrosis through auto-correction and optimal sampling. Quant Imaging Med Surg. 11 (1), 351-361 (2021).
  33. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126 (2023).
  34. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  35. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  38. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infect Immun. 82 (2), 864-872 (2014).
  39. MacLean, A. J., et al. Secondary influenza challenge triggers resident memory B cell migration and rapid relocation to boost antibody secretion at infected sites. Immunity. 55 (4), e718 718-733 (2022).
  40. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (31), 12863-12868 (2011).
  41. Camirand, G. New perspectives in transplantation through intravital microscopy imaging. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 6-12 (2013).
  42. Camirand, G., et al. Multiphoton intravital microscopy of the transplanted mouse kidney. Am J Transplant. 11 (10), 2067-2074 (2011).
  43. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17 (6), 744-749 (2011).
  44. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  45. Li, W., et al. Resolvin D1 prevents injurious neutrophil swarming in transplanted lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (31), e2302938120(2023).
  46. Li, W., et al. Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation. J Clin Invest. 129 (6), 2293-2304 (2019).
  47. Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-Brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (5), 1030-1036 (2018).
  48. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  49. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods Mol Biol. 1041, 307-317 (2013).
  50. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute Crit Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  51. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circ Res. 124 (2), 263-278 (2019).
  52. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), e134700(2020).
  53. Lohmeyer, J., Friedrich, J., Rosseau, S., Pralle, H., Seeger, W. Multiparameter flow cytometric analysis of inflammatory cells contained in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 172 (1), 59-70 (1994).
  54. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), e111 110-125 (2020).
  55. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  56. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  57. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie in vivotransplantacja płucprzeszczep płuc myszytrafficking komórek odpornościowychortotopowa transplantacja płucinfiltracja neutrofiliregulacyjne limfocyty Tokno obrazującealloprzeszczep płuc
Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.