Nieniszcząca kwantyfikacja aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych orzechach ziemnych (Arachis spp.) Nasiona

Podsumowanie

Demonstrujemy średnioprzepustową metodę ilościowego oznaczania aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych nasionach orzeszków ziemnych przy użyciu ultra wydajnej chromatografii cieczowej. Metoda ta została opracowana specjalnie do analiz dzikich gatunków pajęczaków zagrożonych przez aflatoksynogenne gatunki Aspergillus.

Streszczenie

Aflatoksyny są wysoce rakotwórczymi metabolitami wtórnymi niektórych gatunków grzybów, szczególnie Aspergillus flavus. Aflatoksyny często zanieczyszczają ważne gospodarczo towary rolne, w tym orzeszki ziemne, stwarzając wysokie ryzyko dla zdrowia ludzi i zwierząt. Ze względu na wąską bazę genetyczną odmiany orzeszków ziemnych wykazują ograniczoną odporność na patogeny grzybowe. W związku z tym wiele gatunków dzikich orzeszków ziemnych z tolerancją na Aspergillus otrzymało znaczną uwagę naukowców jako źródło odporności na choroby.

Badanie plazmy zarodkowej roślin pod kątem odporności na aflatoksyny jest trudne, ponieważ akumulacja aflatoksyn nie przebiega zgodnie z rozkładem normalnym, co dyktuje potrzebę analiz tysięcy pojedynczych nasion orzeszków ziemnych. Wystarczająco uwodnione nasiona orzeszków ziemnych (Arachis spp.), po zakażeniu przez gatunki Aspergillus, są zdolne do wytwarzania biologicznie aktywnych stylbenów (stilbenoidów), które są uważane za obronne fitoaleksyny. Stylbeny z orzeszków ziemnych hamują rozwój grzybów i produkcję aflatoksyn. Dlatego tak ważne jest, aby przeanalizować te same nasiona pod kątem stilbenoidów z orzeszków ziemnych, aby wyjaśnić naturę odporności/podatności nasion na inwazję Aspergillus. Żadna z opublikowanych metod nie oferuje analiz pojedynczych nasion na obecność aflatoksyn i/lub fitoaleksyn stylbenowych.

Próbowaliśmy zaspokoić zapotrzebowanie na taką metodę, która jest przyjazna dla środowiska, wykorzystuje tanie materiały eksploatacyjne oraz jest czuła i selektywna. Ponadto metoda jest nieniszcząca, ponieważ wykorzystuje tylko połowę nasion i pozostawia nienaruszoną drugą połowę zawierającą oś zarodkową. Taka technika pozwala na kiełkowanie i wzrost rośliny orzeszków ziemnych do pełnej dojrzałości z tych samych nasion, które są używane do analizy aflatoksyn i stilbenoidów. Zintegrowana część tej metody, ręczne wyzwanie nasion za pomocą Aspergillus, jest krokiem ograniczającym, który wymaga więcej czasu i pracy w porównaniu z innymi etapami metody. Metoda ta została wykorzystana do eksploracji dzikiej plazmy zarodkowej Arachis w celu identyfikacji gatunków odpornych na Aspergillus oraz określenia i scharakteryzowania nowych źródeł genetycznej odporności na ten patogen grzybowy.

Wprowadzenie

Orzeszki ziemne (Arachis hypogaea L.) to jedna z głównych roślin spożywczych na świecie. Jest uprawiany w ponad 100 krajach, a jego łączna produkcja przekracza 45 milionów ton¹. Towary rolne, takie jak orzeszki ziemne, kukurydza i nasiona bawełny, są często atakowane przez gatunki Aspergillus, grzybów glebowych, które wytwarzają aflatoksyny². Surowce te są szczególnie podatne na zanieczyszczenie aflatoksynami przed zbiorami, gdy warunki środowiskowe charakteryzują się wysokimi temperaturami i suszą. Aflatoksyny są jednymi z najsilniejszych znanych czynników rakotwórczych³. Zanieczyszczają one jedną czwartą towarów rolnych na świecie⁴, co sprawia, że około połowa światowej populacji jest chronicznie narażona na aflatoksyny⁵. Ze względu na ich wysoką rakotwórczość i toksyczność, obecność aflatoksyn w żywności jest regulowana na najniższych praktycznie dopuszczalnych limitach w większości krajów świata⁶.

Unia Europejska (UE) uchwaliła maksymalny poziom 2 ng/g dla aflatoksyny B₁ i 4 ng/g dla aflatoksyn ogółem (B₁, B₂, G₁ i G₂) w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi⁷. Tak niskie limity wywierają znaczną presję na rolnictwo i przemysł spożywczy, które przetwarzają towary zanieczyszczone aflatoksynami. Monitorowanie aflatoksyn i ponowne przetwarzanie skażonych orzeszków ziemnych można uznać za pasywną i kosztowną strategię zapobiegania przedostawaniu się aflatoksyn do łańcucha żywnościowego. Dlatego wszystkie główne segmenty przemysłu orzechowego doświadczają ogromnych strat zysków z powodu zanieczyszczenia aflatoksynami obecnych odmian orzeszków ziemnych, które często wykazują ograniczoną odporność na choroby grzybowe. Perspektywicznym podejściem do rozwiązania problemu aflatoksyn jest uzyskanie odpornych na grzyby odmian orzeszków ziemnych poprzez introgresję genów, czyli transfer informacji genetycznej z odpornych dzikich gatunków orzeszków ziemnych do elitarnych odmian. W ostatnich latach^8,9, dzikie gatunki orzeszków ziemnych były brane pod uwagę jako źródło odporności na choroby genetyczne, ponieważ wąska baza genetyczna uprawianych orzeszków ziemnych nie jest już w stanie zapewnić wymaganego poziomu cech odporności rośliny orzeszków ziemnych^10,11. Udana introgresja z dzikich gatunków orzeszków ziemnych wymaga analizy tysięcy pojedynczych, małych i rzadkich nasion (Rysunek 1A) ¹².

Rysunek 1: Schemat blokowy analizy pojedynczego nasiona. (A) Porównawcza wielkość różnych odmian orzeszków ziemnych typu rynkowego w porównaniu z dzikimi Arachis spp. (1) Wirginia; (2) biegacz; (3) język hiszpański; (4) dziki Arachis spp. (B) dziki Arachis spp. (tabliczka A, nasiono 4) pocięte na trzy części, (5) połówka nasion o osi zarodkowej; ta część nasion jest używana do wyhodowania rośliny (E). (C) Części (6) i (7) są wiercone wiertłem i (D) zaszczepiane zarodnikami grzybów. Po inkubacji przez 72 godziny w temperaturze 30 °C, jedna z części nasion, (6) lub (7) jest używana do analiz aflatoksyn i fitoaleksyn, a druga jest używana do sekwencjonowania RNA/transkryptomu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odporność orzeszków ziemnych na patogeny grzybowe jest silnie związana z fitoaleksynami^{13,14,15,16,17}. Fitoaleksyny z orzeszków ziemnych są reprezentowane przez przeciwdrobnoustrojowe stilbenoidy, które są biosyntetyzowane i kumulowane w tkankach roślinnych po ekspozycji na bodźce egzogenne, w szczególności na inwazję grzybów^16,17,18. Szybkie nagromadzenie wystarczających stężeń fitoaleksyn w miejscu inwazji grzybów hamuje rozwój grzybów i ma kluczowe znaczenie dla obrony roślin^19,20,21. Patogen przestaje rosnąć, gdy fitoaleksyny gromadzą się do stężeń hamujących^16,22. Rola stilbenoidów jako związków obronnych przed grzybami aflatoksynogennymi w orzeszkach ziemnych została oceniona ponad 30 lat temu w eksperymentach polowych¹³. Eksperymenty te wyraźnie potwierdziły hipotezę, że stilbenoidy z orzeszków ziemnych są kluczowym czynnikiem odporności na zanieczyszczenie aflatoksynami przed zbiorami. Takie dowody opierają się na faktach, że stylbeny są naturalnie wytwarzane w orzeszkach ziemnych uszkodzonych na polu; stylbeny wykazują znaczną aktywność biologiczną przeciwko grzybom aflatoksynogennym; Zanieczyszczenie aflatoksynami w nasionach wykryto tylko wtedy, gdy orzeszki ziemne utraciły zdolność do syntezy fitoaleksyny z powodu odwodnienia nasion wywołanego suszą. Kolejny zestaw doświadczeń polowych potwierdził związek między produkcją fitoaleksyny a odpornością genotypu orzeszków ziemnych na choroby orzeszków ziemnych o znaczeniu rolniczym¹⁷.

Lepsze zrozumienie naturalnego mechanizmu odporności orzeszków ziemnych na inwazję grzybów opartego na fitoaleksynach jest obiecującą strategią kontroli zanieczyszczenia aflatoksynami^15,17. Dlatego oprócz analiz aflatoksyn ważne jest, aby ilościowo analizować te same nasiona pod kątem fitoaleksyn. Chociaż ten mechanizm odporności nie jest w pełni zbadany i zrozumiany, to jednak ma kluczowe znaczenie dla hodowli i genetycznej modyfikacji roślin orzeszków ziemnych w celu uzyskania nowych odmian odpornych na grzyby²³. Pomimo istnienia różnych procedur analitycznych do oznaczania aflatoksyn w różnych towarach, nadal istnieje zapotrzebowanie na proste metody do konkretnych badań, szczególnie gdy tradycyjne metody nie spełniają wymogów analitycznych i opłacalnych. Najbardziej nowoczesne metody oczyszczania stosowane w przemyśle orzechowym, rolnictwie i prywatnych laboratoriach to urządzenia oparte na przeciwciałach²⁴ i immunoassay^25,26,27. Są selektywne i czułe, ale znacznie droższe niż minikolumny wypełnione zwykłymi adsorbentami. Ponadto żadna z tych metod nie została opracowana z myślą o analizie próbek o masie kilku miligramów. Opierając się na naszych wcześniejszych badaniach nad analitycznym zastosowaniem minikolumn z żelem magnezowo-krzemionkowym (Florisil)²⁸, zmodyfikowaliśmy tę procedurę, aby dostosować ją do potrzeb trwających i przyszłych programów przedhodowlanych i hodowlanych.

Celem tej pracy było opracowanie nieniszczącej, średnio przepustowej, przyjaznej dla środowiska metody ilościowego oznaczania aflatoksyn i fitoaleksyn w pojedynczych nasionach orzeszków ziemnych. Taka metoda została opracowana. Jego przewagą nad opublikowanymi metodami to wyższa czułość, możliwość analizy aflatoksyn i fitoaleksyn w ekstrakcie z pojedynczych nasion, brak konieczności ważenia próbek oraz niższy koszt dzięki mniejszym objętościom materiałów eksploatacyjnych. Schemat blokowy metody zintegrowanej przedstawiono na rysunku 1. Analizy genetyczne i inne etapy są wymienione w tym tekście i przedstawione na rysunku, aby pokazać znaczenie sugerowanej metody i jej integrację z całą procedurą.

Protokół

1. Przygotowanie nasion do wyzwania grzybowego

1. Inkubować aflatoksynentny Aspergillus flavus NRRL 3357 na skosie agaru z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) w probówce przez 6 dni w temperaturze 30 °C. Zebrać zarodniki grzybów z probówki z 10 ml wody z Tween 20 (100 μl Tween w 1 litrze destylowanej sterylnej wody), przefiltrować przez watę szklaną umieszczoną w lejku i policzyć zarodniki za pomocą hemocytometru zgodnie z instrukcją obsługi.
2. Rozcieńczyć zawiesinę zarodników sterylną wodą do stężenia 1,000 zarodników/μl. Potwierdź stężenie hemocytometrem.
   UWAGA: Przygotuj zawiesinę zarodników nie wcześniej niż 2 godziny przed wymagającymi eksperymentami.
3. Delikatnie rozbij strąki orzeszków ziemnych i usuń łuski. Umieść nasiona w sterylnej zlewce tak, aby objętość nasion nie przekraczała 1/5 objętości zlewki, dodaj 0,05% roztworu nadtlenku wodoru do około 70% objętości zlewki i pozwól nasionom wchłonąć wodę przez 3 godziny.
4. Zdekantować roztwór nadtlenku wodoru z nasion i dodać około 3 razy więcej niż 80% mieszaniny etanolu i wody (v/v) do zlewki, aby przykryć nasiona. Odstawić na 1 minutę, a następnie opłukać nasiona 2x równą objętością sterylnej wody destylowanej.
5. Dodać 5-krotną objętość 3% nadtlenku wodoru do zlewki z nasionami wysterylizowanymi etanolem i odstawić na 5 minut, następnie zdekantować płyn i dwukrotnie przepłukać nasiona równą objętością sterylnej wody (rysunek 2A).

Rysunek 2: Przygotowanie nasion orzeszków ziemnych do inokulacji, inkubacji i ekstrakcji frakcji aflatoksyny i fitoaleksyny. (A) Sterylizacja wchłoniętych nasion 3% nadtlenkiem wodoru; (B) usunięcie testa (skórki) z nasion; (C) odcięcie części osi zarodka; (D,E) wiercenie wnęki w połowie liścienia za pomocą wiertła; (F) umieszczanie wysianych części nasion na agarze ; (G) wprowadzenie zarodników grzybów do wywierconej jamy. H) szalka Petriego z nasionami po inkubacji; (I) umieszczanie inkubowanych pojedynczych nasion (zdjęcie próbek kontrolnych) we wzmocnionych rurkach z kulkami; J) dodanie odmierzonej objętości rozpuszczalnika ekstrakcyjnego; (K) rozdrabnianie próbek w szczelinie perełkowej; (L) odwirowanie sproszkowanej gnojowicy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Umieść nasiona na sterylnym ręczniku papierowym, usuń pestkę testa za pomocą kleszczy i odetnij skalpelem około 1/3 nasion zawierających oś embrionalną (Rysunek 2B,C).
7. Wyrzuć tę część nasion lub użyj jej do wyhodowania rośliny w probówce z pożywką wzrostową (Rysunek 1B, E).
8. Podziel pozostałą część nasion na dwa liścienie, umieść je na szalce Petriego, przykryj części nasion wilgotną sterylną bibułą filtracyjną, załóż pokrywkę, aby uniknąć odwodnienia i natychmiast przejdź do etapu zaszczepiania.
9. Przed wykonaniem trudnych eksperymentów przygotuj wystarczającą liczbę szalek Petriego z pożywką do inkubacji nasion, wlewając 26 ml 1,5% sterylnego agaru do wody do szalek o wymiarach 100 x 15 mm i pozwól im zestalić się przez noc.
10. Na środku zewnętrznej strony każdego pozostałego liścienia wykonaj wgłębienie o głębokości 1,5-2 mm, ręcznie wysiewając nasiona sterylnym ostrym wiertłem o średnicy 1,6-2,34 mm. Wykonanie ubytku zajmuje ~2-5 s (Rysunek 2D,E).
11. Umieścić od 4 do 6 "wysianych" kawałków nasion na szalce Petriego z agarem i nanieść 2 μl zawiesiny 1000 zarodników/μl do wywierconej wnęki każdego połówki liścienia za pomocą pipetera o pojemności 10 μl. Zamiast zawiesiny zarodników, nałóż sterylną wodę na nasiona kontrolne (Rysunek 2F,G).
12. Przykryć wszystkie szalki Petriego pokrywkami i inkubować w temperaturze 30 °C bez światła przez 72 godziny.

2. Pobieranie próbek i przygotowanie inkubowanych części nasion do analizy aflatoksyn i fitoaleksyny

1. Zbierz kawałki nasion po 72 godzinach, wyjmując je z agaru za pomocą kleszczy i umieszczając każdy z nich w oznaczonych fiolkach z kulkami o pojemności 7 ml z 13 ceramicznymi kulkami cyrkonowymi (12 o średnicy 2,8 mm i 1 o średnicy 6,5 mm) (Rysunek 2H,I).
   UWAGA: W tym momencie, jeśli fiolki nie zostaną natychmiast przetworzone, można je umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C i przechowywać do 2 miesięcy przed dalszym przetwarzaniem.
2. Fitoaleksyny i aflatoksyny są oznaczane w tym samym ekstrakcie z nasion. W celu ekstrakcji, w zależności od wizualnej wielkości nasion (małej, średniej lub dużej), dodaj 2 lub 4 ml precyzyjnie odmierzonej mieszaniny metanolu i wody (90:10, v/v) do fiolek z kulkami i sproszkowaj z prędkością 5,5 m/s przez 45 s. Umieścić fiolki ze sproszkowanymi nasionami w wirówce i odwirować w ilości 1 860 × g przez 3 minuty (Rysunek 2J - L).
   UWAGA: Określa się następujące ważne^17,22 pochodne stilbenoidu (wszystkie w konfiguracji trans): resweratrol, arachidyna-1, arachidyna-2, arachidyna-3, 3′-izopentadienylo-3,5,4′-trihydroksystilben (IPD) i SB-1.
3. W przypadku analiz aflatoksyn, przed przeprowadzeniem trudnych eksperymentów, należy przygotować wystarczającą liczbę kolumn czyszczących w następujący sposób. Umieścić pasującą porowatą frytę polietylenową (20 μl) w kolumnie polipropylenowej o pojemności 1,5 ml za pomocą pręta szklanego przyciętego pod kątem 90^o. Umieść 50 mg żelu magnezowo-krzemionkowego (100-200 mesh) w kolumnie za pomocą specjalnie wykonanej miarki i przykryj kolumnę identyczną frytą, dociskając ją szklanym prętem (Rysunek 3A - E).
   UWAGA: Ta ilość żelu magnezowo-krzemionkowego zajmuje objętość 75 μL, a wysokość warstwy adsorbentu wynosi 3 mm.

Rysunek 3: Przygotowanie kolumn czyszczących i filtrów. (A,B) Umieszczenie porowatej fryty w beczce; (C,D) napełnianie beczki żelem magnezowo-krzemionkowym; (E) zapakowanie adsorbentu i włożenie górnej porowatej fryty do beczki. (F) Umieszczenie koła z włókna szklanego o średnicy 11,5 mm na pipecie Pasteura. (G,H) Dociskając środek koła plastikowym lub drewnianym prętem do dna cylindra pipety Pasteura i mocno zagęszczając włókno szklane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. W tym momencie przygotuj odpowiednią liczbę niestandardowych filtrów, jak pokazano na Rysunek 3F - H.
5. W przypadku analiz aflatoksyn należy dokładnie odmierzyć do 0,5 ml podwielokrotności supernatantu (otrzymanej zgodnie z opisem w kroku 2.2), przenieść ją do specjalnie zapakowanej minikolumny i pozwolić, aby ekstrakt odsączył się grawitacyjnie do szklanej fiolki o pojemności 4 ml. Przenieś 1,0 ml mieszaniny metanolu i wody (90:10, v/v) do kolumny, aby wypłukać zanieczyszczenia grawitacyjnie, do tej samej fiolki o pojemności 4 ml (Rysunek 4A).

Rysunek 4: Oczyszczanie ekstraktów z nasion i przygotowanie do analiz UPLC. (A) Stojak z wypełnionymi kolumnami. (B) Rozpuszczalnik odparowujący z gazem_N2 z sześciu fiolek o pojemności 4 ml z oczyszczonym ekstraktem eluowanym z kolumn czyszczących. (C) Doprowadzenie fiolek i filtrów do temperatury poniżej zera w pojemnikach piankowych (1 i 2) z lodem przed i po dodaniu rozpuszczalnika do wstrzykiwań (MeOH-H₂O 9:1, v/v) do fiolek o pojemności 4 ml. (D) Filtrowanie schłodzonego ekstraktu z fiolki o pojemności 4 ml do fiolki z automatycznym samplerem o pojemności 400 μl. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Odrzucić połączone eluaty. Eluować frakcję aflatoksyny grawitacyjnie z kolumny do czystej szklanej fiolki o pojemności 4 ml z mieszaniną 1,2 ml acetonu, acetonitrylu i wody, 88% kwasu mrówkowego (65:31:3,5:0,5, v/v) (Rysunek 4A).
7. Alternatywnie, wymyć aflatoksyny z kolumny za pomocą 2,0 ml mieszaniny acetonitrylu, wody i 88% kwasu mrówkowego (96:3,5:0,5, v/v) i wstrzyknąć podwielokrotność eluatu, do 2 μl, bezpośrednio do systemu ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) (bez odparowywania rozpuszczalnika z_N2).
   UWAGA: W takim przypadku należy spodziewać się do 10-krotnie niższego limitu ilościowego dla aflatoksyn; W większości przypadków taki spadek wrażliwości jest dopuszczalny, ponieważ stężenia aflatoksyn w zakwestionowanych nasionach są często wysokie.
8. Usunąć rozpuszczalnik z fiolek w strumieniu_N2 w bloku podgrzanym w temperaturze 45 °C. Zakryć fiolkę i umieścić ją w pojemniku z pokruszonym lodem na 30-45 s, aby zminimalizować parowanie rozpuszczalnika dodawanego w następnym etapie. Umieść wykonane na zamówienie filtry w jednorazowych probówkach i włóż probówki do lodu w innym pojemniku, aby zminimalizować parowanie rozpuszczalnika podczas filtracji (Rysunek 4B, C).
9. Po odparowaniu rozpuszczalnika rozpuść suchą pozostałość w precyzyjnie odmierzonym 0,25-1,0 ml mieszaniny metanolu i wody (90:10, v/v) i wiruj przez 1-2 s. Umieść fiolki z oczyszczonymi ekstraktami w autosamplerze UPLC i wstrzyknij 0,1 do 3,0 μl do systemu UPLC (Rysunek 5A,B).
   UWAGA: Jeśli podejrzewa się, że roztwór po wirowaniu zawiera zawieszone cząstki, przefiltruj roztwór przez schłodzony filtr (Rysunek 4D).

Rysunek 5: Proces i wyniki analiz UPLC oczyszczonych ekstraktów. (A) Umieszczenie stojaka z oczyszczonymi ekstraktami próbek w automatycznym podajniku próbek UPLC. (B) Przeprowadzanie analiz instrumentalnych, uzyskiwanie danych i interpretowanie wyników. C) UPLC czterech głównych aflatoksyn; główne szczyty zainteresowania, aflatoksyny B₁ i B₂ reprezentują odpowiednio 0,04 i 0,004 ng. D) UPLC aflatoksyn B₁ i B₂; pik 2 reprezentuje aflatoksynę B₁ na poziomie 2 pg (z kuwetą przepływową o pojemności 8 μl). (E) UPLC oczyszczonego ekstraktu z nasion zebranych z lokalnego pola orzeszków ziemnych z dzikim gatunkiem Arachis. (F) UPLC ekstraktu z zakwestionowanych nasion orzeszków ziemnych oczyszczonego za pomocą minikolumny zasadowego tlenku glinu. G) UPLC ekstraktu z kwestionowanych nasion orzeszków ziemnych oczyszczonego kolumną Florisil; chromatogram niebieski przedstawia zanieczyszczenia, które są wypłukiwane z kolumny za pomocą 1 ml mieszaniny metanolu i wody (90:10 v/v); chromatogram pokazuje piki aflatoksyn_M1 i_B1. Poziom aflatoksyny B₁ wynosi 48 ng/g. (H) Typowy chromatogram stylbenoidów orzeszków ziemnych z zakwestionowanego materiału siewnego; skrót: IPD = 3′-izopentadienylo-3,5,4′-trihydroksystilben. Uwaga: Wszystkie stilbenoidy w ekstraktach z nasion są w konfiguracji trans. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. 

10. W przypadku analizy fitoaleksyny, z każdej fiolki z kulkami, przenieść 200 μl supernatantu do powyższego filtra pipetowego Pasteura. Użyj gazu N₂ ze zbiornika sprężonego azotu, aby przyspieszyć filtrację do fiolki z automatycznym samplerem UPLC o pojemności 400 μl i zakryj fiolkę pasującą nasadką z przegrodą PTFE (Rysunek 4D).

3. Analizy aflatoksyn

1. Do separacji aflatoksyn w ekstraktach nasiennych należy użyć systemu UPLC wyposażonego w automatyczny podajnik próbek, pompę czwartorzędową, detektor fluorescencyjny, kolumnę UPLC BEH C18 3,0 mm x 100 mm, 1,7 μm z dopasowaną kolumną wstępną oraz pokolumnowy reaktor fotochemiczny (PHRED) ze standardową cewką z dzianiny PTFE o średnicy wewnętrznej 0,25 przyciętą do 25% jej pierwotnej długości.
   UWAGA: Przyrząd UPLC i związany z nim sprzęt używany przez autorów są wymienione w Tabeli Materiałów.
2. Użyj wody (A), metanolu (B) i acetonitrylu (C) w następującym gradiencie: warunki początkowe, 62,7% A, 24% B, 13,3% C, zmienione liniowo na 30% A, 45% B, 25% C w 3,75 min, zmienione na 0% A, 64,4% B, 35,6% C w 3,751 min, utrzymywane w stanie izokratycznym przez 3,249 min, następnie zmienione na warunki początkowe w 0,01 min i utrzymywane izokratyczne przez 2,499 min przed następnym wstrzyknięciem. Ustaw natężenie przepływu na 0,45 ml/min i czas pracy na 9,5 min. Utrzymywać kolumnę w temperaturze 40 °C w grzałce kolumny systemu. Użyć 362 nm i 440 nm jako długości fal wzbudzenia i emisji, odpowiednio, dla oznaczania ilościowego aflatoksyn B₁, B₂, G₁, G₂ i_M1. Struktury głównych aflatoksyn są pokazane w Rysunek 6A.
   UWAGA: W warunkach doświadczalnych oczekuje się, że A. flavus NRRL 3357 wytworzy tylko aflatoksyny B₁ i B₂; jeśli szczep A. parasiticus jest używany do wysiewu prób, spodziewana jest produkcja aflatoksyn B₁, B₂, G₁ i G₂.
3. Oznaczyć stężenia aflatoksyn poprzez odniesienie do powierzchni pików odpowiednich autentycznych wzorców (krzywa kalibracyjna) zgodnie z opisem w instrukcji obsługi oprogramowania.
   UWAGA: Ponieważ procedura UPLC wykazuje szum bazowy przy wysokich ustawieniach czułości detektora fluorescencyjnego, granica wykrywalności (LOD) i granica ilościowa (LOQ) dla aflatoksyn są oceniane przy użyciu powszechnie akceptowanego stosunku sygnału do szumu wynoszącego 3:1 dla LOD i 10:1 dla LOQ. W rutynowym stanowisku doświadczalnym do analizy nasion orzeszków ziemnych, opisanym w sekcjach 2 i 3, oczekuje się, że limity ilościowe dla aflatoksyn G₁ i B₁ będą mniejsze lub równe 0,8 i 0,08 ng/g odpowiednio dla aflatoksyn G₂ i B₂.

4. Analizy fitoaleksyny stilbenoidowej

1. Do separacji stilbenoidów należy użyć wody (A), metanolu (B) i 88% kwasu mrówkowego (C) w następującym gradiencie: warunki początkowe, 53% A, 42% B, 5% C, zmienione liniowo do 35% A, 60% B, 5% C w 2,0 min, utrzymywane w stanie izokratycznym przez 4 min, zmienione na 0% A, 95% B, 5% C w 0,5 min, utrzymywane w stanie izokratycznym przez 2,5 min, następnie zmienił się do warunków początkowych w ciągu 0,1 minuty i utrzymywał izokratyczny przez 2,9 minuty przed następnym wstrzyknięciem. Ustaw natężenie przepływu na 0,5 ml/min i czas pracy na 12,0 min.
2. Oznaczyć stężenia stilbenoidów poprzez odniesienie do powierzchni pików odpowiednich autentycznych wzorców (krzywa kalibracyjna) i/lub do opublikowanych współczynników ekstynkcji molowej, jak opisano w instrukcji obsługi oprogramowania. Struktury głównych fitoaleksyn pochodzących z stylbenu są pokazane w Rysunek 6B.
   UWAGA: Separację fitoaleksyn uzyskuje się przy użyciu tego samego systemu, ale bez detektora fluorescencyjnego i reaktora PHRED. Zamiast tego do wykrywania i oznaczania ilościowego stilbenoidów z orzeszków ziemnych stosuje się detektor matrycowy z matrycą diodową. Graniczna wartość ilościowa (LOQ) dla głównych fitoaleksyn stilbenoidowych nie ma praktycznego znaczenia, ponieważ stężenia stilbenoidów przekraczają stężenia aflatoksyn w tym samym ekstrakcie o kilka rzędów wielkości; Po 3 dniach inkubacji stilbenoidy są wiarygodnie oznaczane ilościowo.

Wyniki

Opracowana metoda oznaczania ilościowego aflatoksyn w nasionach jest podstawą całej procedury oceny gatunków dzikich orzeszków ziemnych pod kątem odporności na akumulację aflatoksyn. Specjalnie zapakowane minikolumny i filtry zapewniają znaczne oszczędności i upraszczają całą procedurę ze względu na brak dużych ilości rozpuszczalników, kosztownych i niepotrzebnych komercyjnych filtrów 0,22 lub 0,45 μm oraz urządzeń pompujących. Metoda analizy aflatoksyn zapewnia wysoki odzysk, dokładność i precyzję w badanym zakresie 1,0-50,0 ng/g aflatoksyn ze zmielonych nasion, jak pokazano w tabeli 1. Silnie zanieczyszczone próbki rozcieńczono do wartości liniowej badanej. Rysunek 5C pokazuje podstawową separację czterech głównych aflatoksyn, B₁, B₂, G₁ i G₂ w ciągu 5 minut elucji, co jest akceptowalne, ponieważ wyzwaniem dla grzybów pestek orzeszków ziemnych jest graniczny etap procedury, a nie analizy UPLC.

Proponowana metoda jest wystarczająco czuła, z limitem ilościowym 2 pg dla aflatoksyny B₁ (Rysunek 5D). Wysoka czystość ekstraktów pozwala na jednoznaczne określenie ilościowe aflatoksyn widzianych na podstawie UPLC (Rysunek 5E) oczyszczonego ekstraktu z nasion zebranych z pola z dzikim gatunkiem Arachis. Wcześniej opublikowana metoda minikolumny²⁹ nie jest w stanie osiągnąć zadowalającej czystości dla nasion orzeszków ziemnych z wyzwaniem grzybów (Rysunek 5F) w porównaniu z proponowaną metodą (Rysunek 5G). Z Rysunek 5F oczywiste jest, że aflatoksyny B₂, G₁ i G₂ nie mogą być wiarygodnie wykryte i oznaczone ilościowo ze względu na obecność wysokich stężeń zanieczyszczeń zakłócających, z których wiele, wymytych po aflatoksynach, to fitoaleksyny stilbenoidowe i metabolity grzybów. Natomiast Rysunek 5G pokazuje wysoką skuteczność kolumny z żelem magnezowo-krzemionkowym w usuwaniu zanieczyszczeń z frakcji aflatoksyny. Chromatogram niebieski przedstawia zanieczyszczenia zakłócające, które są wypłukiwane z kolumny 1 ml mieszaniny metanolu i wody (90:10); chromatogram pokazuje nieprzesłonięte piki aflatoksyn_M1 i B₁. Chromatogram ten przedstawia ekstrakt z nasion zakwestionowanych gatunków dzikich. Poziom aflatoksyny B₁ wynosi 48 ng/g.

Oznaczanie ilościowe fitoaleksyn orzeszków ziemnych jest cennym dodatkiem do analiz aflatoksyn w tym samym nasionie, które może być naturalnym ziarnem z pola lub nasionem zagrożonym grzybem. Rysunek 5H pokazuje typowy chromatogram obronnych stilbenoidów orzeszków ziemnych z zakwestionowanego nasiona. Separację związków uzyskuje się przy użyciu tej samej kolumny analitycznej, która jest używana do analiz aflatoksyn. Kolumna i wybrane warunki chromatograficzne zapewniają zadowalające rozdzielenie pików, co pozwala na wiarygodne określenie ilościowe stilbenoidów. Ocena relacji aflatoksyna-fitoaleksyna w nasionach poddanych prowokacji wykracza poza zakres niniejszej prezentacji, a metoda jest tutaj sugerowana jako potencjalne narzędzie badawcze, które jest stosowane w laboratorium autorów od kilku lat i okazało się przydatne.

Rysunek 6: Struktury głównych aflatoksyn i fitoaleksyn z orzeszków ziemnych pochodzących z stylbenu. (A) Struktury głównych aflatoksyn: 1, B₁; 2, B₂; 3, G₁; 4, G₂. (B) Struktury głównych fitoaleksyn z orzeszków ziemnych pochodzących z stilbenu: 6, resweratrol; 7, arachidyna-1; 8, arachidyna-2; 9, arachidyna-3; 10, IPD (3′-izopentadienylo-3,5,4′-trihydroksystylben); 11, SB-1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział

Poziom skokua (ng/g)	Aflatoksyny
	B1	B2	G1	G2
50	85,87 (0,97)	82,33 (0,67)	86,63 (2,89)	84,01 (0,86)
5	91,43 (2,76)	87,32 (0,47)	88,08 (2,08)	87,73 (0,77)
1	81,21 (3,16)	85,33 (1,98)	81,76 (4,66)	88,46 (3,24)

Tabela 1: Odzysk aflatoksyn z nasion orzeszków ziemnych przy użyciu kolumny Florisil i 1,2 ml mieszaniny elucyjnej frakcji aflatoksyny. [średnia (SD), %; n = 5]. Wolne od aflatoksyn próbki mielone (50 g) odmiany orzeszków ziemnych Georgia 06G zostały równomiernie wzbogacone za pomocą mikrostrzykawki z roztworem podstawowym aflatoksyny na poziomie 50, 5 lub 1 ng/g i pozostawione w temperaturze pokojowej na 16 godzin. ^a Poziomy skoków podano dla aflatoksyn B₁ i G₁; dla aflatoksyn_B2 i_G2 należy zastosować mnożnik 0,33.

Dyskusja

Opierając się na naszych wcześniejszych doświadczeniach²⁸, opracowaliśmy prostą, niedrogą, przyjazną dla środowiska procedurę chemiczną odpowiednią do eksploracji kolekcji dzikich plazm zarodkowych Arachis w celu identyfikacji gatunków odpornych na Aspergillus oraz określenia i scharakteryzowania nowych źródeł genetycznej odporności na tego oportunistycznego grzyba. Metoda ta opiera się na oczyszczaniu ekstraktu z nasion techniką ekstrakcji do fazy stałej (SPE) oraz kwantyfikacji aflatoksyn za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) i charakteryzuje się wystarczająco wysokim odzyskiem, precyzją i dokładnością. Proponowana metoda "Florisil" jest modyfikacją procedury czyszczenia pojedynczej minikolumny, która opiera się na unikalnej właściwości Florisil (żelu magnezowo-krzemionkowego) do silnego i selektywnego zatrzymywania aflatoksyn²⁸. Podobnie jak w oryginalnej metodzie, próbki nasion ekstrahowano mieszaniną MeOH-H2 O, ale w innej proporcji 90:10 (v/v) w porównaniu z opublikowaną proporcją 80:20 (v/v). Ta zmiana zwiększyła natężenie przepływu rozpuszczalników przez kolumnę czyszczącą do 2,5 raza przy tym samym współczynniku odzysku aflatoksyny. Ta mieszanina metanolu i wody w proporcji 90:10 (v/v) zapewniła prawie 100% odzysk wzorców aflatoksyn B₁, B₂, G₁ i G₂ dodanych do rozpuszczalnika ekstrakcyjnego przy poziomach skoków odpowiadających 5-50 ng stężeń aflatoksyny w 1 g substratu, a także zapewniła wystarczająco wysoki odzysk z wzbogaconych próbek nasion orzeszków ziemnych (Tabela 1).

Wykazano, że aflatoksyny mogą być eluowane z adsorbentu Florisil tylko przy dużych ilościach acetonu³⁰, acetonu i metanolu ^31,32 oraz mieszanin acetonu i wody 33,34,35,36. W trakcie niniejszych badań odkryliśmy, że zakwaszony acetonitryl zachowuje się podobnie do acetonu pod względem zdolności do eluowania aflatoksyn z Florisilu. O ile nam wiadomo, ta właściwość acetonitrylu nie została opisana w literaturze. Odkrycie tej właściwości pozwala na wstrzykiwanie oczyszczonego ekstraktu bezpośrednio do systemu UPLC z pominięciem etapu odparowywania rozpuszczalnika, co znacznie skraca czas przygotowania. Nawet gdy acetonitryl został zmieszany z acetonem (aceton-acetonitryl-woda-88% kwas mrówkowy (65:31:3,5:0,5, v/v)), zapewniał gładkie, całkowite i szybkie usuwanie wody z oczyszczonych eluatów, znacznie skracając czas parowania rozpuszczalnika. Obecność acetonitrylu pozwoliła na użycie pojedynczego rozpuszczalnika, mieszaniny metanol-woda (90:10, v/v) w celu skutecznego usunięcia zanieczyszczeń z kolumny Florisil w porównaniu z opublikowaną metodą, w której wymagane były dwa dodatkowe rozpuszczalniki myjące, metanol i mieszanina chloroform-metanol. ²⁸

Średnio standardowy odzysk aflatoksyny B₁ wynosił ~ 98% przy użyciu 1,2 ml do elucji aflatoksyn. Ilość 50 mg Florisilu została dobrana tak, aby 1,2 ml rozpuszczalnika elucyjnego wypełniło minikolumnę do górnej części beczki i jednocześnie zapewniło zadowalający odzysk (Tabela 1). Takie podejście przyspiesza procedurę czyszczenia, ponieważ beczka kolumny musi być napełniona tylko raz. Na wczesnych etapach tego projektu nie było jasne, czy komercyjna frakcja Florisil o stosunkowo dużym rozmiarze cząstek, 100-200 mesh, będzie odpowiednia dla małej kolumny zawierającej tylko 3 mm warstwę adsorbentu. Dlatego zbadaliśmy różne frakcje Florisil uzyskane z komercyjnego produktu o oczkach 100-200 przy użyciu standardowych amerykańskich sit testowych 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 i >400 oczek. Wszystkie te frakcje zapewniły powtarzalne, niemal identyczne wyniki z zadowalającym odzyskiem. Chociaż frakcje o mniejszych rozmiarach cząstek wykazywały węższe pasma aflatoksyny w kolumnie pod wpływem światła UV, frakcje te nie były lepsze pod żadnym względem od komercyjnego produktu o siatce 100-200. Ponadto frakcja 100-200 mesh wykazała najkrótsze czasy elucji (8-12 min) dla całej procedury.

Gradientowe dostarczanie rozpuszczalnika UPLC pozwoliło na zadowalające oddzielenie aflatoksyn, a także na całkowite usunięcie zanieczyszczeń niepolarnych z kolumny (rysunek 5G). Takie podejście doprowadziło do bezbłędnej pracy kolumny i powtarzalnych wyników analiz setek próbek. Tożsamość aflatoksyn wymytych z kolumny Florisil została potwierdzona zgodnie z wcześniejszym opisem. ²⁸ Zastosowana tutaj analityczna kolumna UPLC o średnicy 3 mm wykazała wyższą selektywność i bardziej niezawodne rozdzielanie aflatoksyn B₁, B₂, G₁ i G₂ przy wyższych stężeniach w porównaniu z kolumną o średnicy 2,1 mm o tym samym składzie chemicznym. Co więcej, żywotność kolumny 3 mm (ponad 1200 wtrysków) była znacznie wyższa niż kolumny 2,1 mm (do 800 wtrysków). Mimo, że kolumna 3 mm wymagała większej dawki fazy ruchomej (o 40% większej), ta wada została zniwelowana przez powyższe zalety kolumny.

Minikolumna Florisil była skuteczna w oczyszczaniu ekstraktów z nasion orzeszków ziemnych silnie zanieczyszczonych metabolitami Aspergillus (ryc. 5G); Takie nasiona zawierały również wysoki poziom fitoaleksyn stilbenoidowych, które były wytwarzane przez nasiona w odpowiedzi na inwazję grzybów. Wszystkie te zanieczyszczenia mogą przekraczać stężenie aflatoksyny w nasionach nawet 10^{6-krotnie 22}, co sprawia, że nasiona te stanowią wyzwanie dla analiz aflatoksyn. Rysunek 5G przedstawia brak pików interferujących na chromatogramie w czasie retencji aflatoksyny, co sprawiło, że wykrywanie i oznaczanie ilościowe aflatoksyn było nienaruszone na wszystkich badanych poziomach (tabela 1). Jak widać w tabeli 1, dokładność i precyzja metody były wystarczająco wysokie w badanym zakresie 1,0-50,0 ng/g, który jest również najbardziej krytycznym zakresem wykrywania aflatoksyn. Odzysk na różnych poziomach dla różnych genotypów dzikich orzeszków ziemnych był jednolity, a odchylenia standardowe dla pięciu różnych ekstrakcji były zasadniczo niskie.

Metoda została również przetestowana na nasionach orzeszków ziemnych, bawełny, kukurydzy i ryżu naturalnie zanieczyszczonych od zera do ekstremalnie wysokich poziomów - ponad 10 000 ng/g całkowitych aflatoksyn. Odzysk aflatoksyn B₁, B₂, G₁ i G₂ z kukurydzy, nasion bawełny i ryżu na poziomie 5 ng/g wahał się odpowiednio od 76,1% do 93,7%, od 77,1% do 86,6% i od 90,5% do 96,2%. Największemu odzyskowi aflatoksyn z ryżu towarzyszyła "czystość" eluentu, czyli praktycznie brak jakichkolwiek zanieczyszczeń. Co więcej, ryż stanowił najmniejszy pojedynczy badany obiekt, średnio 19 mg/nasiono.

Całkowity czas przygotowania pojedynczego ziarna orzeszków ziemnych (w tym łuskanie, ważenie, ekstrakcja, odwirowanie i oczyszczanie) przy użyciu kolumny Florisil nie przekraczał 20 minut. Koszt minikolumny Florisil jest >10 razy niższy niż w przypadku komercyjnych kolumn czyszczących. Dodatkowe oszczędności wynikają z zastosowania mniejszych ilości adsorbentów, rozpuszczalników i azotu gazowego w porównaniu z opublikowaną procedurą²⁸. Minikolumna nie wymaga do działania urządzeń pompujących ani próżniowych i ma nieokreślony okres trwałości.

Badanie plazmy rozrodczej roślin pod kątem odporności na aflatoksyny jest wyjątkowo trudne, ponieważ akumulacja mikotoksyn nie przebiega zgodnie z normalnym rozkładem^37,38; Aby przezwyciężyć to zjawisko, potrzebna jest duża liczba analiz aflatoksyn w pojedynczych nasionach. Oprócz zawartości aflatoksyny, informacje na temat ilościowego składu fitoaleksyny są bardzo cenne w świetle dużej ilości informacji, które można uzyskać z pojedynczego nasiona (rysunek 1A) i prześledzić do konkretnej rośliny (rysunek 1E). Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do badań przesiewowych setek akcesji, w tym ras lokalnych, zaawansowanych linii hodowlanych i elitarnych odmian orzeszków ziemnych. Metoda jest sugerowana do stosowania w programach badawczych przed hodowlą i hodowlą orzeszków ziemnych i może pomóc w scharakteryzowaniu genów orzeszków ziemnych pod kątem odporności na grzyby.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aceton, Optima	Fisher Scientific	A929-4
Acetonitryl, Optima	Fisher Scientific	A996-4
Acquity BEH C18 2,1 x 5mm Van-Guard kolumna wstępna	Waters Corporation	186003975
Acquity BEH C18 3 x 100mm kolumna	Waters Corporation	186004661
Acquity BEH C18 2,1 x 100mm	kolumna Waters Corporation
Aflatoksyny B1, B2, G1 i G2	Sigma-Aldrich	A9441-1VL	Rozpuścić zawartość handlowej fiolki w 5 ml metanolu w celu uzyskania 5 &mikro; g/ml dla aflatoksyn B1 i G1 oraz 1,5 &mikro; g / ml dla B2 i G2
Aflatoksyna B1 (1 mg)	Sigma-Aldrich	A6636-1 mg
Aflatoksyna B2 (1 mg)	Sigma-Aldrich	A9887-1 mg
Aflatoksyna G1 (1 mg)	Sigma-Aldrich	A0138-1MG
Aflatoksyna G2 (1 mg)	Sigma-Aldrich	A0263-1MG
Aflatoksyna M1 (10 &mikro; g)	Sigma-Aldrich	CRM46319
Agar, granulowany (2 kg)	Becton Dickinson	BD214510
Zasadowy tlenek tlenku glinu (60-325 oczek)	Fisher Scientific	A941-500
Podłoże podstawowe	Murashige i Skoog	M5519
Koralik Ruptor 24	Zlewka Omni International	19-042E
(1000 ml)	Corning (Pyrex)	Zlewka 10001L
(250 ml)	Zlewka Corning (Pyrex)	1000250
400 ml)	Corning (Pyrex)	1000400
Zlewka (600 ml)	Corning (Pyrex)	1000600
Ostrze, skalpel	Pióro	#10
Wirówka (LSE Compact)	Corning	Model: 6755
Wirówka, mikro		Corning Model: 6770
Koraliki ceramiczne (2,8 mm)Koraliki ceramiczne	Omni International	19-646
(6,5 mm)	Omni International	19-682
Oprogramowanie serii Chromeleon 7	Wiertło Thermo Scientific
	Kyocera	07896	1,6 mm
	Kyocera	07357	2,0 mm
Wiertło	Kyocera	07985	2,34 mm
Etanol (200 proof)	Dekon Labs	2805M
Parownik, azot	organimation	11106	6-pozycyjny
Excel, Microsoft	Microsoft	Office 365
Bibuła filtracyjna (#4)	Cytiva Whatman	1004-090
Nóż do bibuły filtracyjnej, stal nierdzewna (ID 11,5mm)	Nieznany
Papier filtracyjny, włókno szklane	Cytiva Whatman	934-AH
Kolba (2800mL)	Corning (Pyrex)	44202XL
Florisil (100-200 mesh)	Fisher Scientific	F101-500
Kleszcze	Integra Lifescience ( Miltex)	PM-0300
Kwas mrówkowy (88%, ACS)	Fisher Scientific	A118P-500
Zamrażarka (-80oC)	Fisher Scientific	TSX70086D
Lejek (15 x 80mm)	DWK Nauki Przyrodnicze (Kimax)	2902060
Gelzan (średni)	Caisson Labs	G024
Pręt szklany (na zamówienie)	Wełna
szklana	na zamówienie Corning (Pyrex)	3950
Rękojeść, skalpel	Hemocytometr Feather	#7
	Hausser Scientific	3100
Nadtlenek wodoru	Fisher Scientific	H325-4	30%, Certyfikowany ACS
Wiadro na lód, okrągłe z pokrywką	Inkubator	Corning 432122
	Percival	136VL
Kimtech SCIENCE Marka Kimwipes	Kimtech	34120	8.2" x 4.39"
Kimtech SCIENCE Marka Kimwipes	Kimtech	34256	16.4" x 14.43"
Fartuch laboratoryjny	Cenmed	B113660SBXL
Metanol, Optima	Fisher Scientific	A454-4
Mini stojak kolumnowy (na zamówienie)	Mikser
, dotykowy (maxi mix II)	Thermolyne	37600 (model 231)
Rękawice nitrylowe	Microflex	XC310M
Gazowy azot, sprężony (ultra wysoka czystość)	Jones Ręcznik papierowy do spawania
	Georgia-Pacific	20023 (D400)
pH-metr	Fisher Scientific (Accumet)	13-636-AB15
Elektroda pH/ATC	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-111
Reaktor	fotochemiczny PhCRWoda (Vicam)	600001222
Pipeta, Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	Pipetor 9"
(1 mL) (Odniesienie 2)	Pipettor Eppendorf	4924000088
(10 μ L) (Odniesienie)	Eppendorf	022470051D
Końcówki do pipet: 10 μ L, 200 μ L, 1 ml	Eppendorf	F144054M
Pipettor (200 &mikro; L)(Ergofit)	Fisher Scientific	12-146-679
Talerze, Petri (100x15mm)	Fisher Scientific	FB0875713
Agar Ziemniaczany Dekstroza (500g)	Becton Dickinson
Wzmocniona rurka z kulkami (2 ml)	Omni International	19-660
Wzmocniona rurka z koralikami (7 ml)	Repipettor Omni International	19-651
, Dozownik III (10 ml)	Brandtech	4701141
Resweratrol	Sigma-Aldrich	R5010-100MG
Szufelka (na zamówienie)	Wykonane
słoik z nakrętką (250 ml)	Corning (Pyrex)	1395250
Żel krzemionkowy, kulisty (200-400 mesh)	Supelco	97727-U	100 g
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	S318-500
SPE ekstrakt czysta kolumna polipropylenowa 1,5 ml	Amerykańskie materiały chromograficzne	SP-5122382
SPE ekstrakt czyste fryty PP (do minikolumny 1,5 ml)	Amerykańskie materiały chromotograficzne	SP-3119414
Spektrofotometr, widzialny w promieniowaniu UV	Fisher Scientific	14-385-351 (Genesys 50)
Probówka	Corning (Pyrex)	982516X	16x125mm
Probówka (jednorazowa)(16x125mm)	Fisher Scientific	14-961-31
Probówka (jednorazowa)(150x250mm)	Fisher Scientific	14-961-34
Detektor Thermo Vanquish DAD (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D11-A-01
Thermo Vanquish Fluourescense detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D51-A Pompa
czwartorzędowa Thermo Vanquish F (UPLC)	Thermo Scientific	VF-P20-A
Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)	Thermo Scientific	VF-A10-A-02
Tween 20 (polisorbat 20) (klasa enzymatyczna)	Fisher Scientific	BP337-500
Nasadki na fiolki (4 ml)	Fisher Scientific	C4015-75A
Nasadki na fiolki (autosampler)	Fisher Scientific	C4010-60A
(16 ml)	Fiolki Thermo Scientific	B7800-4
, szklane (4mL)Fiolki	Fisher Scientific	C4015-1
, polipropylenowe (autosampler) (400mL)	Fisher Scientific	C4010-11
Woda, Optima	Fisher Scientific	W6-4