Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wszystkie procedury, od hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i pobierania supernatantu po ekstrakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą ultrawirowania.

Streszczenie

Wprowadzenie

Większość ADSC pochodzi z tkanki tłuszczowej i wykazano, że wspomaga regenerację i rekonstrukcję różnych tkanek i organów, w tym mięśnia sercowego, kości i skóry¹. Ostatnie badania sugerują, że funkcja regeneracyjna ADSC może być spowodowana kontaktem międzykomórkowym i parakrynnym działaniem komórek². Efekt parakrynny jest ważnym środkiem interakcji komórek i przekazywania informacji na krótkie odległości, a funkcja ta jest osiągana przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV).

EVs to dwuwarstwowe struktury błonowe wytwarzane przez komórki, o średnicy od 40 nm do 160 nm (średnio około 100 nm). Wpływają na różne funkcje komórkowe, takie jak produkcja cytokin, proliferacja komórek, apoptoza i metabolizm^3,4. Przeprowadzono liczne badania nad funkcjami ADSC EV, w tym wspomaganiem regeneracji kości, regeneracją tkanki błony śluzowej jamy ustnej, przeżywalnością tkanki tłuszczowej po przeszczepie tkanek oraz gojeniem ran skóry^5,6,7,8. Ogromny potencjał pojazdów elektrycznych ADSC w medycynie regeneracyjnej jest oczywisty. Istnieją różne metody ekstrakcji i oddzielania EV od supernatantu, takie jak techniki oparte na wirowaniu, wytrącaniu, wielkości cząsteczkowej, powinowactwie i mikrofluidyce. Metoda ultrawirowania jest powszechnie uważana za złoty standard izolowania EVs⁹. Podstawowa zasada ultrawirowania w celu separacji EV opiera się na fakcie, że cząstki w próbce mają różne współczynniki sedymentacji, co powoduje ich sedymentację i agregację w odrębnych warstwach separacji. Niemniej jednak nie ustalono jeszcze szczegółowego protokołu podkreślającego środki ostrożności podczas ultrawirowania.

Dlatego to badanie obiektywnie przedstawia kulturę ADSC, pobieranie supernatantów i procedury ultrawirowania EVs oraz kluczowe punkty za pomocą logicznego przepływu informacji i jasnego, formalnego języka. Stanowi to cenne odniesienie dla przyszłych eksperymentów.

Protokół

Przegląd kroków protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie mediów

1. Przygotuj pożywkę hodowlaną dla ADSC bez egzosomów, używając 450 ml podstawowej pożywki hodowlanej, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej bez egzosomów i 5 ml potrójnych antybiotyków.

2. Reanimacja i hodowla ADSC

UWAGA: Reanimuj ADSC.

1. Wcześniej włącz promieniowanie UV ultra czystego stołu i dezynfekuj go przez 30 minut.
2. Wcześniej podgrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Pobrać 2 probówki zamrożonych ADSC (P3) z ciekłego azotu i wymieszać je w łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozmrożenia.
   UWAGA: Otwór rurki zamrażarki nie powinien mieć kontaktu z wodą, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
4. Zdezynfekuj probówkę do krioprezerwacji za pomocą 75% alkoholu, a następnie przenieś ją na ultra czysty stół. Odessać zawiesinę komórek za pomocą pipety i umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
5. Umieścić probówkę wirówkową w wirówce wolnoobrotowej i wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
6. Przygotuj cztery 10-centymetrowe naczynia hodowlane i wlej 9 ml pożywki do każdego naczynia. Zaznacz nazwę, typ komórki, pokolenie i datę eksperymentu, a następnie podgrzej je w termostatycznym inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C.
7. Zdezynfekuj probówkę wirówkową i przenieś ją na ultra czysty stół. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
8. Dodać 4 ml pożywki i delikatnie wymieszać roztwór (1 x 10⁵ komórek/ml), aż do równomiernego rozproszenia.
   UWAGA: Należy uważać, aby nie usunąć osadu komórkowego podczas ekstrakcji supernatantu.
9. Dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego naczynia. Wstrząśnij naczyniami metodą krzyżową.
   UWAGA: Ustaw płytkę na równej powierzchni i mieszaj ją na krzyż (przesuwając ją w górę, w dół, w lewo i w prawo) przez 5-6 powtórzeń. Unikaj ruchów okrężnych, ponieważ mogą one powodować gromadzenie się komórek w środku.
10. Obserwuj komórki w 40-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu optycznego, a następnie umieść szalki w inkubatorze.
    UWAGA: Głównym celem obserwacji komórek jest ustalenie, czy są one równomiernie rozmieszczone, ponieważ nierównomierny rozkład wpłynie na późniejszy wzrost.
11. Przygotuj pożywkę wymienną dla komórek.
    1. Wcześniej włącz promieniowanie UV ultra czystego stołu i dezynfekuj go przez 30 minut.
    2. Wcześniej podgrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    3. Obserwuj stan komórki pod mikroskopem optycznym przy 40-krotnym powiększeniu. Poziom konfluencji wynosi około 50%.
       UWAGA: Poziom konfluencji oblicza się jako stosunek powierzchni zajmowanej przez komórki do powierzchni szalki Petriego po tym, jak komórki przylegają do ściany i całkowicie się rozciągają.
    4. Po dezynfekcji przenieś naczynie hodowlane na ultra czysty stół (poziom bezpieczeństwa biologicznego 2) i usuń pożywkę.
    5. Delikatnie opłucz każde naczynie hodowlane 2 ml roztworu PBS.
    6. Dodaj 10 ml podłoża do każdego naczynia. Przenieś naczynia do inkubatora.

3. Zbieranie supernatantu ADSC i ekstrakcja EV

1. Wcześniej włącz promieniowanie UV ultra czystego stołu i dezynfekuj go przez 30 minut.
2. Obserwuj stan komórki pod mikroskopem. Poziom konfluencji wynosi około 80%.
3. Po dezynfekcji przenieś naczynie na ultra czysty stół. Ostrożnie zebrać sklarowany osad za pomocą pipety i umieścić go w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
   UWAGA: Komórki można zamrozić lub wyrzucić. Jeśli sterylność nie jest wymagana, na stole operacyjnym można wykonać następujące czynności. W tym momencie eksperyment można wstrzymać, a następnie wznowić później. Jeżeli eksperyment zostanie przerwany, supernatant należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden tydzień. Długotrwałe przechowywanie nie jest zalecane, ponieważ może wpłynąć na aktywność pojazdów elektrycznych. Optymalnym podejściem jest natychmiastowe wyodrębnienie pojazdów elektrycznych.
4. Odwirować (300 x g, 10 min, w temperaturze pokojowej) w celu usunięcia zawieszonych komórek. Zebrać supernatant za pomocą pipety.
   UWAGA: Nie nalewać. Pozostawić trochę supernatantu, aby zapobiec zasysaniu osadu.
5. Odwirować w celu usunięcia resztek komórkowych (2000 x g, 10 min, 4 °C), a następnie kontynuować zbieranie supernatantu za pomocą pipety.
   UWAGA: Kluczowe punkty są takie same jak w kroku 3.4.
6. Przefiltruj supernatant za pomocą membrany 0,22 μm, aby usunąć duże cząstki i resztki komórek.
   UWAGA: Przefiltruj supernatant za pomocą 2 ml sterylnego PBS, aby zwilżyć membranę filtracyjną przed filtracją.
7. Wirówka w ultrawirówce (10 000 x g, 30 min, 4 °C).
8. Następnie odwirować przy 1 000 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia osadu i zebrania supernatantu.
   UWAGA: Otrzymane EV zostały wielokrotnie oczyszczone przez odwirowanie w celu zwiększenia ich czystości. Śrut może nie być widoczny gołym okiem. Dlatego tak ważne jest, aby delikatnie obsługiwać pipetę i pozostawić trochę supernatantu na dnie, aby uniknąć gromadzenia się osadów.
9. Usunąć supernatant za pomocą pipety. Zawiesić osad za pomocą PBS i odwirować (1 00 000 x g, 70 min, 4 °C).
   UWAGA: Śrut może nie być widoczny gołym okiem. Dlatego podczas zasysania supernatantu za pomocą pipety bardzo ważne jest delikatne i dokładne usunięcie supernatantu, aby zmaksymalizować czystość EV.
10. Usunąć supernatant i uzyskać osad EVs. Zawiesić go ponownie w 1 ml PBS, przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1 ml i przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C w celu późniejszego wykrycia.
    UWAGA: Śrut może nie być widoczny gołym okiem. W związku z tym, podczas zasysania supernatantu za pomocą pipety, ważne jest, aby delikatnie i dokładnie usunąć supernatant, aby zmaksymalizować czystość EV. Jeśli próbki nie są potrzebne przez dłuższy czas, należy je przechowywać w lodówce o temperaturze -80 °C.

Wyniki

Po pierwsze, ADSC zostały scharakteryzowane i zidentyfikowane, w tym ich morfologia¹⁰ i przeciwciała powierzchniowe. Na podstawie Rysunek 2A, widać, że ADSC są ułożone w kształt wrzeciona i tworzą wir po gęstym wzroście. Wyhodowane komórki zróżnicowano na komórki adipogenne, osteogenne i chondrogenne i wybarwiono Oil Red O, Alizarin Red i Alcian Blue¹¹. Eksperyment z różnicowaniem indukowanym i cytometria przepływowa potwierdziły, że są to rzeczywiście ADSC z potencjałem do różnicowania wielokierunkowego. Jednak 22% komórek jest CD45 dodatnich w wynikach, co nie wpłynie na wniosek, ponieważ wystarczająca ilość pozytywnych i ujemnych przeciwciał go wspiera (Figura 2A,B).

Następnie, identyfikacja wyodrębnionych EV jest niezbędna. Obejmuje głównie trzy aspekty: morfologię, wielkość cząstek i białka markerowe. Wyniki TEM wyraźnie ujawniają strukturę EV w kształcie miseczki z dwuwarstwową membraną¹² (Rysunek 3A). NTA wskazuje, że EV mają rozkład wielkości cząstek około 50-150 nm, przy stężeniu około 1,6 x^{10 10} cząstek/ml (Rysunek 3B). Analiza Western Blot pokazuje również, że białka markerowe EV, w tym CD9, CD63 i TSG101¹³, są wyrażane płynnie (Figura 3C).

Rysunek 1: Przegląd kroków protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Charakterystyka ADSC. (A) Morfologia ADSC jest wrzecionowata. ADSC hodowano w pożywce odpowiednio w celu różnicowania adipogennego, osteogennego i chondrogennego. Różnicowanie adipogenne zidentyfikowano na podstawie barwienia czerwienią olejową O. Różnicowanie osteogenne i chondrogenne potwierdzono odpowiednio barwieniem czerwienią alizarynową i barwieniem błękitem alcyjskim. Podziałka: 100 μm. (B) Analiza metodą cytometrii przepływowej ADSC pod kątem markerów powierzchniowych MSC (CD90, CD105, CD29 i CD73) oraz markerów specyficznych dla komórek krwiotwórczych (CD31, CD34, CD45 i HLA-DR). Strategia bramkowania: najpierw zakreśl pustą grupę. Na tej podstawie krążą kolejno CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 i HLA-DR zgodnie ze znakowanymi przeciwciałami każdej grupy. Ten rysunek został zaadaptowany z Han, Y. D. et al.¹³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Charakterystyka EVs. (A) Wyniki TEM wyraźnie pokazują strukturę EV w kształcie miseczki membrany dwuwarstwowej. Podziałka: 200 nm. (B) NTA wskazuje, że EV mają rozkład wielkości cząstek około 50-150 nm, przy stężeniu około 1,6 x^{10 10} cząstek/ml. (C) Wykrywanie ekspresji TSG101, CD9 i CD63 w egzosomach za pomocą Western blot. Ten rysunek został zaadaptowany z Han, Y. D. et al.¹³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Podczas formalnego procesu eksperymentalnego kilka punktów ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia najlepszych wyników eksperymentalnych. Opierając się na naszych wcześniejszych doświadczeniach, zaleca się wybór pasażowych 3-6 ADSC, ponieważ zapewniają one najlepszy możliwy stan komórek. Przed P3 czerwone krwinki, komórki śródbłonka i inne różne komórki mogły nie zostać odsiane. Po P6 komórki mogą stopniowo się starzeć, co może wpływać na stan wydzielanych EV. Po drugie, supernatant musi zostać pobrany, gdy stopień konfluencji komórek wynosi od 80% do 90%, aby zapewnić wystarczające wydzielanie jak największej liczby EV. Aby utrzymać maksymalną czystość pojazdów elektrycznych, naukowcy muszą zachować ostrożność podczas pierwszych trzech wirowania i upewnić się, że nie pozostały żadne pozostałości płynów, aby zapobiec aspiracji zanieczyszczeń i granulek. Podczas ostatnich dwóch wirowań należy upewnić się, że supernatant został całkowicie usunięty, jednocześnie chroniąc osad.

Ultrawirowanie jest opłacalne i nie wymaga dalszej obróbki. Technika ta jest szeroko stosowana w badaniach EV i wykazała zadowalającą skuteczność w uzyskiwaniu EV, co potwierdzają eksperymenty charakteryzacyjne. Niemniej jednak istnieją pewne nieuniknione wady. Po pierwsze, wskaźnik odzysku pojazdów elektrycznych jest niski. Po drugie, pojazdy elektryczne mają tendencję do agregacji. Dodatkowo można wyizolować komponenty niekomórkowe, a niektóre pojazdy elektryczne mogą pęknąć podczas tego procesu, prowadząc do akumulacji odłamków 14,15,16. Aby zaradzić tym wadom, większość badań koncentruje się na oczyszczaniu pojazdów elektrycznych^12,13. Jednak protokół ten obejmuje cały proces, od hodowli komórkowej po oczyszczanie egzosomów, ponieważ uważamy, że cały proces wpływa na stan i czystość końcowych wyekstrahowanych EV. Bardzo ważne jest przestrzeganie wyżej wymienionych wytycznych podczas pracy. Dodatkowo, pobranie większej ilości supernatantu i wdrożenie hodowli komórkowej 3D może być korzystne, ponieważ liczne badania wykazały, że hodowla 3D jest bardziej skuteczna w stymulowaniu wydzielania EV w porównaniu z hodowlą 2D ^17,18.

Protokół ten przedstawia proces ekstrakcji EV z ADSC za pomocą ultrawirowania. Dostarcza praktycznych wskazówek i umożliwia eksperymentatorom unikanie szczegółów podczas operacji w jak największym stopniu. Podsumowując, protokół pomaga eksperymentatorom w poprawie jakości próbek i służy jako przypomnienie, że powinniśmy nie tylko skupiać się na szczegółach każdego kroku, ale także rozpatrywać eksperyment jako całość.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acrodisc Filtr igłowy, membrana Supor	Acros Organics	4652	0,22 μ
Podłoże bazowe do hodowli komórkowych	OriCell	BHDM-03011
Płodowa surowica bydlęca bez EXO + suplement hodowlany (do ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej)	OriCell	HUXMD-05002
Mikroskop odwrócony	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Wirówka wolnoobrotowa	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-NR-05
Optima Max-XP Ultrawirówka stołowa	Beckman Coulter	393315
roztworem penicyliny, streptomycyny i gentamycyny (100x)	Solarbio	P1410