Bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody EUCAST RAST bez spektrometrii mas

Summary

EUCAST opracował protokół bezpośredniego testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) dla automatycznych hodowli krwi. Jednak jego zależność od identyfikacji mikrobiologicznej opartej na spektrometrii mas można wyeliminować, stosując protokół bezpośredniego przygotowania inokulum w zautomatyzowanym systemie identyfikacji drobnoustrojów. Takie podejście może dostarczyć raporty AST w ciągu 24 godzin od pobrania próbki.

Abstract

Sepsa Gram-ujemna (GN) to nagły przypadek medyczny, w którym leczenie w warunkach ograniczonych zasobów opiera się na konwencjonalnych technikach hodowli mikrobiologicznej, które dostarczają wyniki w ciągu 3-4 dni. Uznając to opóźnienie w czasie realizacji (TAT), zarówno EUCAST, jak i CLSI opracowały protokoły do określania wyników AST bezpośrednio z pozytywnie oznaczonych automatycznych butelek do posiewu krwi (+aBC). Protokół EUCAST rapid AST (RAST) został po raz pierwszy wprowadzony w 2018 r., w którym można podać punkty graniczne średnicy strefy dla czterech powszechnych czynników etiologicznych sepsy GN, tj. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i kompleksu Acinetobacter baumannii. Jednak te laboratoria kliniczne, które wdrożyły tę metodę w swoim rutynowym przepływie pracy, polegają na identyfikacji drobnoustrojów opartej na spektrometrii mas, która nie jest łatwo dostępna, co wyklucza jej wdrożenie w warunkach ograniczonych zasobów. Aby go obejść, oceniliśmy protokół bezpośredniego inokulum (DIP) przy użyciu komercyjnego zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów i testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (aMIAST), aby umożliwić wczesną identyfikację drobnoustrojów w ciągu 8 godzin od pozytywnego oznaczenia aBC. Oceniliśmy ten protokół od stycznia do października 2023 r. w celu zidentyfikowania czterech raportowanych GN RR-GN (RR-GN) w pozytywnie oznaczonym aBC. Wyniki identyfikacji mikrobiologicznej w DIP porównano ze standardowym protokołem przygotowania inokulum (SIP) w aMIAST. Spośród 204 +aBC z monomorficznym GN (+naBC), jeden z 4 RR-GN został zidentyfikowany w 105 +naBC przez SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 i kompleks A. baumannii: 26). Spośród nich 94% (98/105) zostało prawidłowo zidentyfikowanych przez DIP, podczas gdy poziomy błędu głównego i bardzo poważnego błędu wynosiły odpowiednio 6% (7/105) i 1,7% (4/240). W przypadku gdy DIP do identyfikacji drobnoustrojów przeprowadza się przy użyciu metody EUCAST RAST, wstępne raporty kliniczne mogą zostać dostarczone w ciągu 24 godzin od otrzymania próbki. Podejście to może przyczynić się do znacznego zmniejszenia TAT, umożliwiając wczesne wprowadzenie odpowiedniej terapii przeciwdrobnoustrojowej.

Introduction

Sepsa, ważny globalny problem zdrowotny, jest definiowana jako zagrażająca życiu dysfunkcja narządów spowodowana rozregulowaną odpowiedzią gospodarza na infekcję. W badaniu Global Burden of Diseases oszacowano, że w 2017 r. na całym świecie było 48,9 miliona przypadków sepsy i 11 milionów zgonów związanych z sepsą, co stanowiło prawie 20% wszystkich zgonów na świecie¹. Około 2/3 zakażeń krwi (BSI) powodujących śmiertelność jest spowodowanych przez patogeny bakteryjne Gram-ujemne². Najczęstszymi przyczynami śmiertelności wśród osób Gram-ujemnych (GN) są Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii, które stanowią około 40% przypadków wśród 33 patogenów bakteryjnych².

Posiewy krwi pozostają złotym standardem w diagnozowaniu BSI, a szybka identyfikacja drobnoustrojów wraz z wynikami testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) jest kluczem do zarządzania. Szacuje się, że prawdopodobieństwo zgonu wzrasta o 9% z każdym godzinnym opóźnieniem we wprowadzaniu odpowiednich środków przeciwdrobnoustrojowych w sepsie ³. Czas realizacji (TAT) mikrobiologicznie dodatnich raportów posiewu krwi z wynikami AST wynosi około 48-72 godzin przy użyciu dostępnych narzędzi mikrobiologicznych w warunkach ograniczonych zasobów, nawet w przypadku zautomatyzowanych systemów. W wyniku tego słabego TAT środki przeciwdrobnoustrojowe o szerokim spektrum działania są stosowane empirycznie, co przyczynia się do narastającego problemu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR). Uznając tę pilną potrzebę zmniejszenia TAT w technikach hodowli mikrobiologicznej sepsy, EUCAST i CLSI zmierzają w kierunku wykonywania AST bezpośrednio z pozytywnie oznaczonych butelek do hodowli krwi (+aBC)^4,5.

W 2018 roku EUCAST po raz pierwszy wprowadził metodę szybkiego AST (RAST) do oznaczania AST metodą dyfuzji krążka Kirby'ego-Bauera w krótkich czasach inkubacji, tj. 4 h, 6 h i 8 h, bezpośrednio z +aBC^6,7. Metoda jest obecnie zwalidowana do oznaczania AspAT dla +aBC zawierających jedną z 8 najczęstszych przyczyn BSI, a mianowicie E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa i kompleks A. baumannii wśród Gram-ujemnych oraz Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium i Streptococcus pneumoniae wśród Gram-dodatnich⁸. Wartości graniczne dla oznaczania AspAT w różnych odstępach czasu są podane dla poszczególnych gatunków drobnoustrojów wymienionych powyżej. W związku z tym, przed kategoryczną interpretacją wyników AST, konieczna jest identyfikacja mikrobiologiczna. Jednak norma RAST nie określa metody umożliwiającej identyfikację drobnoustrojów w tym czasie.

Większość badań oceniających metodę EUCAST RAST w ich warunkach wykorzystywała identyfikację mikrobiologiczną opartą na spektrometrii mas po krótkiej inkubacji na pożywkach platerowanych do identyfikacji mikroorganizmów^{9,10,11,12,13,14,15,16,17}. Jednak instrumenty do spektrometrii mas nie są powszechnie dostępne, zwłaszcza w krajach o niskich i średnich dochodach (LMIC), co znacznie ogranicza potencjalną przydatność tej metody. Niewiele badań wykazało implementację tej metody w swoich ośrodkach bez użycia spektrometrii mas^18,19,20. Tayşi et al.¹⁸ podali szeroką kategoryzację GN wśród Enterobacterales, Pseudomonas i Acinetobacter spp. na podstawie morfologii barwienia Grama i testu oksydazy przed interpretacją wyników AST. W innych badaniach przeprowadzonych przez Gupta et al.¹⁹ oraz Siddiqui et al.²⁰, identyfikacja drobnoustrojów na poziomie gatunku została przeprowadzona poprzez przygotowanie osadu bakteryjnego z pozytywnie oznaczonej mieszaniny krwi-bulionu i zaszczepienie go w konwencjonalnych testach biochemicznych. Podczas gdy Tayşi i wsp.¹⁸ nie wypowiedzieli się na temat dokładności identyfikacji drobnoustrojów za pomocą ich podejścia, Gupta i wsp.¹⁹ poinformowali, że przy ich podejściu w 165/176 (94%) przypadkach, raportowany przez RAST gram-ujemny (RR-GN), tj. E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa i A. baumannii kompleks. Jednak przy tym drugim podejściu, odczyt wyników RAST odbywał się retrospektywnie przy użyciu punktów granicznych o średnicy strefy 8 godzin dopiero po pełnej inkubacji konwencjonalnych wyników biochemicznych, tj. 18-24 godzin po inokulacji, a średni czas raportowania wynosił około 2 dni.

Aby jeszcze bardziej zmniejszyć TAT raportów klinicznych, proponujemy alternatywną metodologię, która umożliwi wczesną identyfikację GN obecnego w +aBC za pomocą aMIAST. Przed wprowadzeniem systemów identyfikacji drobnoustrojów opartych na spektrometrii mas, te zautomatyzowane systemy identyfikacji były uważane za standard opieki nad identyfikacją drobnoustrojów, w których identyfikacja była możliwa dzięki zmianom kolorymetrycznym i/lub fluorometrycznym wywołanym przez bakterie testowe po zaszczepieniu w zminiaturyzowanych testach biochemicznych umieszczonych w kasecie i dopasowujących wyniki do ich bazy danych izolatów. Średni czas identyfikacji w tych systemach wynosi około 4 godzin do 8 godzin, jednak są one ograniczone przez fakt, że producenci zalecają nocny wzrost drobnoustrojów, zanim będzie można zaszczepić ich odpowiednie karty identyfikacyjne. Wymóg ten znacznie ogranicza ich przydatność w skracaniu czasu zgłaszania.

Niewiele badań oceniało metody bezpośredniej identyfikacji mikrobów z +aBC za pomocą tych zautomatyzowanych systemów^{21,22,23,24,25,26,27}. W przypadku +aBC zawierających monomorficzny GN, większość badań wykazała doskonałą zgodność między bezpośrednią inokulacją z osadu bakteryjnego wykonanego z dodatniej mieszaniny krwi i bulionu a standardową inkubacją kolonii. Jednak w przypadku Gram-dodatnich wskaźników zgodności były nieoptymalne. Ponieważ średni czas do dodatniego wyniku +aBC wynosi od 8 godzin do 16 godzin, a identyfikacja GN trwa od ~ 4 godzin do 8 godzin w zautomatyzowanym systemie identyfikacji drobnoustrojów, stawiamy hipotezę, że stosując protokół bezpośredniej inokulacji w automatycznej identyfikacji drobnoustrojów, możemy zakończyć raportowanie kliniczne +aBC z GN o RR-GN w ciągu 24 godzin od otrzymania próbki.

Ustawienie dla badania
Niniejsze badanie zostało przeprowadzone w klinicznym laboratorium bakteriologicznym liczącego 950 łóżek, akademickiego instytutu opieki trzeciego stopnia o znaczeniu krajowym (INI) w środkowych Indiach od stycznia do października 2023 r. Laboratorium wyposażone jest w system ciągłego monitorowania posiewów krwi (CBCMS) oraz aMIAST. Laboratorium bakteriologiczne działa przez całą dobę z dostępnością techników i mikrobiologów do przetwarzania i raportowania każdej pozytywnie oznaczonej butelki z posiewem krwi (+aBC).

Metody mikrobiologiczne stosowane tutaj
Przebieg badania jest pokazany w Rysunek 1. +aBC wykazujące monomorficzne GN (+naBC) zostały przetworzone przez bezpośrednią inokulację odpowiednich kart identyfikacyjnych w celu umożliwienia identyfikacji i AST przy użyciu protokołu EUCAST RAST. Wyniki te porównano z metodą standardowej opieki (SoC) dla +aBCs, tj. subkulturacją na konwencjonalnych pożywkach galwanicznych przez agar z krwią owczą (SBA), agar czekoladowy (CA) i agar MacConkey (MA), inkubowane tlenowo przez 16 godzin do 24 godzin, a następnie karty identyfikacyjne i AST podawane przez aMIAST, gdy pojawią się izolowane kolonie. Z badania wykluczono posiewy krwi wykazujące ziarniaki Gram-dodatnie, pałeczki Gram-dodatnie, pączkujące komórki drożdży i ≥2 różne mikroorganizmy na początkowym barwieniu Grama lub pożywce galwanicznej.

Protocol

Badanie, finansowane z grantu badawczego przyznanego dr Ayush Gupta przez AIIMS Bhopal, zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Etyki Człowieka (IHEC) vide list nr: IHEC- LOP/2022/IL072.

UWAGA: Próbka o objętości 5 ml została użyta na podstawie badań przeprowadzonych przez Quesada et al.²⁵ oraz Munoz-Davila et al.²⁷.

1. Standardowy protokół inokulum (SIP) do identyfikacji bakterii za pomocą aMIAST

1. Nosić czyste rękawice, a wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego klasy IIa (BSC) zdezynfekować przegrodę +naBC wacikiem zawierającym 70% alkoholu izopropylowego.
2. Pobrać około 1 ml mieszaniny krwi i bulionu za pomocą sterylnej strzykawki z igłą o sile 21 G.
3. Dozuj 1 dużą kroplę mieszaniny krwi i bulionu z igły na powierzchnię pożywki z pożywki, a mianowicie SBA, CA i MA. Smugować płytki i inkubować płytki hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 °C ± 2 °C w warunkach tlenowych przez 18–24 godzin.
4. Po inkubacji zbadaj płytki pod kątem pojawienia się izolowanych kolonii w BSC i przejdź dalej w celu identyfikacji i AST przez aMIAST.
5. Dla każdego izolatu należy umieścić probówkę polistyrenową aMIAST w stojaku na probówki aMIAST i wsypać do niej 3 ml sterylnego soli fizjologicznej za pomocą dozownika dołączonego do butelki z solą fizjologiczną.
6. Dotknij trzech do pięciu morfologicznie podobnych kolonii sterylnym prostym drutem do zaszczepiania i przenieś inokulum bakteryjne do pierwszej probówki.
7. Dostosuj zmętnienie za pomocą sterylnego soli fizjologicznej w zaszczepionej probówce w zakresie 0,47-0,63 McFarlanda za pomocą densytometru.
8. Umieścić nasadkę kapilarną gram-ujemnej karty identyfikacyjnej aMIAST w pierwszej probówce.
9. Umieść wybrane karty w odpowiedniej pozycji na kasecie. Inokulum w kasecie jest gotowe i trafia do aMIAST w dziale napełniania.
   UWAGA: Wiek zawieszenia nie może przekroczyć 30 minut przed zaszczepieniem kart.
10. Załaduj kasetę na swoje miejsce w komorze napełniania z kodem kreskowym próbki skierowanym do środka.
11. Zamknij drzwi i naciśnij Fill na ekranie interfejsu użytkownika. Napełnianie to cykl 70 s. Po zakończeniu cyklu niebieska lampka kontrolna na systemie zacznie migać. Umieszczenie kart w systemie aMIAST powoduje rozprowadzenie inokulum w małych komorach kart przez maszynę.
12. Wyjmij kasetę z komory napełniania, zamknij drzwi i umieść w komorze załadowczej. Kody kreskowe są automatycznie skanowane i sprawdzane z konserwacją wirtualnej elektronicznej listy roboczej kasety. Słomki są automatycznie zamykane, a karty są automatycznie ładowane do karuzeli. niebieska strzałka na aMIASTACH oznacza, że ładowanie zostało zakończone.
13. Po zakończeniu usuń odpady kasety. Zapoznaj się z procedurą usuwania odpadów w literaturze produktu lub postępuj zgodnie z innymi standardowymi praktykami. Pozostałą część zawiesiny w probówkach należy wykorzystać do subhodowli na agarze CLED w celu sprawdzenia czystości izolatów.
14. Odczytaj wyniki po zakończeniu analizy przez urządzenie.

2. Protokół bezpośredniego inokulum (DIP) do identyfikacji bakterii za pomocą aMIAST

1. Nosić sterylne rękawice, a wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego oczyść przegrodę +naBC wacikiem zawierającym 70% alkoholu izopropylowego.
2. Za pomocą sterylnej strzykawki z igłą 21 G pobrać 5 ml podwielokrotności z mieszaniny krwi i bulionu +naBC i przenieść ją do probówki separatora surowicy (SST) po zdezynfekowaniu gumowej przegrody 70% alkoholem izopropylowym (Rysunek 2A).
3. Odwirować tę porcję przez 10 minut przy sile 160 x g, aby osadzić krwinki w mieszaninie krwi i bulionu. Po pierwszym odwirowaniu obserwuj szwadron, w którym osiądą krwinki.
4. Otworzyć nakrętkę fiolki znajdującą się w komorze bezpieczeństwa biologicznego i za pomocą sterylnej końcówki i pipety ostrożnie usunąć supernatant i przenieść go do nowej zwykłej fiolki do pobierania krwi (czerwona góra), zdejmując jej nakrętkę.
5. Umieścić nakrętkę na fiolce i ponownie odwirować przez 10 minut przy 2000 x g. Po drugim odwirowaniu na dnie utworzy się osad bakteryjny.
6. Odessać supernatant i wyrzucić go za pomocą sterylnej pipety i końcówki. Osad bakteryjny pozostanie na dnie probówki i zostanie użyty do zaszczepienia karty identyfikacyjnej aMIAST.
   UWAGA: W pierwszym wirowaniu użyto probówki z separatorem surowicy przy 160 x g. Zostało to oparte na badaniach przeprowadzonych przez Quesada et al.²⁵ oraz Munoz-Davila et al.²⁷_, gdzie pierwszy etap wirowania przeprowadzono w przybliżeniu przy odpowiednio 30 x g i 60 x g. Mieszanina krwi-bulion z +aBC została najpierw odwirowana z niską prędkością w SST w celu osadzenia krwinek.
7. Umieść tubkę polistyrenową aMIAST w stojaku na probówki aMIAST i dodaj do niej 3 ml sterylnej soli fizjologicznej za pomocą dozownika dołączonego do butelki z solą fizjologiczną.
8. Za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania pobrać osad bakteryjny z dna fiolki i zaszczepić go w probówce aMIAST
9. Powtórz kroki 1.7-1.14.

3. AST według protokołu EUCAST RAST⁴

1. Przechowywać niezaszczepione okrągłe płytki agarowe Muellera-Hintona (MHA) o średnicy 90 mm w gotowości w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Nosić sterylne rękawice, a wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego oczyść przegrodę +naBC wacikiem zawierającym 70% alkoholu izopropylowego.
3. Za pomocą sterylnej strzykawki odessać 125 μl ± 25 μl nierozcieńczonej mieszaniny krwi i bulionu z +naBC i dodać do każdej płytki MHA w środku.
4. Delikatnie rozprowadź bulion na płytkach za pomocą sterylnego bawełnianego wacika w trzech kierunkach i nałóż ≤ 6 krążków przeciwdrobnoustrojowych na każdą płytkę.
5. Inkubować płytki w inkubatorze tlenowym w temperaturze 35 °C± 1 °C przez 8 godzin. Po zakończeniu inkubacji należy obserwować czystość izolatu.
6. Odczyt stref inhibicji po 8 godzinach ± 5 minutach. Interpretację wyników należy dokonać za pomocą tabeli punktów przerwania RAST dla krótkiej inkubacji po sprawdzeniu wyników identyfikacji bakterii w aMIAST.
7. Zgłaszaj wyniki AspAT tylko wtedy, gdy izolat jest zidentyfikowany jako jeden z RR-GN, a na płytkach MHA i CLED rośnie jeden morfotyp.

4. Kontrola jakości

1. Przeprowadzić wewnętrzną kontrolę jakości dla protokołu SIP systemu aMIAST zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu zalecanych szczepów referencyjnych.
2. Przeprowadzaj wewnętrzną kontrolę jakości metody RAST co tydzień przy użyciu zalecanego szczepu referencyjnego E. coli, jak opisano poniżej.
   1. Ułóż 4 sterylne szklane probówki w stojaku na probówki. Dozować 3 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do pierwszej probówki i 990 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej do drugiej, trzeciej i czwartej probówki.
   2. Wykonać 0,5 zawiesiny McFarlanda szczepu QC z izolowanych kolonii nocnej hodowli na pożywkach galaizacyjnych.
   3. Za pomocą sterylnej pipety i końcówki przenieść 10 μl zawiesiny z pierwszej probówki do drugiej.
   4. Po wymieszaniu przenieść 10 μl zawiesiny z drugiej do trzeciej probówki, a następnie do ostatniej probówki.
   5. Z ostatniej probówki pobrać 1 ml inokulum za pomocą sterylnej strzykawki z igłą i dodać go do niezaszczepionego aBC.
   6. Jednocześnie dodać 5 ml sterylnej krwi owczej do aBC za pomocą sterylnej strzykawki z igłą i inkubować w CBCMS, aż oznaczy się dodatni z powodu zmiany koloru czujnika ciekłej emulsji u podstawy aBC.
   7. Powtórz kroki, jak wyjaśniono w krokach 1-3 dla identyfikacji odpowiednio przez SIP, DIP i RAST. Oczekiwane wyniki są takie, że szczep QC powinien być prawidłowo zidentyfikowany przez oba protokoły identyfikacji aMIAST, a średnice stref w płytkach RAST powinny mieścić się w określonym zakresie²⁸.

5. Analiza statystyczna

1. Rozważ identyfikację mikrobiologiczną przy użyciu SIP jako złoty standard, a jeśli taka sama identyfikacja zostanie uzyskana przez DIP, uznaj ją za zgodną.
2. Jeśli RR-GN, tj. jeden z kompleksów E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa i A. baumannii zidentyfikowany za pomocą SIP, jest niezgodny w DIP, należy to uznać za błąd główny (ME), podczas gdy odwrotność należy uznać za bardzo poważny błąd (VME), ponieważ może to spowodować wydanie raportu z błędną identyfikacją.
3. Obliczyć współczynnik zgodności dla RR-GN jako stosunek całkowitej liczby zgodnych RR-GN do całkowitej liczby RR-GN zidentyfikowanych przez SIP pomnożony przez 100.
4. Obliczać wskaźnik ME jako stosunek liczby +naBC zidentyfikowanych jako mające inny niż RR-GN do całkowitej liczby +naBC z RR-GN zidentyfikowanym przez SIP pomnożony przez 100.
5. Obliczyć wskaźnik VME jako stosunek liczby +naBC błędnie zidentyfikowanych jako posiadające RR-GN w DIP do całkowitej liczby +naBC badanych za pomocą DIP pomnożony przez 100.
6. Oblicz czas do identyfikacji izolacji (TTI) jako czas potrzebny do zidentyfikowania izolatu za pomocą obu protokołów od momentu oznaczenia posiewu krwi przez CBCMS.
7. Oblicz różnice między DIP i SIP jako zmniejszenie TTI. Oblicz to tylko dla zgodnych +naBC o RR-GN. Zwróć uwagę na odpowiednie punkty czasowe z zegarów CBCMS i aMIAST.
8. Zarządzaj danymi i analizuj je za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Użyj testu U Manna-Whitneya dla zmiennych ciągłych, uznając dwustronną wartość p ≤ 0,05 za statystycznie istotną.

Results

Ogólne wyniki
W okresie objętym badaniem 240 +naBC zostało zidentyfikowanych przez aMIAST zarówno przy użyciu DIP, jak i SIP. Spośród nich 15% (36/240) +naBC okazało się być wielodrobnoustrojowe po całonocnej inkubacji na pożywkach platerowanych. Spośród 204 +naBC odsetek RR-GN zidentyfikowanych przez SIP wynosił 51,5% (105/204). Wśród nich 47,6% (50/105) stanowił kompleks E. coli, 19% (20/105) K. pneumoniae, 8,6% (9/105) P. aeruginosa i 24,8% (26/105) kompleks A. baumannii. Szczegółowy opis wszystkich wyników identyfikacji za pomocą SIP znajduje się w tabeli 1.

Dokładność diagnostyczna w identyfikacji mikrobiologicznej
Spośród 105 RR-GN, 98 (93,3%) i 99 (94,2%) było zgodnych z DIP, odpowiednio do czasu identyfikacji na poziomie gatunku i rodzaju. Wskaźniki zgodności pod względem organizmu wynosiły 94% (47/50) dla E. coli, 90% (18/20) dla K. pneumoniae, 100% (9/9) dla P. aeruginosa i 92,3% (24/26) dla kompleksu A. baumannii, jak pokazano w tabeli 1. W 7 +naBC wyniki były niezgodne aż do identyfikacji na poziomie gatunku za pomocą DIP, z których aMIAST albo dało niezidentyfikowane (3), albo zidentyfikowało Non-RR-GN (4), jak pokazano w tabeli 2. Ponieważ wyniki te nie zmuszą mikrobiologa klinicznego do złożenia raportu, zostały one uznane za poważne błędy (ME). Wskaźnik ME w naszym badaniu wynosił 6,7% (7/105) do momentu identyfikacji na poziomie gatunku. Udział non-RR-GN w aMIASTACH według SIP wyniósł 48,5% (99/204). Spośród nich 60 (60,6%) było zgodnych przez DIP do identyfikacji na poziomie gatunku. Spośród 99 nie-RR-GN, RR-GN został zidentyfikowany za pomocą DIP w 4 +naBC, jak pokazano w tabeli 2. Taka rozbieżność mogła prowadzić do błędu w raportowaniu i była uważana za bardzo poważny błąd (VME). Ogólny wskaźnik VME przy użyciu DIP wyniósł 1,7% (4/240). Pełny opis wyników identyfikacji i błędów wszystkich wyników badań metodą Gram-ujemnych przedstawiono w tabeli uzupełniającej 1.

Skrócenie czasu do identyfikacji (TTI)
TTI zgodnych +naBC w DIP było znacznie mniejsze niż TTI w SIP (mediana (IQR): 507,5 min (685-404) vs 2171 min (2532-1855), P2 vs P1, p<0,00001 (test Manna-Whitneya)). Mediana różnicy w TTI między obydwoma protokołami wyniosła 1635 min (IQR: 1964-1299).

Rysunek 1: Przebieg badania: przedstawiający przebieg pracy w badaniu dla pozytywnie oznaczonej butelki z posiewem krwi z monomorficznymi gram-ujemnymi wynikami, które są przetwarzane zarówno przez protokół standardowego, jak i bezpośredniego inokulum. Skróty: +aBC = pozytywnie oflagowana butelka z posiewem krwi, +naBC = pozytywnie oznaczona butelka z posiewem krwi z monomorficznymi gram-ujemnymi wartościami, DIP = protokół inokulum bezpośredniego, SIP = standardowy protokół inokulum, SBA = agar z krwią owczą, CA = agar czekoladowy, MA = agar MacConkey, RR-GN = Gram-ujemny raportowalny RASTA, TAT = czas realizacji Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Protokół bezpośredniego inokulum do identyfikacji bakterii: pokazuje obrazy fiolek podczas wykonywania protokołu bezpośredniego inokulum. Skróty: +naBC = pozytywnie oznaczona butelka z posiewem krwi z gram-ujemnymi Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział Rozdział

RAST Gram-ujemne dane raportowane	Testowane izolaty (n)	Zgodny	Błędna identyfikacja	Brak dowodu tożsamości
		n (%)	n (%)	n (%)
łączny	105	98 (93,3%)	4 (3,8%)	3 (2,8%)
Escherichia coli (Escherichia coli)	50	47 (94%)	1	cyfra arabska
Klebsiella pneumoniae	20	18 (90%)	1	1
Kompleks Acinetobacter baumannii	26	24 (92,3%)	2#	0
Pseudomonas aeruginosa	9	9 (100%)	0	0
# Jeden izolat poprawnie zidentyfikowany na poziomie rodzaju, ale nie na poziomie gatunku (kompleks Acinetobacter baumannii zidentyfikowany jako A. haemolyticus)

Tabela 1: Wyniki identyfikacji bakterii w protokole inokulum bezpośredniego. Wyniki dotyczą tylko Gram-ujemnych danych raportowanych przez RASTA. Skróty: n = licznik, % = procent.

Rozdział

Gram-ujemne	Całkowita liczba przetestowanych izolatów	Główny błąd			Błąd bardzo poważny, n (%)
		numer	Błędna identyfikacja	Brak dowodu tożsamości	(zidentyfikowany jako)
		n (%)	n	n
Escherichia coli (Escherichia coli)	50	3 (6%)	1 (A. haemolyticus)	cyfra arabska	0
Klebsiella pneumoniae	20	2 (10%)	1 (Ralstonia pickettii)	1	0
Kompleks Acinetobacter baumannii	26	2 (7,7%)	2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus)	-	0
Salmonella spp.	10	BRAK DANYCH			1 (10%)
					(E. coli)
Kompleks Enterobacter cloacae	8	BRAK DANYCH			1 (12,5%)
					(E. coli)
Acinetobacter lwoffi	14	BRAK DANYCH			1 (7,1%)
					(kompleks A. baumannii)
Sphingomonas paucimobilis	9	BRAK DANYCH			1 (11,1%)
					(K. pneumoniae)
Skróty- n: licznik, %: procent, ID: identyfikacja, NA: nie dotyczy,
A: Acinetobacter, E: Escherichia, K: Klebsiella

Tabela 2: Szczegóły głównych i bardzo poważnych błędów według protokołu bezpośredniego inokulum. Skróty: n = licznik, % = procent, ID = identyfikacja, NA = nie dotyczy, A = Acinetobacter, E = Escherichia, K = Klebsiella.

Tabela uzupełniająca 1: Szczegółowe wyniki identyfikacji organizmu w obu protokołach wraz z wynikami błędów w protokole inokulum bezpośredniego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Korzystając z DIP, udało nam się zidentyfikować RR-GN ze znaczną dokładnością diagnostyczną. Średni TTI po pozytywnym oznaczeniu aBC wynosił tylko 507 min (~ 8,5 h). W związku z tym, w połączeniu z metodą EUCAST RAST do oznaczania AspAT, może ona zapewnić identyfikację izolatu po 8 godzinach odczytu AST. Podejście to ma potencjał do wdrożenia metody EUCAST RAST, eliminując potrzebę identyfikacji opartej na spektrometrii mas. Jest to dobrodziejstwo dla środowisk o ograniczonych zasobach, które chcą wdrożyć metodę EUCAST RAST w swoim rutynowym przepływie pracy, aby skrócić czas potrzebny na raportowanie kliniczne i obejść główne przeszkody w jej wdrożeniu.

Przed wprowadzeniem metody EUCAST RAST wielu autorów oceniało dokładność bezpośrednich testów z +aBC dla różnych systemów aMIAST 21,22,23,24,25,26,27,29,30,31. W tych badaniach protokoły testów bezpośrednich różniły się między etapem pojedynczej wirówki 29,30,31,32 a krokiem podwójnej wirówki 21,22,24,25,26,27 do wytwarzania osadu bakteryjnego. W metodzie jednoetapowej mieszaninę krwi i bulionu z +aBC odwirowano z dużą prędkością w probówce separatora surowicy (SST) w celu osadzenia bakterii powyżej warstwy żelu silikonowego. Osad służył do przygotowania inokulum do inokulacji kart identyfikacyjnych. W metodzie podwójnego wirowania mieszanina krwi i bulionu z +aBC była najpierw odwirowywana z niską prędkością w SST w celu osadzenia krwinek. Z tej probówki supernatant zawierający bakterie został usunięty i przeniesiony do nowej probówki i poddany szybkiemu wirowaniu. Z tej probówki supernatant był odrzucany, a osad służył do zaszczepienia odpowiednich kart identyfikacyjnych. W tych badaniach wskaźnik zgodności wahał się od 62% do 100%, ale ogólnie dokładność była wyższa w przypadku metody podwójnego wirowania.

Okazało się, że metoda jest prosta do wykonania i została podjęta w rutynowym laboratorium diagnostycznym z personelem składającym się >10 techników laboratoryjnych na zmianę, co dowodzi solidności metody. W ~94% (98/105) +naBC zawierających jeden z RR-GN, DIP prawidłowo zidentyfikował mikroorganizm. Wskaźnik zgodności dla różnych kategorii organizmów był również porównywalny, ponieważ wynosił odpowiednio 94%, 90%, 100% i 92,3% dla kompleksu E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa i A. baumannii. Odkryliśmy również, że ogólny wskaźnik zgodności dla każdego gram-ujemnego był nieoptymalny, ~77% (157/204). Jednak większość tych błędnych identyfikacji dotyczyła niefermentacyjnych Gram-ujemnych, takich jak Acinetobacter spp. inne niż kompleks baumannii, Pseudomonas spp. inne niż aeruginosa, Moraxella spp. i Sphingomonas paucimobilis, które są zwykle uważane za powszechne zanieczyszczenia skóry. Błędne identyfikacje z niefermentacyjnymi gram-ujemnymi zostały również odnotowane przez innych autorów^21,23, co prawdopodobnie wynika z niskiej reaktywności tych bakterii w kartach identyfikacyjnych aMIAST.

Stwierdziliśmy znaczne zmniejszenie TTI bakterii w obrębie +naBC za pomocą DIP. Mediana TTI DIP była około 4 razy mniejsza niż mediana TTI SIP (507 min vs 2171 min), gdy została wykonana w rutynowym klinicznym laboratorium diagnostycznym. Ten TTI wynoszący ~8,5 h obejmował również odstęp między pozytywnym oznaczaniem aBC a wykonaniem inokulacji kartą aMIAST, ponieważ średni czas do wyizolowania analizy przez aMIAST wynosił tylko 5,45 h ± 1,6 h. Dodając średni czas do dodatniego wyniku wynoszący 728 min ± 301 min (~12 h) dla zgodnych +naBC w naszym badaniu, to podejście do identyfikacji bakterii może potencjalnie dać raport tego samego dnia po otrzymaniu aBC w rutynowym laboratorium diagnostycznym.

Istnieją również pewne ograniczenia związane z DIP. Po pierwsze, ze względu na to, że jest to zastosowanie preparatu inokulum poza wskazaniami rejestracyjnymi, wyniki należy uznać za wstępne, podobnie jak wyniki AST uzyskane przez EUCAST RAST. Niemniej jednak służy on głównemu celowi, jakim jest identyfikacja tylko RR-GN ze znaczną dokładnością diagnostyczną w odpowiednim czasie. Po drugie, istnieje praktyczna możliwość marnotrawstwa zasobów testowych, jak w przypadku około 60% +naBCs; nie bylibyśmy w stanie dokonać zgłoszenia ani z powodu zakażeń wielodrobnoustrojowych, ani identyfikacji osoby innej niż RRGN. To marnotrawstwo zasobów dotyczy każdej z nowszych zautomatyzowanych metod bezpośredniego wykrywania AspAT w posiewach krwi. Po trzecie, wskaźnik zakażeń wielodrobnoustrojowych i identyfikacja powszechnych zanieczyszczeń skóry były wyższe w tym badaniu ze względu na złe praktyki pobierania próbek. Po czwarte, nie potwierdziliśmy tożsamości badanych izolatów za pomocą spektrometrii mas, która jest obecnie złotym standardem identyfikacji bakterii.

Badanie to z powodzeniem wykazało, że nawet za pomocą testów fenotypowych możliwe jest raportowanie tego samego dnia dodatnich posiewów krwi, zwłaszcza w bakteriemii Gram-ujemnej. Ma to potencjał znacznego skrócenia czasu rozpoczęcia odpowiedniej terapii przeciwdrobnoustrojowej w krajach o niskich i średnich dochodach, gdzie diagnostyka mikrobiologiczna w celu identyfikacji bakterii i AspAT opiera się w dużym stopniu na konwencjonalnych testach fenotypowych. Podejście to powinno zostać zweryfikowane poprzez przeprowadzenie wieloośrodkowego badania, a jego potencjalny wpływ na wyniki leczenia pacjentów oraz jako narzędzie zarządzania środkami przeciwdrobnoustrojowymi powinny być przedmiotem przyszłych badań klinicznych w krajach o niskich i średnich dochodach.

Podsumowując, projekt DIP for aMIAST uzupełnia metodę EUCAST RAST, umożliwiając wczesną identyfikację RR-GN. Eliminuje to konieczność polegania na zaawansowanych technikach identyfikacji mikrobiologicznej i AST, ponieważ czas potrzebny na sporządzenie raportu przy użyciu tych podejść jest porównywalny z tym podejściem. W przypadku bakterii Gram-ujemnych raportowanie tego samego dnia jest możliwe do osiągnięcia za pomocą konwencjonalnych metod fenotypowych, jeśli są one maksymalnie zoptymalizowane. Może to potencjalnie skrócić czas trwania leczenia przeciwdrobnoustrojowego o szerokim spektrum działania i ułatwić zarządzanie środkami przeciwdrobnoustrojowymi w warunkach ograniczonych zasobów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PRZECIWDROBNOUSTROJOWE
Amikacyna dysk 30 µ g	Himedia, Bombaj, Indie	SD035-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Dysk amoksyclav (20/10 &mikro; g)	Himedia, Bombaj, Indie	SD063-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Cefotaksym dysk 5 i mikro; g	Himedia, Bombaj, Indie	SD295E-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Ceftazydym dysk 10 i mikro; g	Himedia, Bombaj, Indie	SD062A-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
krążek cyprofloksacyny (5 &mikro; g)	Himedia, Bombaj, Indie	SD060-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Krążek ko-trimoksazolu (23,75/1,25 &mikro; g)	Himedia, Bombaj, Indie	SD010-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Dysk gentamycyny 10 i mikro; g	Himedia, Bombaj, Indie	SD016-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Dysk imipenemowy 10 i mikro; g	Himedia, Bombaj, Indie	SD073-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Lewofloksacyna krążek 5 i mikro; g	Himedia, Bombaj, Indie	SD216-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Meropenem dysk 10 i mikro; g	Himedia, Bombaj, Indie	SD727-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Krążek piperacyliny-tazobaktamu (30/6 &mikro; g)	Himedia, Bombaj, Indie	SD292E-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Tobramycyna dysk 10 &mikro; g	Himedia, Bombaj, Indie	SD044-1VL	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota, USA	0335A Zalecany	szczep bakterii Gram-ujemny do kontroli jakości w RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francja	412CM8423	Ciągły zautomatyzowany system hodowli krwi
Komora bezpieczeństwa biologicznego II Typ A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, Indie	DFP-2/21-22/149	Do ochrony przed czynnikami niebezpiecznymi  i zakaźnymi oraz do utrzymania kontroli jakości
Agar z krwią nr 2	Himedia, Bombaj, Indie	M834-500G	Przygotowanie agaru z krwią i agaru czekoladowego
Model wirówki klinicznej SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, Indie	HLL/2021-22/021	Wirowanie z niską i wysoką prędkością do separacji supernatantu
Dozownik S Analogowo regulowany dozownik butelkowy	BrandTech, Essex CT, Anglia	V1200	Dozowanie dokładnej ilości soli fizjologicznej
agaru MacConkey	Himedia, Bombaj, Indie	M008-500G	Pożywki różnicowe do fermentorów laktozy / bez fermentorów Mikropipety Gram-ujemne pałeczki
(100-1000 i mikro; L)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, Indie	NJ478162	Przenoszenie supernatantu po pierwszym odwirowaniu, odrzucanie supernatantu po drugim odwirowaniu
Końcówki do mikropipet (200-1000 i mikro; L)	‎ Tarsons Products Pvt. Ltd., Kalkuta, Indie	521020	Przenoszenie supernatantu po pierwszym odwirowaniu, odrzucanie supernatantu po drugim odwirowaniu
Agar Muellera-Hintona	Himedia, Bombaj, Indie	M173-500G	Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe metodą Kirby-Bauera pętli dyfuzji
dysku Nichrom D-4	Himedia, Bombaj, Indie	LA019	Do smug na pożywce hodowlanej
Drut prosty Nichrome	Himedia, Bombaj, Indie	LA022	Do szczepienia kłutego
Sterylne rękawiczki Nulife	MRK healthcare Pvt Limited, Bombaj, Indie		Dla bezpieczeństwa środki ostrożności
Zwykła fiolka (fiolka z czerwoną nakrętką), vacutainer Advance BD	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Otrzymywanie granulatu po drugim odwirowaniu
Krew owcza	Labline Trading Co., Hyderabad, Indie	70014	Przygotowanie agaru z krwią i agaru czekoladowego
SST II, vacutainer Advance BD	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Separacja sklarowanego osadu w pierwszym wirowaniu
Sterylny wacik bawełniany (z drewnianym patyczkiem)	Himedia, Bombaj, Indie	PW005-1X500NO	Hodowla na trawniku bulionu z posiewów krwi do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
Sterylna jednorazowa strzykawka podskórna 5 ml / cc	Nihal Healthcare, Solan, Indie	2213805NB2	Przygotowanie porcji z zestawu
referencyjnego +aBC VITEK DensiCHEK McFarland	bioMérieux, Marcy d' Etoille, Francja	422219	Densytometr do sprawdzania zmętnienia zawiesiny
VITEK roztwór soli fizjologicznej (0,45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francja	V1204	Regulacja standardowego zmętnienia McFarland
Stojak na rurki VITEK	bioMérieux, Marcy d' Etoille, Francja	533306-4 REV	Stojak do prawidłowego umieszczenia probówek przed zaszczepieniem dowodu osobistego
Probówki VITEK	bioMérieux, Marcy d' Etoille, Francja		Probówki do przygotowania inokulum
VITEK-2 Compact 60	bioMérieux, Marcy d' Etoille, Francja	VKC15144	Automatyczna identyfikacja i system AST
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francja	21341	Identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych