Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

13C6-Znakowanie glukozy związane z LC-MS: Identyfikacja pierwotnych organów roślinnych w syntezie metabolitów wtórnych

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66578

⸱

22 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Pharmacy, Ya'an People's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowana metoda znakowania 13C6-Glucose w połączeniu z chromatografią cieczową o wysokiej rozdzielczości spektrometrią mas jest wszechstronna i stanowi podstawę do przyszłych badań nad pierwotnymi organami i szlakami zaangażowanymi w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, jak również kompleksowe wykorzystanie tych wtórnych metabolitów.

Streszczenie

Ten artykuł przedstawia nowatorską i efektywną metodę certyfikacji pierwotnych organów biorących udział w syntezie metabolitów wtórnych. Jako najważniejszy metabolit wtórny w Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Ręka. -Mzt. (PPY), saponina paryska (PS) ma różnorodne działanie farmakologiczne, a PPY cieszy się rosnącym popytem. W badaniu tym ustalono cztery zabiegi karmienia i niekarmienia liśćmi, kłączami i wiązkami naczyniowo-naczyniowymi 13C6-glukozy, aby precyzyjnie certyfikować pierwotne narządy zaangażowane w syntezę saponin paryskich VII (PS VII). Łącząc chromatografię cieczową ze spektrometrią mas (LC-MS), szybko i dokładnie obliczono 13stosunków C/12C liści, kłącza, łodygi i korzenia w różnych zabiegach i znaleziono cztery typy stosunków piku jonów izotopowych PS (M−): (M + 1) − / M−, (M + 2) − / M−, (M+3) −/M− i (M+4) −/M−. Wyniki wykazały, że stosunek 13C do 12C w kłączach pęczka pęczków naczyniowych i kłączy był znacznie wyższy niż w przypadku karmienia bez karmienia. W porównaniu z leczeniem bez karmienia, stosunek cząsteczek PS VII (M+2) −/M− w liściach znacznie wzrósł pod wpływem nawożenia liśćmi i wiązkami naczyń krwionośnych. Jednocześnie, w porównaniu z leczeniem bez karmienia, stosunek cząsteczek PS VII (M+2) -/M− w liściach poddanych działaniu kłącza nie wykazał istotnej różnicy. Ponadto stosunek cząsteczek PS VII (M+2) −/M− w łodydze, korzeniu i kłączu nie wykazał różnic między czterema zabiegami. W porównaniu z leczeniem nienawożeniowym, stosunek cząsteczki saponiny paryskiej II (PS II) (M+2) -/M− w liściach poddanych zabiegowi nawożenia dolistnego nie wykazał istotnej różnicy, a stosunek (M+3) -/M− cząsteczek PS II w liściach poddanych zabiegowi nawożenia dolistnego był niższy. Dane potwierdziły, że pierwotnym organem do syntezy PS VII są liście. Stanowi to podstawę do przyszłej identyfikacji pierwotnych narządów i szlaków zaangażowanych w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych.

Wprowadzenie

Szlaki biosyntezy metabolitów wtórnych w roślinach są zawiłe i różnorodne, obejmując bardzo specyficzne i zróżnicowane organy akumulacji1. Obecnie specyficzne miejsca syntezy i narządy odpowiedzialne za metabolity wtórne w wielu roślinach leczniczych nie są dobrze zdefiniowane. Ta niejednoznaczność stanowi istotną przeszkodę w strategicznym rozwoju i wdrażaniu metod uprawy mających na celu optymalizację zarówno plonów, jak i jakości materiałów leczniczych.

Biologia molekularna, biochemia i techniki znakowania izotopów są szeroko stosowane do odkrywania szlaków syntezy i miejsc metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych2,3,4,5, a każda z tych metodologii wykazuje unikalne mocne strony i ograniczenia, takie jak różnice w wydajności i dokładności. Na przykład podejścia oparte na biologii molekularnej oferują wysoką precyzję w określaniu miejsc w szlakach biosyntezy, ale są szczególnie czasochłonne. Ich użyteczność jest dodatkowo ograniczona w przypadku gatunków, które nie mają publicznie dostępnych sekwencji genomowych, co sprawia, że techniki te są mniej opłacalne w takich przypadkach6. W przeciwieństwie do tego, techniki znakowania izotopowego, wykorzystujące proporcje izotopowe, takie jak 3C/12C, 2H/1H i 18O/16O, zapewniają szybki i dostępny sposób badania mechanizmów syntezy, transportu i przechowywania metabolitów wtórnych7,8. Mogą one ujawnić przestrzenne rozmieszczenie związków organicznych i stabilnych izotopów w liściach, umożliwiając w ten sposób rekonstrukcję warunków środowiskowych doświadczanych przez liście przez cały cykl życia9. Co więcej, zastosowanie zewnętrznych znaczników izotopowych, takich jak 13C 6-Glucose10 i 13C6-Phenylalanine11, umożliwia wytwarzanie metabolitów wtórnych znakowanych węglem, zwiększając naszą wiedzę na temat ich produkcji i funkcji.

Tradycyjne techniki znakowania izotopów węgla napotykają na wyzwania w określaniu konkretnych organów odpowiedzialnych za syntezę metabolitów wtórnych ze względu na wysoce specyficzny dla gatunku charakter ich szlaków biosyntezy i mechanizmów transportu. Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS) zyskała na znaczeniu jako kluczowy instrument analityczny w tej dziedzinie, oferując solidną metodę śledzenia izotopów egzogennych w syntezie chemicznej leków i badania procesów in vivo, takich jak wchłanianie, dystrybucja, metabolizm i wydalanie12. Wyjątkowa czułość, prostota i niezawodność LC-MS sprawiają, że jest to idealny wybór do monitorowania produkcji metabolitów wtórnych w roślinach13. W ostatnim czasie LC-MS staje się coraz bardziej preferowany ze względu na swoje zastosowanie w technikach znakowania izotopów zewnętrznych, co umożliwia ocenę skuteczności znakowania na różnych próbkach. Metodologia ta dostarcza krytycznych informacji na temat pierwotnych narządów zaangażowanych w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, służąc jako nieocenione uzupełnienie biologicznych metod identyfikacji narządów syntezy tych związków14,15. W związku z tym podejście to nie tylko ułatwia porównanie skuteczności znakowania różnych próbek, ale także rzuca światło na kluczowe organy zaangażowane w wytwarzanie wtórnych metabolitów roślinnych, pogłębiając w ten sposób naszą wiedzę na temat ich biosyntezy.

Wprowadziliśmy nową metodę, która łączy znakowanie izotopami węgla z wykrywaniem LC-MS w celu identyfikacji głównych organów odpowiedzialnych za syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych. Saponina paryska (PS) ma różnorodne działanie farmakologiczne, takie jak przeciwnowotworowe, immunomodulacyjne i przeciwzapalne16, a PPY cieszy się rosnącym popytem17. Dlatego użyliśmy sadzonek PPY jako obiektów badawczych i rozszyfrowaliśmy, że liście są głównym organem do syntezy saponiny paryskiej VII (PS VII) (Rysunek 1B) przy użyciu znakowania 13C6-Glucose związanego z metodą LC-MS. Nasze podejście obejmowało cztery różne zabiegi polegające na podawaniu 13C6-glukozy liściom, kłączom i wiązkom naczyniowym łodygi, a także kontroli bez karmienia. Wybór 13C6-Glucose jest strategiczny, ponieważ jest on szybko metabolizowany do acetylokoenzymu A poprzez oddychanie, co następnie ułatwia syntezę PS. Wykorzystując naturalną obfitość 13C, wykorzystaliśmy system spektrometru masowego chromatografii gazowej ze stabilnym stosunkiem izotopów (GC-IRMS) do oceny stosunków 13C/12C w różnych organach roślinnych oraz do analizy stosunków pików jonów izotopowych w cząsteczkach PS VII i saponin paryskich II (PS II) (Rysunek 1B). Nasza metodologia, która wykorzystuje 13znakowanych C prekursorów metabolitów wtórnych roślin i najnowocześniejsze techniki spektrometrii mas, stanowi prostszą i dokładniejszą alternatywę dla konwencjonalnych metod znakowania izotopów węgla. To nowatorskie podejście nie tylko pogłębia naszą wiedzę na temat narządów zaangażowanych w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, ale także kładzie solidne podstawy pod przyszłe badania nad szlakami biosyntezy tych związków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Upewnij się, że podczas wzrostu roślin wilgotność względna w szklarni wynosi 75%, temperatury w dzień/noc wynoszą 20 °C/10 °C, fotoperiod składa się z 12 godzin w dzień i 12 godzin w nocy, a natężenie światła wynosi 100 μmol·m-2·s-1. Zapewnij natężenie promieniowania za pomocą lamp z diodami elektroluminescencyjnymi (LED), zachowując odległość 30 cm między lampą LED a baldachimem rośliny.
    UWAGA: Fotoperiod i natężenie światła zależą od liczby godzin słonecznych w okresie wegetacji w Yunnan. Natężenie promieniowania jest rutynowo mierzone za pomocą czujnika kwantowego (patrz tabela materiałów). Dokonaj niezbędnych zmian w parametrach środowiskowych zgodnie z cechami rośliny leczniczej. Po dokładnym skalibrowaniu tych warunków środowiskowych w oparciu o charakterystykę rośliny i regionalny profil nasłonecznienia, kluczowe znaczenie ma utrzymanie spójności w tych ustawieniach przez cały czas trwania eksperymentu. Arbitralne zmiany parametrów środowiskowych po ich początkowym ustaleniu mogą zagrozić integralności eksperymentu i wiarygodności wyników.
  2. Użyj podejścia hydroponicznego18, aby zapewnić dokładność i szczegółowość naszego eksperymentu. Upewnij się, że umyte 2-letnie sadzonki PPY (zebrane z Wenshan w prowincji Yunnan (104°11′E, 23°04′N) są zanurzone w standardowym stężeniu 1/4 pożywki Hoaglanda na 3 dni w celu adaptacji.
    1. Przygotować roztwór odżywki Hoaglanda (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcją; dodać 1,26 g proszku Hoagland i 0,945 g azotanu wapnia w proszku do 4 l oczyszczonej wody. Przygotować roztwór 13C6-glukozy (patrz tabela materiałów) zgodnie z opisem w standardowej instrukcji; dodać 0,2 g 13C6-glukozy w proszku do 100 ml oczyszczonej wody lub pożywki Hoaglanda.
    2. Przygotuj zbiornik hydroponiczny i pompę tlenową (Rysunek 2; patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: W konfiguracji hydroponicznej użycie roztworu 13C6-glukozy do znakowania omija wpływ mikroorganizmów glebowych, zapewniając w ten sposób, że roztwór bezpośrednio przyczynia się do szybkiej syntezy metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych. Aby zoptymalizować warunki wchłaniania 13C6-Glucose przez rośliny, konieczne jest regulowanie natężenia przepływu pompy tlenowej w zakresie od 4 do 8 l/min. To kontrolowane natężenie przepływu ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia unoszeniu się sadzonek na powierzchni wody, co mogłoby znacznie utrudnić ich zdolność do skutecznego wchłaniania 13C6-glukozy. Utrzymywanie sadzonek zanurzonych na odpowiedniej głębokości pozwala na efektywne pobieranie związku znakującego, zapewniając w ten sposób powodzenie procesu syntezy metabolitów w systemie hydroponicznym.

2. Operacja eksperymentu z etykietowaniem węglowym

  1. Wykonaj cztery zabiegi i prześledź narządy i szlaki syntezy PS VII i PS II w PPY, aby wykazać, że liście są głównym narządem do syntezy PS.
    1. W Zabiegu 1 sadzonka PPY nie jest karmiona; w Zabiegu 2 spryskaj liście siewki PPY 0,2% 13C6-Glukozą; w Zabiegu 3 nakarm kłącza siewki PPY 0,2% 13C6-glukozą; w Zabiegu 3 nakarm sadzonkę PPY w miejscu nacięcia łodygi 0,2% 13C 6-Glucose (Rysunek 2A).
      UWAGA: Leczenie 1 jest ustawione jako grupa kontrolna. Zabieg 2 ma na celu wykazanie, że liście mogą syntetyzować PS. Zabiegi 3 i 4 są ustawione w celu wykazania, że kłącza mogą pobierać 13C6-glukozy.
    2. W zabiegach 1 i 2 hoduj sadzonki PPY w normalnym pożywce Hoaglanda. Spryskaj 5 ml 0,2% 13C roztworu6-glukozy raz rano, po południu i wieczorem na liście Kuracji 2.
    3. W zabiegach 3 i 4 hoduj sadzonki PPY w pożywce Hoaglanda zawierającej 0,2% 13C6-glukozy. W Zabiegu 4 użyj skalpela (patrz Tabela Materiałów), aby odciąć łodygi sadzonek PPY od środka, ale trzymaj wiązki naczyniowe przymocowane.
    4. Pozostaw każdy zabieg na etykiecie przez 3 dni i zmieniaj pożywkę co 1,5 dnia. Przeprowadź eksperyment przy użyciu randomizowanego projektu blokowego i powtórz każdy zabieg 3x.
      UWAGA: Podczas opryskiwania liści ważne jest, aby za spryskanymi liśćmi umieścić papier chłonny. Zapobiega to wpadaniu kropelek wody do pożywki znajdującej się poniżej, co w przeciwnym razie mogłoby wpłynąć na wyniki eksperymentu. Nacięcia w łodygach nie są usuwane, ale mają przymocowane przewody, które są widoczne gołym okiem.

3. Metody pobierania próbek i przygotowania

  1. Zbierz liście, łodygi, kłącza i korzenie z każdego zabiegu osobno pod koniec 3-dniowego eksperymentu 13C6-Glukoza. Dokładnie umyj zebrane organy roślinne, aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe.
    UWAGA: Brak obfitości 13C można stwierdzić za pomocą analizy LC-MS roztworu myjącego, która dowodzi, że mycie jest czyste19.
  2. Użyj elektrycznego pieca do suszenia strumieniowego o stałej temperaturze (patrz Tabela materiałów), aby wysuszyć umyte organy roślinne. Zacząć w temperaturze 105 °C przez 30 minut, a następnie ustawić na 60 °C do uzyskania stałej masy. Rozdrobnić wysuszone organy roślinne na proszek za pomocą w pełni automatycznego młynka do próbek (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Proszek służy do analizy ilościowej stosunków PS VII, II i 13C/12C w różnych organach roślinnych.
  3. Za pomocą elektronicznej wagi analitycznej (patrz tabela materiałów) dokładnie zważyć 30 mg proszku na każdą próbkę i umieścić ją w 2 ml alkoholu etylowego o stężeniu 75% v/v w wodzie. Użyć myjki ultradźwiękowej CNC (patrz Tabela Materiałów) i przeprowadzić ekstrakcję ultradźwiękową w temperaturze 25 °C przez 20 min (60 kHz), powtórzyć 2x; Połącz roztwory ekstrakcyjne i przygotuj trzy równoległe próbki20.
    UWAGA: Błędy w masie próbki powinny być zminimalizowane.
  4. Roztwór ekstrakcyjny należy wysuszyć azotem, a następnie rozpuścić w metanolu chromatograficznym do objętości 1 ml. Przed wstrzyknięciem należy użyć filtra fazy organicznej 0,22 μm (patrz Tabela materiałów) do filtracji (Rysunek 2B).
    UWAGA: Nie wydmuchuj ekstraktu podczas suszenia azotem gazowym; Ekstrakt musi być przepuszczony przez mikroporowatą membranę, aby zapewnić, że zanieczyszczenia minimalnie przeszkadzają.

4. Konfiguracja i obsługa LC-MS

  1. Ustawienie MS
    1. Aktywuj pompę próżniową, przestawiając jej przełącznik w pozycję włączoną. Otwórz główny zawór na butli z argonem, a następnie wyreguluj zawór ciśnienia cząstkowego, aby osiągnąć ciśnienie docelowe około 0,3 MPa. Następnie upewnij się, że zawór azotu gazowego jest również otwarty.
    2. Uruchom oprogramowanie sterujące MS (patrz tabela materiałów). Kliknij na podgrzane źródło jonizacji elektrorozpylania (źródło HESI) w panelu oprogramowania i wprowadź parametry, w tym napięcie kapilarne (3,0 kV dla trybu ujemnego), temperaturę kapilary (350 °C), natężenie przepływu gazu w osłonie (N2) (35 dowolnych jednostek), natężenie przepływu gazu pomocniczego (N2) (15 dowolnych jednostek), poprzez pełne skanowanie w oparciu o masę cząsteczkową PS (operowane od m/z 100-1,500). Kliknij przycisk Zastosuj, aby aktywować źródło jonów.
      UWAGA: Odczekaj co najmniej 8 godzin, aby zapewnić wystarczający stopień próżni dla warunków eksperymentalnych. Przed analizą sprawdź, czy ciśnienie gazu argonu i azotu jest wystarczająco wysokie.
  2. Bieg wstępny LC
    1. Przygotować ruchomą fazę A, mieszając 0,1% kwas mrówkowy z wodą i użyć acetonitrylu do ruchomej fazy B (patrz Tabela materiałów). Degas obie fazy w sonikatorze kąpieli ultradźwiękowej przez 15 minut w celu wyeliminowania rozpuszczonych gazów. Następnie podłącz ruchomą fazę A do odpowiedniego kanału płynu i zrób to samo z ruchomą fazą B. Na koniec wymieszaj roztwór metanolu i wody w proporcji 1:9 v/v z płynem czyszczącym i ręcznie napełnij butelki z pompą i wtryskiwaczami.
      UWAGA: Częstotliwość sonografu kąpieli ultradźwiękowej wynosi 40 kHz.
  3. Ustalenie metody LC
    1. Wybierz przycisk "Konfiguracja instrumentu", aby uzyskać dostęp do okna edycji metody.
    2. Naciśnij przycisk "Nowy", aby zainicjować tworzenie nowej metody przyrządu LC-MS.
    3. Ustawia łączny czas wykonywania dla metody LC. Następnie wprowadź niezbędne wartości dla limitu ciśnienia, całkowitego natężenia przepływu, gradientu przepływu, temperatury próbki, temperatury kolumny i delty temperatury gotowości w oknie edycji metody.
      UWAGA: Ustawienia metody przyrządu LC-MS są dostosowane do badanego analitu i rodzaju używanej kolumny do chromatografii cieczowej. W celu uzyskania optymalnych wyników należy stosować natężenie przepływu 0,3 ml/min przy kolumnie BEH C18 utrzymywanej w temperaturze 40 °C (patrz tabela materiałów). Elucja gradientowa jest skonfigurowana w następujący sposób: rozpocznij od 10% B, zwiększając liniowo do 30% B w ciągu 8 minut, następnie do 45% B od 8 do 16 minut, do 50% B od 16 do 24 minut i do 70% B od 24 do 30 minut. Natychmiast po tym przywróć gradient do początkowego stanu 10% B w ciągu 0,1 minuty, utrzymując go tam przez dodatkowe 2,9 minuty. Wstrzyknąć próbkę o objętości 5 μl do każdej analizy. Ustawienia metody przyrządu LC-MS zależą od konkretnej substancji, która ma być analizowana, oraz od rodzaju używanej kolumny do chromatografii cieczowej21.
  4. Akwizycja MS
    1. Na karcie Ustawienia wybierz typ eksperymentu Ogólne MS lub MSn dla konfiguracji metody MS. Wprowadź niezbędne wartości, aby ustawić czas akwizycji, polaryzację (dodatnią lub ujemną), numer zaworu zmiany zakresu masy i czas trwania zaworu przełączającego. Po wprowadzeniu tych danych kliknij przycisk "Zapisz", aby sfinalizować i zapisać te ustawienia jako metodę instrumentu.
      UWAGA: Ustawienia domyślne bez kolumny chromatograficznej są następujące: czas akwizycji, 2 min; polaryzacja, dodatnia lub ujemna; zakres masy, od 100 do 1,500.
  5. Wykonaj wieloetapową spektrometrię mas zgodnie z konwencjonalnymi metodami.
    1. Zawsze stosuj tryb akwizycji zależnej od danych (DDA) do zbierania danych w wielostopniowej spektrometrii mas. W trybie DDA spektrometr mas identyfikuje pięć najbardziej intensywnych jonów podczas każdego skanowania w pierwszym etapie tandemowego MS, które są następnie fragmentowane i badane w drugim etapie tandemowej spektrometrii mas.
      UWAGA: Zebrane dane MS i MS/MS mogą być wykorzystane do późniejszej analizy i przeszukiwania bazy danych.

5. Ręczne pozyskiwanie, analiza i obliczanie danych

  1. Akwizycja i analiza danych
    1. Kliknij dwukrotnie surowe pliki, aby otworzyć wszystkie widma masowe z MS. Ręcznie oblicz wartości różnicy m/z między jonem a odpowiadającymi mu jonami fragmentacyjnymi.
    2. Zaimportuj surowe pliki danych z kontroli i obróbki próbek oraz ślepych prób do oprogramowania do analizy spektrometrii mas, aby zidentyfikować PS poprzez dokładne obliczenie masy i fragmentów PS.
      UWAGA: PS VII i PS II są identyfikowane przez porównanie z czasami retencji i koelucją, autentycznymi roztworami wzorcowymi. LC-MS wykrywa serię małych pików w miejscach pików jonów molekularnych. Stosunek każdej serii izotopowych pików jonów jest stały. Po podaniu egzogennych izotopów 13C całkowita obfitość 13C w roślinie wzrasta, a stosunki szeregu pików jonów izotopowych metabolitów wtórnych roślin zmieniają się. Maksymalna tolerancja błędu masy wynosi 5 ppm.
    3. Zeskanuj zakres mas m/z 500-1,500, aby zidentyfikować pik podstawowy. Określ dokładną masę cząsteczkową z dokładnością do 4 miejsc po przecinku, zgodnie z dokładną masą cząsteczkową i czasem retencji cząsteczki docelowej. Wyszukaj obszar piku przepływu jonów izotopu szeregowego i wyprowadź wartości dla M−, (M+1) −, (M+2) −, (M+3) − i (M+4) −. Gdy faza ruchoma zawiera kwas mrówkowy, jony ujemne obejmują również (M+COOH) −, (M+COOH+1) −, (M+COOH+2) −, (M+COOH+3) − i (M+COOH+4) −.
      UWAGA: Wybór pików w zakresie mas m/z 500-1,500 poprawia dokładność identyfikacji pików jonów molekularnych dla PS VII i PS II. Na przykład widmo masowe jonów ujemnych PS VII (C51H82O21, 1030.5349) jonizuje głównie jonami COOH− w mieszaninie kwasu mrówkowego i wody. Obserwowane szeregowe jony izotopowe obejmują 1029,53−, 1030,54−, 1031,54−, 1032,55−, 1033,55− i rozciągające się do 1079,56−.
  2. Obliczanie danych
    1. Aby zmniejszyć efekt naturalnej obfitości 13C, oblicz stosunki znakowanych i nieznakowanych prądów jonowych dla każdego narządu poddanego różnym zabiegom, koncentrując się w szczególności na stosunkach (M+1)−/ M−, (M+2)−/M−, (M+3)−/ M− i (M+4)−/ M−. Aby rozróżnić izotopy znakowane i naturalnie występujące w celu dokładnej oceny inkorporacji 13C, należy obliczyć te stosunki dla n = 1, 2, 3, 4 za pomocą równania (1).
      Stosunek = A (M+2) −/ AM− (1)
      PS: (M+2) − obejmują (M+2+COOH) − i (M+2) −; M− obejmują (M+COOH) - i M−.
      UWAGA: Tutaj M− odnosi się do połączonych obszarów szczytowych prądów jonowych dla (M+COOH) − i M −, głównie zjonizowanych COOH− w wodzie z kwasem mrówkowym. A reprezentuje obszar szczytu. Na przykład wzory do obliczania współczynników PS VII są zilustrowane w następujący sposób:
      Stosunek+1= (A1030.54+A1076.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Stosunek+2= (A1031.54+A1077.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Stosunek+3= (A1032.55+A1078.56)/(A1029.53+A1075.55)
      Stosunek+4= (A1033.55+A1079.56)/(A1029.53+A1075.55)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby potwierdzić, że dostarczenie 13C6-Glucose do kłączy przebiegło pomyślnie, przeanalizowano dalej stosunki izotopowe 13C/12C w kłączach. Stosunki izotopowe 13C/12C w wariantach 3 i 4 były znacznie wyższe niż w wariancie 2 (Ryc. 1A). Wyniki wskazały, że 13C6-Glucose z wariantów 3 i 4 przedostały się do kłączy drogą spożycia.

Stosunki pików izotopowych 13C, takich ja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomyślne wdrożenie tego protokołu zależy od kompleksowych badań nad właściwościami fizjologicznymi roślin, tkankami, narządami i metabolitami wtórnymi. Podejście do projektowania eksperymentalnego przedstawione w protokole stanowi solidną podstawę do badania szlaków biosyntezy metabolitów wtórnych roślin. Kluczowymi czynnikami w tym eksperymencie są (1) określenie wieku wieloletnich siewek oraz (2) wybór właściwego czasu znakowania izotopów i wykrywania. Rośliny lecznicze są podzielone na wieloletnie i jednoroczne, z któ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chińskiej Młodzieżowej Programu (nr 82304670).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1% Woda z kwasem mrówkowymChengdu Kelong Fabryka odczynników chemicznych44890
13C6-Glukoza w proszkuMERCK110187-42-3
AcetonitrylChengdu Kelong Fabryka odczynników chemicznych44890
FIOLKI AUTOSAMPLERBiosharp Biotechnology Company44866
BEH C18 kolumnaWody, Milfor, MA1,7 i mu; m,2,1*100 mm
Myjka ultradźwiękowa CNCKunshan Ultrasound Instrument Co., LtdKQ-600DE
Compound DiscovererTM  oprogramowanieThermo Scientific, Fremont,CA3
Compound DiscovererTM  oprogramowanie Thermo Scientific, Fremont, CA3 Elektryczny
piec do suszenia strumieniowego o stałej temperaturzeDHG-9146A
Fabryka odczynników chemicznych Chengdu Kelong44955
W pełni automatyczny szybki młynek do próbekShanghai Jingxin TechnologyTissuelyser-48
Chromatografia gazowa - stabilny spektrometr masowy ze stosunkiem izotopówThermo FisherDelta V Advantage
Rozwiązanie HoaglandSigma-AldrichH2295-1L
Zbiornik hydroponicznyJRD1020421
Oprogramowanie IsodatThermo Fisher Scientific3
Chromatografia cieczowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczościAgilent Technology Agilent 1260 -6120 
Przyrząd do produkcji azotuPEAK SCIENTIFICGenius SQ 24
Filtr fazy organicznejTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd44890
Pompa tlenowaMagic DragonMFL
Czujnik kwantowyHighpointUPRtek
ScalpelHandskit11-23
Zraszanie canCHUSHIWJ-001
Xcalibur  oprogramowanieThermo Fisher Scientific4.2
Elektroniczna waga analityczna Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd SOP Etanol 

Bibliografia

  1. Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
  2. Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H. The effect of developmental and environmental factors on secondary metabolites in medicinal plants. Plant Physiol Biochem. 148, 80-89 (2020).
  3. Liu, S., et al. Genetic and molecular dissection of ginseng (panax ginseng mey.) germplasm using high-density genic snp markers, secondary metabolites, and gene expressions. Front Plant Sci. 14, 1165349(2023).
  4. Chen, X., Wang, Y., Zhao, H., Fu, X., Fang, S. Localization and dynamic change of saponins in cyclocarya paliurus (batal.) iljinskaja. PloS One. 14 (10), e0223421(2019).
  5. Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by lc-ms/ms. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
  6. Cavalli, F. M. G., Bourgon, R., Vaquerizas, J. M., Luscombe, N. M. Specond: A method to detect condition-specific gene expression. Genome Biol. 12 (10), 101(2011).
  7. Epron, D., et al. Pulse-labelling trees to study carbon allocation dynamics: A review of methods, current knowledge and future prospects. Tree Physiology. 32 (6), 776-798 (2012).
  8. Varman, A. M., He, L., You, L., Hollinshead, W., Tang, Y. J. Elucidation of intrinsic biosynthesis yields using 13c-based metabolism analysis. Microb Cell Fact. 13 (1), 42(2014).
  9. Meng-Meng, G., Zhen-Yu, Z., Yu, Z., Qiu-Lin, Y., Ying, W. Systematic extraction and stable isotope determination of different biomarkers from single leaf of reticulate vein plants. Journal of Shaanxi University of Science & Technology. 41 (01), 72-79 (2023).
  10. Zhang, H., et al. A convenient lc-ms method for assessment of glucose kinetics in vivo with d-[13c6]glucose as a tracer. Clin Chem. 55 (3), 527-532 (2009).
  11. Chassy, A. W., Adams, D. O., Waterhouse, A. L. Tracing phenolic metabolism in vitis vinifera berries with 13c6-phenylalanine: Implication of an unidentified intermediate reservoir. J Agric Food Chem. 62 (11), 2321-2326 (2014).
  12. Lozac'h, F., et al. Evaluation of cams for 14c microtracer adme studies: Opportunities to change the current drug development paradigm. Bioanalysis. 10 (5), 321-339 (2018).
  13. Sulyok, M., Stadler, D., Steiner, D., Krska, R. Validation of an lc-ms/ms-based dilute-and-shoot approach for the quantification of > 500 mycotoxins and other secondary metabolites in food crops: Challenges and solutions. Anal Bioanal Chem. 412 (11), 2607-2620 (2020).
  14. Serra, F., et al. Inter-laboratory comparison of elemental analysis and gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry (gc-c-irms). Part i: Delta13c measurements of selected compounds for the development of an isotopic grob-test. J Mass Spectrom. 42 (3), 361-369 (2007).
  15. Jung, J. -Y., Oh, M. -K. Isotope labeling pattern study of central carbon metabolites using gc/ms. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 101-108 (2015).
  16. Ding, Y. G., et al. The traditional uses, phytochemistry, and pharmacological properties of paris l. (liliaceae): A review. J Ethnopharmacol. 278, 114293(2021).
  17. Cunningham, A. B., et al. Paris in the spring: A review of the trade, conservation and opportunities in the shift from wild harvest to cultivation of paris polyphylla (trilliaceae). J Ethnopharmacol. 222, 208-216 (2018).
  18. Madikizela, L. M., Ncube, S., Chimuka, L. Uptake of pharmaceuticals by plants grown under hydroponic conditions and natural occurring plant species: A review. Sci Total Environ. 636, 477-486 (2018).
  19. Tagami, K., Uchida, S. Online stable carbon isotope ratio measurement in formic acid, acetic acid, methanol and ethanol in water by high performance liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Anal Chim Acta. 614 (2), 165-172 (2008).
  20. Li, Y., et al. The combination of red and blue light increases the biomass and steroidal saponin contents of paris polyphylla var. Yunnanensis. Ind Crops Prod. 194, 116311(2023).
  21. Wang, G., et al. Tissue distribution, metabolism and absorption of rhizoma paridis saponins in the rats. J Ethnopharmacoly. 273, 114038(2021).
  22. Peng, S., et al. Progress in the study of differences in the types and contents of steroidal saponins in paris. Polyphylla smith var. Chinensis (franch.) hara. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (05), 2014-2025 (2022).
  23. Alami, M. M., et al. The current developments in medicinal plant genomics enabled the diversification of secondary metabolites' biosynthesis. Int J Mol Sci. 23 (24), 15932(2022).
  24. Wen, F., et al. The synthesis of paris saponin vii mainly occurs in leaves and is promoted by light intensity. Front Plant Sci. 14, 1199215(2023).
  25. Siadjeu, C., Pucker, B. Medicinal plant genomics. BMC Genomics. 24 (1), 429(2023).
  26. Tian, C., et al. Top-down phenomics of arabidopsis thaliana: Metabolic profiling by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy and transcriptome analysis of albino mutants. J Biol Chem. 282 (25), 18532-18541 (2007).
  27. Masakapalli, S. K., et al. Metabolic flux phenotype of tobacco hairy roots engineered for increased geraniol production. Phytochemistry. 99, 73-85 (2014).
  28. Schwender, J., Ohlrogge, J. B., Shachar-Hill, Y. A flux model of glycolysis and the oxidative pentosephosphate pathway in developing brassica napus embryos. J Biol Chem. 278 (32), 29442-29453 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Analiza LC-MSsaponina z Paryżapomiar stosunku izotopowegowiązka przewodząca łodygikarmienie kłączaekstrakcja ultradźwiękowaanaliza spektrometryczna mas
13C6-Znakowanie glukozy związane z LC-MS: Identyfikacja pierwotnych organów roślinnych w syntezie metabolitów wtórnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.