Opracowana metoda znakowania 13C6-Glucose w połączeniu z chromatografią cieczową o wysokiej rozdzielczości spektrometrią mas jest wszechstronna i stanowi podstawę do przyszłych badań nad pierwotnymi organami i szlakami zaangażowanymi w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, jak również kompleksowe wykorzystanie tych wtórnych metabolitów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
13C6-Znakowanie glukozy związane z LC-MS: Identyfikacja pierwotnych organów roślinnych w syntezie metabolitów wtórnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten artykuł przedstawia nowatorską i efektywną metodę certyfikacji pierwotnych organów biorących udział w syntezie metabolitów wtórnych. Jako najważniejszy metabolit wtórny w Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Ręka. -Mzt. (PPY), saponina paryska (PS) ma różnorodne działanie farmakologiczne, a PPY cieszy się rosnącym popytem. W badaniu tym ustalono cztery zabiegi karmienia i niekarmienia liśćmi, kłączami i wiązkami naczyniowo-naczyniowymi 13C6-glukozy, aby precyzyjnie certyfikować pierwotne narządy zaangażowane w syntezę saponin paryskich VII (PS VII). Łącząc chromatografię cieczową ze spektrometrią mas (LC-MS), szybko i dokładnie obliczono 13stosunków C/12C liści, kłącza, łodygi i korzenia w różnych zabiegach i znaleziono cztery typy stosunków piku jonów izotopowych PS (M−): (M + 1) − / M−, (M + 2) − / M−, (M+3) −/M− i (M+4) −/M−. Wyniki wykazały, że stosunek 13C do 12C w kłączach pęczka pęczków naczyniowych i kłączy był znacznie wyższy niż w przypadku karmienia bez karmienia. W porównaniu z leczeniem bez karmienia, stosunek cząsteczek PS VII (M+2) −/M− w liściach znacznie wzrósł pod wpływem nawożenia liśćmi i wiązkami naczyń krwionośnych. Jednocześnie, w porównaniu z leczeniem bez karmienia, stosunek cząsteczek PS VII (M+2) -/M− w liściach poddanych działaniu kłącza nie wykazał istotnej różnicy. Ponadto stosunek cząsteczek PS VII (M+2) −/M− w łodydze, korzeniu i kłączu nie wykazał różnic między czterema zabiegami. W porównaniu z leczeniem nienawożeniowym, stosunek cząsteczki saponiny paryskiej II (PS II) (M+2) -/M− w liściach poddanych zabiegowi nawożenia dolistnego nie wykazał istotnej różnicy, a stosunek (M+3) -/M− cząsteczek PS II w liściach poddanych zabiegowi nawożenia dolistnego był niższy. Dane potwierdziły, że pierwotnym organem do syntezy PS VII są liście. Stanowi to podstawę do przyszłej identyfikacji pierwotnych narządów i szlaków zaangażowanych w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych.
Wprowadzenie
Szlaki biosyntezy metabolitów wtórnych w roślinach są zawiłe i różnorodne, obejmując bardzo specyficzne i zróżnicowane organy akumulacji1. Obecnie specyficzne miejsca syntezy i narządy odpowiedzialne za metabolity wtórne w wielu roślinach leczniczych nie są dobrze zdefiniowane. Ta niejednoznaczność stanowi istotną przeszkodę w strategicznym rozwoju i wdrażaniu metod uprawy mających na celu optymalizację zarówno plonów, jak i jakości materiałów leczniczych.
Biologia molekularna, biochemia i techniki znakowania izotopów są szeroko stosowane do odkrywania szlaków syntezy i miejsc metabolitów wtórnych w roślinach lecznic....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie eksperymentalne
- Upewnij się, że podczas wzrostu roślin wilgotność względna w szklarni wynosi 75%, temperatury w dzień/noc wynoszą 20 °C/10 °C, fotoperiod składa się z 12 godzin w dzień i 12 godzin w nocy, a natężenie światła wynosi 100 μmol·m-2·s-1. Zapewnij natężenie promieniowania za pomocą lamp z diodami elektroluminescencyjnymi (LED), zachowując odległość 30 cm między lampą LED a baldachimem rośliny.
UWAGA: Fotoperiod i natężenie światła zależą od liczby godzin słonecznych w okresie wegetacji w Yunnan. Natężenie promieniowania jest rutynowo mierzone za pomocą czujnika kwantowego (patrz
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby potwierdzić, że dostarczenie 13C6-Glucose do kłączy przebiegło pomyślnie, przeanalizowano dalej stosunki izotopowe 13C/12C w kłączach. Stosunki izotopowe 13C/12C w wariantach 3 i 4 były znacznie wyższe niż w wariancie 2 (Ryc. 1A). Wyniki wskazały, że 13C6-Glucose z wariantów 3 i 4 przedostały się do kłączy drogą spożycia.
Stosunki pików izotopowych 13C, takich ja.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomyślne wdrożenie tego protokołu zależy od kompleksowych badań nad właściwościami fizjologicznymi roślin, tkankami, narządami i metabolitami wtórnymi. Podejście do projektowania eksperymentalnego przedstawione w protokole stanowi solidną podstawę do badania szlaków biosyntezy metabolitów wtórnych roślin. Kluczowymi czynnikami w tym eksperymencie są (1) określenie wieku wieloletnich siewek oraz (2) wybór właściwego czasu znakowania izotopów i wykrywania. Rośliny lecznicze są podzielone na wieloletnie i jednoroczne, z któ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chińskiej Młodzieżowej Programu (nr 82304670).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,1% Woda z kwasem mrówkowym | Chengdu Kelong Fabryka odczynników chemicznych | 44890 | |
| 13C6-Glukoza w proszku | MERCK | 110187-42-3 | |
| Acetonitryl | Chengdu Kelong Fabryka odczynników chemicznych | 44890 | |
| FIOLKI AUTOSAMPLER | Biosharp Biotechnology Company | 44866 | |
| BEH C18 kolumna | Wody, Milfor, MA | 1,7 i mu; m,2,1*100 mm | |
| Myjka ultradźwiękowa CNC | Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd | KQ-600DE | |
| Compound DiscovererTM oprogramowanie | Thermo Scientific, Fremont,CA | 3 | |
| Compound DiscovererTM oprogramowanie | Thermo Scientific, Fremont, CA | 3 Elektryczny | |
| piec do suszenia strumieniowego o stałej temperaturze | DHG-9146A | ||
| Fabryka odczynników chemicznych Chengdu Kelong | 44955 | ||
| W pełni automatyczny szybki młynek do próbek | Shanghai Jingxin Technology | Tissuelyser-48 | |
| Chromatografia gazowa - stabilny spektrometr masowy ze stosunkiem izotopów | Thermo Fisher | Delta V Advantage | |
| Rozwiązanie Hoagland | Sigma-Aldrich | H2295-1L | |
| Zbiornik hydroponiczny | JRD | 1020421 | |
| Oprogramowanie Isodat | Thermo Fisher Scientific | 3 | |
| Chromatografia cieczowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości | Agilent Technology | Agilent 1260 -6120 | |
| Przyrząd do produkcji azotu | PEAK SCIENTIFIC | Genius SQ 24 | |
| Filtr fazy organicznej | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | 44890 | |
| Pompa tlenowa | Magic Dragon | MFL | |
| Czujnik kwantowy | Highpoint | UPRtek | |
| Scalpel | Handskit | 11-23 | |
| Zraszanie can | CHUSHI | WJ-001 | |
| Xcalibur oprogramowanie | Thermo Fisher Scientific | 4.2 |
Bibliografia
- Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
- Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
