Ten protokół opisuje wszystkie procedury, od hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i pobierania supernatantu po ekstrakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą ultrawirowania.
Artykuł metodologiczny
Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wprowadzenie
Większość ADSC pochodzi z tkanki tłuszczowej i wykazano, że wspomaga regenerację i rekonstrukcję różnych tkanek i organów, w tym mięśnia sercowego, kości i skóry1. Ostatnie badania sugerują, że funkcja regeneracyjna ADSC może być spowodowana kontaktem międzykomórkowym i parakrynnym działaniem komórek2. Efekt parakrynny jest ważnym środkiem interakcji komórek i przekazywania informacji na krótkie odległości, a funkcja ta jest osiągana przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV).
EVs to dwuwarstwowe struktury błonowe wytwarzane przez komórki, o średnicy od 40 nm do 160 nm (średnio około 100 nm). Wpływają na różne funkcje komórkowe, takie jak produkcja cytokin, proliferacja komórek, apoptoza i metabolizm3,4. Przeprowadzono liczne badania nad funkcjami ADSC EV, w tym wspomaganiem regeneracji kości, regeneracją tkanki błony śluzowej jamy ustnej, przeżywalnością tkanki tłuszczowej po przeszczepie tkanek oraz gojeniem ran skóry5,6,7,8. Ogromny potencjał pojazdów elektrycznych ADSC w medycynie regeneracyjnej jest oczywisty. Istnieją różne metody ekstrakcji i oddzielania EV od supernatantu, takie jak techniki oparte na wirowaniu, wytrącaniu, wielkości cząsteczkowej, powinowactwie i mikrofluidyce. Metoda ultrawirowania jest powszechnie uważana za złoty standard izolowania EVs9. Podstawowa zasada ultrawirowania w celu separacji EV opiera się na fakcie, że cząstki w próbce mają różne współczynniki sedymentacji, co powoduje ich sedymentację i agregację w odrębnych warstwach separacji. Niemniej jednak nie ustalono jeszcze szczegółowego protokołu podkreślającego środki ostrożności podczas ultrawirowania.
Dlatego to badanie obiektywnie przedstawia kulturę ADSC, pobieranie supernatantów i procedury ultrawirowania EVs oraz kluczowe punkty za pomocą logicznego przepływu informacji i jasnego, formalnego języka. Stanowi to cenne odniesienie dla przyszłych eksperymentów.
Protokół
Przegląd kroków protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie mediów
- Przygotuj pożywkę hodowlaną dla ADSC bez egzosomów, używając 450 ml podstawowej pożywki hodowlanej, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej bez egzosomów i 5 ml potrójnych antybiotyków.
2. Reanimacja i hodowla ADSC
UWAGA: Reanimuj ADSC.
- Wcześniej włącz promieniowanie UV ultra czystego stołu i dezynfekuj go przez 30 minut.
- Wcześniej podgrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Pobrać 2 probówki zamrożonych ADSC (P3) z ciekłego azotu i wymieszać je w łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozmrożenia.
UWAGA: Otwór rurki zamrażarki nie powinien mieć kontaktu z wodą, aby zapobiec zanieczyszczeniu. - Zdezynfekuj probówkę do krioprezerwacji za pomocą 75% alkoholu, a następnie przenieś ją na ultra czysty stół. Odessać zawiesinę komórek za pomocą pipety i umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Umieścić probówkę wirówkową w wirówce wolnoobrotowej i wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Przygotuj cztery 10-centymetrowe naczynia hodowlane i wlej 9 ml pożywki do każdego naczynia. Zaznacz nazwę, typ komórki, pokolenie i datę eksperymentu, a następnie podgrzej je w termostatycznym inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C.
- Zdezynfekuj probówkę wirówkową i przenieś ją na ultra czysty stół. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
- Dodać 4 ml pożywki i delikatnie wymieszać roztwór (1 x 105 komórek/ml), aż do równomiernego rozproszenia.
UWAGA: Należy uważać, aby nie usunąć osadu komórkowego podczas ekstrakcji supernatantu. - Dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego naczynia. Wstrząśnij naczyniami metodą krzyżową.
UWAGA: Ustaw płytkę na równej powierzchni i mieszaj ją na krzyż (przesuwając ją w górę, w dół, w lewo i w prawo) przez 5-6 powtórzeń. Unikaj ruchów okrężnych, ponieważ mogą one powodować gromadzenie się komórek w środku. - Obserwuj komórki w 40-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu optycznego, a następnie umieść szalki w inkubatorze.
UWAGA: Głównym celem obserwacji komórek jest ustalenie, czy są one równomiernie rozmieszczone, ponieważ nierównomierny rozkład wpłynie na późniejszy wzrost. - Przygotuj pożywkę wymienną dla komórek.
- Wcześniej włącz promieniowanie UV ultra czystego stołu i dezynfekuj go przez 30 minut.
- Wcześniej podgrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Obserwuj stan komórki pod mikroskopem optycznym przy 40-krotnym powiększeniu. Poziom konfluencji wynosi około 50%.
UWAGA: Poziom konfluencji oblicza się jako stosunek powierzchni zajmowanej przez komórki do powierzchni szalki Petriego po tym, jak komórki przylegają do ściany i całkowicie się rozciągają. - Po dezynfekcji przenieś naczynie hodowlane na ultra czysty stół (poziom bezpieczeństwa biologicznego 2) i usuń pożywkę.
- Delikatnie opłucz każde naczynie hodowlane 2 ml roztworu PBS.
- Dodaj 10 ml podłoża do każdego naczynia. Przenieś naczynia do inkubatora.
3. Zbieranie supernatantu ADSC i ekstrakcja EV
- Wcześniej włącz promieniowanie UV ultra czystego stołu i dezynfekuj go przez 30 minut.
- Obserwuj stan komórki pod mikroskopem. Poziom konfluencji wynosi około 80%.
- Po dezynfekcji przenieś naczynie na ultra czysty stół. Ostrożnie zebrać sklarowany osad za pomocą pipety i umieścić go w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
UWAGA: Komórki można zamrozić lub wyrzucić. Jeśli sterylność nie jest wymagana, na stole operacyjnym można wykonać następujące czynności. W tym momencie eksperyment można wstrzymać, a następnie wznowić później. Jeżeli eksperyment zostanie przerwany, supernatant należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden tydzień. Długotrwałe przechowywanie nie jest zalecane, ponieważ może wpłynąć na aktywność pojazdów elektrycznych. Optymalnym podejściem jest natychmiastowe wyodrębnienie pojazdów elektrycznych. - Odwirować (300 x g, 10 min, w temperaturze pokojowej) w celu usunięcia zawieszonych komórek. Zebrać supernatant za pomocą pipety.
UWAGA: Nie nalewać. Pozostawić trochę supernatantu, aby zapobiec zasysaniu osadu. - Odwirować w celu usunięcia resztek komórkowych (2000 x g, 10 min, 4 °C), a następnie kontynuować zbieranie supernatantu za pomocą pipety.
UWAGA: Kluczowe punkty są takie same jak w kroku 3.4. - Przefiltruj supernatant za pomocą membrany 0,22 μm, aby usunąć duże cząstki i resztki komórek.
UWAGA: Przefiltruj supernatant za pomocą 2 ml sterylnego PBS, aby zwilżyć membranę filtracyjną przed filtracją. - Wirówka w ultrawirówce (10 000 x g, 30 min, 4 °C).
- Następnie odwirować przy 1 000 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia osadu i zebrania supernatantu.
UWAGA: Otrzymane EV zostały wielokrotnie oczyszczone przez odwirowanie w celu zwiększenia ich czystości. Śrut może nie być widoczny gołym okiem. Dlatego tak ważne jest, aby delikatnie obsługiwać pipetę i pozostawić trochę supernatantu na dnie, aby uniknąć gromadzenia się osadów. - Usunąć supernatant za pomocą pipety. Zawiesić osad za pomocą PBS i odwirować (1 00 000 x g, 70 min, 4 °C).
UWAGA: Śrut może nie być widoczny gołym okiem. Dlatego podczas zasysania supernatantu za pomocą pipety bardzo ważne jest delikatne i dokładne usunięcie supernatantu, aby zmaksymalizować czystość EV. - Usunąć supernatant i uzyskać osad EVs. Zawiesić go ponownie w 1 ml PBS, przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1 ml i przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C w celu późniejszego wykrycia.
UWAGA: Śrut może nie być widoczny gołym okiem. W związku z tym, podczas zasysania supernatantu za pomocą pipety, ważne jest, aby delikatnie i dokładnie usunąć supernatant, aby zmaksymalizować czystość EV. Jeśli próbki nie są potrzebne przez dłuższy czas, należy je przechowywać w lodówce o temperaturze -80 °C.
Wyniki
W pierwszej kolejności przeprowadzono charakterystykę i identyfikację ADSCs, obejmującą ich morfologię10 oraz przeciwciała powierzchniowe. Na podstawie Rysunku 2A widać wyraźnie, że ADSCs mają kształt wrzecionowaty i tworzą wiry po gęstym wzroście. Hodowane komórki zróżnicowano w kierunku adipogennym, osteogennym i chondrogennym, a następnie zabarwiono Oil Red O, Alizarin Red oraz Alcian Blue11. Eksperyment z indukcją różnicowania oraz cytometria przepływowa potwierdziły, że są to rzeczywiście ADSCs z potencjałem do różnicowania wielokierunkowego. Jednak w wynikach 22% komórek wykazuje pozytywny wynik dla CD45, co nie wpływa na sformułowany wniosek, ponieważ wspierają go odpowiednie przeciwciała pozytywne i negatywne (Rysunek 2A,B).
Następnie niezbędna jest identyfikacja wyizolowanych EV. Obejmuje ona głównie trzy aspekty: morfologię, wielkość cząstek oraz białka markerowe. Wyniki TEM wyraźnie ukazują strukturę EV w kształcie filiżanki z dwuwarstwową błoną12 (Rysunek 3A). NTA wskazuje, że EV mają rozkład wielkości cząstek w zakresie około 50-150 nm, przy stężeniu wynoszącym w przybliżeniu 1.6 x 1010 cząstek/mL (Rysunek 3B). Analiza Western Blot wykazuje również, że białka markerowe EV, w tym CD9, CD63 oraz TSG10113, ulegają prawidłowej ekspresji (Rysunek 3C).
Rysunek 1: Przegląd etapów protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Charakterystyka ADSCs. (A) Morfologia ADSCs jest wrzecionowata. ADSCs hodowano odpowiednio w pośrodkach do różnicowania adipogennego, osteogennego i chondrogennego. Różnicowanie adipogenne zidentyfikowano za pomocą barwienia Oil Red O. Różnicowanie osteogenne i chondrogenne potwierdzono odpowiednio barwieniem Alizarin Red oraz barwieniem Alcian Blue. Pasek skali: 100 µm. (B) Analiza cytometrii przepływowej ADSCs pod kątem markerów powierzchniowych MSC (CD90, CD105, CD29 i CD73) oraz markerów specyficznych dla komórek krwiotwórczych (CD31, CD34, CD45 i HLA-DR). Strategia bramkowania: najpierw obrysowano grupę kontrolną (blank). Na tej podstawie kolejno obrysowano CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 i HLA-DR zgodnie z przeciwciałami znakującymi każdą z grup. Rysunek został opracowany na podstawie pracy Han, Y. D. et al.13. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Charakterystyka EV. (A) Wyniki TEM wyraźnie ukazują wklęsłą, przypominającą filiżankę strukturę EV błony dwuwarstwowej. Pasek skali: 200 nm. (B) NTA wskazuje, że EV mają rozkład wielkości cząstek w zakresie około 50-150 nm, przy stężeniu wynoszącym około 1,6 x 1010 cząstek/ mL. (C) Detekcja ekspresji TSG101, CD9 i CD63 w egzosomach za pomocą metody Western blot. Rycina została opracowana na podstawie pracy Han, Y. D. et al.13. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Podczas formalnego procesu eksperymentalnego kilka punktów ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia najlepszych wyników eksperymentalnych. Opierając się na naszych wcześniejszych doświadczeniach, zaleca się wybór pasażowych 3-6 ADSC, ponieważ zapewniają one najlepszy możliwy stan komórek. Przed P3 czerwone krwinki, komórki śródbłonka i inne różne komórki mogły nie zostać odsiane. Po P6 komórki mogą stopniowo się starzeć, co może wpływać na stan wydzielanych EV. Po drugie, supernatant musi zostać pobrany, gdy stopień konfluencji komórek wynosi od 80% do 90%, aby zapewnić wystarczające wydzielanie jak największej liczby EV. Aby utrzymać maksymalną czystość pojazdów elektrycznych, naukowcy muszą zachować ostrożność podczas pierwszych trzech wirowania i upewnić się, że nie pozostały żadne pozostałości płynów, aby zapobiec aspiracji zanieczyszczeń i granulek. Podczas ostatnich dwóch wirowań należy upewnić się, że supernatant został całkowicie usunięty, jednocześnie chroniąc osad.
Ultrawirowanie jest opłacalne i nie wymaga dalszej obróbki. Technika ta jest szeroko stosowana w badaniach EV i wykazała zadowalającą skuteczność w uzyskiwaniu EV, co potwierdzają eksperymenty charakteryzacyjne. Niemniej jednak istnieją pewne nieuniknione wady. Po pierwsze, wskaźnik odzysku pojazdów elektrycznych jest niski. Po drugie, pojazdy elektryczne mają tendencję do agregacji. Dodatkowo można wyizolować komponenty niekomórkowe, a niektóre pojazdy elektryczne mogą pęknąć podczas tego procesu, prowadząc do akumulacji odłamków 14,15,16. Aby zaradzić tym wadom, większość badań koncentruje się na oczyszczaniu pojazdów elektrycznych12,13. Jednak protokół ten obejmuje cały proces, od hodowli komórkowej po oczyszczanie egzosomów, ponieważ uważamy, że cały proces wpływa na stan i czystość końcowych wyekstrahowanych EV. Bardzo ważne jest przestrzeganie wyżej wymienionych wytycznych podczas pracy. Dodatkowo, pobranie większej ilości supernatantu i wdrożenie hodowli komórkowej 3D może być korzystne, ponieważ liczne badania wykazały, że hodowla 3D jest bardziej skuteczna w stymulowaniu wydzielania EV w porównaniu z hodowlą 2D 17,18.
Protokół ten przedstawia proces ekstrakcji EV z ADSC za pomocą ultrawirowania. Dostarcza praktycznych wskazówek i umożliwia eksperymentatorom unikanie szczegółów podczas operacji w jak największym stopniu. Podsumowując, protokół pomaga eksperymentatorom w poprawie jakości próbek i służy jako przypomnienie, że powinniśmy nie tylko skupiać się na szczegółach każdego kroku, ale także rozpatrywać eksperyment jako całość.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnego interesu finansowego do deklaracji.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82202473).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Acrodisc Filtr igłowy, membrana Supor | Acros Organics | 4652 | 0,22 μ |
| Podłoże bazowe do hodowli komórkowych | OriCell | BHDM-03011 | |
| Płodowa surowica bydlęca bez EXO + suplement hodowlany (do ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej) | OriCell | HUXMD-05002 | |
| Mikroskop odwrócony | OLYMPUS | Lx70-S8F2 | |
| Wirówka wolnoobrotowa | Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd. | SC-3612 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-NR-05 | |
| Optima Max-XP Ultrawirówka stołowa | Beckman Coulter | 393315 | |
| roztworem penicyliny, streptomycyny i gentamycyny (100x) | Solarbio | P1410 |
Bibliografia
- Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward. Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).
- Xin, H., Li, Y., Chopp, M. Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke. Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).
- Li, Q., et al. The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration. Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).
- Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).
- Zheng, Y., et al. Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing). Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).
- Mou, S., et al. Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application. Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).
- Li, W., et al. Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).
- Han, B., et al. Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis. Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).
- Brezgin, S., et al. Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles. Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).
- Kim, S. H., et al. Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells. Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).
- Gan, L., et al. Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway. Cytokine. 172, 156386(2023).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. J Vis Exp. (131), e56482(2018).
- Han, Y. D., et al. Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).
- Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).
- Baranyai, T., et al. Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods. PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).
- Yuan, X., et al. Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).
- Eguchi, T., et al. Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment. PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).
Przedruki i uprawnienia
